Artykuł metodologiczny

Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej

2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65828

⸱

25 sierpnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology, Faculty of Medicine, University of Ottawa, 2Department of Biochemistry, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje konfigurację do krystalizacji transportera steroli ABCG5/G8. ABCG5/G8 jest odtwarzany w postaci wodoroceli w celu krystalizacji w kropli wiszącej. Protokół nie wymaga specjalistycznych materiałów ani podłoży, dzięki czemu jest dostępny i łatwy do adaptacji w każdym laboratorium w celu określenia struktury białka za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Streszczenie

transportery kasetowe wiążące ATP (ABC) stanowią białka błonowe osadzone w lipidach. Ekstrakcja tych białek błonowych z dwuwarstwy lipidowej do środowiska wodnego odbywa się zwykle przy użyciu detergentów. Detergenty te dezintegrują dwuwarstwę lipidową i rozpuszczają białka. Wewnętrzne siedlisko białek błonowych w dwuwarstwie lipidowej stanowi wyzwanie w utrzymaniu ich stabilności i jednorodności w roztworze do charakterystyki strukturalnej. Wodorokomórki, które stanowią mieszankę fosfolipidów długo- i krótkołańcuchowych oraz detergentów, odtwarzają naturalną strukturę lipidową. Wykorzystanie wodorokomórek lipidowych i detergentów służy jako odpowiedni system modelowy do otrzymywania wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych, w szczególności do określania struktury białek błonowych o wysokiej rozdzielczości. Dzięki tym syntetycznym mikrośrodowiskom białka błonowe zachowują swoją natywną konformację i funkcjonalność, ułatwiając tworzenie trójwymiarowych kryształów. W tym podejściu rozpuszczony w detergentach heterodimeryczny ABCG5/G8 został ponownie zintegrowany z bicelami DMPC/CHAPSO, uzupełnionymi cholesterolem. Układ ten został zastosowany w eksperymentalnej procedurze dyfuzji parowej do krystalizacji białek.

Wprowadzenie

Transportery kasety wiążącej ATP (ABC) stanowią nadrodzinę białek błonowych odpowiedzialnych za różnorodne, zależne od ATP procesy transportu przez błony biologiczne1,2,3,4,5. Te białka transportowe są zaangażowane w choroby sercowo-naczyniowe i odgrywają znaczącą rolę w ułatwianiu odpływu cholesterolu do żółci w celu późniejszego wydalenia w wątrobie. W związku z tym metabolizm i równowaga cholesterolu cieszą się dużym zainteresowaniem na przestrzeni lat6. Specyficzny mechanizm biorący udział w eliminacji cholesterolu i innych steroli z organizmu obejmuje członków ludzkiej podrodziny ABCG, w szczególności heterodimerycznego ABCG5/G87,8,9,10. Mutacje w którymkolwiek z tych genów zaburzają heterodimer, prowadząc do utraty funkcji i powodując sitosterolemię, zaburzenie wpływające na handel sterolami11,12,13. Biorąc pod uwagę znaczenie choroby i ich rolę w promowaniu wypływu cholesterolu, transportery steroli przyciągnęły znaczną uwagę. Niemniej jednak zawiłe szczegóły ich mechanizmu molekularnego i selektywności substratowej pozostają w dużej mierze nieujawnione. Tak więc wyjaśnienie struktury krystalicznej ABCG5 / G8 jest kluczowym krokiem w kierunku zrozumienia mechanizmów i dalszych funkcji w transporcie cholesterolu.

Białka błonowe wymagają zakotwiczenia w błonach, aby się składać i funkcjonować poprawnie. W związku z tym ekstrakcja białek błonowych z ich naturalnego środowiska często powoduje niestabilność białek, nieprawidłowe fałdowanie i utratę funkcji14,15. Wyzwania te podkreślają główne przeszkody, z jakimi borykają się krystalizacja białek błonowych. Jednak rekonstytucja białek w syntetyczne dwuwarstwy detergentowe, takie jak bicele, pojawiła się jako rozwiązanie tego problemu, umożliwiając utrzymanie białek błonowych w natywnym środowisku dwuwarstwowym16. Wodorocele to zespoły syntetycznych fosfolipidów i detergentów zawieszonych i rozpuszczonych w wodzie. Warto zauważyć, że przyjmują dwuwarstwową strukturę, która naśladuje błony biologiczne16,17,18. Dwucele mogą przechodzić między fazami ciekłymi i żelowymi w zależności od temperatury i lepkości. Krystalizacja Bicelle wykorzystuje małe dwuwarstwowe krążki i niską lepkość w obniżonych temperaturach, ułatwiając dokładne mieszanie białek i roztworów bicelle. Wielkość biceli zależy od stosunku detergentu do lipidów podczas przygotowania19,20. Do najbardziej rozpowszechnionych detergentów do tworzenia bicelli należą: 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-2-hydroksy-1-propanosulfonian (CHAPSO), wraz z 3-[(3-cholamidopropylo)dimetyloamonio]-1-propanosulfonianem (CHAPS) i 1,2-ditridekanoilo-sn-glicerol-3-fosfocholiną (DHPC)21. Detergenty te są stosowane w połączeniu z lipidami, takimi jak di-mirystoilofosfatydylocholina (DMPC) i 1-palmitoilo-2-oleoilo-fosfatydylocholina (POPC). Co więcej, ostatnie badania wykazały pełną funkcjonalność białek błonowych w obrębie biceli w warunkach fizjologicznych. Na przykład Lee i jego współpracownicy z powodzeniem skrystalizowali i opisali strukturę krystaliczną ABCG5/ABCG8 w oparciu o dwuwarstwę lipidową22,23. W procesie krystalizacji mieszaniny białkowo-bikielowe mogą być umieszczane przy użyciu standardowego sprzętu, w tym wysokowydajnych robotów krystalizacyjnych24. Możliwość wykorzystania biceli zależy jednak od termostabilności białek ze względu na warunki krystalizacji w wyższych temperaturach. Niemniej jednak, w porównaniu z innymi technikami, wymagane warunki krystalizacji dla białek błonowych na ogół pozostają łagodne, obejmując niskie stężenia strącacza, soli i buforu. To sprawia, że zarówno mieszaniny białko-bicell, jak i dyfuzja parowa są skutecznymi i łatwymi do wdrożenia narzędziami do badań strukturalnych białek błonowych.

Ten protokół przedstawia podstawowe kroki w przygotowaniu białka i krystalizacji bicelle do określenia struktury krystalicznej promieniowania rentgenowskiego ABCG5/G8 w wysokiej rozdzielczości (Rysunek 1).

Protokół

1. Klonowanie i ekspresja białek

  1. Sklonuj ludzki gen ABCG5/G8 do drożdży Pichia pastoris zgodnie z poprzednimi protokołami25,26. Krótko mówiąc, wyprowadź wektory ekspresji pSGP18 i pLIC z pPICZB. Dodaj znacznik, który koduje miejsce proteazy 3C rinowirusa, a następnie peptyd wiążący kalmodulinę (CBP) do C-końca cDNA ABCG8 (pSGP18-G8-3C-CBP).
    1. Dodaj znacznik sześcio-histydynowy oddzielony glicyną (His6GlyHis6) do C-końca cDNA ABCG5 (pLIC-G5-H12). Współprzekształcanie plazmidów w szczep Pichia KM71H za pomocą elektroporacji.
      UWAGA: Proszę zapoznać się z Tabelą materiałów, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat zastosowanych plazmidów, pożywek i.
    2. Hodować przekształcone komórki drożdży na płytkach agarowych MD w temperaturze 28 °C.
  2. Po 1-2 dniach wybierz 10-12 kolonii i zaszczep je w 10 ml pożywki na bazie azotu (MGY) z drożdży o minimalnej zawartości glicerolu za pomocą probówek wirówkowych o pojemności 50 ml do hodowli na małą skalę.
    1. Wykonaj trzy małe otwory w pokrywie probówki wirówkowej, aby uzyskać lepsze napowietrzenie. Pozwól komórkom rosnąć w temperaturze 28 °C ze stałym wytrząsaniem przy 250 obr./min, aż gęstość optyczna przy 600 nm (OD600) osiągnie 10, zwykle zajmując 1-2 noce.
      UWAGA: Wzrost komórek trwa zwykle od 12 do 24 godzin.
  3. Następnego dnia należy pobrać 1 l sterylnej pożywki MGY i zaszczepić ją kulturą pierwotną w kolbie o pojemności 2,4 l. Inkubować kolbę w temperaturze 28 °C w inkubatorze z wytrząsarką z prędkością 250 obr./min przez 24 godziny.
    1. Aby utrzymać pH w zakresie 5-6, dodaj 10% wodorotlenku amonu (NH4OH), aż pH się ustabilizuje.
  4. Dostosuj pH i indukuj ekspresję białka, dodając 1 ml czystego metanolu na 1 l kultury (0,1 % (v/v) metanolu).
    UWAGA: Następnie karmić komórki 5 ml czystego metanolu na litr kultury (0,5 % (v/v) metanolu) co 12 godzin przez łączny czas 36-48 godzin.
  5. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 15 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  6. Zebrać granulki komórek i ponownie zawiesić je w buforze do lizy (0,33 M sacharozy, 0,3 M Tris-Cl pH 7,5, 0,1 M kwasu aminoheksanowego, 1 mM EDTA i 1 mM EGTA) do stężenia 0,5 g / ml. Zawiesinę przechowywać w temperaturze -80 °C. Zazwyczaj z 1 l hodowanych komórek można odzyskać 30 ± 5 g masy komórkowej.
    UWAGA: Przechowuj granulki komórkowe bezpośrednio w zamrażarce lub natychmiast wykonaj ponowne zawieszenie w buforze do lizy w celu przygotowania membrany.

2. Przygotowanie membrany mikrosomalnej

  1. Rozmrozić komórki i dodać inhibitory proteazy (2 μg/ml leupeptyny, 2 μg/ml pepstatyny A, 2 mM PMSF, patrz tabela materiałów).
    1. Aby przeprowadzić dalszą lizę komórek, użyj emulgatora chłodzonego lodem lub mikrofluidyzatora (patrz Tabela materiałów) przy ciśnieniu 25 000-30 000 psi. Powtórz ten proces 3-4 razy.
    2. Wirować w celu usunięcia resztek komórek: wirować z prędkością 3.500-4.000 x g przez 15 min, a następnie ponownie wirować z prędkością 15.000 x g przez 30 min. Utrzymywać oba wirowania w temperaturze 4 °C.
  2. W celu wyizolowania mikrosomalnych pęcherzyków błonowych należy przenieść supernatant do probówek ultrawirówek i poddać go ultrawirowaniu przy 2 000 000 x g przez 1,5 godziny w temperaturze 4 °C.
    1. Zawiesić osad membrany w 50 ml buforu A (50 mM Tris-Cl pH 8,0, 100 mM NaCl i 10% glicerolu) za pomocą homogenizatora z odbłykowym roztworem. Przechowywać zawiesinę w temperaturze -80 °C.

3. Przygotowanie białek - oczyszczanie heterodimerów

  1. Rozmrozić zamrożone błony mikrosomalne i dostosować stężenie do 4-6 mg/ml za pomocą buforu do rozpuszczania. Bufor powinien zawierać 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM NaCl, 10% glicerolu, 1% (w/v) maltozydu β-dodecylu (β-DDM), 0,5% (w/v) cholanu, 0,1% (m/v) hemibursztynianu cholesterolu (CHS), 5 mM imidazolu, 5 mM β-merkaptoetanolu (β-ME), 2 μg/ml leupeptyny, 2 μg/ml pepstatyny A i 2 mM PMSF (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Można mieszać równe objętości preparatu błonowego i buforu solubilizacyjnego lub użyć 2x buforu solubilizacyjnego bez inhibitorów proteazy i środków redukujących. Krótkie gotowanie buforu pomaga w skutecznym rozpuszczaniu CHS. Do oczyszczania należy używać wyłącznie buforu chłodzonego w temperaturze 4 °C.
    1. Mieszać mieszaninę na średnich obrotach przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C. Następnie dodatkowo mieszać w temperaturze pokojowej (RT) przez 20-30 minut.
    2. Odwirować mieszaninę przy 1 000 000 x g przez 30 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia nierozpuszczalnych błon. Zebrać rozpuszczony supernatant i dodać 20 mM imidazolu i 0,1 mM TCEP.
  2. Przeprowadzić chromatografię kolumnową powinowactwa26: związać rozpuszczony supernatant ze wstępnie zrównoważonymi kulkami Ni-NTA (10-15 ml) (patrz Tabela Materiałów) w buforze A (krok 2.2.1) przez noc.
    UWAGA: Od tego momentu należy unikać stosowania glicerolu w biegowych.
    1. Przepłukać kolumnę dwukrotnie 10 objętościami buforu B (50 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% (m/v) β-DDM, 0,05% (m/v) cholanu, 0,01% (w/v) CHS, 0,1 mM TCEP) zawierającego 25 mM imidazolu.
    2. Przemyć kolumnę 10 objętościami buforu B zawierającego 50 mM imidazolu.
    3. Eluować białko za pomocą buforu C (bufor B z 200 mM imidazolem).
    4. Dodać 1 mM TCEP (patrz tabela materiałów) i 10 mM MgCl2 do eluowanych białek.
    5. Zweryfikuj eluowane frakcje na żelu SDS-PAGE, aby potwierdzić poprawność rozmiaru białka26.
      UWAGA: Typowa wydajność białka (1st Ni-NTA): 10-20 mg białka na 6 L kultury. Użyj DDM przy 10-krotnym lub 5-krotnym krytycznym stężeniu miceli (CMC), około 0,01%. Ten protokół wykorzystuje 0,1% DDM.
    6. Rozcieńczyć frakcje pikowe z elucji Ni-NTA równą objętością buforu D1 (bufor B z 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2), wymieszać i załadować frakcje białkowe do kolumny CBP (3-5 ml) (patrz tabela materiałów), która została wstępnie zrównoważona buforem CBP D1.
    7. Wykonać sekwencyjne płukanie na kolumnie CBP w celu wymiany detergentów przy użyciu buforu D1 i D2 (bufor B z 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0,1% (w/v) glikolu decyloli maltozy neopentylowej (DMNG), bez β-DDM): najpierw przemyć 3 objętościami kolumny D1; po drugie, przemyć 3 objętościami kolumny D1:D2 (3:1, v/v); po trzecie, mycie 3 objętościami kolumn D1:D2 (1:1, v/v); w czwartym kroku umyj 3 objętościami kolumn D1:D2 (1:3, v/v), a następnie 6-10 objętościami kolumn D2.
    8. Eluować białko za pomocą buforu CBP do przemywania D2 300 mM NaCl we frakcjach 1 ml z kolumny CBP (łącznie 10 ml). Zagęścić eluowane frakcje do 1-2 ml.
      UWAGA: Typowa wydajność białka (1st CBP) wynosi 5-15 mg białka na 6 L kultury. Detergenty z glikolu maltozo-neopentylowego (MNG) zwiększają magazynowanie oczyszczonego białka w temperaturze 4 °C. Zastosowano zarówno DMNG, jak i Lauryl MNG (LMNG), przy czym DMNG dawał lepsze kryształy dyfrakcyjne promieniowania rentgenowskiego. Użyj DMNG przy 10-20-krotności krytycznego stężenia miceli (CMC), około 0,003%. Ten protokół używał 0,1% DMNG. Frakcja eluatu CBP może być dalej oczyszczana za pomocą chromatografii żelowo-filtracyjnej (krok 4.4.) w celu analizy aktywności ATPazy białek lub oceny monodyspersji za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM).

4. Przygotowanie białka - obróbka przed krystalizacją

  1. Rozszczepić glikany sprzężone z N i znaczniki CBP za pomocą odpowiednio endoglikozydazy H (Endo H, ~0,2 mg na 10-15 mg oczyszczonego białka) i proteazy HRV-3C (~2 mg na 10-15 mg oczyszczonego białka) (patrz tabela materiałów). Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.
  2. Podczas inkubacji proteazy Endo H i 3C należy przeprowadzić redukcyjną alkilację na połączonych białkach. Rozpocząć od inkubacji z 20 mM jodoacetamidu (patrz Tabela Materiałów) przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie przeprowadzić 1-godzinną inkubację z dodatkowymi 2 mM jodoacetamidu na lodzie.
    UWAGA: Ten etap dodatkowo stabilizuje magazynowanie białka przez okres do jednego miesiąca w temperaturze 4 °C.
  3. Zastosuj drugą kolumnę CBP (1-2 ml), aby oddzielić rozszczepiony znacznik CBP. W tym procesie użyj bufora D2.
    UWAGA: Typowa wydajność białka (2nd CBP) wynosi 5-10 mg białka na 6 l kultury.
  4. Oczyść białko wolne od znaczników CBP za pomocą żelowej chromatografii filtracyjnej. Bufor powinien zawierać 10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) choczanu i 0,01% (w/v) CHS.
    UWAGA: Typowa wydajność białka (filtracja żelowa) wynosi 2-8 mg białka na 6 l kultury. Na tym etapie brak piku DDM (~65 kD) podczas filtracji żelu wskazuje na udaną wymianę detergentu na DMNG.
  5. Zmodyfikuj połączone frakcje białkowe poprzez redukcyjną metylację: dodaj 20 mM boranu dimetyloaminy (DMAB, patrz tabela materiałów) i 40 mM formaldehydu do białka. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce oscylacyjnej. Dodaj 10 mM DMAB.
    1. Powtórzyć krok 4.5, łącznie z dodaniem 10 mM DMAB, i inkubować przez noc (12-18 godzin) w temperaturze 4 °C.
    2. Zatrzymaj reakcję, dodając 100 mM Tris-Cl, pH 7,5.
  6. Załaduj metylowane białko do kolumny Ni-NTA o pojemności 2 ml wstępnie zrównoważonej 100 mM Tris-Cl, pH 8,0 i 100 mM NaCl.
    1. Przepłukać kolumnę za pomocą 10 objętości buforu płuczącego (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, z 0,5 mg/mL DOPC: DOPE (3:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholate, 0,01% (w/v) CHS).
    2. Eluować zrelipidowane białko za pomocą buforu elucyjnego (10 mM HEPES, pH 7,5, 100 mM NaCl, 200 mM imidazol, 0,5 mg/mL DOPC: DOPC: 1:1, w/w), 0,1% (w/v) DMNG, 0,05% (w/v) cholan, 0,01% (w/v) CHS).
      UWAGA: Typowa wydajność białka (2 nd Ni-NTA) wynosi 1-5 mg białka na 6 L kultury.
    3. Przepuścić eluatywy białkowe przez kolumnę odsalającą PD-10 wstępnie zrównoważoną z buforem użytym w kroku 4.4.
  7. Odsolone i zrelipidowane białko inkubować przez noc z cholesterolem (przygotowanym w izopropanolu lub etanolu) do końcowego stężenia ~20 μM.
    1. Następnego ranka usunąć osad przez ultraodwirowanie w stężeniu 1,50 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant.
    2. Zagęścić białko do końcowego stężenia 30-50 mg/ml za pomocą odśrodkowego koncentratora o stężeniu 100 kDa.
    3. Usunąć osad za pomocą wirówki stołowej z chłodzeniem na najwyższych obrotach przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Utrzymać supernatant na lodzie w temperaturze 4 °C i ustalić warunki krystalizacji w dwuczelach.
      UWAGA: Skoncentrowane białka należy wykorzystać do wzrostu kryształów w ciągu tygodnia. Nie zamrażaj białek.

5. Krystalizacja białek w bicelach

  1. Przygotować 10% roztwór podstawowy bicelle z lipidami DMPC i detergentem CHAPSO w stosunku 3:1 (w/w) (patrz Tabela Materiałów).
    UWAGA: Stosować CHAPSO w stężeniu 5-krotności jego krytycznego stężenia miceli (CMC), około 0,5%. W ten sposób utrzymuje się stężenie detergentu w okolicach jego CMC w mieszaninie białkowo-bicellowej (krok 5.2).
    1. Dodać dejonizowany detergent H2O rozpuszczony (CHAPSO) do wstępnie wysuszonych lipidów (mieszanina 5 mol cholesterolu i 95 mol DMPC).
      UWAGA: Przygotuj różne kompozycje lipidowe w chloroformie i wysusz je w szklanej probówce za pomocą strumienia azotu w temperaturze pokojowej. Wyeliminuj resztki rozpuszczalników, umieszczając je na noc w komorze próżniowej, tworząc cienką warstwę lipidową.
    2. Zawiesić lipidy i detergent za pomocą sonikatora w kąpieli wodnej.
    3. Sonikować mieszaninę bicelle w lodowatej wodzie, używając ciągłej mocy, aż roztwór stanie się przezroczysty.
      UWAGA: Stosować ochronniki słuchu i zapewnić wystarczający zapas lodu, aby utrzymać mieszaninę w fazie ciekłej.
    4. Usunąć nierozpuszczone składniki za pomocą filtra odśrodkowego 0,2 μm (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Przechowywać podany roztwór bicelle w temperaturze -80 °C.
  2. Stwórz mieszaninę białka i bicelle na lodzie, delikatnie łącząc 10% bicele (krok 5.1.4) i białka (krok 4.7.4) w stosunku 1:4 (v/v), osiągając końcowe stężenie białka między 5-10 mg/ml.
  3. Inkubować mieszaninę białka i bicelle na lodzie przez 30 minut.
  4. Ustaw warunki krystalizacji w formie dyfuzji par w wiszącej kropli za pomocą 48-dołkowych płytek.
    1. Wymieszać równe objętości (0,5 lub 1 μl) mieszaniny białko/bicelle i roztworu zbiornika krystalizacyjnego zawierającego 1,6 M-2,0 M siarczanu amonu, 100 mM MES (pH 6,5), 0%-4% PEG 400 i 1 mM TCEP (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Przed każdym eksperymentem należy stworzyć matrycę roztworu w zbiorniku, dostosowując siarczan amonu (1,6-2,0 M) i PEG 400 (0%-4%).
    2. Inkubować do krystalizacji w temperaturze 20 °C.
    3. Następnego dnia sprawdź tace do krystalizacji, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie szkła nakrywkowego.
    4. Monitoruj wzrost kryształów co najmniej raz dziennie. Wysokiej jakości kryształy pojawiają się zwykle w ciągu 1-2 tygodni o wymiarach 50-150 μm x 20-50 μm x 2-5 μm.
      UWAGA: Kryształy mogą tworzyć się dłużej przy niższych stężeniach białka. Dojrzałe kryształy należy zebrać w ciągu jednego miesiąca.
    5. Namocz kryształy białka w 0,2 M malonianu sodu i błyskawicznie zamroź je w ciekłym azocie za pomocą kriopętli 50 lub 100 μm.
      UWAGA: Jeśli dostępny jest dyfraktometr rentgenowski, przetestuj kilka kryształów przy 15-30 minutowej ekspozycji na wiązkę promieniowania rentgenowskiego, aby ujawnić dyfrakcję do 5 A. Dyfrakcja o wyższej rozdzielczości wymaga synchrotronowego źródła światła. Wykorzystując 0,2 M malonian sodu jako krioprotekcję, kryształ o wymiarach 100 μm x 50 μm x 2 μm może dostarczyć około 90 klatek obrazu dyfrakcyjnego z synchrotronowym promieniowaniem rentgenowskim.

Wyniki

Rekombinowane półtransportery ABC, ludzkie ABCG5 i ABCG8, są koeksprymowane w drożdżach Pichia pastoris. Frakcja błonowa drożdży jest następnie frakcjonowana poprzez wirowanie. Zgodnie z opisem w niniejszym protokole, białka heterodimeryczne są ekstrahowane przy użyciu tandemowej chromatografii kolumnowej. Następnie białka poddane obróbce chemicznej są krystalizowane poprzez inkubację z bicelami fosfolipidowo-cholesterolowymi. Schematyczne przeglądy procesów oczyszczania i krystalizacji przedstawiono na Rysunku 1.

Aby ocenić monodyspersyjność oczyszczonych białek, próbki zawierające 0,01-0,05 mg/mL białek barwi się 1%-2% octanem uranylu. Następnie próbki te bada się przy użyciu TEM z barwieniem negatywowym (Ryc. 2A). W celu oceny stabilności białek bez poddawania ich cyklom zamrażania i rozmrażania stosuje się analityczną chromatografię filtracyjną w żelu. Analiza ta polega na monitorowaniu przebiegu przechowywania oczyszczonych białek z wykorzystaniem małych, równych objętościowo alikwotów białek (Ryc. 2B). Po tygodniu inkubacji w 4 °C może wystąpić niewielka utrata białek w frakcjach szczytowych, co prawdopodobnie wynika z obecności resztkowych rozpuszczalnych agregatów białkowych. Niemniej jednak całkowita wydajność białka pozostaje wystarczająca do wzrostu kryształów. Zastosowanie TEM z barwieniem negatywowym oraz analitycznej chromatografii filtracyjnej w żelu jest standardową praktyką oceny przydatności białek do krystalizacji, szczególnie w przypadku różnych konstruktów inżynieryjnych.

W celu oceny jakości białka na każdym etapie procesu chromatografii kolumnowej, a także po chemicznej obróbce prekrystalizacyjnej, aliquoty frakcji odpowiadające dwóm kolumnom Ni-NTA, dwóm kolumnom CBP, jednej filtracji żelowej oraz alkilacji redukcyjnej naniesiono na żel 10% SDS-PAGE (Rysunek 3). Ponadto to samo środowisko reakcyjne, które wykorzystano do alkilacji, można zastosować do znakowania rtęcią za pomocą etylortęci (EMTS), choć wykracza to poza zakres niniejszego badania.

Wzrost kryształów jest monitorowany codziennie przy użyciu nadstołowego stereomikroskopu wyposażonego w polaryzator. Kryształy dojrzałe i odpowiednie do zbierania danych osiągają zazwyczaj wymiary 50 µm x 100 µm x 2 µm (Rysunek 4). Podczas procesu pozyskiwania kryształów celowo unika się mniejszych kryształów lub ich skupisk.

Etapy oczyszczania białka (Ni-NTA, CBP, filtracja żelowa) i schemat tworzenia biceli wraz z procesem dyfuzji.
Rycina 1: Schematyczne zestawienia procesu oczyszczania (A) oraz krystalizacji biceli (B) heterodimeru ABCG5/G8. Konstrukcje rekombinowanego ludzkiego ABCG5 (hG5) i ABCG8 (hG8) posiadają odpowiednio znaczniki RGS-H6-G-H6 oraz 3C-CBP (A, góra). Tandemowa chromatografia powinowactwa, a następnie chromatografia filtracyjna w celu uzyskania oczyszczonego heterodimeru (A, dół). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozkład nanocząstek w mikroskopii elektronowej, wykres chromatograficzny; detekcja G5G8 w czasie.
Rysunek 2: Ocena monodyspersyjności (A) i stabilności (B) oczyszczonych białek. (A) Mikrograf elektronowy heterodimerów ABCG5/G8 (G5G8) barwionych negatywnie wykonany za pomocą TEM. Reprezentatywne cząsteczki zaznaczono pełnymi białymi okręgami. Pasek skali = 100 nm. (B) Białka alkilowane przechowywane w 4 °C analizowane za pomocą analitycznej chromatografii żelowej w ciągu miesiąca z niewielką utratą białek po tygodniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Żel SDS-PAGE pokazujący prążki białkowe dla analizy filtracji żelowej i alkilowania redukcyjnego.
Rycina 3: Analiza SDS-PAGE eluatów białkowych z chromatografii kolumnowej i alkilowania redukcyjnego. Różne objętości (1-10 µL) frakcji białkowych naniesiono na 10% żel Tris/glicyna i przeprowadzono elektroforezę przez 45 min przy stałym napięciu 200 V. Żel barwiono błękitem Coomassie, odbarwiono, wysuszono na powietrzu i zdigitalizowano za pomocą skanera biurkowego. 1° & 2° Ni: pierwsza i druga kolumna Ni-NTA; 1° & 2° CBP: pierwsza i druga kolumna CBP; Peak Fractions linia ciągła: połączone frakcje do krystalizacji; Peak Fractions linia przerywana: frakcje ramienne; EMTS: tiosalicynian etylortęci; IA: jodoacetamid. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Proces krystalizacji, obraz mikroskopowy, analiza formowania kryształów, skala 100 µm.
Rysunek 4: Ocena dojrzewania kryształów białka za pomocą mikroskopii świetlnej. Dojrzałe kryształy ABCG5/G8 z kropli krystalizacyjnej zostały zobrazowane pod mikroskopem stereoskopowym z polaryzatorem. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyzwania związane z krystalizacją białek błonowych skłoniły do opracowania metod krystalizacji opartych na dwuwarstwach lipidowych, takich jak bicelle27 lub metoda lipidowej fazy sześciennej (LCP)14 . Jednak osiągnięcie pomyślnej krystalizacji białek błonowych nadal zależy od krytycznego, a czasem wąskiego gardła etapu przygotowania białka. Warto zauważyć, że transportery ABC stanowią potężną przeszkodę w hodowli kryształów nadających się do krystalografii rentgenowskiej. Protokół ten zapewnia kompleksowe, praktyczne wskazówki dotyczące usprawnienia przygotowania ludzkiego transportera steroli ABCG5 / G8 i wspierania wzrostu kryształów poprzez podejście do krystalizacji bicelle.

Kluczową kwestią przy opracowywaniu tego protokołu był imperatyw znacznego uzysku białka w początkowych fazach oczyszczania białka, co pozwoliło na pewien stopień utraty białka podczas obróbki przed krystalizacją (ryc. 3). Typowe strategie radzenia sobie z tym wyzwaniem obejmują między innymi rozległą inżynierię białek, wykorzystanie różnych gospodarzy ekspresji oraz eksplorację ortologów lub homologów. Niemniej jednak, dzięki tej pozornie skomplikowanej procedurze, zidentyfikowano szereg kluczowych kroków, które leżą u podstaw sukcesu protokołu, a także dostarczają wglądu w potencjalne ograniczenia, które mogą pojawić się podczas badania innych transporterów ABC lub ogólnie białek błonowych.

Po pierwsze, protokół ten wykorzystuje dokładne wirowanie na każdym etapie, aby zminimalizować agregację białek. Ponadto kluczowe znaczenie ma ciągłe monitorowanie termostabilności oczyszczonych białek. Mikroskopia elektronowa jest wykorzystywana do weryfikacji monodyspersji białek, podczas gdy analityczna filtracja żelowa śledzi stabilność białka w czasie (ryc. 2). Można również zastosować alternatywne techniki, takie jak dichroizm kołowy (CD) lub różnicowa kalorymetria skaningowa (DSC). Co więcej, włączenie lipidów na określonych etapach jest niezbędne do maksymalizacji zarówno aktywności, jak i krystalogenezy oczyszczonego ABCG5/G8. Na przykład cholan i CHS są niezbędne do wykazania mierzalnej hydrolizy ATP; fosfolipidy są niezbędne do utrzymania stabilności metylowanych białek; a cholesterol jest niezbędnym składnikiem roztworu bicelle, sprzyjającym wzrostowi kryształów odpowiednim do dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości (ryc. 4).

Zasadniczo całą procedurę można wykonać w ciągu tygodnia wysiłku. W przeciwieństwie do LCP, pobieranie kryształów z tacek krystalizacyjnych wiszących jest proste. Patrząc w przyszłość, przy znacznej wydajności białka (około 10 mg), protokół ten można łatwo dostosować do opracowywania badań krystalograficznych z udziałem mutantów ABCG5/G8 lub innych białek transportowych. Jest to szczególnie istotne w przypadkach, które obecnie unikają wizualizacji za pomocą mikroskopii elektronowej.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez Natural Sciences and Engineering Research Council Discovery Grant (RGPIN 2018-04070) oraz Canadian Institutes of Health Research Project Grant (PJT-180640) dla JYL. Protokół ten jest oparty na oryginalnych raportach dotyczących struktur krystalicznych ABCG5/G8 zgłoszonych wcześniej przez Farhat et al.22 i Lee et al.23.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Kolekcja ABCG5National Institute of Health Numer dostępu do NCBI NM_022436
ABCG8National Institute of Health Numer dostępu do NCBI NM_022437
Ä System KTA FPLC Cytiva (dawniej GE Healthcare Life Sciences)
CaCl2Bisent600-024-CGBezwodny
CBPAgilent214303Żywica powinowactwa peptydu wiążącego kalmodulinę
Koncentratory odśrodkowe (Vivaspin)Sartorius
CHAPSO AnatraceC317Anagrade
CholesterolAnatraceCH200
CHSSteraloidyC6823-000
DMABMiliporeSigma18023897%
DMNGAnatraceNG322
DMPCAnatraceD514
DOPCAvanti850375
DOPCAnatraceD518
DOPEAvanti850725
DTTFisherBP172
Mikropętle o podwójnej grubościMiTeGen
EDTABioShopEDT003Sól disodowa, dwuwodna
EGTAMiliporeSigma324626
EmulsiFex-C3)Avestin
Endo HNew England BiolabsP0702
EtanolGreenfieldP016EAANAlkohol etylowy Bezwodny
FormaldehydMiliporeSigma252549Odczynnik ACS
GlicerolBioShopGLY004
HEPESBioShopHEP001
ProteazaDomowy
ImidazolBioShopIMD510Odczynnik klasy
JodoacetamidMiliporeSigmaI1149BioUltra
IsopropanolFisherBP2618212
LeupeptinBioShopLEU001
MESMilliporeSigma69892BioUltra
MetanolFisherA412P
MgCl2Bisent800-070-CGUwodniony
mikrofluidyzator (LM 20)Mikrofluidyka
NaClBioShopSOD002
NH4OHFisherA669-212Odczynnik ACS
Ni-NTA superflowQiagen30430Żywice naładowane niklem
PEG 400MilliporeSigma202398
PepstatinBioShopPEP605
PMSFMilliporeSigmaP7626
pSGP18 i pLIC Domowej roboty (pochodzące z pPICZ, Invitrogen)
SDSBioShopSDS003
Cholan soduFisher229101
Malonian soduMiliporeSigma63409
SacharozaŻubr800-081-WGUltra pure
Superdex 200 30/100 GLCytiva (dawniej GE Healthcare Life Sciences)28990944Wstępnie wypełniona żelowa kolumna filtracyjna
TCEP
TEMFEI, Technai
Tris BaseFisherBP152
β-DDMAnatraceD310SSol Grade
β-merkaptoetanolMilliporeSigma
ε-aminokapronowykwas Fisher
Kolekcja Emulgator ( HRV-3CAAA1471936

Bibliografia

  1. Hamada, H., Tsuruo, T. Purification of the 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein associated with multidrug resistance. 170- to 180-kilodalton membrane glycoprotein is an ATPase. Journal of Biological Chemistry. 263 (3), 1454-1458 (1988).
  2. Higgins, F., Hiles, D., Whalley, K., Jamieson, J. Nucleotide binding by membrane components of bacterial periplasmic binding protein-dependent transport systems. The EMBO Journal. 4 (4), 1033-1039 (1985).
  3. Higgins, F., et al. A family of related ATP-binding subunits coupled to many distinct biological processes in bacteria. Nature. 323 (6087), 448-450 (1986).
  4. Horio, M., Gottesman, M., Pastan, I. ATP-dependent transport of vinblastine in vesicles from human multidrug-resistant cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (10), 3580-3584 (1988).
  5. Mimmack, L., et al. Energy coupling to periplasmic binding protein-dependent transport systems: stoichiometry of ATP hydrolysis during transport in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (21), 8257-8261 (1989).
  6. Grundy, M. Absorption and Metabolism of Dietary Cholesterol. Annual Review of Nutrition. 3 (1), 71-96 (1983).
  7. Berge, E., et al. Accumulation of dietary cholesterol in sitosterolemia caused by mutations in adjacent ABC transporters. Science. 290 (5497), 1771-1775 (2000).
  8. Repa, J., et al. Regulation of ATP-binding cassette sterol transporters ABCG5 and ABCG8 by the Liver X receptors α and β. Journal of Biological Chemistry. 277 (21), 18793-18800 (2002).
  9. Yu, L., et al. Stimulation of cholesterol excretion by the Liver X receptor agonist requires ATP-binding cassette transporters G5 and G8. Journal of Biological Chemistry. 278 (18), 15565-15570 (2003).
  10. Yu, L., et al. Expression of ABCG5 and ABCG8 is required for regulation of biliary cholesterol secretion. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 8742-8747 (2005).
  11. Lütjohann, D., Björkhem, I., Beil, F., von Bergmann, K. Sterol absorption and sterol balance in phytosterolemia evaluated by deuterium-labeled sterols: effect of sitostanol treatment. Journal of Lipid Research. 36 (8), 1763-1773 (1995).
  12. Miettinen, A. Phytosterolaemia, xanthomatosis and premature atherosclerotic arterial disease: a case with high plant sterol absorption, impaired sterol elimination and low cholesterol synthesis. European Journal of Clinical Investigation. 10 (1), 27-35 (1980).
  13. Salen, G., et al. Sitosterolemia. Journal of Lipid Research. 33 (7), 945-955 (1992).
  14. Caffrey, M. Membrane protein crystallization. Journal of Structural Biology. 142 (1), 108-132 (2003).
  15. Michel, H. Crystallization of membrane proteins. Trends in Biochemical Sciences. 8 (2), 56-59 (1983).
  16. Dürr, N., Gildenberg, M., Ramamoorthy, A. The magic of bicelleslights up membrane protein structure. Chemical Reviews. 112 (11), 6054(2012).
  17. Dürr, N., Soong, R., Ramamoorthy, A. When detergent meets bilayer: Birth and coming of age of lipid bicelles. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 69 (1), 1-22 (2013).
  18. Dufourc, J. Bicelles and nanodiscs for biophysical chemistry. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (1), 183478(2021).
  19. Beaugrand, M., et al. Lipid concentration and molar ratio boundaries for the use of isotropic bicelles. Langmuir. 30 (21), 6162-6170 (2014).
  20. Sanders, R., Schwonek, P. Characterization of magnetically orientable bilayers in mixtures of dihexanoylphosphatidylcholine and dimyristoylphosphatidylcholine by solid-state NMR. Biochemistry. 31 (37), 8898-8905 (1992).
  21. Seddon, M., Curnow, P., Booth, J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  22. Farhat, D., et al. Structural analysis of cholesterol binding and sterol selectivity by ABCG5/G8. Journal of Molecular Biology. 434 (20), 167795(2022).
  23. Lee, J. Y., et al. Crystal structure of the human sterol transporter ABCG5/ABCG8. Nature. 533 (7604), 561-564 (2016).
  24. Ujwal, R., Bowie, U. Crystallizing membrane proteins using lipidic bicelles. Methods. 55 (4), 337-341 (2011).
  25. Johnson, H., Lee, J. Y., Pickert, A., Urbatsch, L. Bile acids stimulate ATP hydrolysis in the purified cholesterol transporter ABCG5/G8. Biochemistry. 49 (16), 3403-3411 (2010).
  26. Wang, Z., et al. Purification and ATP hydrolysis of the putative cholesterol transporters ABCG5 and ABCG8. Biochemistry. 45 (32), 9929-9939 (2006).
  27. Faham, S. Crystallization of bacteriorhodopsin from bicelle formulations at room temperature. Protein Science. 14 (3), 836-840 (2005).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transporter ABCG5 G8krystalizacja w lipidowych bicelachstruktura białka błonowegoATP-binding cassetteoczyszczanie białeksolubilizacja detergentowadyfuzja par metodą wiszącej kropliwiązanie cholesteroluchromatografia żelowa
Krystalizacja ABCG5/G8 w lipidowym środowisku bicelle do krystalografii rentgenowskiej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.