Artykuł metodologiczny

Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego

2.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65824

⸱

10 listopada 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Institute of Biology, 2University of Nova Gorica

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół do badania szybkości inicjacji programowanej śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści po indukcji śmierci komórki.

Streszczenie

Odporność na nadwrażliwość (HR) jest skuteczną reakcją obronną, która może być określona przez geny odporności N. HR objawia się tworzeniem stref śmierci komórek na zaszczepionych liściach. W tym artykule przedstawiono protokół badania szybkości inicjacji śmierci komórki poprzez obrazowanie zaszczepionych liści w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego. Mikroskop cyfrowy umożliwia ciągły proces obrazowania w żądanych odstępach czasu, co pozwala na dokładne określenie szybkości inicjacji śmierci komórki z dokładnością do kilku minut, w przeciwieństwie do godzin w przypadku tradycyjnych metod. Obrazowanie za pomocą mikroskopu cyfrowego jest również niezależne od światła, dzięki czemu może być stosowane w dzień i w nocy bez zakłócania rytmu dobowego rośliny. Różne patosystemy powodujące rozwój programowanej śmierci komórki mogą być badane przy użyciu tego protokołu z niewielkimi modyfikacjami. Ogólnie rzecz biorąc, protokół umożliwia prostą, dokładną i niedrogą identyfikację wskaźnika inicjacji śmierci komórki.

Wprowadzenie

Ziemniak jest jedną z najczęściej uprawianych roślin spożywczych na świecie, na czwartym miejscu za ryżem, pszenicą i kukurydzą. Jednak na produkcję ziemniaków może mieć poważny wpływ wirus ziemniaka Y (PVY), który jest obecnie uważany za jego najważniejszy patogen wirusowy1,2. W roślinach ziemniaka odmiany cv. Przeciwnie, kilka szczepów PVY (w tym szczep PVY N-Wilga) wyzwala oporność wynikającą z odpowiedzi nadwrażliwości (HR), gdzie ograniczenie patogenu do miejsca infekcji objawia się zmianami nekrotycznymi na zaszczepionych liściach3. W tym patosystemie HR jest pośredniczony przez gen oporności na Ny-1, który jest zależny od temperatury, ponieważ rośliny uprawiane w niższych temperaturach skutecznie rozwijają zmiany nekrotyczne, podczas gdy u roślin uprawianych konstytutywnie w podwyższonej (28 °C) temperaturze poronienia oporności wykazuje się brakiem tworzenia zmian chorobowych i ogólnoustrojowym rozprzestrzenianiem się wirusa3,4. Po przeniesieniu roślin do niższej temperatury (22 °C) inicjowana jest śmierć komórki, którą można wykorzystać do śledzenia tempa inicjacji śmierci komórki poprzez obrazowanie zaszczepionych liści w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki.

Ten protokół demonstruje prostą metodę określania szybkości inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego. Dzięki obrazowaniu zaszczepionych liści po przeniesieniu rośliny z 28 °C do 22 °C, mikroskop cyfrowy umożliwia ciągłą obserwację liścia w żądanych odstępach czasu. W przeciwieństwie do stosowania innych metod (na przykład mikroskopii konfokalnej lub obserwacji powstawania zmian gołym okiem), pozwala to na określenie dokładnego czasu powstawania zmiany, a tym samym szybkości inicjacji śmierci komórki z dokładnością do minut, a nie godzin w wyżej wymienionych metodach5,6. Korzystanie z mikroskopu cyfrowego jest również niezależne od światła i dlatego może być używane zarówno w dzień, jak i w nocy. Protokół ten może być również wykorzystany do identyfikacji składników zaangażowanych w inicjację śmierci komórki lub do określenia wpływu różnych składników na wskaźnik inicjacji śmierci komórki, jeśli używane rośliny są transgeniczne i mają zmienione poziomy składników będących przedmiotem zainteresowania.

Protokół

UWAGA: Sekcje 1 i 2 opisują zmodyfikowany protokół przygotowania materiału roślinnego oparty na metodach opisanych przez Lukan et al.7. W szczególności dokonano pewnych modyfikacji kontrolowanych warunków środowiskowych i preparatu inokulum.

1. Uprawa ziemniaków

  1. Uprawiaj zdrowe ziemniaki cv. Rośliny Rywal w kulturze tkankowej węzła łodygi8.
  2. Po 6-8 tygodniach wytnij dziesięć eksplantatów o długości 1 cm zawierających węzły z roślin ziemniaka na sterylnym papierze w sterylnych warunkach za pomocą sterylnej pęsety i noża skalpela.
  3. Przenieś je do plastikowych pudełek z pożywką Murashige i Skoog (MS30) (Rysunek 1A) i hoduj je w kontrolowanych warunkach środowiskowych (22 °C w świetle i 19 °C w ciemności przy promieniowaniu 250 μE lub μmol/m2/s i 16-godzinnym fotoperiodze, przy wilgotności względnej 55% ± 5%).
  4. Przenieś je do gleby 2 tygodnie po mikrorozmnażaniu.
    1. Napełnij doniczki (r = 10 cm) ziemią. Palcem utwórz otwór o głębokości 3-4 cm w glebie na środku doniczki, napełnij otwór wodą i poczekaj, aż się wchłonie.
    2. Umieść jedną roślinę na doniczkę w dołku, pozostawiając liście nad powierzchnią. Delikatnie przykryj korzenie ziemią (Rysunek 1B).
      UWAGA: Niektóre rośliny mogą nie mieć korzeni. Należy wykluczyć te rośliny z analizy.
  5. Uprawiaj rośliny w glebie w komorze wzrostowej w kontrolowanych warunkach środowiskowych (22 °C w świetle i 19 °C w ciemności, przy wilgotności względnej 55% ± 5%, przy promieniowaniu 250 μmol/m2/s i 16-godzinnym fotoperiodzie).
  6. Po 3-4 tygodniach rośliny są gotowe. Użyj tych roślin do zaszczepienia.
    UWAGA: Rośliny powinny mieć co najmniej 3-4 w pełni rozwinięte liście z widocznymi listkami (Rysunek 1C). Powinny wyglądać zdrowo, bez widocznych objawów (żółte lub brązowe liście), które można pomylić ze zmianami wywołanymi przez PVY. Aby osiągnąć porównywalne wyniki, rośliny powinny być inokulowane w tym samym czasie (np. o 9 rano) we wszystkich eksperymentach, aby uniknąć możliwego wpływu rytmu okołodobowego na odpowiedź immunologiczną roślin i tworzenie się zmian chorobowych9,10,11.

2. Przygotowanie inokulum i inokulacja ziemniaków

  1. Zaszczepić roślinę szczepem PVY N-Wilga (PVYN-Wi; nr akcesyjny. EF558545) Inokulum zgodnie z poniższymi informacjami.
    UWAGA: Więcej roślin można zaszczepić równolegle, jeśli dostępny jest więcej niż jeden mikroskop cyfrowy. Rośliny powinny mieć co najmniej trzy w pełni rozwinięte liście przed inokulacją (Rysunek 1C). PVYN-Wi jest rozmnażany i utrzymywany w ziemniaku odmiany Pentland.
    1. Przygotować bufor fosforanowy, uzupełniony dietylotitiokarbaminianem sodu (DIECA), do inokulacji: Wymieszać 1,3 ml 0,2 M NaH2PO4, 8,7 ml 0,2 M Na2HPO4 i 0,225 g DIECA. Uzupełnić objętość do 100 ml za pomocą ddH20. Doprowadzić pH do 7,6, dodając 1 M roztwór NaOH lub 1 M HCl.
    2. Zebrać 6-8 tygodniowe ziemniaki zakażone PVYN-Wi odmiany Pentland z hodowli tkankowych w workach ekstrakcyjnych z siatką filtracyjną (0,5 g na 6 roślin) i dodać bufor fosforanowy uzupełniony DIECA (4x masa materiału roślinnego, stosunek masy do objętości). Użyj homogenizatora ręcznego przez 1-2 minuty, aby uzyskać jednorodny roztwór.
    3. Pierwsze trzy dolne, w pełni rozwinięte liście 3-4 tygodniowych roślin ziemniaka (od kroku 1.6) lekko oprószyć proszkiem karborundowym.
      UWAGA: Dostosuj ilość proszku karborundowego. Zbyt duża ilość może spowodować szkody, podczas gdy zbyt mała może skutkować nieskuteczną infekcją. Optymalnie stosuje się 0,1 mg/cm proszku karborundowego, co daje około 1,5 mg proszku na liść średniej wielkości (około 15cm2).
    4. Delikatnie natrzyj liście inokulum (~100 μL na liść). Po 10 minutach dokładnie umyj liście wodą z kranu.
      1. Uważaj, aby nie uszkodzić liści. Nie należy przekraczać czasu inkubacji. Dostosuj ilość inokulum w zależności od wielkości liścia - 6,5 μL/cm, co daje około 100 μL na liść średniej wielkości (około 15 cm2).
    5. Przenieś rośliny do komory wzrostowej i hoduj je w kontrolowanych warunkach środowiskowych (28 °C w świetle i 28 °C w ciemności przy wilgotności względnej 55% ± 5%, przy promieniowaniu 250 μmol/m2/s i 16 godzinnym fotoperiodze) przez 3 dni.

3. Przygotowanie roślin i użycie mikroskopu cyfrowego do rejestrowania rozwoju zmian

  1. Przenieść zaszczepione rośliny z komory wzrostowej utrzymywanej w temperaturze 28 °C do komory wzrostowej w temperaturze 22 °C 3 dni po inokulacji, w innych warunkach opisanych w kroku 1.5.
  2. Wybierz roślinę do obserwacji. Unieruchomić drugi zaszczepiony liść za pomocą taśmy (Ryc. 1D). Upewnij się, że żądany liść jest całkowicie unieruchomiony przed rozpoczęciem obrazowania (Rysunek 1D).
  3. Zainstaluj aplikację do przechwytywania obrazu na laptopie. Podłącz mikroskop cyfrowy do komputera. Otwórz oprogramowanie.
    UWAGA: Upewnij się, że roślina, mikroskop cyfrowy i laptop są umieszczone na półce w pobliżu gniazdka, aby podłączyć komputer. Decyzja o wyborze liści, które mają być monitorowane, może zależeć od badanego zagadnienia biologicznego, np. rodzaju procesu, który prowadzi do powstania ograniczonej zaprogramowanej śmierci komórki.
  4. Ustaw mikroskop nad unieruchomionym skrzydłem. Ustaw ostrość za pomocą pokrętła na mikroskopie cyfrowym (pokazanym na Rysunek 1E).
    1. Upewnij się, że linia wzroku jest jak najszersza, aby zwiększyć szanse na uchwycenie powstawania zmiany, ale nadal wystarczająco powiększona, aby dostrzec wygląd zmiany (zazwyczaj stosuje się powiększenie 25x).
  5. Skonfiguruj ustawienia aparatu. Kliknij przycisk Ustawienia w prawym górnym rogu obrazu (Rysunek 2A, zakreślony część 1) i dostosuj ustawienia kamery: Jasność (60-70), Kontrast (10-15), Odcień (0), Balans bieli, Nasycenie (45-50), Ostrość (0), Gamma (5) (Rysunek 2B). Ustawienia użyte w tym badaniu były następujące: Jasność (64), Kontrast (14), Odcień (0 ), Nasycenie (47), Ostrość (0), Gamma (5).
    UWAGA: Ustawienia aparatu należy dostosować do światła zewnętrznego, aby zapewnić najlepszą jakość obrazu. Ustawienia można dostosować do warunków użytkownika w komorze wzrostowej.
  6. Ustaw ustawienia przechwytywania obrazu, klikając ikonę przechwytywania obrazu (Rysunek 2C, zakreślony część 2). Kliknij na przycisk Time-Lapsed Video i ustaw Image Capture co 15 minut przez 24 godziny (Rysunek 2C).
    UWAGA: Interwał między wykonanymi zdjęciami i czas trwania obrazowania są w pełni elastyczne i można je dostosować do potrzeb eksperymentu. W czasie pomiędzy wykonaniem obrazu dioda LED jest wyłączana. Dioda LED jest automatycznie włączana podczas robienia zdjęć.
  7. Rozpocznij przechwytywanie obrazu, klikając przycisk START (Rysunek 2C).
    UWAGA: Po przeniesieniu z temperatury 28 °C do 22 °C rośliny powinny zacząć rozwijać zmiany chorobowe w ciągu 24 godzin. Jeśli nie, może to być oznaką nieskutecznego szczepienia. Dostosuj ilość proszku karborundowego, upewnij się, że czas inkubacji inokulum na liściach był prawidłowy i określ obfitość wirusa w inokulum za pomocą qPCR.
  8. Aby zapisać obrazy, zaznacz wszystkie obrazy i kliknij ikonę Zapisz (Rysunek 2B, zakreślona część 3). Ustaw opcje eksportu. Ustaw DPI na maksimum (300) (Rysunek 2D). Po zapisaniu usuń wszystkie zdjęcia w programie.
  9. Do analizy obrazu wystarczy dowolny program do przeglądania/edycji obrazu. Korzystanie z bezpłatnego oprogramowania do edycji obrazów, ImageJ, wyjaśniono poniżej.
    1. Zaimportuj sekwencję czasową obrazów z pojedynczego pola widzenia (w lewym górnym rogu kliknij Plik, wybierz Importuj, a następnie Sekwencja obrazów). Wklej ścieżkę do katalogu z zapisanymi zdjęciami i naciśnij przycisk OK, aby rozpocząć konwersję.
    2. Po konwersji oprogramowanie automatycznie otwiera wewnętrzny odtwarzacz wideo, pokazując końcowy film. Wyeksportuj plik wideo, klikając opcję Plik > Zapisz jako i wybierając Format AVI. Otwiera się małe okienko. Ustaw liczbę klatek na sekundę na 0.3 kl./s i naciśnij OK, aby zapisać wideo jako plik wideo AVI.
      UWAGA: Czas rozwoju zmiany można również określić, ręcznie sprawdzając wszystkie obrazy i znajdując obraz, na którym pojawia się zmiana.

Wyniki

Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół badania inicjacji śmierci komórek poprzez powstawanie zmian chorobowych u ziemniaka cv. Rywal z wykorzystaniem mikroskopu cyfrowego. Pozwala to na określenie dokładnego czasu rozpoczęcia programowanej śmierci komórek.

Rośliny, które rozwinęły korzenie, przeniesiono do gleby 2 tygodnie po mikrorozmnażaniu ziemniaka cv. Rywal (Rycina 1A,B). Po 3-4 tygodniach wzrostu w opisanych warunkach, do dalszych analiz wykorzystano rośliny posiadające co najmniej 3-4 w pełni rozwinięte liście z widocznymi listkami, które wyglądały na zdrowe i nie wykazywały oznak opadania (Rycina 1C). Przy użyciu mikroskopu cyfrowego, zgodnie z opisem w niniejszym protokole, obserwowano ten sam obszar na inokulowanym liściu w odstępach 15-minutowych, określając moment wystąpienia oraz tempo powiększania się zmiany chorobowej w czasie (Rycina 3). Zmiana chorobowa pojawiła się po 15 h 30 min (Rycina 3).

Etapy wzrostu rośliny; układ do mikrorozmnażania (A), sadzonka w doniczce (B), pomiar wzrostu (C), obserwacja łodygi (D), analiza mikroskopowa (E).
Rycina 1: Przygotowanie rośliny do analizy za pomocą mikroskopu cyfrowego. (A) Plastikowe pudełko z pożywką MS 30 i eksplantami rośliny ziemniaka cv. Rywal zawierającymi węzły. (B) Roślina ziemniaka cv. Rywal w glebie (2 tygodnie po mikrorozmnażaniu). (C) Roślina ziemniaka cv. Rywal gotowa do inokulacji (4 tygodnie po przesadzeniu do gleby), posiadająca co najmniej trzy w pełni rozwinięte liście. (D) Drugi inokulowany liść (strzałka) rośliny ziemniaka cv. Rywal, ustawiony i unieruchomiony (strzałka) za pomocą taśmy. (E) Roślina ustawiona pod mikroskopem cyfrowym; strzałka wskazuje pokrętło służące do ustawiania ostrości. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Konfiguracja analizy mikroskopowej z regulacją kamery, siatką obrazu, ustawieniami rejestracji oraz opcjami eksportu.
Rycina 2Ustawienia oprogramowania cyfrowego do rejestrowania rozwoju zmian chorobowych. (A) Interfejs oprogramowania – okręgiem czerwonym zaznaczono opcje przycisku dla (1) kamera ustawienia, (2) obraz utrwalenie ustawieniaoraz (3) zapisywanie obrazy. (B) Okno z ustawieniami kamery, które otwiera się po kliknięciu w (1) w panelu A. Jasność, Kontrast, Nasycenie, Ostrośći Gamma powinny zostać odpowiednio dostosowane. (C) Okno z ustawieniami przechwytywania obrazu, które otwiera się po kliknięciu elementu (2) wskazanego na panelu A. (D) Okno z ustawieniami zapisywania obrazów, które otwiera się po kliknięciu elementu (3) wskazanego na panelu A. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Powierzchnia liścia pod mikroskopem; postęp uszkodzeń w 4 etapach oznaczonych A-D czerwonymi strzałkami.
Rysunek 3: Tworzenie się zmian na zaszczepionym liściu obserwowane pod mikroskopem cyfrowym. Obrazy środkowej części liścia ziemniaka zaszczepionego PVY przy powiększeniu 23,6x obserwowane pod mikroskopem cyfrowym, wykonane w odstępach 5 min. Zaszczepione rośliny przetrzymywano w temperaturze 28 °C przez 3 dni, a trzeciego dnia o godzinie 7:00 rozpoczęto obserwacje mikroskopem cyfrowym w temperaturze 22 °C. (A) O godzinie 21:02 zmiana nie jest jeszcze widoczna, (B) 90 min później, o 22:32, zmiana jest widoczna. (C) Ekspansję zmiany zaobserwowano o 01:02 oraz (D) o 07:32 następnego ranka. Eksperyment powtórzono dwukrotnie, a zmiany wystąpiły odpowiednio 8 h 15 min oraz 12 h po zainicjowaniu śmierci komórek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Zademonstrowany protokół pozwala użytkownikowi na dokładne określenie wskaźnika inicjacji śmierci komórki poprzez ciągłe obrazowanie zaszczepionych liści w czasie między inicjacją śmierci komórki a pojawieniem się śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego. Mimo że istnieje wiele sposobów monitorowania zmian chorobowych i występowania chorób roślin 12,13,14,15, protokół ten ma tę zaletę, że pomiar jest niezależny od światła bez zakłócania rytmu dobowego rośliny, ponieważ światło jest wyłączane między pomiarami.

Po zaszczepieniu rośliny powinny rosnąć w temperaturze 28 °C przez 3 dni. Gen oporności Ny-1 , który indukuje reakcję nadwrażliwości, jest zależny od temperatury, a u roślin uprawianych w wyższych temperaturach prowadzi do poronienia oporności, co objawia się brakiem tworzenia zmian chorobowych i ogólnoustrojowym rozprzestrzenianiem się wirusa3. Po przeniesieniu roślin do temperatury 22 °C inicjowana jest śmierć komórki, dlatego w celu uzyskania dokładnych wyników obserwację za pomocą mikroskopu cyfrowego należy rozpocząć jak najszybciej po tym przeniesieniu. Kolejnym kluczowym krokiem w przygotowaniu rośliny do obrazowania jest unieruchomienie liścia (ryc. 1D), ponieważ roślina będzie nadal rosła podczas obrazowania, co może spowodować przesunięcie obserwowanego liścia poza ostrość lub takie ustawienie nie przyniesie pożądanych rezultatów.

Jeśli opisany protokół jest stosowany na roślinach transgenicznych ze zmienionymi składnikami będącymi przedmiotem zainteresowania, co do których przypuszczalnie bierze się udział w inicjacji śmierci komórki, protokół umożliwia użytkownikowi określenie, czy obniżony poziom badanego składnika wpływa na szybkość inicjacji śmierci komórki. W ten sposób składniki zaangażowane w inicjację śmierci komórki można zidentyfikować w patosystemach, w których zachodzi zaprogramowana śmierć komórki, przy użyciu tego protokołu. Innymi metodami identyfikacji tych składników są na przykład analiza transkryptomiczna, taka jak sekwencja RNA lub różne formy mikroskopii, które mogą być kosztowne i czasochłonne16. Metoda opisana w tym protokole pozwala na łatwą i niedrogą identyfikację składników zaangażowanych w inicjację śmierci komórki poprzez obserwację różnic w wskaźnikach inicjacji śmierci komórki między roślinami transgenicznymi i kontrolnymi. Optymalnie, w takiej konfiguracji, należy użyć dwóch kamer cyfrowych, ponieważ roślina transgeniczna powinna być analizowana równolegle z rośliną kontrolną w ramach tego samego eksperymentu.

W tym protokole zastosowano szczep PVY N-Wilga; jednak inne szczepy tego wirusa, na przykład PVY oznaczone GFP (PVY-N605(123)-GFP)7, mogą być również stosowane. Co więcej, inne patosystemy, które powodują rozwój programowanej śmierci komórki, mogą być badane przy użyciu tego protokołu z niewielkimi modyfikacjami.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Barbarze Jaklič za pomoc techniczną. Badania te były wspierane finansowo przez Słoweńską Agencję ds. Badań i Innowacji (podstawowe finansowanie badań nr P4-0165 oraz projekt Z4-3217: Deciphering redox-related signaling interconnectedness in potato resistance against viruses).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Palnik alkoholowyMikro+PoloSH-234002455Do sterylizacji pęsetą i skalpelem
Autoklaw A-21 CAVKambifigure-materials-1N/A
Bacto AgarBecton, Dickinson and Company214010
Proszek karborundowyVWR Chemicals22505297
DinoCapture 2.0 Oprogramowanie Dino-LiteVersion 2.0do mikroskopu cyfrowego
Mikroskop cyfrowy Dino-Lite Edge AM7915MZTLAnMo Electronics CorporationAM7915MZTL
Etanol, 70%Stella TechP94000Do sterylizacji pęsetą i skalpelem
Worki ekstrakcyjneBioreba420100
Komora wzrostowa FS-WIPhoton Systems InsturmentsN/A
Homogenizatorręczny Bioreba400010
Hawita Special SubstrateHAWITA Gruppe2000000071701Gotowe do użycia podłoże, wykonane z torfu (H4-H6 i H6-H8)
Kwas solny (HCl)Merck109057
Taśma etykietowaSigmaL8144-5EA
Laptop z zainstalowanym DinoCapture 2.0 Komputer HPZ2V77EA#BEDmusi być przenośny, ponieważ eksperyment bierze udział w komorze wzrostu
Murashige i Skoog mediumDuchefa BiochemieM02220100
Na2HPO4Emsure1065860500
NaH2PO4Emsure1064700250
Pasteur pipeta  0,5 ml
Mettler ToledoML1601
Pudełka plastikowe Cvetlice DornigVCG10,5Promień = 10,5 cm
Doniczki plastikowe Współpracownicy laboratoriumDIS40003Promień = 11,5 cm (góra), Promień = 9,8 cm (dół)
SacharozaKemika d.d.
Dietyloditiokarbaminian sodu (DIECA)Sigma-Aldeich228680Dityloditiokarbaminian sodu trójwodny, odczynnik ACS
Wodorotlenek sodu (NaOH)Merck106462
Sterylne ostrza chirurgicznePęseta Braun
BraunBD033R
pH-metr marki 21500209 1800408 4511733633

Bibliografia

  1. Karasev, A. V., Gray, S. M. Continuous and emerging challenges of potato virus y in potato. Annual Review of Phytopathology. 51, 571-586 (2013).
  2. Quenouille, J., Vassilakos, N., Moury, B. Potato virus Y: A major crop pathogen that has provided major insights into the evolution of viral pathogenicity. Molecular Plant Pathology. 14 (5), 439-452 (2013).
  3. Szajko, K., et al. The novel gene Ny-1 on potato chromosome IX confers hypersensitive resistance to Potato virus Y and is an alternative to Ry genes in potato breeding for PVY resistance. Theoretical and Applied Genetics. 116 (2), 297-303 (2008).
  4. Szajko, K., Strzelczyk-Żyta, D., Marczewski, W. Ny-1 and Ny-2 genes conferring hypersensitive response to potato virus Y (PVY) in cultivated potatoes: Mapping and marker-assisted selection validation for PVY resistance in potato breeding. Molecular Breeding. 34 (1), 267-271 (2014).
  5. Lukan, T., et al. Cell death is not sufficient for the restriction of potato virus Y spread in hypersensitive response-conferred resistance in potato. Frontiers in Plant Science. 9, 168(2018).
  6. Baebler, Š, et al. Salicylic acid is an indispensable component of the Ny-1 resistance-gene-mediated response against Potato virus y infection in potato. Journal of Experimental Botany. 65 (4), 1095-1109 (2014).
  7. Lukan, T., Coll, A., Baebler, Š, Gruden, K. Analysis of virus spread around the cell death zone at spatiotemporal resolution using confocal microscopy. Methods in Molecular Biology. 2447, 261-270 (2022).
  8. Vinterhalter, D., Dragiüeviü, I., Vinterhalter, B. Potato in vitro culture techniques and biotechnology. Fruit, Vegetable and Cereal Science and Biotechnology. 2, Special Issue 16-45 (2008).
  9. Wang, W., et al. Timing of plant immune responses by a central circadian regulator). Nature. 470, 110-115 (2011).
  10. Roden, L. C., Ingle, R. A. Lights, rhythms, infection: The role of light and the circadian clock in determining the outcome of plant-pathogen interactions. Plant Cell. 21 (9), 2546-2552 (2009).
  11. Srivastava, D., et al. Role of circadian rhythm in plant system: An update from development to stress response. Environmental and Experimental Botany. 162, 256-271 (2019).
  12. Mulaosmanovic, E., et al. High-throughput method for detection and quantification of lesions on leaf scale based on trypan blue staining and digital image analysis. Plant Methods. 16, 62(2020).
  13. Martinelli, F., et al. Advanced methods of plant disease detection. A review. Agronomy for Sustainable Development. 35, 1-25 (2015).
  14. Ali, M., Bachik, N., Muhadi, N. A., Tuan Yusof, T. N., Gomes, C. Non-destructive techniques of detecting plant diseases: A review. Physiological and Molecular Plant Pathology. 108, 101426(2019).
  15. Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. A review of advanced techniques for detecting plant diseases. Computers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).
  16. Rowarth, N. M., et al. RNA-Seq analysis reveals potential regulators of programmed cell death and leaf remodelling in lace plant (Aponogeton madagascariensis). BMC Plant Biology. 21 (1), 375(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Odpowiedź nadwrażliwaprogramowana śmierć komórkirośliny ziemniakaobrazowanie poklatkowetworzenie się nekrozzaszczepione liścieanaliza w programie Image Jkomora wzrostowa
Badanie inicjacji śmierci komórki za pomocą mikroskopu cyfrowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.