Celem obecnego protokołu jest nakreślenie kroków niezbędnych do ustanowienia i użycia testu preferencji społecznych dla dorosłych ryb danio pręgowanego i pokazanie, że można go użyć do scharakteryzowania wad społecznych wywołanych etanolem.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Modelowanie płodowych zaburzeń alkoholowych u danio pręgowanego w celu scharakteryzowania wpływu niekorzystnego środowiska embrionalnego na zachowania społeczne dorosłych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Alkoholowe zaburzenia płodowe (FASD) opisują wszystkie wady wrodzone wywołane alkoholem. Wady wrodzone, takie jak niedobory wzrostu, nieprawidłowości czaszkowo-twarzowe, behawioralne i poznawcze, są związane z FASD. Trudności społeczne są częstymi nieprawidłowościami behawioralnymi związanymi z FASD i często skutkują poważnymi problemami zdrowotnymi. Modele zwierzęce mają kluczowe znaczenie dla zrozumienia mechanizmów odpowiedzialnych za defekty społeczne wywołane etanolem. Danio pręgowany to kręgowce społeczne, które wytwarzają zewnętrznie zapłodnione przezroczyste jaja; Cechy te zapewniają naukowcom precyzyjną, ale prostą procedurę tworzenia fenotypu FASD i wrodzonego zachowania, które można wykorzystać do modelowania deficytów społecznych związanych z FASD. Tak więc danio pręgowany jest idealny do charakteryzowania deficytów społecznych FASD. Celem obecnego protokołu jest dostarczenie użytkownikowi prostego testu behawioralnego, który można wykorzystać do scharakteryzowania konsekwencji negatywnego środowiska na wczesnym etapie rozwoju i wpływu, jaki może ono mieć na zachowania społeczne w wieku dorosłym. Protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania wpływu mutacji lub teratogenów na zachowania społeczne dorosłych. Przedstawiony tutaj protokół pokazuje, jak scharakteryzować zachowanie społeczne poszczególnych ryb podczas 20-minutowego testu społecznego. Co więcej, dane uzyskane przy użyciu obecnego protokołu dostarczają dowodów na to, że protokół może być wykorzystany do scharakteryzowania skutków wad społecznych wywołanych embrionalnym etanolem u dorosłych danio pręgowanego.
Wprowadzenie
Prenatalne narażenie na alkohol może prowadzić do różnych wad wrodzonych, znanych jako spektrum płodowych zaburzeń alkoholowych (FASD)1. Upośledzone zachowanie, takie jak trudności społeczne, są częstymi wadami wrodzonymi związanymi z FASD2,3. Niestety, trudności społeczne często skutkują poważnymi problemami ze zdrowiem psychicznym4, które mogą niekorzystnie wpłynąć na jakość życia osób z FASD. Dlatego zrozumienie mechanizmów odpowiedzialnych za defekty społeczne wywołane etanolem ma kluczowe znaczenie.
Danio pręgowany ma cechy biologiczne i behawioralne, które czynią je dobrze nadającymi się do pogłębiania naszego zrozumienia mechanizmów odpowiedzialnych za wady społeczne wywołane etanolem. Na przykład danio pręgowany wytwarza duże ilości przezroczystych, zewnętrznie zapłodnionych jaj; te cechy biologiczne pozwalają naukowcom łatwo tworzyć precyzyjne i powtarzalne fenotypy FASD5. Aby wystawić zarodki na działanie etanolu w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf), wystarczy użyć mikroskopu preparacyjnego, aby zbadać przezroczystą komórkę jajową i etapizować zarodek w oparciu o wcześniej opublikowane prace, takie jak Kimmel i wsp.6, a następnie umieścić jajo w pożądanym stężeniu etanolu na żądany czas. Ponieważ kosmówka jest słabą barierą dla alkoholu7, etanol łatwo kąpie zarodek. Aby zatrzymać ekspozycję, wystarczy usunąć jaja z roztworu etanolu. Oprócz zapewnienia naukowcom prostej, ale dokładnej metody tworzenia fenotypów FASD, danio pręgowany pozwala również naukowcom na dokonywanie porównań genetycznych z ludźmi, ponieważ 70% ludzkich genów ma ortologię danio pręgowanego, dlatego są cennym narzędziem do zrozumienia genów związanych z chorobami ludzkimi8. Dodatkowo, w przeciwieństwie do innych modeli zwierzęcych, danio pręgowany tworzy grupy społeczne9 zwane shoals10. Zachowanie związane z płycizną może być wykorzystane do scharakteryzowania wpływu embrionalnej ekspozycji na etanol na zachowania społeczne11. Co więcej, u danio pręgowanego reakcję społeczną można wywołać za pomocą sterowanych komputerowo bodźców społecznych12 lub żywego bodźca społecznego13.
Poprzednie prace opisywały reakcję społeczną dorosłych ryb danio pręgowanych w grupach14, jednak ograniczeniem tego podejścia jest niemożność skorelowania zachowania pojedynczej ryby z konkretną miarą, taką jak zmiany poziomu neuroprzekaźników11. Poniższy protokół da użytkownikom możliwość scharakteryzowania zachowań społecznych poszczególnych dorosłych ryb zebry. Ponieważ zachowania społeczne są nabywane dla poszczególnych ryb, użytkownicy protokołu mogą teraz skorelować nabyty profil behawioralny każdej ryby z zależnym wynikiem. Na przykład wcześniejsze prace wykazały, że embrionalna ekspozycja na etanol upośledza odpowiedź dopaminergiczną na bodziec społeczny11. Podczas gdy przedstawione tutaj dane wykorzystały ekspozycję na embrionalny etanol jako zmienną niezależną, użytkownicy protokołu mogą scharakteryzować wpływ innych terapii farmakologicznych lub mutacji genetycznych na zachowania społeczne. Co więcej, użytkownicy protokołu nie są ograniczeni do zbadania, w jaki sposób leczenie embrionalne zmienia zachowanie, ale mogą również określić, jak ostre leczenie farmakologiczne u dorosłych danio pręgowanego wpływa na zachowania społeczne15.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Południowej Dakoty.
1. Trzymanie danio pręgowanego, pielęgnacja i ekspozycja na embrionalny etanol
- Hoduj i hoduj danio pręgowanego zgodnie z opisem16.
- Narażenie na etanol
- Wybierz odpowiedni etap rozwoju, na którym chcesz przeprowadzić ekspozycję na etanol. W tym protokole zarodki zostały wystawione na działanie etanolu w stężeniu 24 hpf.
- Umieść jajka w 1,0% objętości etanolu na 2 godziny15. Dobrą praktyką jest stosunek 1 jaja na ml EM. W szczególności umieść zarodki w 50 ml pożywki dla zarodków (EM; zobacz Westerfield16 dla przepisu EM), a następnie usuń 500 μl EM i zastąp 500 μL etanolu.
- Po ekspozycji na etanol wyhoduj zarodki zgodnie z opisem17. Testuj zachowania społeczne, gdy ryby mają 16 tygodni.
2. Losowość i konfiguracja czołgu
- Korzystając z internetowego generatora sekwencji losowych, zrandomizuj wszystkie badania a priori przed przeprowadzeniem testów behawioralnych. Upewnij się, że strona bodźca i grupy leczone różnią się losowo.
- Aby uniknąć czynników zakłócających, takich jak pora dnia lub dzień testowania, rozpoczynaj i kończ test behawioralny o tej samej porze każdego dnia i przeprowadzaj testy behawioralne w kolejnych dniach, aż wszystkie ryby doświadczalne zostaną przetestowane.
- Do tego testu (Rysunek 1), użyj zbiornika o pojemności 37 litrów (50 cm x 25 cm x 30 cm, dł. x szer. x wys.) z butlami o pojemności 1,4 l umieszczonymi na zewnątrz wzdłuż szerokości zbiornika, jak opisano wcześniej17.
- Wyłóż tył i dno zbiornika o pojemności 37 litrów białym falistym tworzywem sztucznym, aby zwiększyć kontrast między rybami doświadczalnymi a tłem i poprawić śledzenie wideo.
- Umieść tekturę falistą na zewnętrznej ścianie zbiorników o pojemności 1,4 l, aby zwiększyć kontrast bodźca społecznego dla ryb doświadczalnych. Na koniec umieść biały falisty plastik między zbiornikami o pojemności 1,4 l i 37 l; Ta nieprzezroczysta bariera służy do uniemożliwienia rybom doświadczalnym oglądania bodźca społecznego podczas habituacji.
- Umieść kamerę w odległości wystarczająco dużej, aby uchwycić całą długość zbiornika o pojemności 37 litrów oraz połowę zbiorników o pojemności 1,4 litra i dokładnie śledzić dorosłe ryby doświadczalne.
UWAGA: Sprawdzenie, po której stronie znajduje się bodziec, zapewnia, że badacze prawidłowo oznaczyli strefy śledzenia i zapewnia redundancję jako kopię zapasową. - Jeśli śledzenie w podczerwieni nie jest używane, upewnij się, że zbiornik o pojemności 37 l jest oświetlony. Używaj wszelkich dostępnych na rynku lamp okapowych akwariowych z lampą o pełnym spektrum 15 W T8.
UWAGA: Jeśli ustawianych jest wiele aren, użyj identycznych okapów akwariowych z identycznymi lampami.
3. Przeprowadzanie testu społecznego
- Zacznij od napełnienia zbiornika o pojemności 37 litrów używanego do testu behawioralnego wodą, która jest identyczna z wodą używaną w szafie mieszkaniowej. Upewnij się, że temperatura wody mieści się w zakresie 2 °C od stelaża obudowy.
- Pod koniec dnia opróżnij zbiornik o pojemności 37 l. Rozpocznij każdy dzień testowy od świeżej wody. Upewnij się, że poziom wody w zbiorniku o pojemności 37 l i poziom wody w zbiornikach o pojemności 1.4 l są identyczne. Jeśli temperatura w pomieszczeniu nie utrzymuje wody w zbiorniku o pojemności 37 l na poziomie 28.5 °C 2 °C, należy wymienić wodę na ciepłą wodę o temperaturze 28.5 °C.
- Następnie ustaw strefy zainteresowania. Zapoznaj się z wybranym przez użytkownika oprogramowaniem do ręcznego śledzenia, aby utworzyć strefy. W protokole tym wzdłuż długości zbiornika o pojemności 37 litrów na górze i na dole zastosowano taśmę mierniczą do oznaczania odstępów co 5 cm. Biorąc pod uwagę, że zbiornik testowy ma 50 cm, przyrosty co 5 cm prowadzą do 10 stref, z których każda ma 5 cm.
- Korzystając z oznaczeń wykonanych na zbiorniku o pojemności 37 litrów jako odniesienia, użyj oprogramowania do skonstruowania stref, łącząc punkt 5 cm na górze z odpowiednim punktem 5 cm na dole. Dodatkowo utwórz strefę wzdłuż dna i wzdłuż bodźca. Dostosuj strefy zainteresowania.
- Użyj oprogramowania śledzącego w tym protokole, aby zmierzyć odległość od strefy i czas spędzony w strefie. W protokole tym zastosowano 12 stref.
- Określ ilościowo czas spędzony w strefach od 1 do 10 oraz odległość od bodźca i dna jako strefę 1, jako strefę najbliższą bodźcowi, podczas gdy strefa 10 jest najbardziej oddalona od bodźca.
- Następnie wybierz dwóch samców i dwie samice, które zostaną użyte do bodźca społecznego. Najlepszą praktyką byłoby wykorzystanie samców i samic z tej samej kohorty co ryby doświadczalne. Jeśli nie jest to możliwe, spróbuj znaleźć ryby, które pasują do odmiany, wieku i wielkości ryb doświadczalnych.
- Przenieś rybę doświadczalną ze zbiornika mieszkalnego na arenę testową (zbiornik o pojemności 37 litrów). Użyj siatki, aby złapać ryby w zbiorniku mieszkalnym. Umieść siatkę z rybami w niej w pojemniku z wodą dla ryb.
UWAGA: Zastosowanie tego podejścia zmniejszy stres u ryb doświadczalnych podczas przemieszczania się między zbiornikami. - Umieść eksperymentalną rybę na środku areny testowej.
- Gdy ustawienia wykrywania są zadowalające w oparciu o wybrane przez użytkownika oprogramowanie (patrz instrukcja obsługi), rozpocznij 20-minutową próbę. Przez pierwsze 10 minut należy pozostawić nieprzezroczystą barierę między zbiornikiem o pojemności 37 l a zbiornikiem o pojemności 1,4 litra na miejscu. Uniemożliwi to rybom doświadczalnym dostrzeżenie bodźca społecznego, składającego się z dwóch samców i dwóch samic danio pręgowanego, i pozwoli rybom zaaklimatyzować się na arenie testowej13,17.
- Po 10 minutach ostrożnie usuń nieprzezroczyste bariery, pociągając je za zbiornik; pozwoli to rybom doświadczalnym zobaczyć bodziec społeczny.
- Użyj oprogramowania śledzącego, aby śledzić i określać ilościowo zachowanie ryb doświadczalnych 11, 12, 17 w oparciu o preferencje użytkownika i instrukcję oprogramowania. W obecnym protokole należy określić ilościowo odległość od bodźca społecznego i dna zbiornika, a także czas spędzony we wszystkich strefach.
- Analizuj dane przy użyciu tradycyjnych narzędzi do analizy danych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rysunek 2 został zmodyfikowany na podstawie pracy Fernandes et al.17 i pokazuje, że prenatalna ekspozycja na etanol tłumi reakcję tworzenia ławic, co wykazano poprzez badanie odległości od bodźca. Dane na Rysunku 2 przedstawiają odległość od bodźca społecznego podczas 20 min próby. Oś Y wskazuje odległość w centymetrach, natomiast oś X przedstawia 20 min próbę podzieloną na 1 min interwały. Czarny pasek wzdłuż osi X oznacza czas, w którym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Danio pręgowany ma szereg cech biologicznych i behawioralnych, co czyni je bardzo atrakcyjnym organizmem do badań obejmujących geny, środowisko i zachowanie 5,19. Protokół ten daje użytkownikowi końcowemu stosunkowo prosty przewodnik po testowaniu zachowań społecznych, wiele sposobów ilościowego zachowania społecznego i ma potencjał do powiązania reakcji behawioralnych poszczególnych ryb z zabiegami, takimi jak ekspozycja na embrionalny etanol, mutacje genetyczne...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Fundusze na wsparcie tych badań zostały zapewnione przez National Institutes of Health (NIH)/National Institute on Alcohol Abuse (NIAAA) [R00AA027567] dla Y.F.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 1,4-l ZT140 Zbiorniki wodne | Aquaneering | ZT140 | Zbiorniki na bodźce społeczne |
| Aqueon 20" Deluxe Fluorescencyjny Full Hood oświetlenie akwariowe | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aqueon-aquarium-black-24-fluorescent-deluxe-full-hood-215740 | Światło do zbiornika 37-I | |
| Aqueon Standard Zbiornik akwariowy ze szkła otwartego, zbiornik 10 galonów | https://www.petco.com/shop/en/petcostore/product/aga-10g-20x10x12bk-tank-170917 | 37 l do testu społecznego | |
| Etanol | Fisher Scienticfic | ||
| System śledzenia BP28184 Ethovision XT | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| kolorowa kamera Basler GigE | https://www.noldus.com/ethovision-xt | ||
| Biały tektura falista | Tworzywo sztuczne do wyściełania tylnej i dolnej części zbiornika 37-I oraz tylnej części zbiorników używanych do stymulacji społecznej |
Bibliografia
- Institue Med. Fetal alcohol syndrome: diagnosis, epidemiology, prevention, and treatment. , National Academies Press. Washington, D.C. (1996).
- Abel, E. L. Fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. , Springer. (1984).
- Stevens, S. A., Clairman, H., Nash, K., Rovet, J. Social perception in children with fetal alcohol spectrum disorder. Child Neuropsychol. 23 (8), 980-993 (2017).
- Streissguth, A. P., et al. Risk factors for adverse life outcomes in fetal alcohol syndrome and fetal alcohol effects. J Dev Behav Pediatr. 25 (4), 228-238 (2004).
- Lovely, C. B., Fernandes, Y., Eberhart, J. K. Fishing for fetal alcohol spectrum disorders: zebrafish as a model for ethanol teratogenesis. Zebrafish. 13 (5), 391-398 (2016).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Lovely, C. B., Nobles, R. D., Eberhart, J. K. Developmental age strengthens barriers to ethanol accumulation in zebrafish. Alcohol. 48 (6), 595-602 (2014).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult zebrafish as a model organism for behavioural genetics. BMC Neurosci. 11 (1), 90(2010).
- Pitcher, T. J. Heuristic definitions of fish shoaling behaviour. Animal Behav. 31 (2), 611-613 (1983).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Embryonic alcohol exposure impairs the dopaminergic system and social behavioral responses in adult zebrafish. Int J Neuropsychopharmacol. 18 (6), pyu089(2015).
- Fernandes, Y., Gerlai, R. Long-term behavioral changes in response to early developmental exposure to ethanol in zebrafish. Alcohol Clin Exp Res. 33 (4), 601-609 (2009).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Jones, E. M., Eberhart, J. K. Social deficits following embryonic ethanol exposure arise in post-larval zebrafish. Addict Biol. 24 (5), 898-907 (2019).
- Buske, C., Gerlai, R. Early embryonic ethanol exposure impairs shoaling and the dopaminergic and serotoninergic systems in adult zebrafish. Neurotoxicol Teratol. 33 (6), 698-707 (2011).
- Pannia, E., Tran, S., Rampersad, M., Gerlai, R. Acute ethanol exposure induces behavioural differences in two zebrafish (Danio rerio) strains: A time course analysis. Behav Brain Res. 259, 174-185 (2014).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)/Monte Westerfield. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2007).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Eberhart, J. K. Social behavioral phenotyping of the zebrafish casper mutant following embryonic alcohol exposure. Behav Brain Res. 356, 46-50 (2019).
- Fernandes, Y., Rampersad, M., Gerlai, R. Impairment of social behaviour persists two years after embryonic alcohol exposure in zebrafish: A model of fetal alcohol spectrum disorders. Behav Brain Res. 292, 102-108 (2015).
- Fernandes, Y., Buckley, D. M., Eberhart, J. K. Diving into the world of alcohol teratogenesis: a review of zebrafish models of fetal alcohol spectrum disorder. Biochem Cell Biol. 96 (2), 88-97 (2018).
- Park, J. S., et al. Innate color preference of zebrafish and its use in behavioral analyses. Mol Cells. 39 (10), 750-755 (2016).
- Gerlai, R., et al. Forward genetic screening using behavioral tests in zebrafish: a proof of concept analysis of mutants. Behav Genet. 47 (1), 125-139 (2017).
- Scerbina, T., Chatterjee, D., Gerlai, R. Dopamine receptor antagonism disrupts social preference in zebrafish: a strain comparison study. Amino Acids. 43 (5), 2059-2072 (2012).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
