Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

Summary

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Abstract

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z płynów biologicznych zyskały ostatnio znaczną uwagę w dziedzinie płynnej biopsji. Uwalniane przez prawie każdy typ komórek, zapewniają migawkę komórek gospodarza w czasie rzeczywistym i zawierają bogactwo informacji molekularnych, w tym białek, w szczególności tych z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM), takimi jak fosforylacja, jako główny gracz funkcji komórkowych oraz początku i progresji choroby. Jednak izolacja pojazdów elektrycznych z biopłynów pozostaje wyzwaniem ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia wynikające z obecnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, co utrudnia dalszą analizę ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak fosfoproteiny pojazdów elektrycznych. W tym miejscu opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji EV opartą na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych do izolacji EV z płynów biologicznych, takich jak ludzki mocz oraz dalsza analiza proteomiczna i fosfoproteomiczna po izolacji EV. Protokół umożliwił wysoką wydajność odzyskiwania EV w moczu oraz czułe profile proteomu EV i fosfoproteomu. Ponadto poruszono tu również kwestię wszechstronności tego protokołu i odpowiednich względów technicznych.

Introduction

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to otoczone błoną nanocząsteczki wydzielane przez wszystkie typy komórek i obecne w płynach biologicznych, takich jak krew, mocz, ślina itp.^1,2,3,4. EV przenoszą ładunek różnorodnych bioaktywnych cząsteczek, które odzwierciedlają fizjologiczny i patologiczny stan komórek gospodarza, a zatem działają jako kluczowe czynniki w postępie choroby^4,5,6. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że markery choroby opa....

Protocol

Wszystkie próbki moczu zostały pobrane od zdrowych osób po świadomej zgodzie. Eksperymenty były zgodne ze wszystkimi standardami etycznymi dotyczącymi próbek ludzkich i są zgodne z wytycznymi Programu Ochrony Badań Naukowych na Ludziach Uniwersytetu Purdue.

1. Pobieranie próbek

1. Odwirować 12 ml próbki moczu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przez 10 minut przy 2 500 x g, 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i dużych ciał apoptotycznych.
2. Przenieść 10 ml supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml i przystąpić do izolacji EV.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać dzi....

Results

Ten protokół demonstruje kompleksowy przebieg procesu od izolacji EV do dalszych analiz proteomicznych i fosfoproteomicznych (Rysunek 1). Potrójne próbki moczu poddano izolacji EV. Wyizolowane EV charakteryzowano za pomocą western blot, a następnie przetworzono w celu przygotowania próbek proteomicznych opartych na spektrometrii mas, w tym ekstrakcji białek, trawienia enzymatycznego i oczyszczania peptydów. Na potrzeby analizy fosfoproteomicznej fosfopeptydy zostały dodatkowo wzbogacone w op.......

Discussion

Skuteczna izolacja EV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do wykrywania białek i fosfoprotein o niskiej obfitości w EV. Pomimo opracowania wielu metod mających na celu zaspokojenie tej potrzeby, większość z nich nadal cierpi z powodu ograniczeń, takich jak słaba regeneracja lub niska odtwarzalność, które utrudniają ich wykorzystanie w badaniach na dużą skalę i rutynowych warunkach klinicznych. DUC jest ogólnie uważana za najpowszechniejszą metodę izolacji EV, a dodatkowe etapy mycia są zwykle stosowane w celu zwiększenia .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml Produkty	z zakresu nauk przyrodniczych	M-1700C-LB
1,5 mL probówka magnetyczna stojak na separator	Sergi Lab Supplies	1005
15 ml stożkowa probówka wirówkowa	Corning
Stojak na separator magnetyczny w probówce 15 ml	Sergi Lab Supplies	1002
Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórek przeciwciał sprzężona z HRP		7074P2
Wytrząsarka inkubowana na stole	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Blok mieszania termokomórek MB-101
CD9 (D3H4P) Technologia	sygnalizacji komórkowej	13403S
Chloroacetamid	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Służy do alkilowania zredukowanych grup siarczkowych. Świeżo przygotować 400 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
Octan etylu	Fisher Naukowy	E145-4	Wytrąca detergenty
Evosep One	chromatografii cieczowej	Evosep
Evotips	Evosep	EV2013	Ładowanie próbki do systemu Evosep One
EVtrap	Tymora Analityczne		Funkcjonalizowane kulki magnetyczne, bufor załadowczy i bufor myjący
Membrana Immobilon-FL PVDF	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrana
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 12-dołkowy
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1,9	Bruker	1893473	Kolumna separacyjna
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, inhibitor fosfotazy.
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Inhibitor fosfotazy.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP
Zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC	Tymora Analytical		Wychwytywanie powinowactwa do jonów metali na bazie polimerów (PolyMAC) do wzbogacania fosfopeptydów
Deoksycholan sodu	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
Sarkosynian lauroilu sodu	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
timsTOF HT	Bruker		Spektrometria mas czasu przelotu uwięzionej ruchliwości jonów
TopTip C-18 (10-200 μ L) napiwki	Glygen	TT2C18.96	Metoda odsalania
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	Do elucji EV.
Bufor bikabonianu trietyloamonu	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Kwas trifluorooctowy	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfiny	Sigma -Aldrich	C4706	Służy do reducynacji wiązań dwusiarczkowych. Przygotować 200 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. Podwielokrotnić roztwór podstawowy na małą objętość i przechowywać go w temperaturze 20& stopni; C (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).
Trypsyna/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007