Artykuł metodologiczny

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65837

⸱

1 marca 2024

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Streszczenie

Dzisiejsze wyzwania związane z naprawą ścięgien i więzadeł wymagają zidentyfikowania odpowiedniego i skutecznego kandydata do terapii opartej na komórkach w celu wspomagania regeneracji ścięgien. Mezenchymalne komórki zrębu (MSC) zostały zbadane jako potencjalna strategia inżynierii tkankowej do naprawy ścięgien. Chociaż są multipotencjalne i mają potencjał regeneracyjny in vivo, mają ograniczoną zdolność do samoodnawiania się i wykazują niejednorodność fenotypową. Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) mogą obejść te ograniczenia ze względu na ich wysoką zdolność do samoodnawiania się i niezrównaną plastyczność rozwojową. W rozwoju tenocytów twardówka (Scx) jest kluczowym bezpośrednim molekularnym regulatorem różnicowania ścięgien. Ponadto wykazano, że mechanoregulacja jest centralnym elementem kierującym rozwojem i gojeniem ścięgien embrionalnych. W związku z tym opracowaliśmy protokół opisujący synergiczny efekt biologicznej i mechanicznej stymulacji, który może być niezbędny do generowania tenocytów. Indukowano iPSC tak, aby stały się mezenchymalnymi komórkami zrębu (iMSC) i scharakteryzowano je klasycznymi mezenchymalnymi markerami komórek zrębu za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie, za pomocą wektora lentiwirusowego, iMSC zostały transdukowane do stabilnej nadekspresji SCX (iMSCSCX+). Te komórkiiMSC SCX+ mogą być dalej dojrzewane do iTenocytów poprzez jednoosiowe obciążenie rozciągające przy użyciu bioreaktora 2D. Powstałe komórki scharakteryzowano poprzez obserwację regulacji w górę wczesnych i późnych markerów ścięgien, a także odkładania kolagenu. Ta metoda generowania iTenocytów może być wykorzystana do pomocy naukowcom w opracowaniu potencjalnie nieograniczonego, gotowego do użycia allogenicznego źródła komórek do zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.

Wprowadzenie

Aby poradzić sobie ze współczesnymi problemami w naprawie ścięgien i więzadeł, potrzebny jest odpowiedni kandydat na komórkę odpowiedni do terapii komórkowych. Jednym z kierunków badań w inżynierii tkankowej w celu naprawy ścięgien jest badanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących ze szpiku kostnego (BM-MSC) i komórek zrębowych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) jako potencjalnych strategii. Komórki te mają zdolność multipotencjalną, dużą obfitość i potencjał regeneracyjny in vivo. Dodatkowo wykazały zwiększoną zdolność gojenia i lepsze wyniki funkcjonalne w modelach zwierzęcych1. Niemniej jednak komórki te wykazują ograniczone zdolności do samoodnawiania, różnorodność fenotypową, a zwłaszcza ograniczoną zdolność do tworzenia ścięgien. Technologia indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) stanowi rozwiązanie tych ograniczeń ze względu na swoją niezwykłą zdolność do samoodnawiania się i niezrównane zdolności adaptacyjne do rozwoju. Nasz zespół badawczy i inni osiągnęli pomyślne różnicowanie iPSC w mezenchymalne jednostki podobne do komórek zrębu (iMSC)2,3. W związku z tym iMSC mają potencjał, aby stać się allogenicznym źródłem zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.

Twardówka (SCX) jest czynnikiem transkrypcyjnym niezbędnym do rozwoju ścięgien i jest uważana za najwcześniejszy wykrywalny marker dla zróżnicowanych tenocytów. Dodatkowo SCX aktywuje markery różnicowania ścięgien, w tym między innymi kolagen łańcuchowy typu 1a1 1 (COL1a1), irokez (MKX) i tenomodulinę (TNMD)4,5,6. Inne geny ulegające ekspresji podczas dojrzewania ścięgien obejmują białko promujące polimeryzację tubuliny 3 (TPPP3) i receptor alfa czynnika wzrostu pochodzenia płytkowego (PDGFRa) 7. Chociaż geny te są niezbędne do rozwoju i dojrzewania ścięgien, niestety nie są unikalne dla tkanki ścięgna i ulegają ekspresji w innych tkankach mięśniowo-szkieletowych, takich jak kości lub chrząstki5,7.

Oprócz ekspresji markerów podczas rozwoju ścięgien, mechanostymulacja jest niezbędnym elementem rozwoju i gojenia ścięgien embrionalnych4,5,6. Ścięgna są mechanofarelacyjne, a ich wzorce wzrostu zmieniają się w odpowiedzi na środowisko. Na poziomie molekularnym sygnały biomechaniczne wpływają na rozwój, dojrzewanie, utrzymanie i gojenie tenocytów8. Do modelowania obciążeń fizjologicznych i sygnałów biomechanicznych wykorzystano różne systemy bioreaktorów. Niektóre z tych systemów modelowych obejmują ładowanie tkanek ex vivo, systemy ładowania komórek 2D wykorzystujące napięcie dwuosiowe lub jednoosiowe oraz systemy 3D wykorzystujące rusztowania i hydrożele9,10. Systemy 2D są korzystne podczas badania wpływu stymulacji mechanicznej na geny specyficzne dla ścięgien lub morfologię komórek w kontekście losu komórki, podczas gdy systemy 3D mogą dokładniej replikować interakcje komórka-ECM9,10.

W systemach ładowania 2D, szczep między komórkami a substratem hodowli jest jednorodny, co oznacza, że obciążenie cytoszkieletu komórek może być w pełni kontrolowane. W porównaniu z obciążeniem dwuosiowym, obciążenie jednoosiowe jest bardziej istotne fizjologicznie, ponieważ tenocyty są głównie poddawane obciążeniu jednoosiowemu z wiązek kolagenu in vivo9. Stwierdzono, że podczas codziennych czynności ścięgna są poddawane jednoosiowemu obciążeniu rozciągającemu do 6% odkształcenia11. W szczególności poprzednie badania wykazały, że obciążenie w fizjologicznych zakresach 4%-5% sprzyja różnicowaniu tenogenicznemu poprzez zachowanie ekspresji markerów związanych ze ścięgnami, takich jak SCX i TNMD, a także zwiększoną produkcję kolagenu9,10. Szczepy powyżej 10% mogą być traumatyczne, ale nie są istotne fizjologicznie12,13.

Tutaj prezentowany jest protokół, który uwzględnia synergiczny efekt mechanicznej i biologicznej stymulacji, która może być niezbędna do generowania tenocytów. W pierwszej kolejności opisano powtarzalną metodę indukcji iPSC do iMSC poprzez krótkotrwałą ekspozycję ciał zarodkowych na czynniki wzrostu, potwierdzone markerami powierzchniowymi MSC za pomocą cytometrii przepływowej. Następnie szczegółowo opisujemy metodę transdukcji lentiwirusowej w celu zaprojektowania iMSC tak, aby miały stabilną nadekspresję SCX (iMSCSCX+). W celu dalszego dojrzewania komórki, iMSCSCX+ są umieszczane w silikonowych płytkach pokrytych fibronektyną i poddawane zoptymalizowanemu protokołowi jednoosiowego napięcia przy użyciu bioreaktora CellScale MCFX. Potencjał tenogeniczny został potwierdzony poprzez obserwację regulacji w górę wczesnych i późnych markerów ścięgien, a także odkładania kolagenu14. Ta metoda generowania iTenocytów jest dowodem słuszności koncepcji, która może stanowić nieograniczone, gotowe do użycia, allogeniczne źródło do zastosowań w terapii komórek ścięgnistych.

Protokół

Ten protokół do produkcji iTenocytów może być przeprowadzony w trzech głównych krokach: iPSC do iMSCs (10 dni), iMSC do iMSCSCX+ (2 tygodnie), iMSCSCX+ do iTenocytes (minimum 4 dni). Każdy główny krok w protokole może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później, w zależności od harmonogramu eksperymentu. W przypadku metod związanych z hodowlą komórek należy stosować techniki sterylne. Wszystkie komórki w tym protokole powinny być hodowane w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.

1. Indukcja ludzkiego iPSC do indukowanych mezenchymalnych komórek zrębowych (iMSC)

  1. Przygotowanie do eksperymentu
    1. Przygotuj zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies (IMDM-EB) firmy Iscove.
      1. Uzupełnij 50 ml podłoża podstawowego IMDM 8,5 ml zastępczej surowicy nokautującej, 500 μl aminokwasów endogennych Minimal Essential Medium (MEM), 0,385 μl (110 mM zapasu) beta-merkaptoetanolu i 500 μl roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (AAS) (stężenia końcowe: odpowiednio 17%, 1%, 110 μM, 1%) (patrz tabela materiałów).
    2. Przygotuj pożywkę dla mezenchymalnych komórek zrębu (MSC).
      1. Uzupełnij 440 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco o niskim poziomie glukozy z 50 ml płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 5 ml roztworu antybiotykowo-przeciwgrzybiczego (AAS) i 5 ml L-glutaminy (końcowe stężenia: odpowiednio 10%, 1%, 2 mM).
    3. Przygotować płytki pokryte poli(2-hydroksyetylometakrylanem) (poli-HEMA).
      1. Dodać 10 g poli-HEMA (patrz tabela materiałów) do sterylnej butelki.
      2. Dodaj mieszadło magnetyczne do butelki i mieszając, powoli dodawaj 500 ml 95% EtOH.
      3. Po dodaniu całego EtOH włącz tryb mieszania przy 1200 obr./min z dodatkowym małym ogniem przez co najmniej 6 godzin. Roztwór poly-HEMA może być przechowywany w temperaturze pokojowej przez okres do roku.
      4. W sterylnych warunkach dodać 2,5 μg/cm2 w 9 ml do kolby T75. Dostosuj objętość do wielkości naczynia hodowlanego.
      5. Zachowując sterylność, przed użyciem pozostaw naczynia do wyschnięcia na powietrzu, aby EtOH całkowicie odparował. Zwykle trwa to 24-72 godziny.
    4. Przygotować kolby pokryte żelatyną.
      1. Umyj szklaną butelkę NaOH i poświęć ją preparatowi żelatyny. Nie używaj detergentu.
      2. Przygotuj 1% roztwór żelatyny (5 g żelatyny i 500 ml wody wolnej od endotoksyn). Szklaną butelkę z roztworem żelatyny należy sterylizować w autoklawie przez 30 minut.
      3. Pozostaw roztwór żelatyny do ostygnięcia i można go przechowywać w temperaturze pokojowej.
      4. Pokryć jedną kolbę T75 5 ml roztworu żelatyny na kolbę i inkubować przez co najmniej 1 godzinę przed wysiewem komórek. Kolby pokryte żelatyną można przygotować 1 dzień wcześniej.
    5. Przygotuj bufor do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
      1. Wymieszać PBS z 2% albuminą surowicy bydlęcej i 0,1% azydkiem sodu. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Wytwarzanie ciał zarodkowych (EBs)
    UWAGA: iPSC powinny być hodowane na płytce 6-dołkowej i powinny osiągnąć 70%-80% konfluencji przed użyciem.
    1. W dniu 0 umieść płytkę 384 z przezroczystym dnem do kaptura do hodowli tkankowej i UV przez 15 minut bez pokrywki.
    2. Usunąć pożywkę wzrostową z iPSC (patrz Tabela Materiałów) i umyć studzienki PBS.
    3. Dodać 0,5 ml wstępnie ogrzanego odczynnika do dysocjacji delikatnych komórek (patrz tabela materiałów) do każdego dołka i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Obserwować komórki co 5 minut, aż iPSC staną się pojedynczymi komórkami lub małymi agregatami uniesionymi w zawiesinie.
    4. Zawiesinę komórek zawiesić za pomocą pipety o pojemności 1 ml, aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki.
    5. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić na pożywce IMDM-EB (krok 1.1.1) i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
    7. Oblicz odpowiednią objętość zawiesiny komórek wymaganą do uzyskania 5 000-25 000 komórek na studzienkę płytki 384-dołkowej z 25 μl zawiesiny komórek na basenik.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 2-3 konfluentne (70%-80%) studzienki płytki 6-dołkowej mogą wytworzyć EB w jednej płytce 384-dołkowej. Wielkość komórek na EB zostanie określona empirycznie. Na całą płytkę 384-dołkową należy użyć 9,6 ml zawiesiny komórek, 25 μl na dołek.
    8. Ponownie odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w odpowiedniej objętości pożywki IMDM-EB i 10 μM dichlorowodorku Y-27632 (zapas: 10 mM, 1000x, patrz Tabela Materiałów) we wstępnie schłodzonej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    10. Dodaj rozpuszczoną na zimno matrycę błony podstawnej (1 mg na płytkę 384-dołkową EB) do stożka (patrz tabela materiałów).
    11. Rozprowadzić 25 μl zawiesiny komórek do każdej studzienki. Umieścić sterylną pokrywkę na talerzu i wirować w temperaturze 450 x g w temperaturze 4 °C przez 7 minut. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
    12. W dniu 2 przenieś komórki na płytkę o średnicy 100 mm z 3 ml wstępnie podgrzanej pożywki IMDM-EB.
    13. Przenieś EB do dedykowanych kolb T75 pokrytych poliehema z 10 ml IMDM-EB. Dostosuj objętość do wielkości naczynia hodowlanego. Pozwól EB rosnąć przez 3 dni.
    14. W dniu 5 przenieść EB do przygotowanych kolb T75 pokrytych żelatyną z 10 ml pożywki IMDM-EB. Dostosuj objętość do wielkości naczynia hodowlanego. Hoduj EB jeszcze przez 3 dni w zawieszeniu.
    15. W dniu 8 upewnij się, że zaobserwowano dwa rodzaje EB: EB przyłączone do kolby i nieprzyłączone EB. Wypłukać nieprzyłączone EB z kolby za pomocą PBS.
    16. Do dołączonych EB dodać pożywkę IMDM-EB uzupełnioną TGFβ-1 (10 ng/ml) (patrz tabela materiałów) i pozostawić je do wzrostu przez 2 dni.
    17. W dniu 10 zmień pożywkę na pożywkę MSC. Komórki należy karmić dwa razy w tygodniu. Gdy zlewa się w 70%, przejdź do "Standardowego protokołu komórek podnoszących", aby ponownie platerować komórki. Ponownie umieść komórki na płytkach pokrytych żelatyną.
  3. Standardowy protokół komórek podnoszących
    1. Gdy przylegające komórki osiągną 70% konfluencji, odessać pożywkę wzrostową z płytek i przemyć PBS.
    2. Podnieś komórki, dodając 5 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny do każdej płytki o średnicy 150 mm i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37 °C. Dostosuj objętość trypsyny do wielkości naczynia hodowlanego.
    3. Pod mikroskopem sprawdź, czy większość komórek została podniesiona z każdej płytki. Jeśli nadal są przyczepione komórki, delikatnie postukaj w boki płytek, aby je usunąć.
    4. Zbierz komórki do stożkowej probówki, dodając podwójną objętość wstępnie podgrzanej pożywki wzrostowej.
    5. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g. Usuń supernatant i przejdź do następnych kroków.
  4. Ocena cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji markera MSC
    UWAGA: Ludzkie MSC, podobnie jak MSCs szpiku kostnego, powinny być stosowane jako kontrola pozytywna.
    1. Wykonaj "Standardowy protokół komórek podnoszących" (krok 1.3).
    2. Zawiesić supernatant w 3 ml buforu FACS i przenieść całą objętość do probówek FACS.
    3. Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g. Powtórz krok mycia z buforem FACS jeszcze dwa razy.
    4. Do barwionych probówek dodać 2 μl mysiego antyludzkiego CD90-FITC, mysiego antyludzkiego CD44-APC i antyludzkiego CD105-PE (patrz tabela materiałów) i inkubować przez 45 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Do probówek kontrolnych izotypu dodać 20 μl mysiego IgG2a-FITC, mysiego IgG1-PB i mysiego IgG1-PE (patrz tabela materiałów).
    6. Inkubować w ciemności w temperaturze 4 °C przez 15 minut. Przemyć wszystkie probówki, dodając 3 ml buforu FACS i odwirowując przez 5 minut przy 300 x g (w temperaturze pokojowej). Ponownie zawiesić komórki w 250 μl buforu FACS dla każdej probówki.
    7. Przeanalizuj ekspresję markerów powierzchniowych MSCs za pomocą cytometrii przepływowej14. Długości fal wzbudzenia i emisji powinny wynosić: CD90-FITC, szczyt wzbudzenia przy 495 nm i szczyt emisji przy 519 nm; CD44-APC, szczyt wzbudzenia przy 640 nm i szczyt emisji przy 660 nm; CD105-PE, szczyt wzbudzenia przy 561 nm i szczyt emisji przy 574 nm.

2. Przejście i rozbudowa iMSC

  1. Przygotowanie odczynników
    1. Przygotuj pożywkę do zamrażania MSC.
      1. Połącz 30 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy, 5 ml DMSO i 15 ml FBS (stężenia końcowe: odpowiednio 60%, 10%, 30%).
      2. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego filtra 0,45 μm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
  2. Passaging
    UWAGA: Po indukcji, iMSC muszą być hodowane na płytkach pokrytych żelatyną przez dodatkowe 2 pasaże, zanim zostaną odstawione do uprawy na plastikowych płytkach do hodowli tkankowych. Dodatkowo komórki powinny być pasażowane w stosunku podziału 1:3, gdy zlewają się w 70%.
    1. Wykonaj "Standardowy protokół komórek podnoszących" (krok 1.3).
    2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce MSC i równomiernie rozprowadzić komórki na trzech nowych płytkach o średnicy 150 mm w kolbach T175 z 20 ml pożywki na kolbę. Przywrócić komórki do temperatury 37 °C.
    3. Nakarm komórki dwa razy w tygodniu, zastępując pożywkę wzrostową wstępnie podgrzaną pożywką MSC.
  3. mrożenie
    1. Wykonaj "Standardowy protokół komórek podnoszących".
    2. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do zamrażania MSC. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do kriowialu i przechowywać w pojemniku do zamrażania przez 24 godziny w temperaturze -80 °C przed przeniesieniem do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
  4. rozmrażanie
    1. Przygotować 10 ml wstępnie podgrzanej pożywki MSC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    2. Wyjmij kriowial, zanurz go w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i mieszaj, aż pozostanie lodowa kula wielkości ziarnka grochu (około 1-2 minuty).
    3. W kapturze do hodowli komórkowej powoli dodaj 1 ml wstępnie podgrzanej pożywki do kriowialnego i pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać.
    4. Przenieść zawiesinę komórek z kriowialu do przygotowanej stożkowej probówki o pojemności 15 ml ze wstępnie podgrzaną pożywką i wirować przez 5 minut przy 300 x g (w temperaturze pokojowej).
    5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić z nowym podłożem. Dodać zawiesinę komórek do płytki o średnicy 150 mm o całkowitej objętości 20 ml. Dostosuj objętość do wielkości kolby hodowlanej.
    6. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, aż będą gotowe do podziału.

3. Inżynieria genetyczna iMSC do nadekspresji SCX za pomocą transdukcji lentiwirusowej

UWAGA: Ukończenie tej sekcji protokołu zajmuje dwa tygodnie.

  1. Przygotowanie pożywek i odczynników
    1. Przygotuj nośnik komórkowy HEK293T/17.
      1. Uzupełnij 445 ml Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) z 50 ml FBS i 5 ml AAS (stężenia końcowe: odpowiednio 10%, 1%).
    2. Przygotuj pożywkę do pakowania soczewek MSC.
      1. Przygotować inaktywowaną termicznie surowicę, ogrzewając 50 ml FBS o temperaturze pokojowej w łaźni wodnej o temperaturze 60 °C przez 30 minut.
      2. Połącz 445 ml DMEM o niskiej zawartości glukozy z inaktywowanym termicznie FBS i 5 ml L-glutaminy (końcowe stężenia: odpowiednio 10%, 2 mM).
    3. Przygotuj kompleks transfekcyjny.
      1. Pozwól składnikom kompleksu transfekcji (patrz Tabela materiałów) rozmrozić się na lodzie: plazmidy pakujące VSV-G i Delta, plazmid SCX i BioT15,16.
      2. Delikatnie wiruj i odwiruj plazmidy. Zmierz stężenia DNA.
      3. Na podstawie stężeń DNA i liczby kolb przeznaczonych do transfekcji oblicz objętość każdego potrzebnego składnika: dla jednej kolby T75 kompleks transfekcji będzie składał się z 750 μl pożywki wolnej od surowicy (takiej jak DMEM lub PBS bez surowicy), 7,5 μg plazmidu SCX, 0,75 μg plazmidu VSV-G, 6,75 μg plazmidu Delta i 22,5 μl BioT. Weź pod uwagę dodatkowe błędy pipetowania.
      4. Mieszać, delikatnie pipetując w górę i w dół. Krótko odwirować w wirówce. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 15 minut i natychmiast zużyć.
  2. Transfekcja i produkcja lentiwirusa
    UWAGA: Począwszy od 3 dnia, protokół obejmuje pracę z lentiwirusem, a zatem prace muszą być wykonywane przy użyciu procedur operacyjnych poziomu hermetyczności 2+. Pracownicy muszą nosić środki ochrony osobistej, w tym dwie warstwy rękawic, osłony na nadgarstki, okulary ochronne, maskę oraz długie spodnie i zamknięte buty. Wszystkie odpady i materiały, w tym końcówki do pipet, kolby i płynne podłoże, należy odkazić wybielaczem (końcowy 1% podchloryn sodu) przez co najmniej 20 minut. Nie używaj odkurzacza.
    1. Nasiona HEK293T/17 komórek.
      1. Około 18-24 godziny przed transfekcją (dzień 0) należy podnieść i poszczepić komórki 293T w kolbach T75. Kolejne tomy przyjmują, że T75 jest naczyniem hodowlanym. Dostosuj objętość w zależności od użytego naczynia do hodowli komórkowej.
      2. Wyjąć pożywkę hodowlaną z kolb i przemyć 5 ml PBS.
        UWAGA: Komórki bardzo łatwo unoszą się z powierzchni kolby. Dodać PBS z boku kolby i unikać bezpośredniego dodawania roztworu do komórek.
      3. Dodać 3 ml wstępnie podgrzanej 0,25% trypsyny do każdej kolby i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zebrać komórki do stożkowej probówki i wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g.
      4. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić w pożywce 293T i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
      5. Płytki komórek o wymiarach 5,3 x 104 komórki/cm2 i inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.
      6. Następnego dnia (dzień 1) przygotuj kompleks transfekcyjny. Zastąp pożywkę wzrostową z komórek 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki opakowaniowej z soczewicy MSC (etap 3.1.2).
      7. Dodaj kompleks transfekcji kroplami do komórek. Delikatnie przechyl naczynie, aby zapewnić równomierne narażenie kompleksu transfekcji na komórki. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze przez 48 godzin
        UWAGA: Toksyczność należy obserwować po 24 godzinach (dzień 2).
      8. Po 48 godzinach (dzień 3) ostrożnie zebrać pożywkę zawierającą wirusa do oddzielnej stożkowej probówki za pomocą pipety i wirować przez 5 minut przy 300 x g (w temperaturze pokojowej).
      9. Dodać 5 ml wstępnie podgrzanej pożywki opakowaniowej MSC z soczewicy do kolby T75 z komórkami 293T i wrócić na noc do inkubatora.
      10. Po odwirowaniu przefiltrować supernatant sterylnym filtrem 0,45 μm, bezpośrednio pipetując supernatant przez filtr. Pożywkę zawierającą wirusa należy przechowywać przez noc w temperaturze 4 °C.
      11. Po kolejnych 24 godzinach (dzień 4) ponownie ostrożnie zebrać pożywkę zawierającą wirusa do oddzielnej stożkowej probówki za pomocą pipety i odwirować przez 5 minut przy 300 x g (w temperaturze pokojowej).
      12. Połączyć wirusa z wirusem z poprzedniego dnia pobrania i wymieszać, aby uzyskać jednorodny roztwór. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później, w zależności od harmonogramu eksperymentu. Lentiwirus może być podzielony na porcje i zamrożony w temperaturze -80 °C lub lentiwirus może być przechowywany na lodzie podczas wykonywania "Transdukcji iMSC za pomocą SCX" (krok 3.3).
        UWAGA: Po zamrożeniu i rozmrożeniu podwielokrotności lentiwirusa nie zamrażaj ponownie.
  3. Transdukcja iMSC za pomocą SCX
    1. Wykonać transdukcję płytki mianowej.
      1. W dniu 0 wykonaj "Standardowy protokół komórek liftingujących".
      2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce MSC i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
      3. Na płytce 6-dołkowej dodać 4 x 103 komórek/cm2. Pozostałą płytkę umieścić na dodatkowej płytce o średnicy 150 mm z 20 ml pożywki MSC (będzie to płytka kontrolna). Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
      4. Następnego dnia (dzień 1) komórki powinny być zlewające się w ~40%. Podgrzej pożywkę do pakowania soczewicy i rozmroź polibren oraz około 3 ml lentiwirusa na lodzie (lub, jeśli zostanie to zrobione w tym samym dniu, w którym pobrano wirusa, przechowywać na lodzie do czasu użycia).
      5. Dodaj pożywkę wzrostową z lenti-packaging i lentiwirusa do studzienek w oparciu o pożądane miana (tj. 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Dodać 0,5 μl polibrenu, aby uzyskać końcowe stężenie 5 μg/ml (stężenie podstawowe: 10 mg/ml, patrz tabela materiałów).
      6. Zakręć płytką, aby zapewnić równomierne naświetlenie wszystkich komórek. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 48 godzin.
    2. Oceń skuteczność miana lentiwirusa SCX za pomocą cytometrii przepływowej.
      1. Po 48 godzinach należy wykonać "Standardowy protokół komórek liftingowych".
      2. Ponownie zawiesić komórki w PBS i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 300 x g.
      3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić go w 3 ml buforu FACS w celu przemycia. Przenieść zawiesinę komórek do probówek do cytometrii przepływowej i odwirować przez 5 minut przy 300 x g.
      4. Powtórzyć płukanie buforem FACS jeszcze dwa razy i ponownie zawiesić końcowe granulki komórek w 300 μl buforu FACS. Ocenić ekspresję GFP dla każdego miana za pomocą maszyny do cytometrii przepływowej.
      5. Na podstawie mian i liczby żywotności komórek określ odpowiednie miano lentiwirusa, aby kontynuować transdukcję. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później, w zależności od harmonogramu eksperymentu.
    3. Wykonaj transdukcję SCX na dużą skalę.
      UWAGA: Podane objętości dotyczą 1x płytki 150 mm lub 1x kolby T175. Można to odpowiednio dostosować w zależności od pożądanej wielkości naczynia i skali transdukcji.
      1. W dniu 0 wykonaj "Standardowy protokół komórek liftingujących".
      2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce MSC i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek. Zasiej komórki w proporcjach 4 x 103 komórki/cm2. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C.
      3. Następnego dnia (dzień 1) komórki powinny być zlewające się w ~40%. Podgrzej pożywkę do pakowania soczewicy i rozmroź polibren oraz wstępnie obliczoną ilość lentiwirusa na lodzie.
      4. Na podstawie ustalonego miana dodać do studzienek żądaną ilość pożywki wzrostowej z opakowaniami soczewicy i lentiwirusa. Dodać 5 μg/ml polibrenu (stężenie podstawowe: 10 mg/ml).
      5. W 3 dniu obserwuj komórki pod mikroskopem fluorescencyjnym. Nowo wyprodukowany iMSCSCX+ powinien fluoryzować GFP. Zastąp pożywkę zawierającą wirusa wstępnie podgrzaną pożywką MSC. W tym momencie protokół może zostać wstrzymany i ponownie uruchomiony później, w zależności od harmonogramu eksperymentu.

4. Przejście i rozbudowa iMSCSCX+

  1. Przeprowadzanie pasażu, rozszerzania, zamrażania i rozmrażania iMSCSCX+ należy przeprowadzić w taki sam sposób, jak w przypadku iMSC, zgodnie z opisem w kroku 2 protokołu.

5. Obciążenie mechaniczne

UWAGA: Ta sekcja trwa minimum 4 dni, ale może być dłuższa w zależności od tego, czy zaobserwowano kurczenie się komórek.

  1. Przygotowanie do eksperymentu
    1. Przygotuj płytki silikonowe.
      1. Autoklaw 2 płytki silikonowe (patrz tabela materiałów). Następnie, w sterylnych warunkach, wyjmij silikonowe płytki z worka autoklawu i umieść je na płytkach o średnicy 150 mm.
      2. Połączyć 130 μl fibronektyny (100x, patrz tabela materiałów) z 13 ml sterylnego PBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Odwróć rurkę kilka razy, aby wymieszać.
      3. Dodaj 400 μl roztworu fibronektyny do każdej studzienki z silikonowych płytek. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez co najmniej 2 godziny lub przez noc.
      4. Przed użyciem należy odessać roztwór fibronektyny i pozostawić płytki do wyschnięcia na powietrzu w kapturze do hodowli komórkowych przez co najmniej 30 minut, aby roztwór fibronektyny całkowicie odparował.
        UWAGA: Roztwór fibronektyny można wcześniej usunąć z dołków, a teraz pokryte płytki mogą pozostać w temperaturze 37 °C przez okres do kilku tygodni do użycia.
    2. Przygotuj nośnik rozciągliwy MSC.
      1. Przygotować pożywkę MSC stretch, dodając 140 μl kwasu askorbinowego (podstawa: 100x, stężenie końcowe: 50 μg/ml) do 14 ml wstępnie podgrzanej pożywki MSC w stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
        UWAGA: Kwas askorbinowy musi być dodawany świeży do podłoża MSC przed każdą wymianą podłoża.
  2. Wysiew iMSCSCX+ w płytkach silikonowych
    1. Wykonaj "Standardowy protokół komórek podnoszących" (krok 1.3).
    2. Ponownie zawiesić komórki w pożywce MSC i policzyć żywe komórki za pomocą hemocytometru lub licznika komórek.
    3. Obliczyć objętość zawiesiny komórek potrzebną do uzyskania 1,25 x 104 komórek/cm2.
    4. Usunąć tę objętość pożywki rozciągliwej MSC z probówki stożkowej o pojemności 15 ml. Dodaj komórki docelowe. Odwrócić do jednorodności nową zawiesinę komórkową.
    5. Dodaj 400 μl nowej zawiesiny komórek do każdego dołka obu płytek silikonowych.
    6. Na płytki o średnicy 150 mm należy ponownie przykryć pokrywką i umieścić je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 24 godziny.
  3. Naprężenie jednoosiowe
    1. Następnego dnia przepłukać aparat do rozciągania (patrz Tabela Materiałów) ddH2O, a następnie 70% etanolem. Wytrzyj aparat, umieść go w kapturze do hodowli komórkowych i poddaj działaniu UV przez 15 minut.
    2. Odzyskaj płytki z nasionami i sprawdź, czy dołki są dobrze przymocowane do komórek.
    3. Pozostaw jedną płytkę w inkubatorze (kontrola statyczna) i umieść drugą płytkę silikonową z nasionami w aparacie do rozciągania, wyrównując z otworami w płytce silikonowej. Załóż pokrywę aparatu, aby zapewnić sterylność.
    4. Przymocować aparat z płytką silikonową z nasionami do źródła elektronicznego (patrz Tabela materiałów) i umieścić go w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    5. W programie ustaw protokół cyklicznego rozciągania na 4% odkształcenia sinusoidalnego, 0,5 Hz, 2 godziny dziennie. Rozpocznij rozciąganie, naciskając raz przycisk start. Rozciąganie należy rozpocząć natychmiast.
    6. Rozciągnij komórki przez minimum 3 dni. Codziennie monitoruj komórki i przerwij protokół rozciągania, jeśli można zaobserwować kurczenie się komórek. Zmieniaj nośnik na nowy nośnik rozciągliwy MSC co drugi dzień.

Wyniki

Różnicowanie ludzkich iPSC w iMSC
Zgodnie z wcześniejszym opisem, obecny protokół różnicowania iPSC w iMSC obejmuje tworzenie ciałek zarodkowych2. Proces ten trwa około dziesięciu dni w celu indukcji iMSC z iPSC (Rysunek 1A). Zdecydowanie zaleca się jednak co najmniej dwukrotne pasażowanie nowo uzyskanych iMSC. Pomaga to nie tylko wyeliminować konieczność stosowania płytek powlekanych żelatyną, ale także zapewnia stabilną ekspresję markerów MSC. Ilościowe oznaczenie metodą cytometrii przepływowej, przeprowadzone po sześciu pasażach od różnicowania, wykazuje niemal czystą populację komórek z wysoką ekspresją klasycznych markerów powierzchniowych MSC, w tym CD44 (83,1%), CD90 (88,4%) i CD105 (99,2%)17,18 (Rysunek 1B). Pod względem morfologii iMSC powinny ściśle przypominać MSC z szpiku kostnego, wykazując wydłużony, fibroblastopodobny kształt (Rysunek 1C).

Inżynieria genetyczna iMSC w celu nadekspresji SCX przy użyciu transdukcji lentiwirusowej
Lentiwirusy otrzymano poprzez transfekcję komórek HEK293T/17 wektorem pLenti-C-mGFP, do którego wstawiono SCXB w celu ekspresji SCX-GFP+, wraz z dwoma plazmidami pakującymi. Transfekcje przeprowadzono metodą BioT15,16, stosując stosunek BioT (µl) do DNA (µg) wynoszący 1,5:1.

Komórki HEK293T/17 wysiano z gęstością 5.3 x 104 komórek/cm2 na 18-24 h przed transfekcją. W momencie transfekcji komórki powinny osiągnąć 80%-95% konfluencji, aby uniknąć niskiej wydajności miana (Rysunek 2B1, lewo). W ciągu 24 h od dodania koktajlu plazmidowego zaobserwowano pewną toksyczność, która osiągnęła szczyt po 48 h (Rysunek 2B2). Ponieważ wektor lentiwirusowy SCX jest sprzężony z GFP, ekspresja GFP powinna być widoczna po 48 h (Rysunek 2B3). Obecność wysokiej toksyczności w połączeniu z ekspresją GFP jest wiarygodnym wskaźnikiem udanej transfekcji. Lentiwirusy pobrano po 48 h i 72 h, a wydajność transdukcji oceniono za pomocą cytometrii przepływowej i analizy ekspresji genów. Bezwzględna intensywność sygnału w komórkach GFP-dodatnich służyła jako wskaźnik integracji SCX i była znacznie wyższa przy wyższych mianach (Rysunek 3A). Wydajność transdukcji, mierzona jako procent komórek SCX-GFP+, wykazała efekt zależny od dawki w oparciu o ładunek lentiwirusowy (Rysunek 3B). Cytometria przepływowa iMSCSCX+ na różnych pasażach wykazała również wysoką stabilność, bez zmian w poziomach ekspresji transgenu lub proporcji komórek transdukowanych (Rysunek 3C). Ponadto po 4 tygodniach regularnej hodowli bez sortowania iMSCSCX+ utrzymywały stabilną nadekspresję SCX (Rysunek 3D). Transdukcja na szeroką skalę została przeprowadzona na podstawie miana, przy użyciu 75% lentiwirusa (Rysunek 2C).

Obciążenie mechaniczne iMSCSCX+
Komórki iMSCSCX+ wysiano na odkształcalne płytki silikonowe z gęstością 1,25 x 104 komórek/cm2 (Rycyna 4A,B), aby umożliwić adhezję komórek przed rozpoczęciem protokołu rozciągania. Końcowa gęstość wysiewu została zoptymalizowana w celu zapobiegania nadmiernemu rozrostowi monowarstwy. Warto zauważyć, że zbyt wysoka gęstość wysiewu prowadziła do przedwczesnego skurczu komórek i ich wczesnej śmierci (Rycina 4D). W grupie kontrolnej statycznej komórki wysiano na identyczne płytki, lecz bez poddawania ich rozciąganiu. Komórki iMSCSCX+ poddano rozciąganiu w bioreaktorze 2D przez minimum trzy dni, maksymalnie do siedmiu dni, przy odkształceniu jednowymiarowym 4% i częstotliwości 0,5 Hz przez 2 h dziennie. Ten reżim rozciągania jest zgodny z opisami istotności fizjologicznej9. Po kilku dniach rozciągania można zaobserwować pewien stopień organizacji komórek w porównaniu z grupą statyczną, w której organizacji komórek była przypadkowa (Rycina 4C). Barwienie filamentów aktynowych faloidyną dodatkowo podkreśla, że komórki zdają się rosnąć prostopadle do kierunku rozciągania, w przeciwieństwie do przypadkowej organizacji komórek zaobserwowanej na płytkach statycznych (Rycina 4E). Aby scharakteryzować nowo wygenerowane iTenocyty, komórki pobrano po trzech i siedmiu dniach do analizy ekspresji genów, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami14. Analiza ekspresji genów wykazuje, że komórki iMSCSCX+ są mechanoreaktywne, ponieważ stwierdzono znaczną nadekspresję genów tenogennych (SCX, THBS4, COL1a1, BGN, MKX i TPPP3)5,7,19,20 zarówno w trzecim, jak i siódmym dniu, w porównaniu do samych iMSC w dniu 0 (Rycina 5A). Dodatkowo depozycja kolagenu w medium po 7 dniach rozciągania była znacznie wyższa w grupie rozciąganej iMSCSCX+ w porównaniu ze wszystkimi pozostałymi grupami (Rycina 5B).

Proces różnicowania iPSC, obejmujący analizę CD44/CD105/CD90; bioreaktor 2D i ekspansja komórek.
Rycina 1: Schemat różnicowania iMSC i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej. (A) Ogólny schemat generowania iTenocytów oraz harmonogram indukcji iMSC. Powielono za zgodą Papalamprou A. et al.14. (B) Ilościowa analiza cytometrii przepływowej wykazuje wysoki odsetek komórek wykazujących klasyczne markery powierzchniowe MSC dla MSC pochodzących z iPSC po 6 pasażach po różnicowaniu. Adaptowano za zgodą Sheyn D. et al.2. (C) Obrazy w kontraście fazowym komórek po różnicowaniu wykazują morfologię przypominającą fibroblasty. Pasek skali = 200 µm. Aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Schemat procesu transfekcji lentiwirusowej z różnicowaniem iPSC w iTenocyty; obraz fluorescencji GFP.
Rysunek 2iMSCSCX+ schemat produkcji. (A) Ogólny schemat transfekcji z użyciem 2nd generowanie wektora lentiwirusowego SCX i transdukcja iMSC. Powielone za zgodą Papalamprou A. i wsp.14. (B1) komórki HEK293T/17 przed dodaniem koktajlu plazmidowego. (B2Komórki HEK293T/17 po 48 h wykazują ekspresję GFP oraz objawy toksyczności.B3Ekspresja GFP, którą można zaobserwować w komórkach HEK293T/17, świadczy o pomyślnej transfekcji.C) wygenerowane iMSCSCX+ komórki (z mianem 75%) wykazują ekspresję SCX-GFP+ w jądrach komórkowych. Paski skali = 400 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza skuteczności edycji genów; wykresy słupkowe, skrzypcowe, cytometria przepływowa; miareczkowanie wektora; fluorescencja GFP.
Rysunek 3: Określanie wydajności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji genów. Absolutna intensywność komórek GFP-dodatnich została wykorzystana jako wskaźnik integracji SCX przy użyciu cytometrii przepływowej. Miana wektorów zostały zweryfikowane za pomocą analizy cytometrii przepływowej dla wszystkich komórek w celu oceny MOI lentiwirusa. (A) Absolutna fluorescencja w zależności od miana wirusa. (B) Wydajność transdukcji oceniona jako procent komórek SCX-GFP+. Zaobserwowano efekt zależności dawka-odpowiedź obciążenia lentiwirusowego w wydajności transdukcji, gdy wyniki przepływowe przedstawiono jako procent komórek GFP+. MOI, wielokrotność infekcji (multiplicity of infection), n = 3 niezależne transdukcje. Do porównania mian zastosowano jednoczynnikową analizę ANOVA; dane przedstawiono jako średnia ± SD; *p < 0,05. (C) Cytometria przepływowa iMSCSCX+ po kilku rundach pasażowania wskazuje na brak zmian w poziomie stabilnej ekspresji transgenu oraz brak zmian w proporcji transdukowanych komórek. Należy zauważyć, że iMSC transdukowane mianami 100% przestały się dzielić w P3. (D) iMSC transdukowane wektorem lentiwirusowym SCX-GFP+ (75%, MOI = 2,9 e5 TU/mL) z oceną ekspresji genu SCX po 4 tygodniach regularnej hodowli bez sortowania. Ekspresja SCX była znacząco podwyższona w iMSCSCX+, co wskazuje na stabilną nadekspresję SCX po 4 tygodniach. TU, jednostki transdukcji (transduction units); dane przedstawiono jako średnia ± SD, **p > 0,01. Reprodukowano za zgodą Papalamprou A. et al.14. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

iMSC na iTenocyty poprzez bioreaktor 2D. Mikroskopia pokazuje efekty hodowli statycznej/rozciąganej.
Rycina 4: iMSCSCX+ zasiane w bioreaktorze 2D poddawane cyklicznemu rozciąganiu. (A) Schemat bioreaktora 2D. Reprodukowano za zgodą Papalamprou A. et al.12. (B) Komórki są najpierw zasiewane na elastycznych płytkach silikonowych i inkubowane w 37 °C, aby umożliwić ich przytwierdzenie przed cyklicznym rozciąganiem w bioreaktorze 2D. (C) iMSCSCX+ były rozciągane w bioreaktorze 2D przez maksymalnie 7 dni. W przypadku kontroli statycznej komórki wysiano na identyczne płytki, ale bez rozciągania. (C1) Płytka kontrolna statyczna po 7 dniach wykazuje stochastyczny układ komórek. (C2) Płytka rozciągana po 7 dniach wykazuje względnie większą organizację komórkową. (D) Trzy przykłady zjawisk, których nie powinno się obserwować. Gdy gęstość zasiewu komórek jest zbyt wysoka lub komórki były rozciągane przez zbyt wiele dni, zaczynają się one odrywać. (D1) Komórki są tylko lekko przerośnięte. Żółte strzałki wskazują początek przedwczesnego skurczu komórek. (D2) Umiarkowany stopień przerostu. Komórki zaczynają odrywać się od płytki. (D3) Silny stopień przerostu. Komórki nie rosną już w monowarstwie i utworzyły struktury 3D. Czarne paski skali = 400 µm. Białe paski skali = 1000 µm. (E) Po 7 dniach rozciągania (lub hodowli w przypadku płytki statycznej) komórki utrwalono przy użyciu faloidyny dla filamentów aktynowych (czerwony) i barwiono kontrastowo DAPI dla jąder (niebieski). Białe paski skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza słupkowa ekspresji genów w komórkach iMSC; SCX, THBS4, BGN, poziomy białek, wykres eksperymentalny.
Rysunek 5: Stymulacja ekspresji genów markerów tenogennych poprzez nadekspresję Scx i jednowymiarowe rozciąganie w bioreaktorze 2D. (A) Komórki iMSCSCX+ poddano rozciąganiu w bioreaktorze 2D przez 7 dni. W grupach kontrolnych (statycznych) komórki wysiano na identyczne płytki, ale bez rozciągania. Analizy ekspresji genów wykazują, że iMSCSCX+ są mechanoodpowiedzialne. ND = brak detekcji. Do porównania ekspresji genów w każdym punkcie czasowym vs. d0 zastosowano jednoczynnikową analizę wariancji ANOVA. N = 8/grupa. (B) Depozycja kolagenu po 7 dniach rozciągania w bioreaktorze 2D. Dane przedstawiono jako średnia ± SD; n = 8/grupa; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Reprodukowano za zgodą Papalamprou A. et al.12. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole iTenocyty są generowane w trzech głównych etapach: (1) indukcja iPSC do iMSC, (2) nadekspresja SCX za pomocą wektora lentiwirusowego oraz (3) dojrzewanie komórek poprzez jednoosiowe napięcie 2D.

Przedstawiony protokół różnicowania iPSC na iMSC został wcześniej opisany przez naszą grupę2. Od czasu tej publikacji opracowano wiele protokołów, w tym ustalony protokół stosowania iMSC w badaniach klinicznych 21,22,23, a także dostępne na rynku zestawy różnicujące. Wcześniej badano również przegląd potencjału trójliniowego iMSC2. Chociaż metodologie różnią się, wszystkie protokoły podkreślają potrzebę ekspansji iMSC po różnicowaniu przez kilka pasaży, aby zapewnić stabilną ekspresję markerów powierzchniowych MSC. Na tym etapie zastosowanie proporcji 1:3 przy około 70% konfluencji spowoduje powstanie stosunkowo zlewającej się płytki w ciągu 4-6 dni po pasażowaniu.

Przy wyborze optymalnego miana do transdukcji ważne jest, aby zachować równowagę między żywotnością komórek a wydajnością. Podczas gdy iMSC transdukowane 100% mianem mogą wykazywać najwyższy poziom komórek SCX-GFP dodatnich, warto zauważyć, że komórki te przestały dzielić trzy przejścia po transdukcji (Figura 3C), prawdopodobnie z powodu toksyczności wywołanej DNA. Dlatego zaleca się stosowanie miana mniejszego niż 100%. Przed wysiewem płytek silikonowych zaleca się ponowną ocenę poziomów SCX-GFP za pomocą cytometrii przepływowej. Jeśli dane wskazują, że wydajność jest poniżej pożądanego progu, zaleca się sortowanie komórekiMSC SCX+ przed wysiewem, szczególnie w przypadku zastosowań in vivo .

Po wysianiu komórekiMSC SCX+ na płytkach silikonowych, należy je inkubować w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić przyczepienie komórek przed rozciąganiem. Opisana gęstość komórek 1,25 x 104 komórek/cm2 w płytkach silikonowych została zoptymalizowana, aby zapobiec przerostowi monowarstwy, co może przyczyniać się do naprężeń statycznych24. Ponadto badania sugerują, że bezpośredni kontakt między komórkami w zlewających się kulturach w podłożach o różnej sztywności może zmieniać zachowanie komórek 24,25,26. Podczas eksperymentów pilotażowych zaobserwowano pewne widoczne oderwanie komórek od płytek silikonowych, szczególnie w późniejszych punktach czasowych (ryc. 4D). Można to przypisać tworzeniu się arkuszy komórek ECM z powodu nadmiernej konfluencji24. Dlatego krytyczne parametry obejmują gęstość komórek i liczbę napadów rozciągania. W obecnych metodach komórki pobrano w 3. i 7. dniu w celu oceny potencjału tenogennego za pomocą analizy ekspresji genów. Zaleca się jednak, aby komórki były rozciągane w bioreaktorze 2D przez co najmniej trzy dni, a następnie monitorowane są rozciągnięte i statyczne płytki, aby zapobiec przerostowi i oderwaniu komórek.

Po kilku napadach rozciągania można zaobserwować pewien stopień wyrównania i organizacji komórek (ryc. 4C1,E). Jest to zgodne z wieloma badaniami, w których obserwuje się wyrównanie komórek prostopadłe do osi szczepu w odpowiedzi na jednoosiowy szczep in vitro24,27. Dla porównania, płytka statyczna przedstawia stochastyczną organizację komórek (rysunek 4C2,E).

Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, tylko kilka badań dotyczyło synergicznego wpływu nadekspresji SCX i mechanicznej stymulacji na różnicowanie MSCs w tenocyty lub więzadła 24,28,29. Gaspar i in. zastosowali podobny system bioreaktorów 2D, jak ten opisany tutaj, ale zastosowali wyższe poziomy całkowitego odkształcenia (10% przy 1 Hz przez 12 godzin / dzień). Co ciekawe, nie byli w stanie wykryć zmian w ekspresji SCX, TNMD i COL1a1 w BM-MSC i ludzkich tenocytach. Można to jednak przypisać szczepom częściej stosowanym w ich badaniu24. Chen i wsp. wykorzystali wektor lentiwirusowy do nadekspresji SCX w hESC-MSC złożonych w wielowarstwowe arkusze. Zastosowali jednoosiowe obciążenie cykliczne (10% odkształcenia przy 1 Hz przez 2 godziny/dzień przez okres do 21 dni) i zaobserwowali regulację w górę COL1a1, COL1a2, COL14 i TNMD, a także zwiększoną depozycję ECM29. Nichols i in. przejściowo transfekowali komórki C3H10T1/2 mysim cDNA Scx o pełnej długości i hodowali komórki w hydrożelach kolagenowych 3D pod jednoosiowym cyklicznym szczepem (1%, 1 Hz, 30 min / dzień przez okres do 14 dni). Podobnie jak nasze ustalenia, ich grupa zaobserwowała podwyższoną ekspresję SCX i COL1A1 w napiętych i nadmiernie eksprymowanych konstruktach, ale nie znalazła żadnej zmiany w ekspresji TNMD w odpowiedzi na cykliczne rozciąganie28.

Dodatkowo intrygujące może być rozważenie nadekspresji innych markerów związanych ze ścięgnami, takich jak MKX. Tsutsumi i in. zbadali łączny efekt nadekspresji MKX w komórkach C3H10T1/2 i poddania ich cyklicznemu mechanicznemu rozciąganiu w systemie 3D. Wykazali znaczną regulację w górę SCX, COL1a1, DCN i COL3a1, wraz z wyrównaniem wiązek włókien kolagenowych i filamentów aktynowych30.

Ważne jest, aby przyznać, że ta metoda generowania iTenocytów ma swoje ograniczenia. Chociaż dostępny na rynku bioreaktor 2D jest korzystny dla prac sprawdzających słuszność koncepcji, jego rozmiar ogranicza wydajność. Jeśli komórki te są potrzebne do testów wysokoprzepustowych lub jako potencjalne źródło komórek w terapiach naprawy ścięgien, należy rozważyć zbadanie systemów zdolnych do realizacji jednoosiowego rozciągania na większą skalę. Co więcej, dalsze badania powinny obejmować ekspansję iTenocytów w celu potwierdzenia stabilnej ekspresji tenogennej, a ocena ich udziału w regeneracji in vivo ma kluczowe znaczenie dla oceny ich potencjału tenogennego.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy nie mają konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Podziękowania

To badanie było częściowo wspierane przez NIH/NIAMS K01AR071512 i CIRM DISC0-14350 dla Dmitriya Sheyna. Dwa plazmidy pakujące lentiwirusa były prezentem od laboratorium Simona Knotta (Wydział Nauk Biomedycznych, Centrum Medyczne Cedars-Sinai).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920odczynnik do dysocjacji komórek
antybiotykowo-przeciwgrzybiczyThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC mysz anty-ludzka CD44BD Biosciences559942
APC mysz IgG2 K kontrola izotypuBD Nauki biologiczne555745
BenchMark płodowa surowica bydlęcaGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA3733
Kolagen typu I alfa 1 łańcuch ludzki Podkład TaqmanThermofisherHs00164004_m1
Kolagen typu III alfa 1 łańcuch ludzki Taqman podkładThermofisherHs00943809_m1
DimetylosulfotlenekMillipore SigmaD8418
DMEM, niska glukoza, pirogronian, bez glutaminy, bez czerwieni fenolowejThermofisher11054020
Minimalna niezbędna pożywka Eagle's (EMEM)ATCC30-2003
Fibronektyna osocze bydlęceSigma AldrichF1141
Mysz FITC anty-ludzka CD90BD Biosciences555595
Żelatyna ze skóry wieprzowejSigma AldrichG1890
Koza anty mysie IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, bez czerwieni fenolowejThermofisher21056023
iPSC: 83i-cntr-33n1Cedry-Synaj iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Przeciwciało, mysz IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
Zamiennik surowicyKnockOut Thermofisher10828010
Kwas L-askorbinowySigma AldrichA4544
L-GlutaminaThermofisher2503081
MatrigelCorning354230matryca błony podstawnej
MechanoCulture FXCellScaleN/Aaparat do rozciągania
MEM Roztwór aminokwasów endogennych Thermofisher11140050
Mohawk ludzki podkład TaqmanThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Receptor płytkowego czynnika wzrostu Ludzki starter TaqmanThermofisherHs00998018_m1
Poli(2-hydroksyetylometakrylan)Sigma Aldrich192066
Odczynniki do infekcji/transfekcji PolybreneMillipore SigmaTR-1003
Rekombinowany człowiek  Białko TGF-beta 1 ludzki Starter TaqmanRnD Systems240-B
Twardówka ludzka Starter TaqmanThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) człowiek oznakowany klon ORFOriGeneRC224305L4
Płytki silikonoweCellScaleN/A
Azydek soduMillipore SigmaS2002
Tenascin C ludzki Podkład TaqmanThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin ludzki Podkład TaqmanThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 ludzki Podkład TaqmanThermofisherHs00170261_m1
Odczynnik do transfekcji, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsyna-EDTA (0,25%)Thermofisher25200072
Polimeryzacja tubuliny promująca białko członek rodziny 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 dichlorowodorekBiogems1293823
Roztwór

Bibliografia

  1. Lim, W. L., Liau, L. L., Ng, M. H., Chowdhury, S. R., Law, J. X. Current progress in tendon and ligament tissue engineering. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (6), 549-571 (2019).
  2. Sheyn, D., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiate into functional mesenchymal stem cells and repair bone defects. Stem Cells Translational Medicine. 5 (11), 1447-1460 (2016).
  3. Czaplewski, S. K., Tsai, T. L., Duenwald-Kuehl, S. E., Vanderby, R., Li, W. J. Tenogenic differentiation of human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells dictated by properties of braided submicron fibrous scaffolds. Biomaterials. 35 (25), 6907-6917 (2014).
  4. Jo, C. H., Lim, H. J., Yoon, K. S. Characterization of tendon-specific markers in various human tissues, tenocytes and mesenchymal stem cells. Tissue Engineering and Regenerative. 16 (2), 151-159 (2019).
  5. Shukunami, C., et al. Scleraxis is a transcriptional activator that regulates the expression of Tenomodulin, a marker of mature tenocytes and ligamentocytes. Scientific Reports. 8 (1), 3155(2018).
  6. Huang, A. H., Lu, H. H., Schweitzer, R. Molecular regulation of tendon cell fate during development. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 800-812 (2015).
  7. Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3(+)Pdgfra(+) tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
  8. Yang, G., Rothrauff, B. B., Tuan, R. S. Tendon and ligament regeneration and repair: clinical relevance and developmental paradigm. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 99 (3), 203-222 (2013).
  9. Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
  10. Wu, S. Y., Kim, W., Kremen, T. J. Jr In vitro cellular strain models of tendon biology and tenogenic differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 826748(2022).
  11. Screen, H. R., Lee, D. A., Bader, D. L., Shelton, J. C. An investigation into the effects of the hierarchical structure of tendon fascicles on micromechanical properties. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 218 (2), 109-119 (2004).
  12. Tatullo, M., et al. Mechanical influence of tissue culture plates and extracellular matrix on mesenchymal stem cell behavior: A topical review. International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 29 (1), 3-8 (2016).
  13. Ding, S., Kingshott, P., Thissen, H., Pera, M., Wang, P. Y. Modulation of human mesenchymal and pluripotent stem cell behavior using biophysical and biochemical cues: A review. Biotechnology and Bioengineering. 114 (2), 260-280 (2017).
  14. Papalamprou, A., et al. Directing iPSC differentiation into iTenocytes using combined scleraxis overexpression and cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 41 (6), 1148-1161 (2023).
  15. Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
  16. Stewart, S. A., et al. Lentivirus-delivered stable gene silencing by RNAi in primary cells. RNA. 9 (4), 493-501 (2003).
  17. Mendicino, M., Bailey, A. M., Wonnacott, K., Puri, R. K., Bauer, S. R. MSC-based product characterization for clinical trials: an FDA perspective. Cell Stem Cell. 14 (2), 141-145 (2014).
  18. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  19. Dunkman, A. A., et al. The tendon injury response is influenced by decorin and biglycan. Annals of Biomedical Engineering. 42 (3), 619-630 (2014).
  20. Liu, H., et al. Crucial transcription factors in tendon development and differentiation: their potential for tendon regeneration. Cell and Tissue Research. 356 (2), 287-298 (2014).
  21. Bloor, A. J. C., et al. Production, safety and efficacy of iPSC-derived mesenchymal stromal cells in acute steroid-resistant graft versus host disease: a phase I, multicenter, open-label, dose-escalation study. Nature Medicine. 26 (11), 1720-1725 (2020).
  22. McGrath, M., Tam, E., Sladkova, M., AlManaie, A., Zimmer, M., de Peppo, G. M. GMP-compatible and xeno-free cultivation of mesenchymal progenitors derived from human-induced pluripotent stem cells. Stem Cell Research and Therapy. 10 (1), 11(2019).
  23. Lian, Q., Zhang, Y., Liang, X., Gao, F., Tse, H. F. Directed differentiation of human-induced pluripotent stem cells to mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. 1416, 289-298 (2016).
  24. Gaspar, D., Ryan, C. N. M., Zeugolis, D. I. Multifactorial bottom-up bioengineering approaches for the development of living tissue substitutes. FASEB Journal. 33 (4), 5741-5754 (2019).
  25. Mao, A. S., Shin, J. W., Mooney, D. J. Effects of substrate stiffness and cell-cell contact on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials. 98, 184-191 (2016).
  26. Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PLoS One. 5 (9), e12905(2010).
  27. Chagnon-Lessard, S., Jean-Ruel, H., Godin, M., Pelling, A. E. Cellular orientation is guided by strain gradients. Integrative Biology (United Kingdom). 9 (7), 607-618 (2017).
  28. Nichols, A. E. C., Werre, S. R., Dahlgren, L. A. Transient scleraxis overexpression combined with cyclic strain enhances ligament cell differentiation. Tissue Engineering Part A. 24 (19-20), 1444-1455 (2018).
  29. Chen, X., et al. Force and scleraxis synergistically promote the commitment of human ES cells derived MSCs to tenocytes. Scientific Reports. 2, 977(2012).
  30. Kataoka, K., et al. In vitro neo-genesis of tendon/ligament-like tissue by combination of mohawk and a three-dimensional cyclic mechanical stretch culture system. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 307(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Indukowane pluripotencjalne kom rki macierzystegenerowanie iTenocyt wmezenchymalne kom rki macierzysteregeneracja ci gienterapia kom rkowarozci ganie w bioreaktorzedepozycja kolagenuanaliza ekspresji gen w
Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.