Artykuł metodologiczny

Opracowanie multipleksowych testów RT-qPCR w czasie rzeczywistym do wykrywania SARS-CoV-2, grypy A/B i MERS-CoV

DOI:

10.3791/65822

⸱

10 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentujemy dwa wewnętrzne, jednoetapowe zestawy RT-qPCR do powszechnych wirusów układu oddechowego. Pierwszy test dotyczy SARS-CoV-2 (N), grypy A (H1N1 i H3N2) oraz grypy B. Drugi dotyczy SARS-Cov-2 (N) i MERS (UpE i ORF1a). Testy te mogą być z powodzeniem wdrożone w każdym specjalistycznym laboratorium.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2), który powoduje chorobę koronawirusową 2019 (COVID-19), jest poważnym zagrożeniem dla zdrowia ogółu społeczeństwa. W sezonach grypowych rozprzestrzenianie się SARS-CoV-2 i innych wirusów układu oddechowego może powodować trudne do opanowania obciążenie całej populacji chorobami układu oddechowego. W tym celu wirusy układu oddechowego SARS-CoV-2, grypa A, grypa B i bliskowschodni zespół oddechowy (MERS-CoV) będą musiały być uważnie obserwowane w nadchodzących sezonach jesienno-zimowych, szczególnie w przypadku SARS-CoV-2, grypy A i grypy B, które mają podobne czynniki epidemiologiczne, takie jak populacje podatne, sposób transmisji i zespoły kliniczne. Bez testów specyficznych dla celu rozróżnienie przypadków tych wirusów może być trudne ze względu na ich podobieństwa. W związku z tym czuły i ukierunkowany test multipleksowy, który może łatwo rozróżnić te cele wirusowe, będzie przydatny dla pracowników służby zdrowia. W tym badaniu opracowaliśmy test oparty na odwrotnej transkryptazie PCR w czasie rzeczywistym, wykorzystując opracowany przez nas jednoetapowy zestaw R3T RT-qPCR do jednoczesnego wykrywania SARS-CoV-2, grypy A, grypy B i SARS-CoV-2, MERS-CoV. Mając już zaledwie 10 kopii ich syntetycznego RNA, możemy z powodzeniem zidentyfikować cele SARS-CoV-2, grypy A, grypy B i MERS-CoV jednocześnie ze 100% swoistością. Ten test jest dokładny, wiarygodny, prosty, czuły i specyficzny. Opracowana metoda może być stosowana jako zoptymalizowany test diagnostyczny SARS-CoV-2, grypy A, grypy B i SARS-CoV-2, MERS-CoV w szpitalach, centrach medycznych i laboratoriach diagnostycznych, a także do celów badawczych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pandemia trwającej choroby koronawirusowej 2019 (COVID-19) jest wywoływana przez nowego koronawirusa znanego jako koronawirus zespołu ciężkiej ostrej niewydolności oddechowej 2 (SARS-CoV-2)1. Ze względu na silną zaraźliwość i zdolność szybkiego przenoszenia się SAR-CoV-2, pandemia COVID-19 pojawiła się w mieście Wuhan w Chinach i szybko rozprzestrzeniła się na cały świat. To ostatecznie doprowadziło do pojawienia się objawów niewydolności oddechowej, a nawet śmierci2,3,4. COVID-19 został uznany za pandemię w ponad 213 krajach, spodziewając się gwałtownego wzrostu liczby potwierdzonych przypadków, o czym świadczą artykuły opublikowane w różnych badaniach naukowych3,5. COVID-19 jest przenoszony głównie przez małe kropelki oddechowe, które zakażone osoby uwalniają do środowiska, a następnie są narażone na kontakt z osobami wrażliwymi poprzez wdychanie lub bliski kontakt ze skażonymi powierzchniami. Kiedy te kropelki wejdą w kontakt z błoną śluzową oczu, ust lub nosa, osoba może zostać zarażona6. Statystyki opublikowane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO) pokazują, że na całym świecie odnotowano ponad 76 milionów potwierdzonych przypadków pandemii, z oszałamiającą liczbą 7 milionów zgonów7. Tym samym Organizacja Narodów Zjednoczonych sklasyfikowała pandemię wywołaną chorobą COVID-19 jako katastrofę ze względu na jej bezpośredni wpływ na życie miliardów ludzi na całym świecie i miała daleko idące skutki gospodarcze, środowiskowe i społeczne.

Inicjatywy związane ze zdrowiem publicznym, w tym dokładne testy, wczesne wykrywanie, śledzenie kontaktów i izolacja przypadków, okazały się kluczowe dla utrzymania tej pandemii pod kontrolą8,9,10,11. Miesiące zimowe zwiększą krążenie innych wirusów układu oddechowego, takich jak grypa A i B, z objawami podobnymi do COVID-19, co utrudni wczesną identyfikację, śledzenie i izolację przypadków COVID-19. Każdego roku epidemia grypy typu A i B rozpoczyna się późną jesienią lub na początku stycznia z przewidywalną sezonowością12. Liczne cechy epidemiologiczne są wspólne dla wirusów SARS-CoV-2 i grypy. Poza tym podobieństwa w populacjach podatnych, które obejmują dzieci, osoby starsze, z obniżoną odpornością i osoby z przewlekłymi chorobami współistniejącymi, takimi jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc, niewydolność serca i nerek lub cukrzyca12,13. Wirusy te nie tylko dzielą wrażliwe populacje, ale także drogi przenoszenia kropelek kontaktowych i oddechowych14. Przewiduje się, że pacjenci mogą zarazić się więcej niż jednym z tych wirusów układu oddechowego w miarę zbliżania się sezonu grypowego14. W tym celu należy przeprowadzić badania przesiewowe w kierunku SARS-CoV-2 i wirusów grypy u pacjentów z objawami, zanim zostaną oni odizolowani. Przeprowadzenie oddzielnych testów dla trzech wirusów (SARS-CoV-2, grypy A i grypy B) nie jest możliwe ze względu na globalny brak zasobów do ekstrakcji i diagnostyki kwasów nukleinowych. Aby przebadać je wszystkie w jednej reakcji, należy opracować metodę lub test.

Zespół oddechowy Bliskiego Wschodu (MERS)-CoV to ludzki koronawirus (CoV) należący do rodziny. Pierwsze izolaty wirusa MERS-CoV pochodziły od hospitalizowanego pacjenta w Arabii Saudyjskiej, który zmarł we wrześniu 2012 roku z powodu ostrych problemów z oddychaniem15. Istnieją dowody sugerujące, że głównym żywicielem rezerwuarowym MERS-CoV są wielbłądy dromadery. Udowodniono, że wirusy pochodzące od zakażonych wielbłądów dromaderów są odzwierzęce, a zatem mogą zarażać ludzi16,17. Ludzie zarażeni tym wirusem mogą przenosić go na innych poprzez bliski kontakt18. Do 26 stycznia 2018 r. na całym świecie odnotowano 2143 potwierdzone laboratoryjnie przypadki zakażenia MERS-CoV, w tym 750 zgonów19. Najbardziej typowymi objawami MERS-CoV są kaszel, gorączka i duszność. Zgłaszano również, że infekcje MERS-CoV wykazują zapalenie płuc, biegunkę i objawy choroby żołądkowo-jelitowej20. Obecnie nie jest dostępna żadna komercyjna szczepionka ani specyficzne leczenie MERS-CoV. Dlatego szybka i precyzyjna diagnoza jest niezbędna do zapobiegania rozprzestrzenianiu się epidemii MERS-CoV i różnicowania MERS-CoV od choroby SARS-CoV-2.

Do tej pory zaproponowano wiele podejść do wykrywania tych wirusów, takich jak multiplex RT-PCR21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928, and CRISPR/Cas329, przepływ boczny test immunologiczny30, papierowe czujniki biomolekularne31, testy SHERLOCK w jednym garnku32, DNA aptamer33, amplifikacja izotermiczna za pośrednictwem pętli (LAMP)19,34, itd. Każda z wyżej wymienionych metod ma unikalne zalety i wady pod względem czułości i swoistości. Wśród tych metod najczęstszy jest test oparty na amplifikacji kwasów nukleinowych: multiplex qRT-PCR, który jest uważany za złoty standard w diagnostyce SARS-CoV-2, grypy A, grypy B i MERS-CoV.

W tym badaniu zaprojektowaliśmy i oceniliśmy różne kombinacje starterów i sondy do skutecznego, dokładnego i jednoczesnego wykrywania SARS-CoV-2, grypy A, grypy B i SARS-CoV-2, MERS-CoV przy użyciu standardowych syntetycznych wirusowych RNA. Testy multipleksowe opracowane dla docelowych genów MERS-CoV lub SARS-CoV-2 są zalecane przez Światową Organizację Zdrowia (WHO). Geny te na ogół kodują białka i kompleksy, które przyczyniają się do tworzenia kompleksu replikacji/transkrypcji (RTC)35, takiego jak region w otwartej ramce odczytu 1a (ORF1a), który jest używany do testu MERS-CoV. Ponadto białka strukturalne są kodowane przez geny wykorzystywane w testach diagnostycznych, takich jak region górny genu otoczki (upE) i gen nukleokapsydu (N), które są używane odpowiednio w testach MERS-CoV i SARS-Cov-235,36. Użyliśmy własnego jednoetapowego zestawu R3T RT-qPCR, aby ustanowić RT-qPCR do wykrywania wirusów37. Wykrywanie wirusów, czułość, swoistość i zakres dynamiczny naszego jednoetapowego zestawu RT-qPCR R3T i zestawów starterów zostały przetestowane i ocenione przy użyciu 10-krotnych seryjnych rozcieńczeń standardowych syntetycznych RNA skrętnych. Najniższa praktyczna granica wykrywalności wynosiła około 10 kopii transkryptów na reakcję. W rezultacie, autorski jednoetapowy zestaw RT-qPCR R3T oraz zestawy starter/sonda mogą być z powodzeniem stosowane i wdrażane do rutynowej jednoczesnej diagnostyki SARS-CoV-2, grypy A, grypy B i SARS-CoV-2, MERS-CoV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ekspresja i oczyszczanie polimerazy Taq

  1. Skonstruuj plazmid z rozszczepialnym znacznikiem heksa-histydyny na C-końcu enzymu.
  2. Przekształć 50 ng wektora wyrażenia w szczep E. coli BL21-(DE3) zgodnie ze standardowym protokołem38.
  3. Zaszczepić przekształcone komórki w czterech kolbach o pojemności 6 l, z których każda zawiera 2 litry bulionu z pożywki 2YT w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 170 obr./min, aż do osiągnięcia OD 600 0,8 lub liczby komórek 6,4 x10,8
    4. .
  4. Indukować ekspresję polimerazy Taq za pomocą 0,5 mM izopropylo-β-d-tiogalaktopiranozydu (IPTG) i dalej inkubować w temperaturze 16 °C przez 18 godzin z wytrząsaniem.
  5. Zebrać komórki, obracając je w temperaturze 4 °C przy 7808 x g przez 10 minut. Zawiesić granulki w 200 ml lodowatego buforu do lizy polimerazy Taq (Tabela 1) w 5 ml/g osadu komórkowego.
  6. Inkubować komórki z lizozymem (2 mg/ml buforu do lizy) i inhibitorami proteazy przez 45 minut, a następnie przepuścić lizat przez urządzenie zaburzające tworzenie komórek w temperaturze 30 kPsi i odwirować przy 22,040 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu oddzielenia resztek komórek.
  7. Podgrzewać supernatant przez 15 minut w temperaturze 85 °C. Wirować w temperaturze 95 834 x g przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant i przefiltrować go na lodzie za pomocą filtra 0,45 μm.
  8. Przeprowadzić oczyszczanie białka za pomocą szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC), najpierw przepuszczając próbkę przez kolumnę Ni-NTA HP 5 ml przy natężeniu przepływu 4 ml / min przy użyciu buforu polimerazy Taq A (Tabela 2; Rysunek 1A).
  9. Przemyć 10 objętościami kolumny (CV) buforu polimerazy A Taq i 4% buforu polimerazy B Taq (Tabela 2). Eluować związane białko za pomocą gradientu liniowego za pomocą buforu polimerazy B Taq przez 20 CV w butelce o pojemności 100 ml.
  10. Przepuścić eluent w butelce o pojemności 100 ml przez kolumnę kationowymienną o pojemności 5 ml z prędkością 4 ml / min przy użyciu buforu polimerazy Taq C (Tabela 2; Rysunek 1A).
  11. Przemyć 20 CV 100% buforem polimerazy C Taq i 5% buforem polimerazy D Taq (Tabela 2).
  12. Elutę z gradientem liniowym za pomocą buforu polimerazy Taq D (tabela 2) zaczynając od 5% do 100%.
  13. Sprawdź eluowane frakcje, wykonując elektroforezę żelową SDS-PAGE 39, a następnie barwienie żelem 40, jak opisano wcześniej. Na krótko weź 10 μl każdej frakcji i dodaj równą objętość 2x barwnika ładującego SDS. Denaturacja próbki w temperaturze 90oC przez 10 minut. Załaduj próbki na 10% żel SDS-PAGE i uruchom żel na 25 minut przy napięciu 200 V. Zabarwić żel za pomocą Coomassie Brilliant Blue, a następnie usunąć plamę.
  14. Zebrać wszystkie frakcje zawierające oczyszczoną polimerazę Taq i poddać dializie w buforze do przechowywania polimerazy Taq (tabela 3) w temperaturze 4 °C. Krótko przygotować 2 litry buforu do przechowywania i zanurzyć kasetę dializacyjną w buforze na 2 minuty w celu uwodnienia. Zebrane frakcje wstrzyknąć za pomocą igły do kasety dializacyjnej i pozostawić na noc w buforze do dializy z prędkością 200 obr./min na mieszadle.
  15. Po dializie zmierzyć stężenie białka za pomocą spektrofotometru, przygotować 10 μl porcji, zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
    UWAGA: Przefiltruj wszystkie do oczyszczenia za pomocą filtra 0,45 μm przed załadowaniem ich do systemu FPLC.

2. Ekspresja MMLV-RT w systemie ekspresji i oczyszczania komórek owadów

  1. Wytwarzanie i izolacja DNA bakterii bakimidowych
    1. Sklonuj sekwencję MMLV-RT ze znacznikiem TEV-8xHis-Strep z C-końcem, jak opisano wcześniej41.
    2. Wymieszaj 100 ng wektora ekspresji z 50 μl komórek DH10Bac i delikatnie wymieszaj, stukając w probówkę.
    3. Inkubować komórki na lodzie przez 15 minut. Szok termiczny komórek przez 1 minutę w temperaturze 42 °C.
    4. Natychmiast przenieść na lód i dodać 400 μl pożywki S.O.C. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 4 godziny.
    5. Płytka 10 μl i 15 μl mieszaniny na płytkach agarowych LB zawierających trzy antybiotyki: 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny i 7 μg/ml gentamycyny wraz z 40 μg/ml IPTG i 100 μg/ml X-Gal do wyboru niebiesko-białego.
    6. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Zebrać kilka białych kolonii i jedną niebieską kolonię jako kontrolę, a następnie ponownie rozprowadzić je na świeżych płytkach agarowych LB zawierających powyższe antybiotyki. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
    7. Po potwierdzeniu białego fenotypu wybierz kilka kolonii i zaszczep je w 10 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml kanamycyny, 10 μg/ml tetracykliny i 7 μg/ml gentamycyny w probówkach o pojemności 50 ml.
    8. Inkubować kulturę w temperaturze 37 °C, wytrząsając przy 170 obr./min przez noc. Granuluj komórki, obracając je w dół z prędkością 22 040 x g przez 10 minut.
    9. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl roztworu do zawieszania z zestawu miniprep (z tym roztworem należy obchodzić się zgodnie z instrukcjami producenta), a następnie przenieść roztwór do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
    10. Dodać 250 μl roztworu do lizy, delikatnie wymieszać i inkubować przez 3 min. Dodać 350 μl roztworu neutralizującego, odwrócić 2x-3x i odwirować przy 22,040 x g przez 10 min.
    11. Przenieść supernatant do świeżej probówki, dodać równą objętość lodowatego izopropanolu i inkubować przez 30 minut w temperaturze -20 °C.
    12. Osad wytrąconego DNA przez wirowanie z prędkością 22 040 x g przez 10 minut. Wyrzuć supernatant i umyj osad 700 μl 70% lodowatego etanolu, 2x.
    13. Usunąć sklarowany osad za pomocą pipety, nie dotykając osadu. Pozostaw granulki do wyschnięcia w okapie z przepływem laminarnym przez 5-10 minut lub do momentu, gdy w rurze nie będzie widać płynu. Rozpuścić osad w 100 μl buforu EB.
  2. Transfekcja Bacmid i amplifikacja wirusa
    1. Przygotowanie wirusa P1
      1. Na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej, nasiona ~ 9 x 105 komórek/studzienka w 2 ml pożywki do hodowli komórek owadów.
      2. Inkubować płytkę przez ~30 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić połączenie komórek.
      3. Przygotować mieszaninę Bacmid/Fugene w następujący sposób: zmieszać 1 μg DNA Bacmid i 300 μl pożywki z komórek owadów w jednej probówce. W innej probówce wymieszaj 8 μl odczynnika do transfekcji i 300 μl pożywki z komórek owadów. Wymieszaj obie mieszaniny przez delikatne pipetowanie i pozostaw na ~30 minut w temperaturze pokojowej, aby powstał kompleks odczynników bakmid/transfekcja.
      4. Dodaj kroplami mieszankę kompleksów bakimowych (~210 μl) do każdego dołka i uszczelnij płytkę przezroczystą folią.
      5. Inkubować płytkę w temperaturze 27 °C przez 3-4 dni.
      6. Pobrać pożywkę, która zawiera wirusa, dodać FBS (stężenie końcowe 2%), przefiltrować za pomocą filtra 0,45 μm i przechowywać w temperaturze 4°C w ciemności jako zapas wirusa P1.
    2. Przygotowanie wirusa P2
      1. Transfekować 50 ml komórek owadów w stężeniu 2 x 106 komórek/ml z 3 ml wirusa P1 w kolbie hodowlanej.
      2. Inkubować w temperaturze 27 °C z wytrząsaniem przy 100 obr./min przez 4-6 dni, aż odsetek martwych komórek osiągnie 25%-30%.
      3. Wirować przy 300 x g przez 10 minut i zebrać supernatant zawierający wirusa.
      4. Dodać FBS do końcowego stężenia 2%, przefiltrować przez filtr 0,45 μm i podatkować po 1 ml i przechowywać w temperaturze -80 °C jako zapas wirusa P2.
    3. Przygotowanie wirusa P3
      1. Przetransfekować 100 ml komórek owadów w stężeniu 2 x 106 komórek/ml z 2 ml wirusa P2 w kolbie hodowlanej.
      2. Inkubować w temperaturze 27 °C z wytrząsaniem przy 100 obr./min przez 3-4 dni, aż odsetek martwych komórek osiągnie 15%-20%.
      3. Odwirować komórki przy sile 300 x g przez 10 minut i zebrać supernatant zawierający wirusa.
      4. Dodaj FBS do końcowego stężenia 2%. Przefiltruj przez filtr 0,45 μm. Może być przechowywany w ciemności w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
  3. Ekspresja i oczyszczanie MMLV-RT w komórkach owadów
    1. Dodać 5 ml wirusa P3 do świeżych komórek owadów o gęstości 2 x 106 komórek/ml (kolba 700 ml/2 l) w sumie 6 kolb.
    2. Zebrać komórki po 55-60 godzinach po transfekcji, wirując w temperaturze 7808 x g przez 10 minut.
    3. Zawiesić osady komórkowe w 200 ml buforu do lizy MMLV-RT (Tabela 4). Przepuścić lizat przez urządzenie do rozbijania komórek w temperaturze 15 kPsi i odwirować przy 22 040 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Przenieść supernatant do nowych probówek i ponownie odwirować w temperaturze 95,834 x g w temperaturze 4 °C przez 1 godzinę. Zebrać supernatant i przefiltrować go na lodzie za pomocą filtra 0,45 μm.
    5. Rozpocznij oczyszczanie białka za pomocą FPLC, najpierw przepuszczając próbkę przez kolumnę Ni-NTA Excel 5 ml (Rysunek 1B) przy natężeniu przepływu 4 ml / min przy użyciu buforu MMLV-RT A (Tabela 5).
    6. Przemyć kolumnę 10 CV buforu A MMLV-RT i 4% buforu B MMLV-RT (Tabela 5) i wymyć białko o liniowym gradiencie buforu B MMLV-RT przez 20 CV w butelce o pojemności 100 ml.
    7. Przepuść eluowaną próbkę przez kolumnę Strep 5 ml (Rysunek 1B) zrównoważoną buforem MMLV-RT C (Tabela 5).
    8. Przemyć kolumnę 10 CV 100% buforu C MMLV-RT i wymyć białko z gradientem liniowym z 20 CV buforu D (Tabela 5).
    9. Sprawdź eluowane frakcje, wykonując SDS-PAGE, jak to zrobiono w krokach 1.13.-1.14. i zebrać frakcje zawierające oczyszczony MMLV-RT do dializy w buforze magazynującym MMLV-RT (Tabela 6) w temperaturze 4 °C.
    10. Zmierzyć stężenie białka za pomocą Nanodrop, podwielokrotności, zamrozić błyskawicznie w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Przefiltruj wszystkie do oczyszczenia za pomocą filtra 0,45 μm przed załadowaniem ich do systemu FPLC.

3. Przygotowanie własnych komponentów jednoetapowego zestawu RT-qPCR do multipleksu R3T

  1. Przygotowanie mieszanki buforowej
    1. Przygotuj bufor 2x do reakcji RT-qPCR, który zawiera odczynniki wcześniej pokazane w37. Przygotować wszystkie odczynniki w wodzie wolnej od DNaz/RNaz, a mieszaninę buforową przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C.
  2. Zestawy podkładów i sond oraz przygotowanie mieszanin podkładów
    UWAGA: Zastosowane sondy i startery są wymienione w Tabeli 7. Zestaw multipleksowy do grypy i SARS-CoV-2 zawiera 3 sondy oraz 4 zestawy starterów do przodu i do tyłu. Sondy są znakowane na końcach 5′ za pomocą reporterów 6-karboksyfluoresceiny (FAM) dla InfA, Texas Red-XN dla SARS-CoV-2 (gen N) i Yakima Yellow dla InfB. Zestaw multipleksowy MERS-CoV i SARS-CoV-2 zawiera 3 sondy oraz 3 zestawy starterów do przodu i do tyłu. Sondy są również znakowane na końcach 5′ za pomocą reporterów Texas Red-XN dla MERS-CoV (gen ORF1a), VIC dla MERS-CoV (gen UpE) i 6-karboksyfluoresceiny (FAM) SARS-CoV-2 (gen N).
    1. Przygotować mieszaninę starterów zawierającą wszystkie startery i sondy wymienione w Tabeli 7 o końcowym stężeniu 6,7 μM dla każdego startera do przodu i do tyłu oraz 1,25 μM dla każdej sondy w probówce o pojemności 1,5 ml. Przechowuj mieszankę podkładów w zamrażarce w temperaturze -20 °C. Użyj buforu elucyjnego, aby uzupełnić wymaganą objętość.
  3. Przygotowanie mieszanki enzymatycznej
    1. Przygotować mieszaninę enzymów polimerazy Taq (30 U/μl) i MMLV-RT (60 ng/μl) w buforze do przechowywania polimerazy Taq, jak pokazano w tabeli 3, aby uzupełnić wymaganą objętość. Wykonać ten krok na lodzie i przechowywać mieszaninę enzymów w temperaturze -20 °C.
  4. Matryca RNA
    1. Ponownie zawiesić syntetyczne RNA SARS-CoV-2, grypy A H1N1, grypy A H3N2, grypy B i MERS-CoV oddzielnie w 100 μl 1x buforu Tris-EDTA (10 mM Tri-Cl i 1 mM EDTA (pH 8,0), aby uzyskać zapas 1 x 106 kopii RNA/μL.
    2. Mieszać syntetyczne RNA do RT-qPCR w następujących konfiguracjach: 1) SARS-CoV-2, grypa A i grypa B, dodając 5 μl każdego zapasu wirusa do objętości 50 μl, aby uzyskać 1 x 105 kopii RNA/μl; 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV, dodając 5 μl każdego zapasu wirusa do objętości 50 μL, aby uzyskać 1 x 105 kopii RNA/μL. Wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia każdej mieszaniny syntetycznego RNA w zakresie od 1 x 10 5kopii RNA/μL do 10 kopii RNA/μL.
      UWAGA: Upewnij się, że używasz lodowatej wody wolnej od DNaz/RNaz do przygotowania seryjnego rozcieńczania szablonów.

4. Własny multipleksowany test RT-qPCR na SARS-CoV-2, grypę A, grypę B i SARS-CoV-2, MERS-CoV

UWAGA: Zdezynfekuj powierzchnie stacji roboczej i użyj szablonu płytki 96-dołkowej, aby zaplanować układ płytki PCR.

  1. Przygotowanie płytki 96-dołkowej
    1. Rozmrozić 2x mieszankę bufora i podkładu. Trzymaj mieszankę enzymów na lodzie.
    2. Do każdej studzienki dodaj 10 μl 2x mieszaniny buforowej, 1,5 μl mieszanki starterów, 1 μl mieszanki enzymatycznej, 6,5 μl wody wolnej od DNazy/RNaz i 1 μl odpowiedniej mieszaniny RNA, którą należy przetestować. Ostateczna objętość w każdym studzience wynosi 20 μl. Zapoznaj się z przygotowanym układem, aby uzyskać pomoc w tym kroku.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie mieszanki wzorcowej w oparciu o liczbę reakcji zawierających wszystkie odczynniki z wyjątkiem próbki RNA, aby uniknąć błędu pipetowania. Ponadto wykonuj reakcje w dwóch lub trzech egzemplarzach, aby uniknąć błędów technicznych.
    3. Uszczelnij płytkę samoprzylepną uszczelką PCR i krótko odwiruj przez 1 minutę, aby zebrać cały płyn na dnie płytki. Upewnij się, że każda studzienka ma taką samą objętość cieczy i jest wolna od pęcherzyków przed przeniesieniem próbek do maszyny qPCR.
      UWAGA: Wszystkie reakcje PCR muszą być ustawione na lodzie.
  2. Program PCR
    1. Otwórz program maszyny qPCR w czasie rzeczywistym i wybierz następujące właściwości eksperymentalne:
      Typ bloku: Szybki 96-dołkowy (0,1 ml)
      Konfiguracja eksperymentu: Krzywa standardowa
      Odczynniki: Odczynniki TaqMan
      Właściwości uruchamiania: Standardowa.
    2. Zdefiniować wszystkie docelowe geny i ich barwnik reporterowy, jak przedstawiono w Tabeli 7. Ponadto należy zdefiniować nazwy próbek dla każdej badanej reakcji, aby ułatwić analizę krzywych amplifikacji.
    3. Przypisz cele i próbki do układu płytki programu na podstawie płytki 96-dołkowej.
    4. Ustaw następujący program cyklu w aparacie do PCR w następujący sposób:
      55 °C przez 10 min
      40 cykli: 94 °C przez 1 min
      94 °C dla 10 s
      68 °C dla 10 s
      68 °C przez 20 s; tutaj nabywają fluorescencję.
    5. Przenieś płytkę do maszyny qPCR w czasie rzeczywistym i umieść ją w uchwycie, zapewniając prawidłową orientację płytki i rozpocznij przebieg.
    6. Wybierz lokalizację pliku, aby zapisać dane eksperymentalne.
  3. analiza danych
    1. Konieczne jest najpierw zbadanie wykresów amplifikacji wytworzonych przez program qPCR. Przeanalizuj granicę wykrywalności, aby ocenić minimalne stężenie RNA, które można wykryć.
    2. Wykreślić logarytm liczby kopii RNA na osi x i odpowiadającą jej średnią wartość Ct na osi y, aby ocenić czułość testu. Nachylenie i R2 wskazują na niezawodność i skuteczność reakcji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach nastąpił znaczący postęp w podejściu diagnostycznym do wykrywania powszechnych wirusów układu oddechowego za pomocą metod PCR21,22,23,24,25. Jednak pomimo tych postępów, podejście multipleksowane, które pozwala na wykrycie wielu wirusów w jednym teście, nie zostało szeroko wdrożone, szczególnie na platformie RT-qPCR. Metoda ta została z powo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

System opieki zdrowotnej na całym świecie jest poważnie obciążony ekonomicznie ze względu na wysokie wskaźniki zakażeń i śmiertelności spowodowane rozprzestrzenianiem się powszechnych wirusów układu oddechowego, takich jak SARS-CoV-2, grypa A/B i warianty MERS-CoV 12,19,20. Kierując się poczuciem odpowiedzialności za złagodzenie tego obciążenia, zdaliśmy sobie sprawę z potrzeby szybkiego, precyzyjnego i dostępnego testu diagnost...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Nauki i Technologii Króla Abdullaha poprzez podstawowe finansowanie i National Term Grand Challenge (NTGC) dla S.M.H.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m kubki filtracyjneThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS bufor do bieganiaNovexLC2675
6-dołkowe płytki do hodowli tkanekCorning353046
Siarczan amonuFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Kationowymiennik (HiTrap SP HP) 5 mlCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotyna, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Kompetentne komórki BacFisher Scientific10361012
Torba do dializy (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Ditiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Woda destylowana bez dnazy/rnazAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) kompetentne komórkiInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Bufor elucyjnyQiagen19086
ESF 921 pożywka do hodowli komórek owadów (pożywka dla komórek owadów)Systemyekspresji96-001-01
Roztwór FBSGibcoA38400-01
Fugene (odczynnik do transfekcji)PromegaE2311
GentamycynaFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazolSigma Aldrich56750-1Kg
Grypa A (H1N1) syntetyczne RNATwist Bioscience103001
Grypa A (H3N2)  syntetyczne RNATwist Bioscience103002
Grypa B syntetyczne RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycynaGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Pożywka bulionowaFisher ScientificBP1426-500
LizozymSigma AldrichL6876-10G
Chlorek magnezuSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV syntetyczne RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-dołkowe płytki reakcyjne z kodem kreskowym (0,1 ml)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Zestaw do miniprepuQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mlCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optyczne osłony adhezyjne (kompatybilne z PCR, inhibitory DNA/RNAZY/PCR FreeApplied Biosystems4311971
Chlorek potasubioodczynniki FisheraBP366-1
startery i sondy, zintegrowane technologie DNA, Inc.
Inhibitor proteazy Mini tabletki Bez EDTAThermo ScientificA32955
Marker białkowyFermentas26616
Maszyna RT-qPCR (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 syntetyczne RNATwist Bioscience102024
Komórki owadów Sf9GibcoA35243
Chlorek soduSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mlCytiva29401323
TetracyklinaIBI ScientificIB02200
Tris Base Biologia molekularna klasyPromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690
, , ,

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
  2. Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
  3. Huang, C., et al. Clinical features of patients infected with 2019 novel coronavirus in Wuhan, China. Lancet. 395 (10223), 497-506 (2020).
  4. Wu, F., et al. A new coronavirus associated with human respiratory disease in China. Nature. 579 (7798), 265-269 (2020).
  5. Yang, S., et al. Deep learning for detecting corona virus disease 2019 (COVID-19) on high-resolution computed tomography: a pilot study. Ann Transl Med. 8 (7), 450(2020).
  6. El Hassan, M., et al. A review on the transmission of COVID-19 based on cough/sneeze/breath flows. Eur Phys J Plus. 137 (1), 1(2022).
  7. World Health Organization. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2023).
  8. Kucharski, A. J., et al. Effectiveness of isolation, testing, contact tracing, and physical distancing on reducing transmission of SARS-CoV-2 in different settings: a mathematical modelling study. Lancet Infect Dis. 20 (10), 1151-1160 (2020).
  9. Reddy, K. P., et al. Cost-effectiveness of public health strategies for COVID-19 epidemic control in South Africa: a microsimulation modelling study. Lancet Glob Health. 9 (2), e120-e129 (2021).
  10. Cheng, H. Y., et al. Contact tracing assessment of COVID-19 transmission dynamics in Taiwan and risk at different exposure periods before and after symptom onset. JAMA Intern Med. 180 (9), 1156-1163 (2020).
  11. Kretzschmar, M. E., et al. Impact of delays on effectiveness of contact tracing strategies for COVID-19: a modelling study. Lancet Public Health. 5 (8), e452-e459 (2020).
  12. Krammer, F., et al. Influenza. Nat Rev Dis Primers. 4 (1), 3(2018).
  13. Yang, J., et al. Prevalence of comorbidities and its effects in patients infected with SARS-CoV-2: a systematic review and meta-analysis. Int J Infect Dis. 94, 91-95 (2020).
  14. Lansbury, L., Lim, B., Baskaran, V., Lim, W. S. Co-infections in people with COVID-19: a systematic review and meta-analysis. J Infect. 81 (2), 266-275 (2020).
  15. Zaki, A. M., van Boheemen, S., Bestebroer, T. M., Osterhaus, A. D., Fouchier, R. A. Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia. N Engl J Med. 367 (19), 1814-1820 (2012).
  16. Azhar, E. I., et al. Evidence for camel-to-human transmission of MERS coronavirus. N Engl J Med. 370 (26), 2499-2505 (2014).
  17. Ling, Y., Qu, R., Luo, Y. Clinical analysis of the first patient with imported Middle East respiratory syndrome in China. Zhonghua Wei Zhong Bing Ji Jiu Yi Xue. 27 (8), 630-634 (2015).
  18. Nazer, R. I. Outbreak of Middle East Respiratory Syndrome-Coronavirus causes high fatality after cardiac operations. Ann Thorac Surg. 104 (2), e127-e129 (2017).
  19. Huang, P., et al. A rapid and specific assay for the detection of MERS-CoV. Front Microbiol. 9, 1101(2018).
  20. Ezhilan, M., Suresh, I., Nesakumar, N. SARS-CoV, MERS-CoV and SARS-CoV-2: A diagnostic challenge. Measurement (Lond). 168, 108335(2021).
  21. Ulloa, S., et al. A simple method for SARS-CoV-2 detection by rRT-PCR without the use of a commercial RNA extraction kit. J Virol Methods. 285, 113960(2020).
  22. Kudo, E., et al. Detection of SARS-CoV-2 RNA by multiplex RT-qPCR. PLoS Biol. 18 (10), e3000867(2020).
  23. Norz, D., Hoffmann, A., Aepfelbacher, M., Pfefferle, S., Lutgehetmann, M. Clinical evaluation of a fully automated, laboratory-developed multiplex RT-PCR assay integrating dual-target SARS-CoV-2 and influenza A/B detection on a high-throughput platform. J Med Microbiol. 70 (2), 001295(2021).
  24. Yun, J., et al. Evaluation of three multiplex real-time reverse transcription PCR assays for simultaneous detection of SARS-CoV-2, Influenza A/B, and Respiratory Syncytial virus in nasopharyngeal swabs. J Korean Med Sci. 36 (48), e328(2021).
  25. Lu, X., et al. Real-time reverse transcription-PCR assay panel for Middle East respiratory syndrome coronavirus. J Clin Microbiol. 52 (1), 67-75 (2014).
  26. Broughton, J. P., et al. CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2. Nat Biotechnol. 38 (7), 870-874 (2020).
  27. Ali, Z., et al. iSCAN: An RT-LAMP-coupled CRISPR-Cas12 module for rapid, sensitive detection of SARS-CoV-2. Virus Res. 288, 198129(2020).
  28. Ali, Z., et al. Bio-SCAN: A CRISPR/dCas9-based lateral flow assay for rapid, specific, and sensitive detection of SARS-CoV-2. ACS Synth Biol. 11 (1), 406-419 (2022).
  29. Yoshimi, K., et al. CRISPR-Cas3-based diagnostics for SARS-CoV-2 and Influenza virus. iScience. 25 (2), 103830(2022).
  30. Chen, Z., et al. Rapid and sensitive detection of anti-SARS-CoV-2 IgG, using Lanthanide-doped nanoparticles-based lateral flow immunoassay. Anal Chem. 92 (10), 7226-7231 (2020).
  31. Kasetsirikul, S., et al. Detection of the SARS-CoV-2 humanized antibody with paper-based ELISA. Analyst. 145 (23), 7680-7686 (2020).
  32. Joung, J., et al. Detection of SARS-CoV-2 with SHERLOCK One-Pot testing. N Engl J Med. 383 (15), 1492-1494 (2020).
  33. Chen, Z., Wu, Q., Chen, J., Ni, X., Dai, J. A DNA aptamer based method for detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein. Virol Sin. 35 (3), 351-354 (2020).
  34. Jang, W. S., et al. Development of a multiplex Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) assay for on-site diagnosis of SARS CoV-2. PLoS One. 16 (3), e0248042(2021).
  35. McBride, R., Fielding, B. C. The role of Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS)-Coronavirus accessory proteins in virus pathogenesis. Viruses-Basel. 4 (11), 2902-2923 (2012).
  36. AlBalwi, M. A., et al. Evolving sequence mutations in the Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV). J Infection Public Health. 13 (10), 1544-1550 (2020).
  37. Takahashi, M., et al. Quick and easy assembly of a One-Step qRT-PCR Kit for COVID-19 diagnostics using In-House enzymes. ACS Omega. 6 (11), 7374-7386 (2021).
  38. Sambrook, J., Fritsch, E. R., Maniatis, T. Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.). , Cold Spring Harbor Laboratory Press. NY, USA. (1989).
  39. Simpson, R. J. SDS-PAGE of Proteins. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  40. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with Coomassie blue. CSH Protoc. 2007, (2007).
  41. Takumi Yano, J. M. L., et al. Expression of the thermostable Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase by silkworm-baculovirus expression system. J Asia-Pac Entomol. 22 (2), 453-457 (2019).
  42. van Kasteren, P. B., et al. Comparison of seven commercial RT-PCR diagnostic kits for COVID-19. J Clin Virol. 128, 104412(2020).
  43. Shu, B., et al. Multiplex Real-Time reverse transcription PCR for Influenza A virus, Influenza B virus, and Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2. Emerg Infect Dis. 27 (7), 1821-1830 (2021).
  44. Engelke, D. R., Krikos, A., Bruck, M. E., Ginsburg, D. Purification of Thermus aquaticus DNA polymerase expressed in Escherichia coli. Anal Biochem. 191 (2), 396-400 (1990).
  45. Pabbaraju, K., Wong, A. A., Ma, R., Zelyas, N., Tipples, G. A. Development and validation of a multiplex reverse transcriptase-PCR assay for simultaneous testing of Influenza A, Influenza B and SARS-CoV-2. J Virol Methods. 293, 114151(2020).
  46. Hirotsu, Y., et al. Analysis of COVID-19 and non-COVID-19 viruses, including Influenza viruses, to determine the influence of intensive preventive measures in Japan. J Clin Virol. 132, 104634(2020).
  47. Sellner, L. N., Coelen, R. J., Mackenzie, J. S. Reverse-Transcriptase inhibits Taq Polymerase-Activity. Nucleic Acids Res. 20 (7), 1487-1490 (1992).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Multiplexowa RT qPCRPCR w czasie rzeczywistymdetekcja SARS CoV 2detekcja grypy Adetekcja grypy Bdetekcja MERS CoVtest w kierunku wirus w oddechowychdetekcja wirusowego RNApolimeraza Taqp ytka 96 do kowa

Powiązane artykuły