Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.
Artykuł metodologiczny
Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Alkoholowe zaburzenia płodowe (FASD) opisują wszystkie wady wrodzone wywołane alkoholem. Wady wrodzone, takie jak niedobory wzrostu, nieprawidłowości czaszkowo-twarzowe, behawioralne i poznawcze, są związane z FASD. Trudności społeczne są częstymi nieprawidłowościami behawioralnymi związanymi z FASD i często skutkują poważnymi problemami zdrowotnymi. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów odpowiedzialnych za defekty społeczne wywołane etanolem. Danio pręgowany to kręgowce społeczne, które wytwarzają zewnętrznie zapłodnione przezroczyste jaja; Cechy te zapewniają naukowcom precyzyjną, ale prostą procedurę tworzenia fenotypu FASD i wrodzonego zachowania, które można wykorzystać do modelowania deficytów społecznych związanych z FASD. Tak więc danio pręgowany jest idealny do charakteryzowania deficytów społecznych FASD. Celem obecnego protokołu jest dostarczenie użytkownikowi prostego testu behawioralnego, który można wykorzystać do scharakteryzowania konsekwencji negatywnego środowiska na wczesnym etapie rozwoju i wpływu, jaki może ono mieć na zachowania społeczne w wieku dorosłym. Protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania wpływu mutacji lub teratogenów na zachowania społeczne dorosłych. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak scharakteryzować zachowanie społeczne poszczególnych ryb podczas 20-minutowego testu społecznego. Co więcej, dane uzyskane przy użyciu obecnego protokołu dostarczają dowodów na to, że protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania skutków wad społecznych wywołanych embrionalnym etanolem u dorosłych danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Prenatalne narażenie na alkohol może prowadzić do różnych wad wrodzonych, znanych jako spektrum płodowych zaburzeń alkoholowych (FASD)1. Upośledzone zachowanie, takie jak trudności społeczne, są częstymi wadami wrodzonymi związanymi z FASD2,3. Niestety, trudności społeczne często skutkują poważnymi problemami ze zdrowiem psychicznym4, które mogą niekorzystnie wpłynąć na jakość życia osób z FASD. Dlatego zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za defekty społeczne wywołane etanolem ma kluczowe znaczenie.
Danio pręgowany ma cechy biologiczne i behawioralne, które czynią je dobrze nadającymi się do pogłębiania naszego zrozumienia mechanizmów odpowiedzialnych za wady społeczne wywołane etanolem. Na przykład danio pręgowany wytwarza duże ilości przezroczystych, zewnętrznie zapłodnionych jaj; te cechy biologiczne pozwalają naukowcom łatwo tworzyć precyzyjne i powtarzalne fenotypy FASD5. Aby wystawić zarodki na działanie etanolu w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf), wystarczy użyć mikroskopu preparacyjnego, aby zbadać przezroczystą komórkę jajową i etapizować zarodek w oparciu o wcześniej opublikowane prace, takie jak Kimmel i wsp.6, a następnie umieścić jajo w pożądanym stężeniu etanolu na żądany czas. Ponieważ kosmówka jest słabą barierą dla alkoholu7, etanol łatwo kąpie zarodek. Aby zatrzymać ekspozycję, wystarczy usunąć jaja z roztworu etanolu. Oprócz zapewnienia naukowcom prostej, ale dokładnej metody tworzenia fenotypów FASD, danio pręgowany pozwala również naukowcom na dokonywanie porównań genetycznych z ludźmi, ponieważ 70% ludzkich genów ma ortologię danio pręgowanego, dlatego są cennym narzędziem do zrozumienia genów związanych z chorobami ludzkimi8. Dodatkowo, w przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych, danio pręgowany tworzy grupy społeczne9 zwane shoals10. Zachowanie związane z płycizną może być wykorzystane do scharakteryzowania wpływu embrionalnej ekspozycji na etanol na zachowania społeczne11. Co więcej, u danio pręgowanego reakcję społeczną można wywołać za pomocą sterowanych komputerowo bodźców społecznych12 lub żywego bodźca społecznego13.
Poprzednie prace opisywały reakcję społeczną dorosłych ryb danio pręgowanych w grupach14, jednak ograniczeniem tego podejścia jest niemożność skorelowania zachowania pojedynczej ryby z konkretną miarą, taką jak zmiany poziomu neuroprzekaźników11. Poniższy protokół da użytkownikom możliwość scharakteryzowania zachowań społecznych poszczególnych dorosłych ryb zebry. Ponieważ zachowania społeczne są nabywane dla poszczególnych ryb, użytkownicy protokołu mogą teraz skorelować nabyty profil behawioralny każdej ryby z zależnym wynikiem. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że embrionalna ekspozycja na etanol upośledza odpowiedź dopaminergiczną na bodziec społeczny11. Podczas gdy przedstawione tutaj dane wykorzystały ekspozycję na embrionalny etanol jako zmienną niezależną, użytkownicy protokołu mogą scharakteryzować wpływ innych terapii farmakologicznych lub mutacji genetycznych na zachowania społeczne. Co więcej, użytkownicy protokołu nie są ograniczeni do zbadania, w jaki sposób leczenie embrionalne zmienia zachowanie, ale mogą również określić, jak ostre leczenie farmakologiczne u dorosłych danio pręgowanego wpływa na zachowania społeczne15.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Południowej Dakoty.
1. Trzymanie danio pręgowanego, pielęgnacja i ekspozycja na embrionalny etanol
- Hoduj i hoduj danio pręgowanego zgodnie z opisem16.
- Narażenie na etanol
- Wybierz odpowiedni etap rozwoju, na którym chcesz przeprowadzić ekspozycję na etanol. W tym protokole zarodki zostały wystawione na działanie etanolu w stężeniu 24 hpf.
- Umieść jajka w 1,0% objętości etanolu na 2 godziny15. Dobrą praktyką jest stosunek 1 jaja na ml EM. W szczególności umieść zarodki w 50 ml pożywki dla zarodków (EM; zobacz Westerfield16 dla przepisu EM), a następnie usuń 500 μl EM i zastąp 500 μL etanolu.
- Po ekspozycji na etanol wyhoduj zarodki zgodnie z opisem17. Testuj zachowania społeczne, gdy ryby mają 16 tygodni.
2. Losowość i konfiguracja czołgu
- Korzystając z internetowego generatora sekwencji losowych, zrandomizuj wszystkie badania a priori przed przeprowadzeniem testów behawioralnych. Upewnij się, że strona bodźca i grupy leczone różnią się losowo.
- Aby uniknąć czynników zakłócających, takich jak pora dnia lub dzień testowania, rozpoczynaj i kończ test behawioralny o tej samej porze każdego dnia i przeprowadzaj testy behawioralne w kolejnych dniach, aż wszystkie ryby doświadczalne zostaną przetestowane.
- Do tego testu (Rysunek 1), użyj zbiornika o pojemności 37 litrów (50 cm x 25 cm x 30 cm, dł. x szer. x wys.) z butlami o pojemności 1,4 l umieszczonymi na zewnątrz wzdłuż szerokości zbiornika, jak opisano wcześniej17.
- Wyłóż tył i dno zbiornika o pojemności 37 litrów białym falistym tworzywem sztucznym, aby zwiększyć kontrast między rybami doświadczalnymi a tłem i poprawić śledzenie wideo.
- Umieść tekturę falistą na zewnętrznej ścianie zbiorników o pojemności 1,4 l, aby zwiększyć kontrast bodźca społecznego dla ryb doświadczalnych. Na koniec umieść biały falisty plastik między zbiornikami o pojemności 1,4 l i 37 l; Ta nieprzezroczysta bariera służy do uniemożliwienia rybom doświadczalnym oglądania bodźca społecznego podczas habituacji.
- Umieść kamerę w odległości wystarczająco dużej, aby uchwycić całą długość zbiornika o pojemności 37 litrów oraz połowę zbiorników o pojemności 1,4 litra i dokładnie śledzić dorosłe ryby doświadczalne.
UWAGA: Sprawdzenie, po której stronie znajduje się bodziec, zapewnia, że badacze prawidłowo oznaczyli strefy śledzenia i zapewnia redundancję jako kopię zapasową. - Jeśli śledzenie w podczerwieni nie jest używane, upewnij się, że zbiornik o pojemności 37 l jest oświetlony. Używaj wszelkich dostępnych na rynku lamp okapowych akwariowych z lampą o pełnym spektrum 15 W T8.
UWAGA: Jeśli ustawianych jest wiele aren, użyj identycznych okapów akwariowych z identycznymi lampami.
3. Przeprowadzanie testu społecznego
- Zacznij od napełnienia zbiornika o pojemności 37 litrów używanego do testu behawioralnego wodą, która jest identyczna z wodą używaną w szafie mieszkaniowej. Upewnij się, że temperatura wody mieści się w zakresie 2 °C od stelaża obudowy.
- Pod koniec dnia opróżnij zbiornik o pojemności 37 l. Rozpocznij każdy dzień testowy od świeżej wody. Upewnij się, że poziom wody w zbiorniku o pojemności 37 l i poziom wody w zbiornikach o pojemności 1.4 l są identyczne. Jeśli temperatura w pomieszczeniu nie utrzymuje wody w zbiorniku o pojemności 37 l na poziomie 28.5 °C 2 °C, należy wymienić wodę na ciepłą wodę o temperaturze 28.5 °C.
- Następnie ustaw strefy zainteresowania. Zapoznaj się z wybranym przez użytkownika oprogramowaniem do ręcznego śledzenia, aby utworzyć strefy. W protokole tym wzdłuż długości zbiornika o pojemności 37 litrów na górze i na dole zastosowano taśmę mierniczą do oznaczania odstępów co 5 cm. Biorąc pod uwagę, że zbiornik testowy ma 50 cm, przyrosty co 5 cm prowadzą do 10 stref, z których każda ma 5 cm.
- Korzystając z oznaczeń wykonanych na zbiorniku o pojemności 37 litrów jako odniesienia, użyj oprogramowania do skonstruowania stref, łącząc punkt 5 cm na górze z odpowiednim punktem 5 cm na dole. Dodatkowo utwórz strefę wzdłuż dna i wzdłuż bodźca. Dostosuj strefy zainteresowania.
- Użyj oprogramowania śledzącego w tym protokole, aby zmierzyć odległość od strefy i czas spędzony w strefie. W protokole tym zastosowano 12 stref.
- Określ ilościowo czas spędzony w strefach od 1 do 10 oraz odległość od bodźca i dna jako strefę 1, jako strefę najbliższą bodźcowi, podczas gdy strefa 10 jest najbardziej oddalona od bodźca.
- Następnie wybierz dwóch samców i dwie samice, które zostaną użyte do bodźca społecznego. Najlepszą praktyką byłoby wykorzystanie samców i samic z tej samej kohorty co ryby doświadczalne. Jeśli nie jest to możliwe, spróbuj znaleźć ryby, które pasują do odmiany, wieku i wielkości ryb doświadczalnych.
- Przenieś rybę doświadczalną ze zbiornika mieszkalnego na arenę testową (zbiornik o pojemności 37 litrów). Użyj siatki, aby złapać ryby w zbiorniku mieszkalnym. Umieść siatkę z rybami w niej w pojemniku z wodą dla ryb.
UWAGA: Zastosowanie tego podejścia zmniejszy stres u ryb doświadczalnych podczas przemieszczania się między zbiornikami. - Umieść eksperymentalną rybę na środku areny testowej.
- Gdy ustawienia wykrywania są zadowalające w oparciu o wybrane przez użytkownika oprogramowanie (patrz instrukcja obsługi), rozpocznij 20-minutową próbę. Przez pierwsze 10 minut należy pozostawić nieprzezroczystą barierę między zbiornikiem o pojemności 37 l a zbiornikiem o pojemności 1,4 litra na miejscu. Uniemożliwi to rybom doświadczalnym dostrzeżenie bodźca społecznego, składającego się z dwóch samców i dwóch samic danio pręgowanego, i pozwoli rybom zaaklimatyzować się na arenie testowej13,17.
- Po 10 minutach ostrożnie usuń nieprzezroczyste bariery, pociągając je za zbiornik; pozwoli to rybom doświadczalnym zobaczyć bodziec społeczny.
- Użyj oprogramowania śledzącego, aby śledzić i określać ilościowo zachowanie ryb doświadczalnych 11, 12, 17 w oparciu o preferencje użytkownika i instrukcję oprogramowania. W obecnym protokole należy określić ilościowo odległość od bodźca społecznego i dna zbiornika, a także czas spędzony we wszystkich strefach.
- Analizuj dane przy użyciu tradycyjnych narzędzi do analizy danych.
Wyniki
Rysunek 2 został zmodyfikowany na podstawie pracy Fernandes et al.17 i pokazuje, że prenatalna ekspozycja na etanol tłumi reakcję tworzenia ławic, co wykazano poprzez badanie odległości od bodźca. Dane na Rysunku 2 przedstawiają odległość od bodźca społecznego podczas 20 min próby. Oś Y wskazuje odległość w centymetrach, natomiast oś X przedstawia 20 min próbę podzieloną na 1 min interwały. Czarny pasek wzdłuż osi X oznacza czas, w którym usunięto nieprzezroczyste bariery i bodziec społeczny stał się widoczny dla badanej ryby. We wszystkich grupach początkowo następuje gwałtowny spadek odległości w kierunku bodźca społecznego w momencie, gdy staje się on widoczny, co można określić po stromym spadku odległości między 9. a 10. minutą; jednakże, podczas gdy ryby kontrolne pozostają w bardzo bliskiej odległości od bodźca społecznego, ryby poddane działaniu alkoholu tak nie czynią, co sugeruje, że prenatalna ekspozycja na etanol wpływa na zachowania społeczne osobników dorosłych12,18.
Rysunek 3 został zmodyfikowany na podstawie pracy Fernandes i wsp.17 i wykorzystuje dane zebrane poprzez pomiar odległości do bodźca, aby dodatkowo wykazać wpływ prenatalnej ekspozycji na etanol na reakcję ławicowania. Dane na Rysunku 3 przedstawiają skrócenie dystansu do bodźca społecznego po jego pojawieniu się w polu widzenia. Aby obliczyć średnie skrócenie dystansu do bodźca, od średniej odległości do bodźca w okresie habituacji (gdy bodziec społeczny nie jest widoczny) odjęto średnią odległość do bodźca w okresie stymulacji (gdy bodziec jest widoczny); w związku z tym większa wartość ujemna oznacza silniejszą reakcję społeczną.
Rycina 4 przedstawia czas spędzony w strefach w zależności od odległości od bodźca. Rycina 4 zostało zmodyfikowane na podstawie pracy Fernandes i wsp.17. Rysunek 4A przedstawia czas (oś Y), jaki ryby spędzają w każdej z stref (oś X) podczas widoczności bodźca. Choć ryby ze wszystkich grup wykazują preferencję do strefy położonej najbliżej bodźca społecznego, ryby z grupy kontrolnej spędzają w strefie 1 niemal dwa razy więcej czasu niż ryby poddane działaniu alkoholu (Rycina 4B). Rycina 4C wykazuje, że prenatalna ekspozycja na etanol nie upośledziła mobilności, ponieważ nie stwierdzono różnic między grupami w poszczególnych strefach. W końcu, Rycina 4D wykazuje, że w przypadku braku bodźca społecznego ryby nie spędzają czasu w strefie najbliższej bodźcowi społecznemu. Zatem wyniki wskazują, że ryby z grupy kontrolnej zbliżają się do bodźca społecznego i pozostają w jego bezpośrednim sąsiedztwie, gdy jest on widoczny, podczas gdy ryby traktowane etanolem tego nie robią. Co więcej, dane przedstawione w Rycina 2 i Rysunek 4C sugeruje, że ekspozycja na etanol w okresie embrionalnym nie upośledza zdolności ryb do dostrzegania bodźca społecznego (Rycina 2) lub przenieść (Rysunek 4C), co stanowi silny dowód na to, że ekspozycja na etanol w okresie embrionalnym upośledza zachowania społeczne u dorosłych danio pręgowanych.
Rysunek 1: Schemat aparatury behawioralnej. Do oceny zachowań społecznych dorosłych danio przebrzosionych (linia ZT140) z ekspozycją na etanol w stadium embrionalnym i bez niej wykorzystano zbiornik o pojemności 37 L. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Fernandes i wsp.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Ekspozycja embrionów na etanol osłabia zachowania społeczne u dorosłych danio pręgowanych. Średnia odległość między dorosłą rybą eksperymentalną a żywą ławicą przedstawiona w odstępach 1 min podczas 20-minutowej sesji behawioralnej. Wykazano średnią ± SEM. Grupa kontrolna (n = 12); 1% etanolu (EtOH; n = 11). Poziomy pasek nad osią X, od 10 do 20 min, przedstawia oś czasu, w trakcie której żywa ławica jest widoczna dla osobników eksperymentalnych. Stężenie alkoholu jest podane nad wykresami. Rysunek zmodyfikowano na podstawie pracy Fernandes i wsp.17. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Ryby poddane działaniu alkoholu znajdują się znacząco dalej od żywej ławicy. Słupki przedstawiają różnicę w dystansie ryb od żywej ławicy przed i po pojawieniu się żywej ławicy. Większe wartości ujemne sugerują silniejszą reakcję na osobniki tego samego gatunku. Przedstawiono średnią ± SEM. Przedstawiono średnią ± SEM. Grupa kontrolna (n = 12); 1% etanolu (EtOH; n = 11). Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie pracy Fernandes et al.17. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rysunek 4: Ekspozycja na etanol w okresie embrionalnym zmienia czas spędzony w strefie 1 tylko wtedy, gdy widoczne jest żywe stado. (A) Słupki reprezentują czas spędzony we wszystkich 10 strefach podczas prezentacji bodźca. (B) Słupki reprezentują czas spędzony w strefie 1 podczas prezentacji bodźca. Strefa 1 to strefa najbliższa żywemu stadu, natomiast strefa 10 znajduje się najdalej od żywego stada. Zwróć uwagę na istotną różnicę w czasie spędzonym w strefie przez ryby z grupy kontrolnej. (C) Słupki reprezentują średni procent czasu spędzonego we wszystkich strefach podczas habituacji, w ciągu pierwszych 10 min. (D) Słupki reprezentują czas spędzony w strefie 1 podczas habituacji. Przedstawiono średnią ± SEM. Wielkości prób są następujące: Kontrola (n = 12); etanol (EtOH; n = 11). Rysunek zmodyfikowany na podstawie pracy Fernandes i wsp.17. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
Dyskusja
Danio pręgowany ma szereg cech biologicznych i behawioralnych, co czyni je bardzo atrakcyjnym organizmem do badań obejmujących geny, środowisko i zachowanie 5,19. Protokół ten daje użytkownikowi końcowemu stosunkowo prosty przewodnik po testowaniu zachowań społecznych, wiele sposobów ilościowego zachowania społecznego i ma potencjał do powiązania reakcji behawioralnych poszczególnych ryb z zabiegami, takimi jak ekspozycja na embrionalny etanol, mutacje genetyczne lub inne substancje farmakologiczne.
Aby ocenić zachowania społeczne u dorosłych danio pręgowanego, należy dokładnie przestrzegać tego protokołu w połączeniu z instrukcją obsługi wybranego oprogramowania śledzącego. Do zbudowania areny testowej potrzebny jest po prostu 37-litrowy zbiornik z pokrywą i lekkim materiałem z tektury falistej, dwa mniejsze zbiorniki na bodziec społeczny oraz kamera; Większość z tych przedmiotów można kupić w sklepach zoologicznych i każdym dużym sprzedawcy detalicznym. Kiedy pojedynczy danio pręgowany jest prezentowany z grupą danio pręgowanego, naturalnym zachowaniem pojedynczego danio pręgowanego jest zmniejszenie odległości od grupy przy jednoczesnym wydłużeniu czasu spędzonego w bliskiej odległości od grupy19, zachowanie to nazywa się reakcją na mieliznę19. Reakcja na mieliznę jest zachowaniem społecznym, które można scharakteryzować na dwa sposoby: po pierwsze, gdy bodziec społeczny jest widoczny, zmierz odległość między bodźcem społecznym a pojedynczą rybą12 , a po drugie, zmierz czas spędzony w strefie najbliższej bodźca społecznego, gdy jest on widoczny. Możliwość ilościowego określenia czasu spędzonego przez danio pręgowanego w strefie 5 cm, gdy widoczny jest bodziec społeczny, stanowi silny dowód na reakcję społeczną, biorąc pod uwagę, że ryby te mają średnio około 4 cm długości.
Podział zbiornika o długości 50 cm na obszary o długości 10, 5 cm pomaga w analizie statystycznej, ponieważ prawdopodobieństwo, że badana ryba znajdzie się w dowolnej strefie, jest takie samo. Na pierwszy rzut oka posiadanie dwóch miar dla tego samego wyniku wydaje się zbędne. Jednak nadmiarowość może zapewnić walidację. Dodatkowo, pomiary odległości i czasu trwania podczas habituacji mogą być wykorzystane do określenia, czy leczenie wpływa na wzrok lub ruch. Protokół ten wykorzystywał dostępne na rynku oprogramowanie do automatycznego śledzenia13,18, ale jest podatny na inne systemy śledzenia, a nawet ręczne śledzenie przez wyszkolonego obserwatora.
Niezależnie od używanego oprogramowania śledzącego, istnieją krytyczne kroki, które należy podjąć, aby zoptymalizować śledzenie. Najpierw wybierz tło, które zapewnia znaczny kontrast w porównaniu z nagrywanymi rybami. Danio pręgowany typu dzikiego ma poziome paski, które są złote i niebieskie20; Mają również mozaiki żółtych ksantoforów, srebrzystych lub niebieskich irydoforów i czarnych melanoforów20. Tak więc, charakteryzując zachowanie ryb typu dzikiego AB, użyj białego tła 12,13,17, z drugiej strony, charakteryzując zachowanie społeczne zebryka, którego brakuje pigmentu, użyj czarnego tła 17. Po drugie, upewnij się, że jest wystarczające oświetlenie do śledzenia ryb doświadczalnych. Jeśli istnieje wiele aren śledzących, upewnij się, że oświetlenie jest identyczne między arenami. Kolejnym krytycznym krokiem jest upewnienie się, że poziom wody w zbiorniku o pojemności 37 litrów odpowiada poziomowi wody w zbiornikach o pojemności 1,4 litra, aby upewnić się, że badane ryby nie mogą pływać w obszarach, które nie mają bodźca społecznego. Dodatkowo upewnij się, że zbiornik o pojemności 1.4 l znajduje się w kadrze podczas nagrywania filmów; Zapewni to kopię zapasową na wypadek, gdyby wymagane było ręczne kodowanie danych lub konieczna jest weryfikacja strony bodźca.
Typowe problemy w protokole to nieprawidłowe śledzenie obiektu, niewystarczający okres przyzwyczajenia i krótkie opóźnienie podczas przeciągania nieprzezroczystych barier, gdy ustawianych jest wiele aren. Aby uniknąć nieprawidłowego śledzenia obiektu, upewnij się, że istnieje wystarczający kontrast między rybą a tłem, jak wspomniano wcześniej, i przestrzegane są wytyczne oprogramowania. Dodatkowo, jeśli oprogramowanie użytkownika zezwala na śledzenie w podczerwieni, może to złagodzić problemy związane z kontrastem. Chociaż 10 minut może wydawać się długim czasem jak na okres przyzwyczajenia, nasza niepublikowana praca sugeruje, że skrócenie czasu przyzwyczajenia negatywnie wpływa na protokół. Wreszcie, jeśli nieprzezroczysta bariera między zbiornikami o pojemności 37 l i 1,4 l jest ciągnięta ręcznie i jeśli ustawionych jest wiele aren, wszystkie bariery nie mogą zostać pociągnięte dokładnie w tym samym czasie, chyba że wiele osób ciągnie bariery. Alternatywnie, jeśli tylko jedna osoba przeprowadza test, należy zrównoważyć, które bariery areny zostaną pociągnięte jako pierwsze.
Chociaż protokół jest prosty, koszt oprogramowania śledzącego i dodatkowy czas potrzebny na indywidualne scharakteryzowanie ryb są potencjalnymi pułapkami. W protokole tym wykorzystano dostępne na rynku oprogramowanie do śledzenia zachowania ryb doświadczalnych, co pozwala uniknąć stronniczości obserwatora i zwiększa przepustowość poprzez ustawienie wielu aren, a tym samym rejestrowanie wielu ryb. Mimo że w tym protokole użyto oprogramowania komercyjnego, dostępne jest inne oprogramowanie śledzące, w tym oprogramowanie bezpłatne. Użycie tego protokołu z wybranym przez użytkownika końcowego śledzeniem spowoduje odtworzenie testu społecznego. W protokole tym scharakteryzowano zachowanie pojedynczej ryby; Inni skupili się na badaniu grup danio pręgowanego14 , co jest jednym ze sposobów na rozwiązanie potencjalnej pułapki związanej z charakteryzowaniem jednej ryby na raz. Alternatywnie, jak wspomniano wcześniej, korzystanie z wielu aren testowych w tym samym czasie może zwiększyć przepustowość przy jednoczesnym zachowaniu możliwości przypisania profilu behawioralnego do pojedynczej ryby. Utrzymanie zdolności do korelowania profilu behawioralnego poszczególnych ryb jest ważne, ponieważ daje badaczowi możliwość poszukiwania zmienności w badanej grupie. Chociaż embrionalna ekspozycja na etanol została wykorzystana jako zmienna niezależna w reprezentatywnych danych, przyszłe zastosowania techniki opisanej w obecnym protokole nie ograniczają się po prostu do scharakteryzowania wpływu embrionalnej ekspozycji na etanol na zachowania społeczne. Na przykład, można określić wpływ mutacji genetycznych21 lub innych terapii farmakologicznych22 na zachowania społeczne. Ponadto, oprócz embrionalnej ekspozycji na etanol, przyszłe prace mogą scharakteryzować wpływ innych teratogenów na zachowania społeczne. W związku z tym obecny protokół jest przydatny dla każdego badacza zainteresowanego zrozumieniem, w jaki sposób geny i/lub środowisko wpływają na zachowania społeczne.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Fundusze na wsparcie tych badań zostały zapewnione przez National Institutes of Health (NIH)/National Institute on Alcohol Abuse (NIAAA) [R00AA027567] dla Y.F.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,4-l ZT140 Zbiorniki wodne | Aquaneering | ZT140 | Zbiorniki na bodźce społeczne |
| Aqueon 20" Deluxe Fluorescencyjny Full Hood oświetlenie akwariowe | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | Światło do zbiornika 37-I | |
| Aqueon Standard Zbiornik akwariowy ze szkła otwartego, zbiornik 10 galonów | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | 37 l do testu społecznego | |
| Etanol | Fisher Scienticfic | ||
| System śledzenia BP28184 Ethovision XT | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| kolorowa kamera Basler GigE | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| Biały tektura falista | Tworzywo sztuczne do wyściełania tylnej i dolnej części zbiornika 37-I oraz tylnej części zbiorników używanych do stymulacji społecznej |
Bibliografia
- Institue Med. Fetal alcohol syndrome: diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academies Press. Washington, D.C. (1996).
- Abel, E. L. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. , Springer. (1984).
- Stevens, S. A., Clairman, H., Nash, K., Rovet, J. Social perception in children with fetal alcohol spectrum disorder. Child Neuropsychol. 23 (8), 980-993 (2017).
- Streissguth, A. P., et al. Risk factors for adverse life outcomes in fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. J Dev Behav Pediatr. 25 (4), 228-238 (2004).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: zebrafish as a model for ethanol teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
- Pitcher, T. J. Heuristic definitions of fish shoaling behaviour. Animal Behav. 31 (2), 611-613 (1983).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Embryonic alcohol exposure impairs the dopaminergic system and social behavioral responses in adult zebrafish. Int J Neuropsychopharmacol. 18 (6), pyu089(2015).
- Fernandes, Y., Gerlai, R. Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish. Alcohol Clin Exp Res. 33 (4), 601-609 (2009).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Jones, E. M., Eberhart, J. K. Social deficits following embryonic ethanol exposure arise in post-larval zebrafish. Addict Biol. 24 (5), 898-907 (2019).
- Buske, C., Gerlai, R. Early embryonic ethanol exposure impairs shoaling and the dopaminergic and serotoninergic systems in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 33 (6), 698-707 (2011).
- Pannia, E., Tran, S., Rampersad, M., Gerlai, R. Acute ethanol exposure induces behavioural differences in two zebrafish (Danio rerio) strains: A time course analysis. Behav Brain Res. 259, 174-185 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)/Monte Westerfield. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2007).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Eberhart, J. K. Social behavioral phenotyping of the zebrafish casper mutant following embryonic alcohol exposure. Behav Brain Res. 356, 46-50 (2019).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Impairment of social behaviour persists two years after embryonic alcohol exposure in zebrafish: A model of fetal alcohol spectrum disorders. Behav Brain Res. 292, 102-108 (2015).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochem Cell Biol. 96 (2), 88-97 (2018).
- Park, J. S., et al. Innate color preference of zebrafish and its use in behavioral analyses. Mol Cells. 39 (10), 750-755 (2016).
- Gerlai, R., et al. Forward genetic screening using behavioral tests in zebrafish: a proof of concept analysis of mutants. Behav Genet. 47 (1), 125-139 (2017).
- Scerbina, T., Chatterjee, D., Gerlai, R. Dopamine receptor antagonism disrupts social preference in zebrafish: a strain comparison study. Amino Acids. 43 (5), 2059-2072 (2012).
Przedruki i uprawnienia
