Artykuł metodologiczny

Mikrodysekcja i barwienie immunofluorescencyjne rękawów mięśnia sercowego w mysich żyłach płucnych

DOI:

10.3791/65836

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  ,  , 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig-Maximilians-University Munich (LMU), 2Walter Brendel Center of Experimental Medicine (WBex), LMU Munich, 3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance (MHA), 4Interfaculty Center for Endocrine and Cardiovascular Disease Network Modelling and Clinical Transfer (ICONLMU), LMU Munich

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje izolację pod kontrolą mikroskopii i barwienie immunofluorescencyjne mysich żył płucnych. Przygotowujemy próbki tkanek zawierających lewy przedsionek, żyły płucne i odpowiadające im płuca i wybarwiamy je pod kątem sercowej troponiny T i Connexin 43.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żyły płucne (PVs) są głównym źródłem ektopowych uderzeń w arytmii przedsionkowej i odgrywają kluczową rolę w rozwoju i progresji migotania przedsionków (AF). PV zawierają rękawy mięśnia sercowego (MS) złożone z kardiomiocytów. Stwardnienie rozsiane bierze udział w inicjacji i utrzymaniu migotania przedsionków, ponieważ zachowują podobieństwa do pracującego mięśnia sercowego, w tym zdolność do generowania ektopowych impulsów elektrycznych. Gryzonie są szeroko stosowane i mogą stanowić doskonałe modele zwierzęce do badania mięśnia sercowego żyły płucnej, ponieważ kardiomiocyty są szeroko obecne na całej ścianie naczynia. Jednak precyzyjna mikrodysekcja i przygotowanie mysich PV jest trudne ze względu na mały rozmiar narządu i skomplikowaną anatomię.

Demonstrujemy protokół mikrodysekcji pod kontrolą mikroskopii do izolowania mysiego lewego przedsionka (LA) razem z PVs. Barwienie immunofluorescencyjne za pomocą sercowych przeciwciał Troponin-T (cTNT) i connexin 43 (Cx43) jest wykonywane w celu wizualizacji LA i PV na całej długości. Obrazowanie przy powiększeniu 10x i 40x zapewnia kompleksowy obraz struktury PV, a także szczegółowy wgląd w architekturę mięśnia sercowego, szczególnie podkreślając obecność koneksyny 43 w SM.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Migotanie przedsionków (AF) jest najczęstszą trwałą arytmią1. Częstość występowania migotania przedsionków wzrasta jeszcze bardziej, a oczekiwana liczba pacjentów w Europie w 2060 r. wyniesie ~17,9 miliona pacjentów1. Migotanie przedsionków jest klinicznie bardzo ważne, ponieważ jest istotnym czynnikiem ryzyka rozwoju zawału mięśnia sercowego, niewydolności serca lub udaru mózgu, powodując ogromne obciążenie indywidualne, społeczne i społeczno-ekonomiczne1. Mimo że migotanie przedsionków jest znane od dziesięcioleci, patofizjologia migotania przedsionków wciąż nie jest w pełni poznana2.

Już pod koniec lat dziewięćdziesiątych, badania wykazały ogromny wpływ żył płucnych (PV) na inicjowanie i utrzymywanie migotania przedsionków, ponieważ są one głównym źródłem wyzwalających migotanie przedsionków ektopowych3. Wykazano, że PV różnią się strukturalnie od innych naczyń krwionośnych. Podczas gdy typowe naczynia krwionośne zawierają komórki mięśni gładkich, osłonka pożywki PV zawiera również kardiomiocyty4. U gryzoni ta muskulatura serca jest wszechobecna w całych PV, w tym w częściach wewnątrz- i zewnątrzpłucnych, a także w okolicy otworu5. U ludzi PV zawierają również kardiomiocyty, które można zaobserwować w przedłużeniach mięśnia sercowego lewego przedsionka (LA) - tak zwane rękawy mięśnia sercowego (MS)6,7.

MS mają morfologiczne podobieństwa do mięśnia sercowego przedsionkowego8. Kształt i wielkość kardiomiocytów przedsionkowych i PV nie różnią się znacząco między sobą i wykazują porównywalne właściwości elektrofizjologiczne8. Zapisy elektrofizjologiczne w PV dowiodły aktywności elektrycznej SM, a obrazowanie angiograficzne ujawniło skurcze zsynchronizowane z biciem serca9,10.

Połączenia szczelinowe to tworzące pory kompleksy białkowe złożone z sześciu podjednostek koneksyny, które umożliwiają przepływ jonów i małych cząsteczek11. W apozycjach międzykomórkowych istnieją połączenia szczelinowe, które łączą ze sobą sąsiednie kardiomiocyty i umożliwiają międzykomórkowe sprzężenie elektryczne między kardiomiocytami12,13. Kilka izoform koneksyny ulega ekspresji w sercu, przy czym koneksyna 43 (Cx43) jest najpowszechniejszą izoformą wyrażaną we wszystkich regionach serca14. Wcześniejsze badania dostarczają dowodów na ekspresję Cx43 w kardiomiocytach klasy PVs15,16.

Nadal trudno jest zbadać MS w nienaruszonych PV ze względu na ich delikatną strukturę, zwłaszcza w małych modelach zwierzęcych. Tutaj pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować PV wraz z LA i płatami płuc u myszy za pomocą mikrodysekcji pod kontrolą mikroskopii. Dodatkowo demonstrujemy barwienie immunofluorescencyjne (IF) PV w celu wizualizacji kardiomiocytów i ich wzajemnych połączeń w PV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opieka nad zwierzętami i wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Etyki Uniwersytetu Ludwika Maksymiliana w Monachium, a wszystkie procedury z użyciem myszy zostały zatwierdzone przez Regierung von Oberbayern (ROB 55.2-2532. Vet_02-20-215, ROB 55.2-2532. Vet_02-18-46, ROB 55.2-2532. Vet_02-19-86, ROB 55.2-2532. Vet_02-21-178, ROB 55.2-2532. Vet_02-22-170). Myszy C57BL6/N uzyskano komercyjnie.

1. Przygotowanie

  1. Przygotuj 3% żel agarozowy, mieszając 3 mg agarozy i 100 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej Tris w kolbie Erlenmeyera o pojemności 500 ml. Podgrzej roztwór w kuchence mikrofalowej o mocy 600 W przez 2-3 minuty, aż żel stanie się jednorodny.
  2. Przygotować naczynie rozbiorowe, delikatnie wlewając żel na szalkę Petriego o średnicy 100 mm. Napełnij połowę szalki Petriego żelem. Usuń bąbelki z żelu, aby zapewnić jednorodną konsystencję. Pozostaw naczynie do wycinka do ostygnięcia, aż żel stanie się twardy.
  3. Przygotować wszystkie potrzebne i roztwory, w tym roztwór utrwalający, roztwór przepuszczalny, bufor blokujący i bufor do przemywania zgodnie z przepisami podanymi w Tabeli 1.

2. Pobieranie narządów i przygotowanie tkanek

UWAGA: Obszerny protokół szczegółowo opisujący procedurę znieczulenia myszy i pobierania serca został wcześniej opublikowany17,18. W związku z tym przedstawiamy jedynie krótki opis tej części. Eksperymenty przeprowadzono na 12-16 tygodniowych myszach C57BL6 (sześć samców, cztery samice). Masa ciała samca zwiększyła się z 26 g do 28 g, a masy ciała samicy z 19 g do 22 g. Poniższe kroki wykonano bez uprzedniego wstrzyknięcia heparyny ogólnoustrojowej.

  1. Znieczulij mysz izofluranem (5%, 95% tlenu, przepływ: 1 l/min) i upewnij się, że głębokość znieczulenia jest wystarczająca.
  2. Przenieś mysz na stół operacyjny, ustawiając ją w pozycji leżącej. Utrzymuj narkozę za pomocą inhalacji izofluranu (2%, 98% tlenu, przepływ: 1 l/min) przez maskę znieczulającą i przymocuj mysz taśmą na końcach. Wstrzyknąć fentanyl w celu znieczulenia (0,1 mg/25 g masy ciała i.p.).
  3. Podnieś futro w wyrostku mieczykowatym i ustaw poprzeczne cięcie 2 mm. Odłącz sierść od powięzi podskórnej za pomocą rozwarstwienia (tył nożyczek) i rozciągnij cięcie czaszkowo i na boki, aby odsłonić klatkę piersiową.
  4. Ostrożnie otwórz brzuch ogonowy do łuku żebrowego. Lekko unieś wyrostek mieczykowaty, aby naciąć przeponę od ogona i spowodować zapadnięcie się płuc. Następnie przetnij przeponę od lewej do prawej, nie uszkadzając żadnych narządów i obustronnie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce.
  5. Przeciąć żyłę główną dolną (IVC), gdy serce nadal bije, aby wykrwawić mysz i przystąp do perfuzji serca, penetrując lewą komorę igłą 27 G i wstrzykując 10 ml lodowatej soli fizjologicznej 1x buforowanej fosforanem (PBS).
  6. Po usunięciu krwi z serca myszy zlokalizuj łuk aorty, żyłę główną górną (SVC) i tchawicę. Przetnij je ~3 mm powyżej podstawy serca i zbierz serce wraz z połączonymi płucami.
  7. Zanurz pobrane narządy w stożkowej probówce o pojemności 10 ml zawierającej 2 ml wysterylizowanego 30% roztworu sacharozy. Pozostawić próbki do odwodnienia przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie LA i PV pod kontrolą mikroskopii

  1. Umieść odwodnione serce i płuca w naczyniu separacyjnym zawierającym 40-50 ml 1x PBS. Umieść go pod mikroskopem jasnego pola o 10-krotnym powiększeniu i ustaw oświetlenie. Umieść serce jego grzbietową powierzchnią na naczyniu rozwarstwiającym. Zidentyfikuj przejście między ścianą komory a ścianą przedsionka i ostrożnie oddziel komory od przedsionków za pomocą nożyczek chirurgicznych.
    UWAGA: Przeciąć około 1 mm poniżej przedsionków, aby zachować trochę tkanki komorowej. Będzie to potrzebne później do przypięcia przedsionków do naczynia preparacyjnego bez uszkadzania struktur u podstawy serca. Sugerujemy zachowanie komór, ponieważ można je wykorzystać jako dodatnią próbkę kontrolną. Aby osadzić tkankę komorową, należy postępować zgodnie z tą samą procedurą, która została opisana dla osadzania PV, jak opisano w sekcji 4.
  2. Umieść oddzielone przedsionki z powierzchnią tnącą komory (krok 3.1) na naczyniu preparacyjnym tak, aby podstawa serca była skierowana do góry. Ustaw przedsionki tak, aby płaty płuc znajdowały się z tyłu, LA i uszek lewego przedsionka (LAA) znajdowały się po prawej stronie, a prawy przedsionek (RA) i prawy aroson przedsionka (RAA) znajdowały się po lewej stronie. Utrwal preparat, przypinając pozostałą tkankę lewej komory do naczynia rozwarstwiającego. Delikatnie rozłóż płatki płuc bez przykładania nadmiernej siły i przypnij je do naczynia preparacyjnego (Rysunek 1A).
  3. Zapoznaj się z przeglądem anatomicznych punktów orientacyjnych u podstawy serca.
    1. Znajdź aortę z łukiem aorty pośrodku podstawy serca.
    2. Wykryj pień płucny (PT) bezpośrednio po prawej stronie aorty i śledź jej bieg w kierunku tylnym, aby odróżnić tętnice płucne (PA). Sprawdź ich lokalizację, podążając ich kursem aż do lewego płata i prawego górnego/środkowego płata, aby znaleźć odpowiednią wnękę płuca (LH).
    3. Określ położenie tchawicy i/lub lewego i prawego oskrzela głównego (L Br, R Br), które znajdują się za aortą, i sprawdź ich położenie, podążając za ich kursem w kierunku LH (Rysunek 1A).
    4. Znajdź SVC po lewej stronie aorty i sprawdź, podążając za jego przebiegiem do RA obok RAA.
  4. Usuń tkankę łączną i tłuszczową wokół podstawy serca, zachowując wszystkie zidentyfikowane punkty orientacyjne wymienione powyżej. Dodatkowo usuń łuk aorty i tchawicę, aby mieć swobodny widok podstawy serca (Rysunek 1B).
  5. Delikatnie oddziel PA od górnej powierzchni przedsionka przez rozcięcie za pomocą cienkich kleszczy. Następnie odetnij je w LH i odwróć na bok, aby odsłonić wolną ścianę lewego przedsionka (LAFW) i PV w ich pełnym wymiarze. Odetnij główne oskrzela od lewej strony i usuń tkankę oskrzelową (Rysunek 1C).
    UWAGA: LH służy zarówno jako wspólny punkt wejścia dla PA i dróg oddechowych do płuc, jak i punkt wyjścia dla PV. Ważne jest, aby każdą procedurę wykonywać ostrożnie w LH, aby uniknąć uszkodzenia paneli fotowoltaicznych.
  6. Aby oddzielić LA/RA oraz lewą i prawą komorę (LV, RV), wykonaj cięcie, zaczynając od przedniej części pozostałego RV w górę przez zastawkę trójdzielną (TV) aż do przedniej strony SVC, aby otworzyć RA od strony czołowej. Przetnij tylną ścianę wolną od RZS (RAFW) obok przegrody międzyprzedsionkowej, aby oddzielić RZS i LA. Przeciąć tylną ścianę prawej komory obok przegrody międzykomorowej, aby całkowicie odciąć LV i RV.
    UWAGA: Wcześniej opublikowano obszerny protokół szczegółowo opisujący procedurę przygotowania i izolacji prawego przedsionka19. Oddzielenie RA jest przydatne do usunięcia niechcianej tkanki z kompleksu tkankowego LA-PV i pobrania tkanki do dodatkowych eksperymentów.
  7. Zmniejsz rozmiar płatów płuc, odcinając część podstawowej tkanki płucnej, tak aby pozostało około 3-4 mm tkanki płucnej.
    UWAGA: Zachowaj wierzchołki płatów płuc, ponieważ służą one jako pływaki podczas kolejnych etapów osadzania i umożliwiają poziome osadzanie PV w związku OCT.

4. Osadzanie tkanek

  1. Przenieś preparat, w tym LA i PV, do krioformy, upewniając się, że podstawa serca i wierzchołek płuc są skierowane do góry. Ułóż je w konfiguracji fizjologicznej - upewnij się, że PV nie są skręcone ani odwrócone.
  2. Napełnij kriomold związkiem OCT i delikatnie ściśnij PV drobnymi kleszkami, aby usunąć resztki powietrza. Utrzymuj ich konfigurację fizjologiczną niezmienioną przez cały proces.
  3. Umieść kriomold z osadzoną tkanką na suchym lodzie, aby zamrozić związek OCT. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.
    UWAGA: Bardzo ważne jest, aby utrzymać panele fotowoltaiczne w pozycji poziomej, aby zapewnić uzyskanie odcinków zawierających panele fotowoltaiczne na całej długości do kolejnych procedur.

5. Wycinanie i pobieranie zamrożonych skrawków tkanek

UWAGA: Aby przeciąć bloki tkanki, ustawienia maszyny zostały dostosowane do temperatury próbki -18 °C, a temperatury ostrza -25 °C.

  1. Zainstaluj blok tkankowy na uchwycie próbki, nakładając warstwę związku OCT między blok tkankowy a uchwyt próbki. Zamroź je na 3-4 minuty.
  2. Zablokuj głowicę próbki i załaduj uchwyt próbki blokiem tkankowym na głowie próbki, zamykając dźwignię zwalniającą uchwyt na próbkę. Dokładnie wyreguluj położenie bloku tkanki za pomocą pokręteł precyzyjnej regulacji.
  3. Usunąć kriomold z próbki. Odblokuj głowicę próbki i hamulec elektryczny kriostatu.
  4. Ustaw kriostat w trybie przycinania z rozmiarem przycinania od 30 μm do 50 μm. Przycinaj próbkę tkanki, aż PV staną się widoczne.
  5. Przełącz się na tryb precyzyjnego cięcia przekrojów i ustaw grubość na 10 μm. Rozpocznij pobieranie skrawków, w tym PV oraz połączonej tkanki płucnej i przedsionkowej. Zbierz sekcje za pomocą płytki zapobiegającej przetaczaniu się lub przymocowując wolny koniec każdej sekcji do uchwytu ostrza za pomocą drobnej zimnej szczotki i rozłóż je.
  6. Umieść szkiełko (utrzymywane w temperaturze pokojowej) obok sekcji. Ostrożnie zdejmij sekcję ze szczotki, pozwalając jej naturalnie przylegać do szkiełka, ponieważ zamrożona sekcja i związek O.C.T. topią się po dotknięciu cieplejszej powierzchni szkiełka.
    UWAGA: Utrzymuj stabilny i delikatny stan podczas procesu cięcia, aby zapobiec pęknięciom lub fałdom w sekcjach. W razie potrzeby wymień ostrze na nowe.
  7. Zbierz maksymalnie trzy sekcje na każdym slajdzie. Oznacz szkiełka i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Zalecamy zebranie co najmniej pięciu sekcji (co odpowiada dwóm slajdom) dla każdego PV.

6. Barwienie immunofluorescencyjne kriosekcji z PV

  1. Ułóż zamrożone szkiełka w systemie barwiącym i pozwól sekcjom rozmrozić się przez około 20 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Napełnij system barwienia wodą, aby utrzymać próbki nawilżone. Wysuszenie tkanki może uszkodzić antygeny, powodując niespecyficzne wiązanie przeciwciał i nadmierne artefakty barwienia podczas procedur barwienia.
  2. Po 20 minutach rozmrażania przykryj skrawki kilkoma kroplami roztworu utrwalającego (4% paraformaldehydu [PFA], Tabela 1), aby utrwalić tkankę na szkiełkach przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po zamocowaniu przenieś szkiełka do pionowego stojaka na prowadnice i zanurz je w pojemniku wypełnionym 1x PBS. Umieść pojemnik na wytrząsarce na niskich obrotach i myj szkiełka przez 5 minut. Powtórz ten cykl prania jeszcze dwa razy, za każdym razem używając świeżego 1x PBS.
  4. Po umyciu zakreśl każdą pojedynczą sekcję na każdym szkiełku pisakiem blokującym zawierającym ksylol. Ponownie ułożyć szkiełka w systemie barwiącym i nanieść 1 lub 2 krople roztworu przepuszczalnego (0,1% Triton X-100, Tabela 1) na każdą próbkę za pomocą pipety Pasteura. Pozostaw sekcje do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby przepuszczalność błon komórkowych i organelli komórkowych.
  5. Po przepuszczalności usunąć 0,1% roztwór Triton X-100, myjąc szkiełka przez 3 x 5 minut w 1x PBS, postępując zgodnie z tą samą procedurą, jak opisano w kroku 6.3.
  6. Po umyciu przełóż szkiełka na systemie barwiącym i nałóż 1 lub 2 krople buforu blokującego (tabela 1) na każdą sekcję, upewniając się, że są całkowicie pokryte buforem blokującym. Pozostawić szkiełka do inkubacji przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  7. Przygotować 1 ml mieszaniny przeciwciał pierwszorzędowych, pipetując 5 μl mysiego przeciwciała anty-cTNT (rozcieńczonego w stosunku 1:200) i 1 ml króliczego przeciwciała anty-Cx43 (rozcieńczonego w stosunku 1:1000) do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml wypełnionej 994 μl buforu blokującego. Pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby zapewnić dokładne wymieszanie.
    UWAGA: Dostosuj ilość nałożonej mieszaniny przeciwciał do wielkości sekcji. Upewnij się, że skrawki są całkowicie pokryte mieszaniną przeciwciał. Stężenie, czas inkubacji i optymalna temperatura inkubacji przeciwciał mogą się różnić w zależności od takich czynników, jak typ przeciwciała, klony przeciwciał i charakterystyka tkanek. Zalecamy testowanie i optymalizację warunków barwienia indywidualnie dla każdego przeciwciała.
  8. Po etapie blokowania (krok 6.6) usunąć pozostały bufor blokujący i bezpośrednio nanieść 2 lub 3 krople mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych na każdą sekcję. Pozostawić szkiełka do inkubacji przez noc w temperaturze 4 °C.
  9. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemywać szkiełka przez 3 x 5 minut buforem myjącym, delikatnie wstrząsając (Tabela 1).
  10. Przygotować 1 ml mieszaniny przeciwciał drugorzędowych, pipetując 1 μl sprzężonego z AF488 przeciwciała drugorzędowego przeciwciała koziego (rozcieńczonego 1:1,000) i 1 ml sprzężonego z AF568 koziego przeciwciała drugorzędowego przeciwko królikowi (rozcieńczonego 1:1,000) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml wypełnionej 998 μl buforu płuczącego. Pipetować mieszaninę w górę i w dół, aby dobrze wymieszać.
  11. Po etapie mycia (krok 6.9) przestawić szkiełka w systemie barwienia i nanieść pipetą 2 lub 3 krople mieszaniny przeciwciał wtórnych na każdą sekcję. Pozostawić przeciwciała do inkubacji przez 45 minut w temperaturze pokojowej, jednocześnie chroniąc próbki przed światłem, aby zapobiec wygaszaniu fluoroforu. Po wtórnej inkubacji przeciwciał myć szkiełka przez 3 x 5 minut buforem myjącym pod delikatnym wstrząsem (Tabela 1).
  12. Zmień rozmieszczenie szkiełek w systemie barwienia. Wybarwić skrawki za pomocą Hoechst-33342 (w rozcieńczeniu 1:1,000 w 1x PBS), nakładając 2 do 3 kropli roztworu Hoechst-33342 na każdą sekcję. Pozostawić szkiełka do inkubacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  13. Po inkubacji umyć szkiełka 3 x 5 minut buforem do płukania pod delikatnym wstrząsem (Tabela 1). Zamontuj szkiełka, nakładając 1 lub 2 krople fluorescencyjnego medium montażowego na każde szkiełko. Przykryj szkiełka szkiełkami nakrywkowymi.
    UWAGA: Upewnij się, że szkiełko nakrywkowe jest płaskie podczas jego umieszczania. Jeśli obecne są pęcherzyki powietrza, delikatnie dociśnij bok pęcherzyka, aby je usunąć.
  14. Przechowywać zamontowane prowadnice w wygaszaczu prowadnic w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Zaleca się jak najwcześniejsze wykonanie zdjęcia slajdów. Protokół ten nie jest ważny wyłącznie dla wymienionych przeciwciał. Docelowe antygeny i przeciwciała mogą być zastępowane lub modyfikowane zgodnie z indywidualnymi wymaganiami eksperymentu lub alternatywnymi strategiami wykrywania antygenów.

7. Obrazowanie plastrów barwienia immunofluorescencyjnego

  1. Ustaw mikroskop.
    1. Uruchom mikroskop z laserowym źródłem światła, podłączonym komputerem i dołączonym oprogramowaniem zgodnie z instrukcją producenta.
    2. Wejdź do menu Konfiguracja. Kliknij, aby wybrać odpowiedni typ kamery do obrazowania fluorescencyjnego (np. kamera monochromatyczna DFC365FX).
    3. Wejdź do menu Zdobądź i utwórz trzy kanały.
    4. Wybierz kanał FCr1 do wykrywania Hoechst-33342, oznacz go etykietą i wybierz kostkę filtra DAP w sekcji wyboru. Ustaw czas naświetlania na 200 ms, wzmocnienie elektroniczne na 2, a natężenie światła na 17%.
    5. Wybierz kanał FCr2 do wykrywania cTNT (barwionego przeciwciałem sprzężonym z AF488), oznacz go i wybierz kostkę filtra L5 w sekcji wyboru. Ustaw czas naświetlania na 200-300 ms, wzmocnienie elektroniczne na 1,8, a natężenie światła na 100%.
    6. Wybierz kanał FCr3 do wykrywania Cx43 (barwionego przeciwciałem sprzężonym z AF568), oznacz go i wybierz kostkę filtra TXR w sekcji wyboru. Ustaw czas naświetlania na 150 ms, wzmocnienie elektroniczne na 2, a natężenie światła na 100%.
      UWAGA: Charakterystyki spektralne kostek filtracyjnych są wymienione w tabeli 2.
  2. Załaduj szkiełko na stolik mikroskopu.
  3. Wykonaj obrazowanie poglądowe w 10-krotnym powiększeniu:
    1. Wybierz obiektyw 10x i otwórz migawkę lasera, klikając Na żywo. Po wybraniu kanału FCr1 użyj funkcji nawigatora, aby poruszać się po slajdzie, aż zostanie wykryty sygnał. Z grubsza skoncentruj próbkę, aż jądra komórkowe będą można rozróżnić.
    2. Zainicjuj tryb skanowania spiralnego, aby uzyskać pełny podgląd próbki. Dezaktywuj na żywo, klikając ponownie przycisk, aby chronić próbkę. Zidentyfikuj LA, PV i tkankę płucną.
    3. Zdefiniuj obszar zainteresowania dla kolejnego skanowania kafelków; wybierz wiele punktów ostrości w obszarze zainteresowania. Kliknij opcję Live (Na żywo) w kanale FCr1 i dostosuj ostrość dla każdego punktu ostrości. Zapisz odpowiednie pozycje Z, które reprezentują dokładną pozycję ostrości dla każdego punktu ostrości. Rozpocznij skanowanie kafelków przy 10-krotnym powiększeniu, aby uchwycić pełny obraz poglądowy próbki.
    4. Po zakończeniu skanowania otwórz skanowanie kafelków i scal poszczególne obrazy. Aby zwiększyć jasność i kontrast pojedynczych kanałów, zaznacz je na pasku obiektów i dostosuj ich zakres sygnału za pomocą suwaków zgodnie z potrzebami.
  4. Uzyskaj powiększone obrazy w 40-krotnym powiększeniu:
    1. Wybierz obiektyw 40x. Dostosuj ustawienia czasu ekspozycji i wzmocnienia dla każdego kanału w następujący sposób: FCr1: Kostka filtra DAP: czas ekspozycji: 50 ms, wzmocnienie: 1,5; FCr2: kostka filtra L5: czas naświetlania: 80 ms, wzmocnienie: 1,8; FCr3: Kostka filtra TXR: czas ekspozycji: 20 ms, wzmocnienie: 2.
    2. Skorzystaj z obrazu poglądowego w kroku 7.3, aby zlokalizować otwór PV (PVO), a także pozapłucne i wewnątrzpłucne obszary PV (PVex, PVin). Zdefiniuj ten obszar, który ma być skanowany.
    3. Otwórz podmenu Obraz i kliknij z, aby aktywować Z-Stack.
      1. Wybierz kanał FCr1 i otwórz migawkę lasera, aby uzyskać podgląd na żywo.
      2. Przejdź do podmenu Z-Stack i określ punkt początkowy i końcowy Z-Stack, obracającpokrętło precyzyjnej regulacji f ocus zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, aż ogólny sygnał zacznie tracić ostrość.
      3. Po ustawieniu zakresu ostrości wybierz tryb Z-Stack zoptymalizowany pod kątem systemu i aktywuj opcję obliczania obrazów o rozszerzonej głębi ostrości (EDF). W zależności od tego, jak płaska jest tkanka, spodziewaj się około 20 warstw w odstępach około 0,5 μm.
    4. Rozpocznij skanowanie kafelków. Po zeskanowaniu otwórz skanowanie kafelków i scal tylko obraz EDF. Aby zwiększyć jasność i kontrast pojedynczych kanałów, zaznacz je na pasku obiektów i dostosuj ich zakres sygnału za pomocą suwaków zgodnie z potrzebami (patrz krok 7.3.4).
  5. Po wygenerowaniu obrazów zapisz projekt i wyeksportuj zarówno scaloną wersję, jak i nieprzetworzone kanały każdego obrazu jako plik TIFF.
    UWAGA: Zapisanie plików w formacie TIFF nadającym się do odczytu ImageJ umożliwia programowi ImageJ zaimportowanie oryginalnego rozmiaru kafelka w μm zamiast pikseli. Zawsze zamykaj migawkę lasera, gdy sygnał laserowy nie jest potrzebny, aby zapobiec fotowybielaniu przeciwciał wtórnych.

8. Edycja obrazu za pomocą ImageJ

  1. Załaduj odpowiednie pliki kanałów RAW do ImageJ. Kliknij na Obrazek | Kolor | Scal i wybierz żądany kolor dla każdego kanału.
  2. Utwórz podziałkę liniową, wybierając pozycję Analizuj | Narzędzia | Pasek skali i wklej go w prawym dolnym rogu. Kontynuuj dalsze przetwarzanie i analizę zgodnie z wymaganiami obrazu. Zapisz scalone obrazy po zakończeniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy mikroanalizę, barwienie i obrazowanie PV u 10 myszy w wieku 12-16 tygodni. Postępując zgodnie z protokołem, z powodzeniem przeprowadziliśmy mikropreparację PV wraz z LA u wszystkich myszy eksperymentalnych i uzyskaliśmy sekcje z kompleksowym widokiem PV u ośmiu myszy. Zdjęcia poglądowe zostały wykonane w 10-krotnym powiększeniu w celu zidentyfikowania obszaru kryzy PV (PVO) na złączu LA-PV, pozapłucnych PV (PVex) (PV pomiędzy wnęką płuca a złączem LA-PV) oraz wewnątrzpłucnych PV (PV in

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dzięki temu protokołowi udostępniamy metodę rozróżniania i izolowania PV serca myszy oraz wykonywania na nich barwienia immunofluorescencyjnego. Po pobraniu narządów serce i płuca odwodniono w wysterylizowanym roztworze sacharozy, a następnie oddzielono komory od przedsionka i płatów płuc pod mikroskopowym nadzorem. Następnie przygotowano podstawę serca w celu uwidocznienia PV, a następnie wycięto je z płuc na wnęce. Późniejsze barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono przy użyciu kriotechniki poprzez zatopienie tka...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Niemieckie Centrum Badań Sercowo-Naczyniowych (DZHK; 81X3600221 do H.V., 81X2600255 do S.C.), Chińską Radę Stypendialną (CSC201808130158 do R.X.), Niemiecką Fundację Badawczą (DFG; Clinician Scientist Program in Vascular Medicine (PRIME), MA 2186/14-1 do PT) oraz Corona Foundation (S199/10079/2019 do SC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka adhezyjneEpredia10149870
AF568-przeciwciało drugorzędoweInvitrogenA11036Gospodarz: Koza, Reaktywność: Agaroza królicza
Biozym LE840104
Alexa Fluor 488-przeciwciało wtórneTechnologia sygnalizacji komórkowej4408SGospodarz: Koza, Reaktywność: mysz
Anti-Connexin 43 / GJA1 przeciwciałoAbcamab11370Przeciwciało poliklonalne, Klon: GJA1, Gospodarz: Królik 
Przeciwciało anty-cTNTInvitrogenMA5-12960Przeciwciało monoklonalne, Klon: 13-11, Gospodarz: Mysz
Albumina surowicy bydlęcejSigma-AldrichA2153
SzczotkaLukas 5486rozmiar 6
Szkiełka nakrywkoweEpredia24 mm x 50 mm
Cryotome Cryo Star NX70Epredia Ustawienia: Temperatura próbki: -18 ° C, Temperatura ostrza: -25 ° C
DFC365FX aparatfotograficzny Leica 
Mikroskop fluorescencyjny DM6 BLeica 
Suchy lód
Solanka buforowana fosforanami Dubecco (DPBS) 1x stężenie.Gibco14040133500 ml
Dumont #5FS KleszczeFST91150-202 sztuki
Drobne nożyczkiFST14090-09
Fluorescencyjny nośnik montażowyDAKOS3023
Graefe KleszczeF.S.T.11052-10
Hoechst 33342InvitrogenH3570Barwienie przeciwstawne jąder komórkowych
ImageJOprogramowanie do analizy i przetwarzaniaFIJI
LAS XLeica Oprogramowanie do obrazowania dla Leica DM6 B
Ostrza mikrotomu S35Feather207500000
Kuchenka mikrofalowa
Normalna surowica koziaSigma-AldrichS26-M
O.C.T. compoundTissue-Tek4583
Paraformaldehyd 16%Pierce28908pipety
Pasteura bez metanoluVWR612-1681
szalka PetriegoTPP93100średnica 100 mm
Rocker 3D digitalIKA Schü ttler00040010000
Słoiki do barwienia szkiełekEasyDipM900-12
Formy do próbekTissue-Tek Cryomold455725 mm x 20 mm x 5 mm
System barwienia StainTray M920StainTray631-1923System barwienia na 20 szkiełek
Sterican NeedleBraun4657705G 27 - służy do iniekcji (krok 2) i przypinania (krok 3 i 4) w protokole
Student Vannas Spring ScissorsF.S.T.91500-09
Super PAP Pen Liquid BlockerSuper PAP PenN71310-N
StrzykawkiBraun4606108V10 mL
Tris baseRocheTRIS-ROskładnik do 1x Tris-Buffered Saline (TBS)
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
Tween 20Sigma-AldrichP2287
potrzebne

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lippi, G., Sanchis-Gomar, F., Cervellin, G. Global epidemiology of atrial fibrillation: An increasing epidemic and public health challenge. International Journal of Stroke. 16 (2), 217-221 (2021).
  2. Wijesurendra, R. S., Casadei, B. Mechanisms of atrial fibrillation. Heart. 105 (24), 1860-1867 (2019).
  3. Haïssaguerre, M., et al. Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins. The New England Journal of Medicine. 339 (10), 659-666 (1998).
  4. Mueller-Hoecker, J., et al. Of rodents and humans: a light microscopic and ultrastructural study on cardiomyocytes in pulmonary veins. International Journal of Medical Sciences. 5 (3), 152-158 (2008).
  5. Kramer, A. W., Marks, L. S. The occurrence of cardiac muscle in the pulmonary veins of Rodenita. Journal of Morphology. 117 (2), 135-149 (1965).
  6. Nathan, H., Eliakim, M. The junction between the left atrium and the pulmonary veins. Circulation. 34 (3), 412-422 (1966).
  7. Nathan, H., Gloobe, H. Myocardial atrio-venous junctions and extensions (sleeves) over the pulmonary and caval veins: Anatomical observations in various mammals. Thorax. 25 (3), 317-324 (1970).
  8. Bond, R. C., Choisy, S. C., Bryant, S. M., Hancox, J. C., James, A. F. Ion currents, action potentials, and noradrenergic responses in rat pulmonary vein and left atrial cardiomyocytes. Physiological Reports. 8 (9), 14432(2020).
  9. Thiagalingam, A., et al. Pulmonary vein contraction: Characterization of dynamic changes in pulmonary vein morphology using multiphase multislice computed tomography scanning. Heart Rhythm. 5 (12), 1645-1650 (2008).
  10. Spach, M. S., Barr, R. C., Jewett, P. H. Spread of excitation from the atrium into thoracic veins in human beings and dogs. The American Journal of Cardiology. 30 (8), 844-854 (1972).
  11. Scott McNutt, N., Weinstein, R. S. Membrane ultrastructure at mammalian intercellular junctions. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 26, 45-101 (1973).
  12. Barr, L., Dewey, M. M., Berger, W. Propagation of action potentials and the structure of the nexus in cardiac muscle. Journal of General Physiology. 48 (5), 797-823 (1965).
  13. Kawamura, K., Konishi, T. Ultrastructure of the cell junction of heart muscle with special reference to its functional significance in excitation conduction and to the concept of "disease of intercalated disc". Japanese Circulation Journal. 31 (11), 1533-1543 (1967).
  14. Van Kempen, M. J., Fromaget, C., Gros, D., Moorman, A. F., Lamers, W. H. Spatial distribution of connexin43, the major cardiac gap junction protein, in the developing and adult rat heart. Circulation Research. 68 (6), 1638-1651 (1991).
  15. Verheule, S. Tissue structure and connexin expression of canine pulmonary veins. Cardiovascular Research. 55 (4), 727-738 (2002).
  16. Xiao, Y., et al. Expression of connexin 43, ion channels and Ca2+-handling proteins in rat pulmonary vein cardiomyocytes. Experimental and Therapeutic Medicine. 12 (5), 3233-3241 (2016).
  17. Xia, R., et al. Whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3D reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (166), (2020).
  18. Tomsits, P., et al. Medetomidine/midazolam/fentanyl narcosis alters cardiac autonomic tone leading to conduction disorders and arrhythmias in mice. Lab Animal. 52 (4), 85-92 (2023).
  19. Xia, R., et al. Isolation and culture of resident cardiac macrophages from the murine sinoatrial and atrioventricular node. Journal of Visualized Experiments. (171), (2021).
  20. Bredeloux, P., Pasqualin, C., Bordy, R., Maupoil, V., Findlay, I. Automatic activity arising in cardiac muscle sleeves of the pulmonary vein. Biomolecules. 12 (1), 23(2021).
  21. Chen, P. S., et al. The mechanisms of atrial fibrillation. Journal of Cardiovascular Electrophysiology. 17, S2-S7 (2006).
  22. Thibault, S., Ton, A. -T., Huynh, F., Fiset, C. Connexin lateralization contributes to male susceptibility to atrial fibrillation. International Journal of Molecular Sciences. 23 (18), 10696(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Protok mikrodysekcjiserce mysiemigotanie przedsionk wtroponina T sercakoneksyna 43mikroskopia w wietle przechodz cymizolacja kardiomiocyt w

Powiązane artykuły