Artykuł metodologiczny

Badanie wyborów dotyczących historii życia: wykorzystanie temperatury i rodzaju podłoża jako czynników oddziałujących na larwy plujki i preferencje samic

DOI:

10.3791/65835

⸱

17 listopada 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Genetics and Evolutionary Biology, Institute of Biosciences, University of São Paulo, 2Department of Zoology, Institute of Biosciences, University of São Paulo

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj szczegółowo opisano dwa protokoły oceny preferencji dotyczących źródła pożywienia i składania jaj u larw i samic plujek. Składają się one z czterech opcji, w których na siebie oddziałują dwa czynniki: rodzaj podłoża i temperatura. Testy umożliwiają określenie preferencji larw dotyczących źródła pożywienia oraz preferencji miejsca składania jaj przez samice.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plujki (Diptera: Calliphoridae) prezentują szeroki zakres larwalnego trybu życia, zazwyczaj klasyfikowany jako obligatoryjne pasożytnictwo, fakultatywne pasożytnictwo i kompletna sapro-nekrofagia. Kilka gatunków pasożytniczych, zarówno obligatoryjnych, jak i fakultatywnych, uważa się za mające znaczenie sanitarne i gospodarcze, ponieważ ich larwy mogą powodować muszycę (inwazję larw w żywych tkankach). Warto jednak zauważyć, że dorosła samica odgrywa decydującą rolę, ponieważ wybiera miejsce składania jaj, a zatem w dużej mierze decyduje o zwyczaju żywieniowym i warunkach rozwoju larw. W tym badaniu zaproponowano dwa protokoły do badania preferencji żywieniowych larw i preferencji miejsca składania jaj przez samice, biorąc pod uwagę dwa oddziałujące na siebie czynniki: rodzaj podłoża mięsnego i temperaturę. Przedstawione tu konfiguracje pozwoliły na przetestowanie larw Lucilia cuprina i grawitujących samic w teście czterokrotnego wyboru z dwiema temperaturami (33 ± 2 °C i 25 ± 2 °C) i dwoma rodzajami substratów mięsnych (świeże mięso uzupełnione krwią i 5-dniowe zgniłe mięso). Larwy lub ciężarne samice mogą zdecydować się na zakopywanie się lub składanie jaj odpowiednio w jednym z następujących elementów: zgniłe mięso w temperaturze 25 °C (symulujące stan gatunku nekrafagicznego), świeże mięso uzupełnione krwią w temperaturze 33 °C (symulujące stan gatunku pasożytniczego) oraz dwie grupy kontrolne, zgniłe mięso w temperaturze 33 °C lub świeże mięso uzupełnione krwią w temperaturze 25 °C. Preferencję ocenia się, licząc liczbę larw lub jaj złożonych w każdym wariancie dla każdej kontrpróby. Porównanie obserwowanych wyników z rozkładem losowym pozwoliło na oszacowanie istotności statystycznej preferencji. Wyniki wskazują, że larwy L. cuprina silnie preferują zgniłe podłoże w temperaturze 25 °C. I odwrotnie, preferencje samic dotyczące miejsca składania jaj były bardziej zróżnicowane w zależności od rodzaju mięsa. Metodologię tę można dostosować do badania preferencji innych gatunków owadów o podobnej wielkości. Inne pytania można również zbadać, stosując alternatywne warunki.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Muchy, szczególnie muskowate (w tym między innymi plujki, muchy domowe, muchy i muchy mięsne), prezentują szeroki zakres stylu życia, obejmujący zachowania pasożytnicze i nekropafagiczne1. Gatunki pasożytnicze zazwyczaj powodują muszycę, czyli zarażenie żywych tkanek przez larwy 2. W rodzinie Calliphoridae zarówno obligatoryjne, jak i fakultatywne gatunki pasożytnicze są głównymi szkodnikami zwierząt gospodarskich odpowiedzialnymi za straty ekonomiczne i niski dobrostan zwierząt z powodu inwazji robaków2,3,4,5,6,7. Szczególnie ><><><><>Cochliomyia hominivorax i Chrysomyia bezziana), a także pasożyty fakultatywne, takie jak muchówki (Lucilia cuprina i Lucilia sericata)2,5,6,7. Gatunki niepasożytnicze, w tym sapro-nekrofagiczne, rozwijają się w rozkładającej się i nekrotycznej materii organicznej i są powszechnie spotykane w niehigienicznych środowiskach. Ich ściśle niepasożytniczy tryb życia może być z powodzeniem wykorzystany do terapii czerwi, która wykorzystuje larwy much do oczyszczania ran nekroztycznych tkanek11,12,13. Muchy plujki są również wykorzystywane w kryminalistyce, ponieważ są jednymi z pierwszych organizmów, które lokalizują i kolonizują niedawno zmarłe ciała, a rozwijające się larwy służą jako sposób szacowania czasu śmierci14.

Styl życia muchówek był przedmiotem różnych badań naukowych (np. 15,16,17,18,19,20,21) ze względu na ich znaczenie w odniesieniu do interesów ludzkich. Zrozumienie mechanizmów biologicznych rządzących stylem życia gatunku może dostarczyć cennych informacji na temat ulepszania metod zwalczania gatunków szkodników. Co więcej, różnorodność i ewolucja stylu życia plujek stanowią idealny kontekst do badania pochodzenia i mechanizmów złożonych cech (np. pasożytnictwa). Pasożytnictwo wywołane przez larwy żywiące się żywymi tkankami ewoluowało niezależnie kilka razy w obrębie rodziny Calliphoridae22,23. Jednak ewolucyjna historia nawyków żywieniowych muchówek jest nadal w dużej mierze nieznana, a badania ograniczają się do mapowania nawyków wzdłuż filogenezy (np. 16,19,22) bez pomocy testów funkcjonalnych. Na przykład nie jest pewne, czy pasożyty obligatoryjne wyewoluowały z generalistów (tj. pasożytów fakultatywnych), czy bezpośrednio z gatunków nekrofagicznych. Procesy molekularne, fizjologiczne i behawioralne towarzyszące ewolucyjnym zmianom w stylu życia są również w dużej mierze nieznane.

W tym kontekście, fakultatywne pasożyty, takie jak plujka Lucilia cuprina, które mogą rozwijać się jako pasożyty na żywicielu lub jako nekrofagi na zwłokach, oferują możliwość zbadania czynników i mechanizmów kontrolujących wybory dotyczące stylu życia. Lucilia cuprina to kosmopolityczny gatunek znany z wywoływania ataków much, szczególnie w Australii, gdzie jest uważany za szkodnika3,16. Muszyca wywołana przez L. cuprina może również wystąpić u innych zwierząt gospodarskich, zwierząt domowych i ludzi3,24,25,26,27,28,29,30. Jednak jego larwy mogą również rozwijać się w tkankach martwiczych i rozkładającej się materii, a gatunek ten jest z powodzeniem stosowany w entomologii sądowej, ponieważ bardzo szybko lokalizuje i kolonizuje zwłoki31,32,33,34. Chociaż pasożytniczy i niepasożytniczy tryb życia plujek jest definiowany przez stadium larwalne, to dorosła samica wybiera miejsce składania jaj. W związku z tym dorosła samica ma duży wpływ na tryb życia larw, ponieważ te ostatnie mają ograniczoną mobilność. Jednak wybór samicy niekoniecznie oznacza, że larwy wolałyby ten sam substrat, gdy zostaną przedstawione choice35. Jedna z hipotez głosi, że zmiany behawioralne prowadzące do składania jaj przez samice na żywej tkance mogły być częścią wczesnego przejścia na pasożytniczy styl życia. Wstępne adaptacje lub zdolności fizjologiczne powstałych larw byłyby niezbędne do ich pomyślnego rozwoju w żywej tkance, prowadząc do pojawienia się pasożytniczego trybu życia. W związku z tym procesy, których dotyczy i które są wybrane, niekoniecznie muszą być zgodne między oboma etapami życia.

W tym kontekście, opracowano dwie metody testowania preferencji behawioralnych u much, w szczególności dla L. cuprina, w odniesieniu do substratu pokarmowego larw (test preferencji larw) i miejsca składania jaj (test preferencji samic). Metody te uwzględniają dwa oddziałujące na siebie czynniki: temperaturę i świeżość mięsa. Temperatura została wybrana jako kluczowy czynnik, ponieważ większość przypadków muszycy występuje u zwierząt homeotermicznych2. W związku z tym temperatura 33 °C została wybrana jako wskaźnik zastępczy dla "czynnika pasożytniczego stylu życia", podczas gdy temperatura 25 °C (temperatura pokojowa) reprezentuje "czynnik niepasożytniczy". Wybrano temperaturę 25 °C, ponieważ jest ona reprezentatywna dla średniej rocznej temperatury odnotowanej w Brazylii (National Institute of Meteorology, INMET). Dodatkowo pod uwagę wzięto dwa rodzaje substratów mięsnych, oba ze źródeł bydlęcych: (i) świeże mięso uzupełnione krwią, naśladujące substrat dla pasożytniczego trybu życia, który jest używany do hodowli pasożytniczej plujki Co. hominivorax w warunkach laboratoryjnych36, oraz (ii) 5-dniowe zgniłe mięso, naśladujące substrat dla nekrofagicznego stylu życia. Podłoże bydlęce jest powszechnie używane do hodowli L. cuprina w warunkach laboratoryjnych27,37,38,39, ponieważ oferuje kilka zalet pod względem dostępności, opłacalności i praktyczności, będąc jednocześnie podłożem uzasadnionym ekologicznie. Inne badania40,41 porównując wpływ zgniłych i świeżych substratów u muchówek, użyły 7-dniowego zgniłego podłoża (w warunkach beztlenowych) i wykazały niekorzystny wpływ zgniłego podłoża na tempo rozwoju, przeżycie i wzrost. Ponieważ L. cuprina jest znana z kolonizacji świeżych zwłok, które są zwykle wystawione na działanie powietrza, zdecydowaliśmy się użyć 5-dniowego zgniłego mięsa (mielonej wołowiny) w niehermetycznych doniczkach (rozkład tlenowy i beztlenowy), aby naśladować podłoże nekrofagiczne.

Przedstawione tutaj projekty eksperymentalne oferują przewagę w postaci rozróżniania preferencji dla poszczególnych czynników, jak również ich łącznych efektów. Co więcej, oceniane fenotypy, a mianowicie wybór podłoża pokarmowego dla larw i liczba składanych jaj, są bezpośrednio związane z biologicznymi i ekologicznymi aspektami gatunków plujek. Przydatność tych protokołów podkreślono poprzez wykazanie ich skuteczności w przypadku L. cuprina. Dodatkowo dostępny jest skrypt do analizy statystycznej, który można wykorzystać do porównania zaobserwowanych wyników uzyskanych u L. cuprina z symulowanymi danymi losowymi, zapewniając solidną analizę statystyczną i interpretację.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Próbki much zostały pobrane za pomocą pułapek, a nie na zainfekowanych zwierzętach. Wydano licencję SISBIO (67867-1) na zbieranie i przetrzymywanie much z rodziny Calliphoridae w niewoli w warunkach laboratoryjnych. Próbki owadów są zwolnione z oceny etycznej w badaniach prowadzonych w Brazylii. Wołowina i krew bydlęca były pozyskiwane w handlu i nie było wymagane żadne zezwolenie etyczne.

1. Preferencje żywieniowe larw

  1. Przygotowanie szalek Petriego zawierających 2% agaru
    1. Przygotuj cztery szalki Petriego z 2% agarem. Aby to zrobić, dodaj 6 g agaru bakteriologicznego do 300 ml wody i rozpuść tę mieszankę w kuchence mikrofalowej. Następnie podziel objętość równomiernie na cztery szklane szalki Petriego (150 x 20 mm), używając około 70 ml w każdym szaluku.
      UWAGA: Przygotować szalki Petriego równą pożądanej liczbie powtórzeń eksperymentalnych. W tym badaniu wykorzystano 36 powtórzeń.
    2. Gdy agar zastygnie, użyj stożkowej probówki o pojemności 50 ml (średnica 3 cm), aby przebić cztery otwory w agarze, po dwa z każdej strony szalki Petriego, postępując zgodnie z dostarczonym wzorem cięcia (Rysunek 1).
      UWAGA: Ta konfiguracja jest podobna do wcześniej opisanych protokołów przez Fouche et al. (2021)40 i Boulay et al. (2016)42.
  2. Przygotowanie podłoży
    1. Aby przygotować świeże mięso z krwią, dodaj 12 ml rozcieńczonej krwi bydlęcej do 200 g świeżej mielonej mięsa wołowego. Dokładnie wymieszaj. Upewnij się, że używasz różnych cylindrów z podziałką i łyżek do każdego rodzaju mięsa, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między substratami.
      UWAGA: Rozcieńczona krew składa się w 50% z czystej krwi zmieszanej z antykoagulantem (3,8% cytrynianu sodu) i w 50% z przefiltrowanej wody.
    2. Aby przygotować zgniłe podłoże, dodaj 12 ml przefiltrowanej wody do 200 g 5-dniowego, zgniłego mięsa mielonego bydła i dobrze wymieszaj.
      UWAGA: Zgniłe mięso otrzymano przez inkubację świeżego mięsa mielonego przez pięć dni w temperaturze 25 °C w niehermetycznych doniczkach z tworzywa sztucznego (mieszanina rozkładu tlenowego i beztlenowego). W każdym garnku znajdowało się 200 g świeżo zmielonego mięsa. Następnie został zamrożony do czasu użycia.
    3. Wypełnij dwa otwory w każdej szalce Petriego mieszanką świeżego mięsa i krwi, a pozostałe dwa otwory mieszanką zgniłego mięsa i wody.
      UWAGA: Aby uniknąć odchyleń pozycji, zmieniaj rozmieszczenie różnych rodzajów mięsa na szalkach Petriego. Na przykład, niektóre szalki Petriego powinny mieć ten sam rodzaj mięsa zwrócony do siebie, podczas gdy w innych potrawach rodzaj mięsa powinien być skrzyżowany, jak pokazano na Rysunek 2.
  3. Konfiguracja eksperymentalna
    1. W temperaturze pokojowej (RT) 25 °C umieść poduszkę grzewczą bezpośrednio pod źródłem światła, aby równomiernie oświetlić obszar eksperymentalny i uniknąć odchylenia zachowania w kierunku lub przeciw światłu. Umieść tekturowe podkładki wokół poduszki grzewczej, aby upewnić się, że konfiguracja eksperymentalna pozostaje wypoziomowana.
      UWAGA: Zastosowane źródło światła było białym światłem emitującym światło o niskim przegrzaniu, takie jak rurka neonowa. Poduszka grzewcza została umieszczona na stole tuż pod żarówkami sufitowymi (Rysunek 3).
    2. Przykryj poduszkę grzewczą i podkładki z tektury wyrównującej czarnym kartonem i włącz poduszkę grzewczą.
      UWAGA: Należy użyć czarnej tekturowej okładki, aby uniknąć wskazówek wizualnych, które mogą zniekształcić test zachowania.
    3. Umieść sześć szalek Petriego z agarem i substratem mięsnym na czarnym kartonie z dwoma podłożami, po jednym z każdego rodzaju, na poduszce grzewczej, a pozostałe dwa poza powierzchnią poduszki grzewczej (Rysunek 2). Pozwól substratom grzać się przez około 10 minut.
      UWAGA: Na pokrywie szalek Petriego może tworzyć się kondensacja.
  4. Test larwalny
    1. Sprawdź temperaturę podłoży (strona zimna: 25 ± 2 °C; strona gorąca: 33 ± 2 °C) za pomocą termometru na podczerwień.
      UWAGA: Poduszka grzewcza pozostaje włączona przez cały czas trwania eksperymentu. Pomiary temperatury wykonano na początku i na końcu eksperymentu. Chociaż temperatura wahała się o ± 2 °C, różnica temperatur między gorącymi i zimnymi warunkami wynosiła co najmniej 8 °C.
    2. Po osiągnięciu pożądanej temperatury umieść pięć larw w trzecim stadium na środku każdej szalki Petriego za pomocą pęsety (Rysunek 2) i przykryj szalki Petriego pokrywkami. Niech eksperyment wyboru trwa 10 min.
      UWAGA: Niektóre larwy mogą pełzać po krawędziach i pokrywie szalek Petriego. Jeśli jakaś larwa ucieknie, użyj pęsety, aby umieścić ją z powrotem na środku szalki Petriego.
    3. Po 10 minutach zdejmij wszystkie szalki Petriego z poduszki grzewczej i umieść je na innej powierzchni, aby uniknąć dalszego podgrzewania podłoży. Następnie policz liczbę larw w każdym podłożu, a także te, które nie wybrały żadnego podłoża.
      UWAGA: Larwy Lucilia cuprina pozostają w wybranym podłożu, jak zaobserwowano w tym eksperymencie.

2. Preferencja miejsca składania jaj przez kobiety

  1. Konfiguracja eksperymentalna
    1. Użyj zwykłej półki wcześniej pokrytej czarnym kartonem i równomiernie oświetlonej białymi paskami świetlnymi LED.
      UWAGA: Należy użyć czarnych tekturowych okładek, aby uniknąć wskazówek wizualnych, które mogą zniekształcić test zachowania. Białe paski LED są przymocowane wzdłużnie na środku półki tuż nad eksperymentem. Półki użyte w zestawie zostały rozmieszczone w odległości 45 cm od siebie.
    2. Przy temperaturze pokojowej (25 °C) umieść poduszkę grzewczą na środku półki. Użyj tekturowych podkładek wokół poduszki grzewczej jako podpory, aby upewnić się, że konfiguracja eksperymentalna jest wypoziomowana.
    3. Przykryj poduszkę grzewczą i wyrównujące podkładki tekturowe czarnym kartonem, aby zachować ten sam wzór wizualny pod wszystkimi podłożami.
    4. Umieść dwa szklane pojemniki w kształcie krzyża na jednej półce, każdy powinien mieć dwa ramiona nad czarnym kartonem i poduszką grzewczą. Włącz białe paski świetlne LED i poduszki grzewcze przed rozpoczęciem eksperymentu.
    5. Użyj 70% etanolu do czyszczenia krzyżyków (wewnątrz krzyża i pokrywy), aby uniknąć zanieczyszczenia zapachem.
  2. Przygotowanie podłoży
    1. Przygotuj cztery szalki Petriego (60 mm x 15 mm) na krzyżówkę z 5 g 5-dniowego, zgniłego lub świeżego mięsa (po dwa z każdego rodzaju podłoża).
      UWAGA: Przygotować szalki Petriego równą liczbie powtórzeń eksperymentalnych razy cztery. W tym badaniu wykorzystano 30 powtórzeń, w sumie 120 przygotowanych szalek Petriego.
    2. Dodaj 1 ml rozcieńczonej krwi bydlęcej (50% czystej krwi z antykoagulantem i 50% przefiltrowanej wody) na świeże mięso i 1 ml przefiltrowanej wody na zgniłe mięso. Dokładnie wymieszaj mięso (świeże lub zgniłe) z płynem (krwią lub wodą) używając innej łyżki do każdego rodzaju mięsa.
      UWAGA: Przygotowanie mięsa do testu na samicy jest bardzo podobne do testu na larwach, chociaż ilości są różne, ponieważ test na samicach będzie trwał dłużej niż test na larwach. Pamiętaj, aby używać różnych końcówek pipet i łyżek do każdego rodzaju mięsa, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego zapachu między substratami.
    3. Sprawdź, czy alkohol całkowicie wyparował z krzyżówek. Następnie umieść cztery szalki Petriego (po jednej z każdego rodzaju mięsa na poduszce grzewczej, a pozostałe dwie poza powierzchnią poduszki grzewczej) na końcu każdego ramienia krzyża (Rysunek 4). Zamknij krzyże pokrywkami i pozwól substratom nagrzać się przez około 10 minut.
      UWAGA: Ponadto, aby uniknąć odchyleń pozycji, zmieniaj rozmieszczenie różnych rodzajów mięsa w krzyżówkach. Na przykład, niektóre krzyżówki powinny mieć ten sam rodzaj mięsa na sąsiednich ramionach, podczas gdy w innych krzyżówkach ten sam rodzaj mięsa powinien znajdować się naprzeciwko siebie, jak pokazano na Rysunek 4.
  3. Test dla kobiet
    1. Zbierz ciężarne samice w klatce na muchy i wyizoluj je w osobnych probówkach.
      UWAGA: Samice gravid charakteryzują się powiększonym i białawo-żółtym brzuchem, w przeciwieństwie do samic bez ciężaru (Ryc. 5). Ciężarne samice zostały zebrane do eksperymentów między 10 a 16 dniem po wzejściu.
    2. Sprawdź temperaturę podłoży w krzyżówkach (strona zimna: 25 ± 2 °C; strona gorąca: 33 ± 2 °C) za pomocą termometru na podczerwień.
      UWAGA: Podobnie jak w teście larwalnym, poduszka grzewcza pozostaje włączona przez cały czas trwania eksperymentu. Pomiary temperatury wykonano na początku i na końcu eksperymentu. Chociaż temperatura wahała się o ± 2 °C, różnica temperatur między gorącymi i zimnymi warunkami wynosiła co najmniej 8 °C.
    3. Umieść rurkę do góry nogami zawierającą jedną ciężarną samicę w otworze pośrodku każdego krzyża. Po wejściu samicy do krzyża wyjmij rurkę i zamknij otwór małą pokrywką. Po zamknięciu wszystkich krzyżyków umieść karton z przodu półki, aby zamknąć zestaw eksperymentalny. Pozwól eksperymentowi trwać 4 godziny.
    4. Następnie usuń samicę, ostrożnie łapiąc ją rurką i sprawdź, czy na podłożach nie ma jaj.
    5. Zidentyfikuj pokrywę każdej szalki Petriego z typem podłoża z każdej krzyżówki. Użyj 70% etanolu do oczyszczenia krzyżyków (wewnątrz krzyża i pokrywy) z wszelkich zapachów z testu.
      UWAGA: W przypadku, gdy jaja nie mogą być policzone bezpośrednio po eksperymencie, szalki Petriego z substratami można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  4. Liczba jaj
    UWAGA: Jeśli substraty na szalkach Petriego były zamrożone, rozmrozić je przed liczeniem.
    1. Użyj mikroskopu stereoskopowego, aby policzyć liczbę jaj złożonych w każdym podłożu. Użyj pędzla i wody, aby oddzielić jajka, aby je policzyć.

3. Analiza danych i statystyki

  1. Obliczanie wskaźników preferencji
    1. Dla każdej powtórzonej próby badań larwalnych (n = 36) i żeńskich (n = 30) oblicza się wskaźnik preferencji dla mięsa (oznaczonego jakomięso PI), określając stosunek larw lub jaj obecnych na świeżych podłożach (świeże gorące i świeże zimne) do całkowitej liczby larw lub jaj na wszystkich podłożach (świeże gorące + świeże zimno + zgniłe gorące + zgniłe zimno).
      PImięso = (# larwy lub jaja na świeżych podłożach) / # Całkowita liczba larw lub jaj
      UWAGA: Terminy "Gorąco" i "Zimno" wskazują na warunki temperaturowe wynoszące odpowiednio 33 ± 2 °C i 25 ± 2 °C.
    2. Podobnie, należy obliczyć wskaźnik preferencji dla temperatury (PI temp) dla każdej powtórzonej próby badań larwalnych i żeńskich jako liczbę larw lub jaj obecnych na gorących podłożach (świeże gorące i zgniłe gorące) podzieloną przez całkowitą liczbę larw lub jaj na wszystkich podłożach (świeże gorące + świeże zimno + zgniłe gorące + zgniłe zimno).
      PItemp = (# larwy lub jaja na gorących podłożach) / # Całkowita liczba larw lub jaj
      UWAGA: Wartości bliskie 1 oznaczają preferencję dla podłoży świeżych lub gorących, a wartości bliskie zeru wskazują preferencję dla podłoży zgniłych lub zimnych. PI można obliczyć ręcznie lub za pomocą dostarczonego kodu (pliki uzupełniające S1 i pliki uzupełniające S2).
  2. Porównanie zaobserwowanej preferencji z symulowanymi danymi losowymi
    1. Uruchom podany kod (plik uzupełniający S1 i plik uzupełniający S1), aby wygenerować symulowane dane i porównać je z zaobserwowanymi danymi.
      UWAGA: Ten kod generuje 1000 symulowanych losowych zestawów danych dla larw i samic i oblicza wskaźniki preferencji (PI) dla każdej repliki symulowanej oraz obserwowane dane L. cuprina. Symulacje zakładają, że zarówno larwy, jak i samice nie wykazują preferencji dotyczących podłoża i dokonują losowych wyborów. Symulacje obejmują kluczowe aspekty behawioralne zwierząt, obejmujące różne scenariusze, takie jak: prawdopodobieństwo, że larwy nie wybiorą żadnego substratu oraz dorosłe samice koncentrujące składanie jaj na jednym podłożu lub rozprowadzające jaja równomiernie lub nie na różnych podłożach. Uogólnione modele liniowe (GLM, rodzina: quasibinomialny; link: logit) wykorzystano do porównania obserwowanych danych z testów zachowania z symulowanymi danymi losowymi. Zastosowany GLM dobrze nadawał się do tej analizy ze względu na ograniczony charakter Indeksu Preferencji (PI), mieszczącego się w zakresie od 0 do 1. GLM są biegłe w obsłudze zmiennych odpowiedzi o nierozkładzie normalnym i pozwalają na solidne porównania statystyczne. Wybór ten ułatwił uzyskanie istotnych informacji, umożliwiając skuteczne porównywanie zaobserwowanych danych z testów behawioralnych ze złożonymi wzorcami generowanymi przez symulowane dane losowe. W przypadku innych ustrukturyzowanych zestawów danych mogą być konieczne drobne korekty kodu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zademonstrować skuteczność prezentowanych metod, eksperymenty przeprowadzono na laboratoryjnej populacji Lucilia cuprina (rodzina: Calliphoridae), fakultatywnej pasożytniczej muchówki plujki2. Cały surowy zbiór danych uzyskany dla tego gatunku można znaleźć w pliku uzupełniającym S3 z wynikami testów preferencji larw i substratów żeńskich. Aby ocenić, czy larwy i samice preferują jakikolwiek substrat, obserwowane dane porównano z 1000 symulowanych zestawów danych, z k...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zrozumienie ewolucji nawyków żywieniowych, szczególnie w kontekście pasożytnictwa u plujek, wymaga zbadania preferencji podłoża na różnych etapach życia w zakresie żerowania lub składania jaj. Dlatego w niniejszym badaniu zaproponowano solidne i proste metody badania preferencji podłoża u larw i samic plujek. Metody te zostały przetestowane na Lucilia cuprina, fakultatywnej pasożytniczej muchówce2. Co ciekawe, eksperymenty ujawniły wyraźną skłonność larw L . cuprina do gnijącego ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden nie zadeklarował.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Patrícii J. Thyssen, Gabrieli S. Zampim i Lucasowi de Almeida Carvalho za udostępnienie kolonii L. cuprina i pomoc w przygotowaniu eksperymentu. Chcielibyśmy również podziękować Rafaelowi Barrosowi de Oliveirze za nakręcenie i montaż filmu. Badania te były wspierane przez Developing Nation Research Grant od Animal Behavior Society dla V.A.S.C. oraz przez grant FAPESP Dimensions US-Biota-São Paulo dla T.T.T. (20/05636-4). S.T. i D.L.F. byli wspierani przez FAPESP (odpowiednio grant podoktorski 19/07285-7 i stypendium doktoranckie 21/10022-8). V.A.S.C. i A.V.R. otrzymały stypendia doktoranckie CNPq (odpowiednio 141391/2019-7, 140056/2019-0). T.T.T. był wspierany przez CNPq (310906/2022-9).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AgarSigma-Aldrich05038-500GDo mikrobiologii
Czarne kartony--70x50 cm
Krew bydlęca z antykoagulatem -50% czystej krwi bydlęcej z antykoagulantem (3,8% cytrynianu sodu) + 50% filtrowanej wody
Mięso mielone bydlęce-około 7-8% tłuszczu
Szczotka-wykonana z tworzywa sztucznego
Rurka stożkowaFalcon lub Generic-50ml
Szklane pojemniki w kształcie krzyżaRęcznie robioneNA48x48 cm, 8 cm wysokości i 8 cm szerokości
ErlenmeyerVidrolaborNA500 mL
70% EtanolSynthA1084.01.BL70% absolut etanolu etylowego + 30% przefiltrowana woda
Butla z podziałkąNalgon lub Generic-500ml i 50 mL Poduszka
grzewczacm wymiary, 40 W, 127 V
Termometr na podczerwieńHeTaiDaHTD8808Bezdotykowy termometr do ciała (częstotliwość próbkowania: 0,5 s,
Dokładność: ± 0,2 &stopni; C,
Wymiary: 5-15 cm)
szalka Petriego (szkło)PrecyzjaNA150x20 mm wymiary
           (Uwaga: szalki Petriego mogą być plastikowe, jeśli zostaną użyte tylko raz)
Szalka Petriego PSCralplast18130Wymiary 60x15 mm
Plastikowa pipeta Pasteura-3 ml (objętość całkowita)
Cytrynian soduSynthC11033.01.AG3,8% Cytrynian sodu (38 g rozcieńczony w 1 l przefiltrowanej wody)
Łyżki-Potrzeba więcej niż jednej łyżki. Użyj jednego dla każdego rodzaju podłoża mięsnego. Najlepiej ze stali nierdzewnej.
Szpatułka ze stali nierdzewnejGeneric-Flatend i końcówka łyżkowa
Stereoskop/22 soczewki
Pęseta-wykonana z metalu i drobna końcówka
Białe paski świetlne ledNANA 4,8W, 2x0,05 mm², 320 lumenów, Temperatura barwowa:6500 K (biały)
Thermolux-30x40 Bioptika-WF10X

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kutty, S. N., et al. Phylogenomic analysis of Calyptratae: Resolving the phylogenetic relationships within a major radiation of Diptera. Cladistics. 35 (6), 605-622 (2019).
  2. Zumpt, F. Myiasis in Man and Animals in the Old World. A textbook for physicians, veterinarians and zoologists. , Butterworths. London. (1965).
  3. Hall, M., Wall, R. Myiasis of humans and domestic animals. Advances in Parasitology. 35, 257-334 (1995).
  4. Grisi, L., et al. Reassessment of the potential economic impact of cattle parasites in Brazil. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária. 23 (2), 150-156 (2014).
  5. Sackett, D., Holmes, P., Abbot, K., Jephcott, S., Barber, M. Assessing the economic cost of endemic disease on the profitability of Australian beef cattle and sheep producers. Meat & Livestock Australian Report. AHW.087. Meat & Livestock Australian Report. , (2006).
  6. Heath, A. C. G., Bishop, D. M. Flystrike in New Zealand: An overview based on a 16-year study, following the introduction and dispersal of the Australian sheep blowfly, Lucilia cuprina Wiedemann (Diptera: Calliphoridae). Veterinary Parasitology. 137 (3-4), 333-344 (2006).
  7. Mullen, G. R., Durden, L. A. Medical and veterinary entomology. , Academic press. (2009).
  8. Spradbery, J. P. Screw-worm fly: A tale of two species. Agricultural Zoology Reviews. 6 (1), (1994).
  9. World Organization for Animal Health (OIE). New World screwworm (Cochliomyia hominivorax) and Old World screwworm (Chrysomya bezziana), Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. World Organization for Animal Health (OIE). , Paris. (2013).
  10. Wardhana, A. H., Abadi, I., Cameron, M. M., Ready, P. D., Hall, M. J. R. Epidemiology of traumatic myiasis due to Chrysomya bezziana in Indonesia. Jurnal Ilmu Ternak dan Veteriner. 23 (1), 45(2018).
  11. Linger, R. J., et al. Towards next generation maggot debridement therapy: Transgenic Lucilia sericata larvae that produce and secrete a human growth factor. BMC Biotechnology. 16 (1), 30(2016).
  12. Fonseca-Muñoz, A., Sarmiento-Jiménez, H. E., Pérez-Pacheco, R., Thyssen, P. J., Sherman, R. A. Clinical study of Maggot therapy for Fournier's gangrene. International Wound Journal. 17 (6), 1551(2020).
  13. Franciéle, S. M., Demetrius, S. M., Patricia, J. T. Larval Therapy and the application of larvae for healing: review and state of the art in Brazil and worldwide. Revista Thema. 12 (01), 4-14 (2015).
  14. Greenberg, B. Flies as forensic indicators. Journal of Medical Entomology. 28 (5), 565-577 (1991).
  15. Stevens, J. R., Wallman, J. F., Otranto, D., Wall, R., Pape, T. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (Part II): Biological and life-history studies. Trends in Parasitology. 22 (4), 181-188 (2006).
  16. Stevens, J. R. The evolution of myiasis in blowflies (Calliphoridae). International Journal for Parasitology. 33 (10), 1105-1113 (2003).
  17. McDonagh, L. M., Stevens, J. R. The molecular systematics of blowflies and screwworm flies (Diptera: Calliphoridae) using 28S rRNA, COX1 and EF-1α Insights into the evolution of dipteran parasitism. Parasitology. 138 (13), 1760-1777 (2011).
  18. Wallman, J. F., Leys, R., Hogendoorn, K. Molecular systematics of Australian carrion-breeding blowflies (Diptera:Calliphoridae) based on mitochondrial DNA. Invertebrate Systematics. 19 (1), (2005).
  19. Yan, L., et al. Monophyletic blowflies revealed by phylogenomics. BMC Biology. 19 (1), 230(2021).
  20. Cardoso, G. A., Deszo, M. S., Torres, T. T. Evolution of coding sequence and gene expression of blowflies and botflies with contrasting feeding habits. Genomics. 113 (1), 699-706 (2021).
  21. Cardoso, G. A., Marinho, M. A. T., Monfardini, R. D., Espin, A. M. L. D. A., Torres, T. T. Evolution of genes involved in feeding preference and metabolic processes in Calliphoridae (Diptera: Calyptratae). PeerJ. 4, 2598(2016).
  22. Stevens, J. R., Wallman, J. F. The evolution of myiasis in humans and other animals in the Old and New Worlds (part I): Phylogenetic analyses. Trends in Parasitology. 22 (3), 129-136 (2006).
  23. Wiegmann, B. M., et al. Episodic radiations in the fly tree of life. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (14), 5690-5695 (2011).
  24. Azevedo, W. T. D. A., et al. Record of the first cases of human myiasis by Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae), Rio de Janeiro, Brazil. Journal of Medical Entomology. 52 (6), 1368-1373 (2015).
  25. Bishop, D., Patel, D., Heath, A. A New Zealand case of nasal myiasis involving Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae). The New Zealand Medical Journal (Online). 131 (1484), 68-70 (2018).
  26. Lukin, L. G. Human cutaneous myiasis in Brisbane: a prospective study. Medical Journal of Australia. 150 (5), 237-240 (1989).
  27. Paulo, D. F., et al. Specific gene disruption in the major livestock pests Cochliomyia hominivorax and Lucilia cuprina Using CRISPR/Cas9. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (9), 3045-3055 (2019).
  28. Puttalakshmamma, G. C., Dhanalakshmi, H., D'souza, P. E., Ananda, K. J. Incidence of myiasis in domestic animals in Bangalore. Intas Polivet. 6 (2), 353-356 (2005).
  29. Rao, M. A. N., Pillay, M. R. Some notes on cutaneous myiasis in animals in the Madras presidency. Indian Journal of Veterinary Science. 6 (3), (1936).
  30. Soundararajan, C. Traumatic myiasis in an Indian peafowl (Pavo cristatus) due to Lucilia cuprina first report. Journal of Veterinary Parasitology. 34 (1), 49-51 (2020).
  31. Smith, K. G. V. A manual of forensic entomology. , Cornell University Press. UK. (1986).
  32. Goff, M. L. A Fly for the Prosecution. , Harvard University Press. Cambridge, MA and London, England. (2001).
  33. CRC Press. Forensic entomology: the utility of arthropods in legal investigations. , CRC Press. Boca Raton. (2001).
  34. Greenberg, B., Kunich, J. C. Entomology and the law: flies as forensic indicators. , (2002).
  35. Ellis, A. M. Incorporating density dependence into the oviposition preference-offspring performance hypothesis. Journal of Animal Ecology. 77 (2), 247-256 (2008).
  36. Vargas, M. E. I., Azeredo-Espin, A. M. L. Genetic variability in mitochondrial DNA of the screwworm, Cochliomyia hominivorax (Diptera: Calliphoridae), from Brazil. Biochem Genet. 33, 237-256 (1995).
  37. Bambaradeniya, Y. T. B., Karunaratne, W. I. P., Tomberlin, J. K., Goonerathne, I., Kotakadeniya, R. B. Temperature and tissue type impact development of Lucilia cuprina (Diptera: Calliphoridae) in Sri Lanka. Journal of Medical Entomology. 55 (2), 285-291 (2018).
  38. Chaaban, A., et al. Insecticide activity of Curcuma longa (leaves) essential oil and its major compound α-phellandrene against Lucilia cuprina larvae (Diptera: Calliphoridae): Histological and ultrastructural biomarkers assessment. Pesticide Biochemistry and Physiology. 153, 17-27 (2019).
  39. Selem, G., Geden, C. J., Khater, H., Khater, K. S. Effects of larval diets on some biological parameters and morphometric and biochemical analysis of ovaries of Lucilia cuprina (Wiedemann) (Diptera: Calliphoridae). Journal of Vector Ecology. 48 (2), (2023).
  40. Fouche, Q., Hedouin, V., Charabidze, D. Effect of density and species preferences on collective choices: an experimental study on maggot aggregation behaviours. Journal of Experimental Biology. 224 (6), 233791(2021).
  41. Richards, C. S., Rowlinson, C. C., Cuttiford, L., Grimsley, R., Hall, M. J. R. Decomposed liver has a significantly adverse affect on the development rate of the blowfly Calliphora vicina. International Journal of Legal Medicine. 127, (2013).
  42. Boulay, J., Deneubourg, J. -L., Hédouin, V., Charabidzé, D. Interspecific shared collective decision-making in two forensically important species. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 283 (1824), 20152676(2016).
  43. Joseph, R. M., Devineni, A. V., King, I. F. G., Heberlein, U. Oviposition preference for and positional avoidance of acetic acid provide a model for competing behavioral drives in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (27), 11352-11357 (2009).
  44. Mierzejewski, M. K., Horn, C. J., Luong, L. T. Ecology of fear: Environment-dependent parasite avoidance among ovipositing Drosophila. Parasitology. 146 (12), 1564-1570 (2019).
  45. Stensmyr, M. C., et al. A conserved dedicated olfactory circuit for detecting harmful microbes in drosophila. Cell. 151 (6), 1345-1357 (2012).
  46. Yang, S. -T., Shiao, S. -F. Oviposition preferences of two forensically important blow fly species, chrysomya megacephala and C. rufifacies (Diptera: Calliphoridae), and implications for postmortem interval estimation. Journal of Medical Entomology. 49 (2), 424-435 (2012).
  47. Brodie, B. S., Wong, W. H. L., VanLaerhoven, S., Gries, G. Is aggregated oviposition by the blow flies Lucilia sericata and Phormia regina (Diptera: Calliphoridae) really pheromone-mediated?: Pheromone-mediated Lucilia sericata and Phormia regina flies. Insect Science. 22 (5), 651-660 (2015).
  48. Horn, C. J., Liang, C., Luong, L. T. Parasite preferences for large host body size can drive overdispersion in a fly-mite association. International Journal for Parasitology. , (2023).
  49. Liu, W., et al. Enterococci mediate the oviposition preference of Drosophila melanogaster through sucrose catabolism. Scientific Reports. 7 (1), 13420(2017).
  50. Parodi, A., et al. Black soldier fly larvae show a stronger preference for manure than for a mass-rearing diet. Journal of Applied Entomology. 144 (7), 560-565 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Blowfly Larval PreferenceOviposition Site ChoiceTemperature PreferenceLucilia CuprinaLarval Feeding PreferenceFemale Oviposition PreferenceMyiasis ModelSapro necrophagyBehavioral Assay

Powiązane artykuły