Artykuł metodologiczny

Ilościowa ilościowa zawartość kallosu w tkankach roślinnych za pomocą enzymatycznego testu immunosorpcyjnego / spektrofotometrii immunofluorescencji

DOI:

10.3791/65833

⸱

22 maja 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten ilościowo określa kallosę w tkankach roślinnych za pomocą metody specyficznej dla kalozy, spektrofotometrii immunofluorescencyjnej/ELISA, która opiera się na wiązaniu kallozy w próbkach roślin z przeciwciałami specyficznymi dla kalozy, a następnie ilościowo określa kallosę za pomocą enzymatycznych przeciwciał wykrywających poprzez pomiar aktywności enzymatycznej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istniejące metody ilościowej analizy kallosu z tkanek roślinnych obejmują mikroskopię epifluorescencyjną, spektrofotometrię fluorescencyjną, mikroskopię immunofluorescencyjną oraz pośrednią ocenę aktywności syntazy kallosowej i β-(1,3)-glukanazy. Jednak niektóre z tych metod mają istotne ograniczenia, w tym czasochłonność, niespecyficzność dla modowaciałości, pracochłonność, subiektywność, wysoką autofluorescencję, niską czułość, bardziej jakościowe niż ilościowe oraz wymaganie posiadania zasobów programistycznych i umiejętności technicznych. Dlatego istnieje pilna potrzeba zbadania alternatywnych metod ilościowego określania kallosu w tkankach roślinnych. Postawiono hipotezę, że spektrofotometria immunofluorescencyjna lub enzymatyczny immunosorbentny test (ELISA) wykorzystujący przeciwciała specyficzne dla kalozy mogą przezwyciężyć niektóre ograniczenia obecnych metod ilościowej kallosy. Stres biotyczny był stosowany poprzez inokulację roślin bananów pochodzących z kultury tkankowej Xanthomonas vasicola pv. bakterie musacearum (Xvm), które indukowały produkcję kallo. Próbki tkanki bulwy bananowej pobrano 14 dni po inokulacji (dpi) do ilościowej identyfikacji kallosu przy użyciu nowej metody spektrofotometrii immunofluorescencyjnej. Produkcja kallose w bulwach grup zaszczepionych Xvm i kontrolnych różniła się istotnie zarówno w genotypach bananów, np. w badaniu t-test < 0,05). Opisana tutaj metoda spektrofotometrii immunofluorescencyjnej może być stosowana do ilościowej identyfikacji kallozy w różnych tkankach roślinnych o wysokiej specyficzności dla kalozy, wrażliwości, wiarygodności i powtarzalności. Dodatkowo, zastosowanie płyty 96-dołkowej sprawia, że metoda ta nadaje się do badań ilościowej kallozy o wysokiej przepustowości przy minimalnych błędach próbkowania i analizy.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalloza to polisacharyd β-1,3-glukanu, który jest naturalnie występującym związkiem występującym w ścianach komórkowych różnych roślin wyższych. Kalloza jest syntetyzowana przez syntazy kallosowe (CalS) i degradowana przez β-(1,3)-glukanazy 1,2,3. Uczestniczy w kilku procesach biologicznych, w tym w wzroście i rozwoju oraz w reakcji na stresy abiotyczne i biotyczne 4,5,6. Podczas infekcji patogenem wzrost osadzania się kallow w brodawkach pomaga zapobiegać dalszej kolonizacji mikroorganizmów, działając jako bariera przepuszczalności między sąsiednimi komórkami roślinnymi 2,4,7,8,9,10,11,12 . Poprzez spowolnienie inwazji patogenów w atakowanej tkance, osadzanie kallosa pozwala na wywołanie dodatkowych odpowiedzi obronnych13. Dokładne ilościowe określenie kallozy w tkankach roślinnych jest niezbędne do zrozumienia jej roli w różnych procesach fizjologicznych. Jednak obecne metody ilościowej analizy kallosu z tkanek roślinnych, obejmujące mikroskopię epifluorescencyjną, mikroskopię immunofluorescencyjną oraz spektrofotometrię fluorescencyjną, napotykają na istotne ograniczenia i wyzwania ilościowe. Dlatego istnieje pilna potrzeba poszukiwania alternatywnych metod ilościowania kallosów, aby przezwyciężyć te wady. Postawiono hipotezę, że spektrofotometria immunofluorescencyjna lub enzymatyczny immunosorbentny test (ELISA) może zaoferować bardziej efektywną metodę ilościowej ilościowej analizy kallose w próbkach roślin, obejmującą wysoką swoistość, czułość, wiarygodność, powtarzalność oraz wysoką przepustowość.

Złota standardowa metoda ilościowej kallosy polega na obrazowaniu cząstek kalisoz barwionych na niebiesko anilinie za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej 14,15,16,17. Kallosa barwiona na niebiesko anilina po ekspozycji na wzbudzenie niebieskim lub UV objawia się jako żółte cząstki fluorescencyjne, które można ręcznie policzyć do liczby fluorescencyjnych cząstek kallosy14,15 lub policzyć za pomocą automatycznego oprogramowania do liczenia kallosów. Ręczne liczenie cząstek kallow jest pracochłonne, czasochłonne i subiektywne dlabadacza, podczas gdy automatyczne liczenie wymaga zdobycia zasobów programistycznych i znacznych umiejętności technicznych. Niektóre programy używane do automatycznego liczenia kalloz to ImageJ 19,20,21,22, Photoshop23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 oraz Ilastik26. Kalloza barwiona na niebiesko anilina może być również ilościowa za pomocą spektrofotometrii fluorescencyjnej 17,19,27,28,29. Jednak wysokie tło/autofluorescencja związana z mikroskopią epifluorescencyjną i spektrofotometrią fluorescencyjną sprawia, że te metody są trudne i zawodne ze względu na niski stosunek sygnału do szumu26. Ponadto błękit anilinowy może barwić inne β-1,3-glukany opróczkallosu 30, co sprawia, że zarówno metody mikroskopii epifluorescencyjnej, jak i spektrofotometrii fluorescencyjnej wykrywania i ilościowania kallos są częściowo niespecyficzne i niewiarygodne. Metoda mikroskopii immunofluorescencyjnej do ilościowego pomiaru kallosów, oparta na przeciwciałach specyficznych dla kaloz, została również zastosowana w kilku badaniach31, 32, 33. Chociaż metoda ta ma kilka wad w porównaniu z mikroskopią epifluorescencyjną kalozy zabarwionej na niebiesko, ma tę zaletę, że jest specyficzna dla kalozy ze względu na stosowane tu przeciwciała. Ilościowa analiza kallosu była również przeprowadzana metodami opartymi na aktywności enzymów. Metody oparte na aktywności enzymów do ilościowania kalloz obejmują ocenę aktywności syntazy kallose (CalS)20,33 oraz β-(1,3)-glukanazy34,35. Metody oparte na aktywności enzymów mają kilka wad w porównaniu z mikroskopią epifluorescencyjną, mikroskopią immunofluorescencyjną i spektrofotometrią fluorescencyjną. Należą do nich pośrednie szacowanie kalozy, trudności w ekstrakcji enzymów i testach aktywności enzymatycznej oraz brak równomiernego rozmieszczenia kallose w tkankach roślinnych.

Ze względu na wady obecnych metod ilościfikacji kallos, które obejmują mikroskopię epifluorescencyjną, mikroskopię immunofluorescencyjną, spektrofotometrię fluorescencyjną, testy CalS oraz β-1,3)-glukanazy, pojawiła się potrzeba opracowania nowej metody ilościowania kallosów, która oferowałaby szereg zalet, w tym 1) wysoką swoistość, czułość, niezawodność i powtarzalność oraz 2) łatwiejszą ilościową ilościową o wysokiej przepustowości. Zastosowanie spektrofotometrii immunofluorescencyjnej do ilościowego określania kallos nie zostało zbadane. Przedstawiono nową metodę ilościowej kallozy opartą na spektrofotometrii immunofluorescencyjnej, a konkretnie Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Metoda może być zoptymalizowana pod kątem ilościowej kallozy w różnych roślinach lub ich tkankach z odpowiednią swoistością na kalozę, precyzją, powtarzalnością oraz wysoką przepustowością eksperymentalną. Metodę tę można również zmodyfikować, aby ilościowo określić dowolny roślinny analit, jeśli przeciwciało przeciwko temu analitowi jest dostępne. Aby zapewnić dokładny, efektywny i niezawodny rozkład przestrzenno-czasowy kallozy w tkankach roślinnych, zaleca się jednoczesne stosowanie różnych metod ilościowania kallozy, takich jak mikroskopia, spektrofotometria oraz metody oparte na aktywności enzymów. W konsekwencji pozwoli to dokładnie i efektywnie zrozumieć rolę kallozy w różnych reakcjach fizjologicznych i stresowych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inokulacja roślin doświadczalnych

  1. Izoluj, przygotuj i potwierdź szczepionkę Xvm według standardowych procedur36,37. Losowo wybierz 10 roślin Musa balbisiana i Mbwazirume pochodzących z 2-miesięcznej kultury tkankowej i inokuluj grzbietową stronę najmłodszego, całkowicie otwartego ogonka liściowego 200 μL (1 x 108 komórek) inokulum Xvm potwierdzonego PCR (Rysunek 1)38.
  2. Podobnie losowo wybierz 10 roślin bananów Musa balbisiana i Mbwazirume i zaszczep je 200 μL sterylnej wody destylowanej (SDW).
  3. Utrzymuj rośliny zaszczepione Xvm i kontroluj bananowce w podobnych warunkach w przesiatce z 12-godzinnym światłem i 12-godzinnym ciemnym fotoperiodem w temperaturze 25 °C, podlewając je co 3 dni.
    UWAGA: Zapoznaj się z Tabelą Materiałów oraz Tabelą 1 , aby zobaczyć odpowiednio listę materiałów i sprzętu oraz przepis na bufory.

2. Pobieranie próbek tkanek z bulwy i przygotowanie próbek

  1. Wykonaj destrukcyjne pobieranie próbek z roślin doświadczalnych (Rysunek 1).
  2. Szybko usuń około 2 g próbek z kruszy sterylnymi ostrzami chirurgicznymi 14 dni po szczepieniu (dpi) i umieść je pojedynczo w oznakowanych probówkach o pojemności 50 mL. Zrób to dla wszystkich 10 próbek pobranych z roślin zaszczepionych Xvm oraz z roślin kontrolnych.
  3. Natychmiast zanurz probówki 50 mL zawierające próbki w ciekłym azocie.
  4. Przetransportować próbki do laboratorium i przechowywać je w temperaturze -80 °C do momentu gotowości do dalszego działania. Przechowywać próbki w temperaturze −80 °C przez maksymalnie rok lub dłużej, z minimalnymi cyklami zamarzania i rozmrażania.
  5. Próbki liofilizują przez 72 godziny przy użyciu liofilizera (Rysunek 1).
  6. Włóż dokładnie 30 mg próbek liofilizowanych do 2 mL probek zawierających 2 stalowe koraliki rowerowe i rozkrusz je na drobny proszek, z prędkością ustawioną na 5 przez 1 minutę (Rysunek 1).
  7. Przechowuj zmielone próbki w chłodnym, suchym środowisku w temperaturze pokojowej, dobrze szczelnie zamknięte aż do dalszego działania. Przechowywać rozdrobnione próbki w temperaturze pokojowej do 4 miesięcy lub w temperaturze −80 °C przez maksymalnie 1 rok z minimalnymi cyklami zamarzania i rozmrażania39,40.

3. Ekstrakcja kalloty i przygotowanie standardów laminarynowych i blanków

  1. Aby wydobyć kallos z 30 mg zmielonej próbki korza, należy dodać 800 μL 1 M NaOH i inkubować przez 30 minut w 80 °C w kąpieli wodnej, z okazjonalnym wirowaniem po co 10 minut27,41 (Rysunek 1, Krok 6).
  2. Pozostawić próbki do ostygnięcia do temperatury pokojowej (około 5 minut), a następnie wirować w 15 294 x g przez 5 minut.
  3. Przelej supernatant (ekstrakt kallozy) do sterylnej probówki o pojemności 2 mL i rozcieńcz go buforem blokującym (Tabela 1) w proporcji 1:2.
    UWAGA: Wybierz współczynnik rozcieńczenia na podstawie wstępnych eksperymentów i optymalizacji. Rozcieńczenie ekstraktu z kallozy może być konieczne, ale nie musi. W razie potrzeby należy wykonać rozcieńczenie w buforze blokującym, a współczynnik rozcieńczania zoptymalizować dla różnych typów próbek, aby mieścił się w zakresie krzywej standardowej.
  4. Przechowuj ekstrakty z kallozy w temperaturze -20 °C, aż będziesz gotowy do dalszej pracy. Przechowuj ekstrakt z kallozy do 6 miesięcy z minimalnymi cyklami mrozu i mrozu.
  5. Przygotuj skoncentrowany zapas laminaryny w dawce 100 mg/mL w 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    UWAGA: Laminaryna to polimer 1-3-β-glukan i może być stosowany jako standard dla odpowiedników kallosów w spektrofotometrii immunofluorescencyjnej.
  6. Inkubuj powstałą zawiesinę normy w temperaturze 80 °C w kąpieli wodnej, delikatnie potrząsając ją w odstępach czasu, aż cała laminarina całkowicie się rozpuści (około 20-40 minut).
  7. Schłodzić rozpuszczony standard do temperatury pokojowej (około 10 minut).
  8. Przygotuj standardy laminariny w stężeniach 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL oraz 0,01 mg/mL, używając buforu blokującego, zaczynając od skoncentrowanego zapasu 100 mg/mL.
  9. Przygotuj puste naboje, mieszając 1 M NaOH i bufor blokujący w proporcji 1:2. Jeśli konieczne jest rozcieńczenie, należy użyć tego samego współczynnika rozcieńczenia, co do przygotowania ekstraktu kallozy.
  10. Przechowuj standardy laminaryny i puste materiały w temperaturze −20 °C. Przechowuj standardy i puste materiały do 6 miesięcy z minimalną liczbą cykli zamarzania i rozmrażania.

4. Ilościowa skala za pomocą spektrofotometrii immunofluorescencyjnej

  1. Dodaj 100 μL pierwotnego przeciwciała (β myszy IgG skierowanej przez glukan) przygotowanego za pomocą buforu powłokowego (Tabela 1) do każdej z 96 wgłębień płytek ELISA z polistyrenem (Rysunek 2).
  2. Szczelnie uszczelnij płytę folią parafinową i inkubuj przez noc w lodówce w 4 °C.
  3. Następnego dnia połóż talerz na stole i pozwól mu osiągnąć temperaturę pokojową (około 10 minut).
  4. Myj talerz standardowymi procedurami rozpylania i mycia46. Krótko dodaj 200 μL bufora do płukania (Tabela 1) do dołków, rozkręć go przy 500 obr./min przez 30 sekund za pomocą cyfrowego shakera i rozmazuj na bibucie. Powtórz ten proces mycia 2 razy (Rysunek 2). Upewnij się, że studnie nie wyschną całkowicie i użyj sterylnej końcówki mikropipety, aby usunąć pęcherzyki z nich bez dotykania dna i ścian.
  5. Dodaj 200 μL bufora blokującego do każdego odwiertu (Rysunek 2) i szczelnie uszczelnij płytę warstwą parafinową. Inkubuj ją przez 4 godziny w 37 °C. Płucz płytkę, jak wspomniano wyżej (Rysunek 2).
  6. Dodaj 100 μL ekstraktu z kallose z 10 zakładów zaszczepionych Xvm i 10 urządzeń kontrolnych do wyznaczonych studni. Dodaj 100 μL standardów laminarynowych do innych studni. Dodaj 100 μL pustej warstwy do innych studni (rysunek 2).
  7. Szczelnie uszczelnij płytę warstwą parafinową i inkubuj przez noc w lodówce w 4 °C. Umyj talerz ponownie, jak wspomniano wyżej (Rysunek 2).
  8. Dodaj 100 μL pierwotnego przeciwciała (1-3-β-skierowanego mysz IgG) przygotowanego za pomocą bufora blokującego do każdej z dołków (Rysunek 2).
  9. Szczelnie uszczelnij płytę warstwą parafinową i inkubuj przez 4 godziny w 37 °C, następnie umyj płytę zgodnie z powyższym (Rysunek 2).
  10. Do każdego dołku dodaj 100 μL przeciwciała wtórnego przeciwciała przeciw myszej fosfatazie IgG-alkalicznej (Rysunek 2).
  11. Szczelnie uszczelnij płytę filmem parafinowym i inkubuj przez noc w lodówce w 4 °C. Następnie myj płytę zgodnie z wyżejszym wskazaniem (Rysunek 2).
  12. Dodaj do studni 100 μL świeżo przygotowanego roztworu para-nitrofenylfosforanu (pNPP) w stężeniu 1 mg/mL (Tabela 1) (Wykres 1) (Rysunek 2)
  13. Inkubuj talerz na stole w temperaturze pokojowej przez 30 minuti 48 minut.
    UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od próbek roślin i stosowanego standardu. W tym badaniu laminarina miała najlepszy odczyt – 30 minut.
  14. Zakończ reakcję, dodając 100 μL świeżo przygotowanego roztworu stopowego (0,5 M NaOH) do każdego z otworów48 (Rysunek 2).
  15. Przełóż płytkę do czytnika mikropłytek (wyrównany do 37 °C), potrząsaj nią ze średnią prędkością przez 1 minutę i odczytuj absorbancje przy 405 nm48 (Rysunek 1, Rysunek 2).

5. Analiza danych

  1. Wykonaj prostą regresję liniową absorbancji laminaryny przy 405 nm względem stężenia laminaryny (μg/mL), aby uzyskać krzywą standardową. Równanie krzywej standardowej to
    Y = β1X + β0
    gdzie Y oznacza absorbancję laminaryny przy 405 nm,β 1 to nachylenie linii regresji (współczynnik korelacji Pearsona), X to Log10 (stężenie laminaryny w μg/mL), a β0 to przecięcie y.
  2. Oblicz stężenia kallose w próbkach z kłu, odejmując absorbancję pustego materiału od absorbancji próbek. Następnie użyj krzywej standardowej do oszacowania stężenia kallozy w μg/mL jako równoważnika laminaryny (LE).
  3. Przeanalizuj wszystkie dane pod kątem normalności rozkładu za pomocą testu Shapiro-Wilka i sprawdź homoskedastyczność wariancji za pomocą testu Levene'a (α > 0,05).
  4. Wykorzystaj niezależny test t do porównania produkcji kallózy między grupami zaszczepionymi Xvm a grupami kontrolnymi (s≤ 0,05).

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znane stężenia standardów laminaryny zostały przeanalizowane za pomocą spektrofotometrii i zarejestrowano odpowiadające im wartości absorpcji. Na podstawie tych danych skonstruowano wykres Beer-Lamberta poprzez wykreślenie stężeń standardów laminaryny na osi x oraz absorbancji na osi y. Równanie linii regresji wynosiło y = 0,5079x − 0,04534 (Rysunek 3)49. Wykres Beer-Lamberta wykazał wysoki współczynnik korelacji (r) wynoszący 0,9988 oraz współczynnik determinacji (r2) 0,9975, co wskazuje na silną liniową zależność między stężeniem a absorbancją, a do 0,9975 wariancji zmiennej zależnej (absorpcji) wyjaśniono przez zmienną niezależną (stężenie; Rysunek 3; s<0.0001). Dlatego ten model był dobrym dopasowaniem, dokładnym i wiarygodnym do przewidywania stężenia laminaryny i kalozy. Stężenie kallozy w próbkach bulwy bananowej określono poprzez pomiar absorpcji próbek bulwy za pomocą spektrofotometrii oraz wykorzystanie wartości absorpcji do obliczenia stężeń kallose za pomocą równania.

Test spektrofotometrii immunofluorescencyjnej wykazał istotny wzrost indukowanej kallozy u roślin zaszczepionych Xvm w porównaniu do grupy kontrolnej w obu genotypach banana (niezależny test t próby, p < 0,05; Rysunek 4). Produkcja kallos w zakładach kontrolnych przy 14 dpi wyniosła odpowiednio 1474,34 mg/mL oraz 1037,11 mg/mL dla Mbwazirume i M. balbisiana (Rysunek 4). Inokulacja roślin Xvm spowodowała 4190,78 mg/mL oraz 1996,07 mg/mL kallozy w bulwach roślin Mbwazirume i M. balbisiana zaszczepionych Xvm odpowiednio w dawce 14 dpi (Rysunek 4). Inokulacja Xvm spowodowała produkcję kallow o 1,9 do 2,8 razy większą niż w zakładach kontrolnych (test t-próbki niezależnej, p < 0,001; Rysunek 4).

figure-results-1
Rysunek 1: Schematyczna ilustracja głównych kroków dotyczących ilościowania kallosu za pomocą nowej metody spektrofotometrii immunofluorescencyjnej. Ten rysunek pokazuje główne etapy związane z ilościową ilościową analizą kallose z tkanek bananowych, które obejmują podniesienie sadzonek pochodzących z kultury tkankowej, inokulację Xvm, destrukcyjne pobieranie tkanek z buli, liofilizację próbek, ekstrakcję kallose oraz ilościową ilościową metodę spektrofotometrii immunofluorescencyjnej. Ta liczba została wznowionaw 50 miejscach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2: Szczegółowa schematyczna ilustracja metody spektrofotometrii immunofluorescencyjnej do kwantyfikacji kalloes. Ten rysunek szczegółowo demonstruje metodę spektrofotometrii immunofluorescencyjnej do kwantyfikacji kallose, pokazując, jak płytka ELISA jest obciążona różnymi składnikami oraz jak kallosa jest ostatecznie ilościowa za pomocą spektrofotometrii. Ta liczba została wznowionaw 50 miejscach. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3: Ilościowa ilościowa analiza białek. Wykres Beer-Lamberta oparty na standardach laminaryny znanych stężeń i odczytach absorpcji (przy 405 nm) służył do obliczania stężeń kallow (jako równoważników laminariny, LE) na podstawie odczytów absorpcji próbek z buli. Ta liczba została wznowiona49. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie stężenia kallozy. Porównanie średnich stężeń kallow (średnia ± SEM, n = 9) w bulwach roślin bananów M. balbisiana i Mbwazirume zaszczepionych Xvm , zgodnie z nową metodą spektrofotometrii immunofluorescencyjnej (niezależny test t-test, α ≤ 0,05) Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

BuforSkładPrzechowywanie
Bufor blokujący10 g albuminy surowicy bydłej (BSA; 1% objętości), rozpuszczonej w 1 litrze PBS.-20 °C do 6 miesięcy
Bufor powłokowy1,59 g węglanu sodu (Na2CO3), 2,93 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 0,2 g azydu sodu (NaN3), rozpuszcza się w 1 L dejonizowanego H2O, pH 9,6.-20 °C do 12 miesięcy
Bufor sprzężony2 g PVP (2% objętości), rozpuszczonego w 1 litrze bufora blokującego.-20 °C do 6 miesięcy
Roztwór para-nitrofenylfosforanu (pNPP)Rozpuszczać para-nitrofenylfosforan (pNPP) w buforze substratowym do stężenia roboczego 1 mg/mL-20 °C do 12 miesięcy
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)8,0 g chlorku sodu (NaCl), 0,2 g jednozasadowego fosforanu potasu (KH2PO4), 1,15 g dwuzasadowego fosforanu sodu (Na2HPO4), 0,2 g chlorku potasu (KCl), 0,2 g azydu sodu (NaN3), rozpuszczonych w 1 litrze zjonowego H2O, pH 7,4.-20 °C do 12 miesięcy
Przeciwciało pierwotne w buforze blokującymOdtworzenie liofilizowanego przeciwciała pierwotnego zgodnie z instrukcją producenta, aby uzyskać skoncentrowany zapas. Rozcieńcz uzyskane zrekonstituowane pierwotne zapasy przeciwciał w buforze blokującym do stężenia roboczego 2 μg/mL.-20 °C do 6 miesięcy
Przeciwciało pierwotne w buforze powłokowymOdtworzenie liofilizowanego przeciwciała pierwotnego zgodnie z instrukcją producenta, aby uzyskać skoncentrowany zapas. Rozcieńcz uzyskane zrekonstytuowane pierwotne przeciwciała w buforze powłokowym do stężenia roboczego 2 μg/mL.-20 °C do 6 miesięcy
Przeciwciało wtórne1:1000 koncentratu przeciwciał wtórnych: bufor sprzężony-20 °C do 6 miesięcy
Bufor podłoża97 ml diethanolaminy, 0,2 g azyku sodu (NaN3), rozpuszcza się w 1 litrze dejonizowanego H2O, pH 9,8-20 °C do 12 miesięcy
Bufor płukania0,5 ml Tween 20 (0,05% v/v), rozpuszczonego w 1 L PBS, pH 7,5-20 °C do 12 miesięcy

Tabela 1: Przepis na bufory.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metoda spektrofotometrii immunofluorescencyjnej została po raz pierwszy zastosowana do ilościowego określenia kallozy w bulwach bananowych. Opiera się na enzymatycznym testie immunologicznym (EIA), używanym do ilościowego pomiaru kallozy w surowym wylocie 1 M NaOH z banana przy użyciu przeciwciał specyficznych dla kalozy 47,51,52. Krótko mówiąc, ten nowy test ilościowy oparty na spektrofotometrii immunofluorescencyjnej, specyficzny dla kalozy, polegał na pokryciu mikropłytki przeciwciałem specyficznym dla kalozy, które następnie wiązało się z kallosą w wytrze roślinnym, a następnie pojawiło się przeciwciało wtórne również specyficzne dla kalozy. Następnie dodaje się wykrywanie przeciwciała powiązanego z enzymem (fosfatazą alkaliczną), co tworzy kompleks z przeciwciałem wtórnym. Następnie dodaje się podłoże, para-nitrofenylfosforan (pNPP). Ilościowa identyfikacja kallozy w próbce opiera się na zdolności fosfatazy alkalicznej do rozszczepiania grup fosforanowych z cząsteczek pNPP, co skutkuje powstaniem żółtego związku (p-nitrofenol). Wykrywanie intensywności żółtego koloru przeprowadzono za pomocą spektrofotometru na 405 nm, a absorpcję skorelowano z aktywnością fosfatazy alkalicznej, która była bezpośrednio proporcjonalna do stężenia kalloz obecnego w próbce. Reakcję zatrzymano poprzez podniesienie pH poprzez dodanie 0,5 M NaOH, co zapobiegło dalszej aktywności fosfatazy alkalicznej.

Natomiast metoda standardowo-złota do lokalizacji i ilościowania kallos to metoda mikroskopii epifluorescencyjnej, dobrze znana metoda oparta na barwieniu kallosu fluorochromem anilinowym błękitnym53. Krótko mówiąc, metoda ta opiera się na specyficznym wiązaniu barwnika błękitu anilinowego z beta-1,3-glukanami (kalozą), tworząc kompleks. Anilinowy błękit w tym kompleksie jest następnie wzbudzany za pomocą światła ultrafioletowego (długość fali 365-375 nm). Gdy barwnik anilinowy jest wzbudzony, emituje niebieską fluorescencję, która jest rejestrowana, umożliwiając specyficzną wizualizację kallozy w tkankach roślinnych53. Ilościowa ilościowa kallosa barwionego na niebiesko anilina opiera się na serii technik obrazowania, które określają ilość fluorescencji pochodzącej z tkanek roślinnych. Fluorescencja jest proporcjonalna do ilości kallose dostępnej w tkankach roślinnych. Mikroskopia epifluorescencyjna była wykorzystywana do wizualizacji i ilościowej kallozy w stresie biotycznym54.

W osobnym badaniu depozycji kallosowej zidentyfikowano zarówno za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej, jak i spektrofotometrii immunofluorescencyjnej49. Chociaż zaobserwowano pewne różnice w danych, analiza statystyczna w dużej mierze wykazała zgodność danych z mikroskopii epifluorescencyjnej i spektrofotometrii immunofluorescencyjnej, co wskazuje na spójność obu metod wykrywania kallosów49. Chociaż wyniki obu metod były w dużej mierze zbieżne, zaleca się, aby zarówno mikroskopia epifluorescencyjna, jak i spektrofotometria immunofluorescencyjna wzajemnie się uzupełniały dla bardziej wiarygodnej oceny. Mimo że metoda oparta na ELISA jest specyficzna dla kalozy, wrażliwa i niezawodna, początkowo jest czasochłonna podczas optymalizacji protokołu i uzyskania najlepiej dopasowanej krzywej standardowej, która pasuje do wszystkich stężeń i absorpcji.

Niektóre metody ilościowania kallosów są pracochłonne 17,32,55, czasochłonne 26,56, niespecyficzne dla kalozy, ponieważ błękit anilinowy może barwić inne β-1,3-glukan opróczkallosy 30, wymagają drogiego i zaawansowanego oprogramowania do liczenia kalloz 23,24,26, wymagają znacznych umiejętności technicznych, a wysokie tło/autofluorescencja związana ze spektrofotometrią fluorescencyjną sprawia, że ilościowość Callose jest trudna i zawodna26. Metody ilościowej Callose oparte na zautomatyzowanym procesie analizy obrazów, takie jak oprogramowanie ImageJ, wymagają odpowiedniego szkolenia wtyczki do analizy obrazów, takiej jak Trainable Weka Segmentation (TWS) dla ImageJ, co jest bardzo uciążliwe57.

Testy oparte na spektrofotometrii immunofluorescencyjnej są bardzo preferowane ze względu na swoją specyficzność, czułość, łatwość obsługi oraz powtarzalność. Należy jednak pamiętać, że system detekcji i jego czułość mogą się różnić w zależności od konkretnego protokołu testowego i używanego sprzętu.

Tutaj opisano nową metodę ilościowej kallosu opartą na spektrofotometrii immunofluorescencyjnej. Opisana tutaj metoda mogłaby być stosowana do ilościowej identyfikacji kallozy w różnych tkankach roślinnych i gatunkach z zadowalającym poziomem specyficzności dla kalozy, wysoką precyzją i powtarzalnością. Metoda ta jest uzupełnieniem różnych metod ilościowego kallosowania i może być wykorzystywana do monitorowania zmian poziomu kallosu podczas wzrostu i rozwoju roślin oraz w odpowiedzi na różne bodźce lub zabiegi. Ponadto zastosowanie płyty 96-dołkowej ogranicza subiektywne próbkowanie i analizę, co czyni tę metodę odpowiednią do ilościowej analizy kallozy o wysokiej przepustowości. Warto zauważyć, że chociaż kallosa może być łatwo wyodrębniona ze świeżo zebranych tkanek roślinnych 17,27,55, to etap przygotowania próbek polegający na liofilizacji zgodnie z nowym protokołem zapewnia możliwość przechowywania próbek przez bardzo długi czas (do 1 roku) oraz umożliwia przechowywanie i transport łatwo psujących się próbek biologicznych między odległymi laboratoriami w temperaturze otoczenia. Pozwala to na powtarzalne ekstrakcje kallose bez konieczności wielokrotnego przygotowywania całego eksperymentu do pobierania świeżych próbek.

Spektrofotometria immunofluorescencyjna jest zalecana do eksperymentów ilościowej kallose o wysokiej wydajności, natomiast mikroskopia epifluorescencyjna i mikrokopia immunofluorescencyjna mogą być wykorzystywane zarówno do ilościowej identyfikacji kallos, jak i histolokalizacji kallosu w tkankach roślinnych. Aby zapewnić dokładny, efektywny i niezawodny rozkład przestrzenno-czasowy kallozy w tkankach roślinnych, zaleca się jednoczesne stosowanie różnych metod ilościowania kallozy, takich jak mikroskopia, spektrofotometria oraz metody oparte na aktywności enzymów. W konsekwencji pozwoli to dokładnie i efektywnie zrozumieć rolę kallozy w różnych reakcjach fizjologicznych i stresowych. Przyszłe badania mogłyby kompleksowo i jednocześnie ocenić kilka metod ilościowej kallozy, w tym mikroskopię epifluorescencyjną, mikroskopię immunofluorescencyjną, spektrofotometrię fluorescencyjną, spektrofotometrię immunofluorescencji oraz metody oparte na aktywności enzymatycznej.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania te zostały sfinansowane przez The Bill & Melinda Gates Foundation, numer grantu INV 009894/OPP1134098. Fundatorzy nie mieli udziału w projektowaniu badania; w zbieraniu, analizach lub interpretacji danych; przy pisaniu rękopisu; ani w decyzji o publikacji wyników.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Folia aluminiowa  Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Analityczna waga Mettler-Toledo AG, Greifensee, SzwajcariaML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, USA1001 EUR
Papier do osuszania  Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenia
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)  Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAB14
Wirówka, 5425REppendorf, Hamburg, Niemcy5406000240
Połączona lodówka-zamrażarka (4 stopnie; C i − 20 & f; C) Haier Medical and Laboratory Co. Ltd., Qingda, ChinyHYCD-282
Diethanolamina  PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania191287
Cyfrowy shaker, MixMateEppendorf, Hamburg, Niemcy5353000529
Di-fosforan sodu (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania141679
Płytki ELISA, 96-dołkowe, płaska podstawa, przezroczyste, polistyrenowe, o wysokim wiązaniuSarstedt AG & kompania KG, Nü mbrecht, Niemcy82.1581.200
Filtr do czytnika mikropłyt iMark, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Kapsztad, RPABRD1681011
Liosuszarka VirTis— Ławka na ławce " K” serial; Model: 4KBTXLLabWrench, Kanada, USA448053
Kwas solny (HCl)  PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania141020
Inkubator wymuszonej konwekcji izotermycznej, IFA-54-8Esco Lifesciences Group, Singapur2100002
Laminaryna  Alfa Aesar, Massachusetts, USAJ66193
Rurki mikrowirówkowe 1,5 mL Eppendorf, Hamburg, Niemcy022363204
Rurki mikrowirówkowe 2 mL Genesee Scientific Corp., Kalifornia, USA24– 283
Mikropipeta (30 i skrzyżowanie; 300 i mu; L), 12-kanałowy, seria 2100 Eppendorf, Hamburg, NiemcyEP-12-300R
Końcówki mikropipety epT.I.P.S.  SingleEppendorf, Hamburg, Niemcy022363204
Mikropipety (0,5 i przerwa; 1000 i mu; L), badania i niebsp; PlusEppendorf, Hamburg, Niemcy3123000900
Czytnik absorpcji mikropłyt, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornia, USA1681135EDU
Microplate Manager 6 Wersja 6 oprogramowania & nbsp;Bio-Rad Laboratories, Inc., Kalifornia, USA1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & kompania KG, Lauda-Kö nigshofen, Niemcy740751
Para-nitrofenylfosforan (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Niemcy20-106
pH miernik, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA02310048991
Poliwinylpirolidon (PVP) i nbsp;PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, HiszpaniaA2260
Chlorek potasu (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, HiszpaniaA2939
Fosforan potasu (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania141509
Precyzyjna kąpiel wodna, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, USATSGP10
Przeciwciało główne (1-3-β-mysz skierowane glukanem)  Bio dostarcza Australia Pty Ltd., Melbourne, Australia400-2
Rezerwuary odczynników  Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA15075
Przeciwciało wtórne sprzężone z fosfatazą alkaliczną (antymysza IgG-fosfataza alkaliczna)  Sigma Life Sciences, New Jersey, USAA5153
Azyd sodu (NaN3)  PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, HiszpaniaA1430
Węglan sodu (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania141648
Chlorek sodu (NaCl)  PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, HiszpaniaA2942
Węglan sodu (NaHCO3)  PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania141638
Wodorotlenek sodu (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcelona, Hiszpania141687.1210
Tween-20Biomatik Corporation, Ontario, KanadaA4031
Ultraczysta woda destylowanaThermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA10-977-015

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Callose QuantificationCallose Specific AntibodiesFluorescence SpectrophotometryEpifluorescence MicroscopyBanana Corm TissueBiotic StressHigh Throughput Quantification
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły