Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.
Artykuł metodologiczny
Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z płynów biologicznych zyskały ostatnio znaczną uwagę w dziedzinie płynnej biopsji. Uwalniane przez prawie każdy typ komórek, zapewniają migawkę komórek gospodarza w czasie rzeczywistym i zawierają bogactwo informacji molekularnych, w tym białek, w szczególności tych z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM), takimi jak fosforylacja, jako główny gracz funkcji komórkowych oraz początku i progresji choroby. Jednak izolacja pojazdów elektrycznych z biopłynów pozostaje wyzwaniem ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia wynikające z obecnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, co utrudnia dalszą analizę ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak fosfoproteiny pojazdów elektrycznych. W tym miejscu opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji EV opartą na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych do izolacji EV z płynów biologicznych, takich jak ludzki mocz oraz dalsza analiza proteomiczna i fosfoproteomiczna po izolacji EV. Protokół umożliwił wysoką wydajność odzyskiwania EV w moczu oraz czułe profile proteomu EV i fosfoproteomu. Ponadto poruszono tu również kwestię wszechstronności tego protokołu i odpowiednich względów technicznych.
Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to otoczone błoną nanocząsteczki wydzielane przez wszystkie typy komórek i obecne w płynach biologicznych, takich jak krew, mocz, ślina itp.1,2,3,4. EV przenoszą ładunek różnorodnych bioaktywnych cząsteczek, które odzwierciedlają fizjologiczny i patologiczny stan komórek gospodarza, a zatem działają jako kluczowe czynniki w postępie choroby4,5,6. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że markery choroby oparte na EV można zidentyfikować przed wystąpieniem objawów lub fizjologicznym wykryciem nowotworów5,6,7.
Fosforylacja działa jako kluczowy mechanizm w sygnalizacji i regulacji komórkowej. Dlatego fosfoproteiny stanowią cenne źródło do odkrywania biomarkerów, ponieważ nieprawidłowe zdarzenia fosforylacji są związane z rozregulowanymi szlakami sygnalizacji komórkowej i rozwojem chorób przerzutowych, takich jak rak8,9,10. Chociaż profilowanie dynamiki fosforylacji pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby sygnatur fosfoprotein jako potencjalnych biomarkerów, niska liczebność i dynamiczna natura fosfoprotein stanowią poważne wyzwanie w rozwoju fosfoprotein jako biomarkerów11,12. Warto zauważyć, że nisko występujące fosfoproteiny zamknięte w EV są chronione przed zewnętrznym trawieniem enzymatycznym w środowisku zewnątrzkomórkowym8. W związku z tym EV i fosfoproteiny pochodzące z EV stanowią idealne źródło do odkrywania biomarkerów we wczesnym stadium wykrywania raka i innych chorób.
Chociaż analiza fosforylacji białek w EVs stanowi cenne źródło do zrozumienia sygnalizacji raka i wczesnego stadium diagnozowania choroby, brak skutecznych metod izolacji EV stanowi główną barierę. Izolację EV zwykle osiąga się za pomocą różnicowego ultrawirowania (DUC)13. Jednak ta metoda jest czasochłonna i nie nadaje się do implikacji klinicznych ze względu na niską przepustowość i słabą odtwarzalność13,14. Alternatywne podejścia do izolacji EV, takie jak wytrącanie indukowane polimerami15, są ograniczone niską specyficznością ze względu na współwytrącanie białek innych niż EV. Podejścia oparte na powinowactwie, w tym wychwytywanie powinowactwa oparte na przeciwciałach16 i filtracja powinowactwa17, oferują zwiększoną specyficzność, ale są ograniczone do stosunkowo niskiego współczynnika odzysku ze względu na małą objętość.
Aby rozwiązać problemy związane z badaniem dynamiki fosfoprotein w EVs, nasza grupa opracowała technikę całkowitego odzyskiwania i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVtrap) opartą na chemicznym powinowactwie do wychwytywania EV na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych18. Poprzednie wyniki wykazały, że ta metoda izolacji EV oparta na kulkach magnetycznych jest wysoce skuteczna w izolowaniu EV z szerokiej gamy próbek płynów biologicznych i jest w stanie osiągnąć znacznie wyższą wydajność EV przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia w porównaniu z DUC i innymi istniejącymi metodami izolacji18,19. Z powodzeniem wykorzystaliśmy EVtrap i metodę wzbogacania fosforeptydem na bazie tytanu opracowaną przez naszą grupę20 do profilowania fosfoproteomu EV pochodzących z różnych płynów biologicznych i wykrywania potencjalnych biomarkerów fosfoprotein dla różnych chorób19,21,22.
Tutaj prezentujemy protokół oparty na EVtrap do izolacji krążących EV. Protokół koncentruje się na EV w moczu. Pokazujemy również charakterystykę izolowanych pojazdów elektrycznych za pomocą western blotting. Następnie szczegółowo opisujemy przygotowanie próbki i akwizycję spektrometrii mas (MS) zarówno do analiz proteomicznych, jak i fosfoproteomicznych. Protokół ten zapewnia wydajny i powtarzalny przebieg pracy do profilowania proteomu EV i fosfoproteomu w moczu, co ułatwi dalsze badania nad EV i ich zastosowaniami klinicznymi23.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie próbki moczu zostały pobrane od zdrowych osób po świadomej zgodzie. Eksperymenty były zgodne ze wszystkimi standardami etycznymi dotyczącymi próbek ludzkich i są zgodne z wytycznymi Programu Ochrony Badań Naukowych na Ludziach Uniwersytetu Purdue.
1. Pobieranie próbek
2. Izolacja EV przy użyciu podejścia EVtrap
3. Charakterystyka EV za pomocą western blotting
4. Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej
5. Analiza LC-MS/MS
UWAGA: Można używać różnych systemów/ustawień LC-MS/MS i metod pozyskiwania danych, takich jak akwizycja zależna od danych (DDA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten protokół demonstruje kompleksowy przebieg procesu od izolacji EV do dalszych analiz proteomicznych i fosfoproteomicznych (Rysunek 1). Potrójne próbki moczu poddano izolacji EV. Wyizolowane EV charakteryzowano za pomocą western blot, a następnie przetworzono w celu przygotowania próbek proteomicznych opartych na spektrometrii mas, w tym ekstrakcji białek, trawienia enzymatycznego i oczyszczania peptydów. Na potrzeby analizy fosfoproteomicznej fosfopeptydy zostały dodatkowo wzbogacone w op...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Skuteczna izolacja EV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do wykrywania białek i fosfoprotein o niskiej obfitości w EV. Pomimo opracowania wielu metod mających na celu zaspokojenie tej potrzeby, większość z nich nadal cierpi z powodu ograniczeń, takich jak słaba regeneracja lub niska odtwarzalność, które utrudniają ich wykorzystanie w badaniach na dużą skalę i rutynowych warunkach klinicznych. DUC jest ogólnie uważana za najpowszechniejszą metodę izolacji EV, a dodatkowe etapy mycia są zwykle stosowane w celu zwiększenia ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy deklarują konkurencyjny interes finansowy. Anton Iliuk i W. Andy Tao są współzałożycielami firmy Tymora Analytical Operations, która opracowała kulki EVtrap i skomercjalizowała zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC.
Ta praca została częściowo sfinansowana przez granty NIH 3RF1AG064250 i R44CA239845.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka do mikrowirówek 1,5 ml Produkty | z zakresu nauk przyrodniczych | M-1700C-LB | |
| 1,5 mL probówka magnetyczna stojak na separator | Sergi Lab Supplies | 1005 | |
| 15 ml stożkowa probówka wirówkowa | Corning | ||
| Stojak na separator magnetyczny w probówce 15 ml | Sergi Lab Supplies | 1002 | |
| Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórek przeciwciał sprzężona z HRP | 7074P2 | ||
| Wytrząsarka inkubowana na stole | Bioer | DIS-87999-3367802 | Bioer Blok mieszania termokomórek MB-101 |
| CD9 (D3H4P) Technologia | sygnalizacji komórkowej | 13403S | |
| Chloroacetamid | Sigma -Aldrich | C0267-100G | Służy do alkilowania zredukowanych grup siarczkowych. Świeżo przygotować 400 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. |
| Octan etylu | Fisher Naukowy | E145-4 | Wytrąca detergenty |
| Evosep One | chromatografii cieczowej | Evosep | |
| Evotips | Evosep | EV2013 | Ładowanie próbki do systemu Evosep One |
| EVtrap | Tymora Analityczne | Funkcjonalizowane kulki magnetyczne, bufor załadowczy i bufor myjący | |
| Membrana Immobilon-FL PVDF | Sigma -Aldrich | IPFL00010 | Blotting membrana |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel | Invitrogen | NP0322BOX | Invitrogen NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 12-dołkowy |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | Invitrogen | NP0007 | |
| PBS | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pepsep C18 15 x 75 x 1,9 | Bruker | 1893473 | Kolumna separacyjna |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 2 | Sigma -Aldrich | P5726-5ML | 100X, inhibitor fosfotazy. |
| Koktajl inhibitorów fosfatazy 3 | Sigma -Aldrich | P0044-1ML | 100X, Inhibitor fosfotazy. |
| Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA | ThermoFisher | 23225 | |
| Pierce ECL Western Blotting Substrate | ThermoFisher | 32106 | HRP |
| Zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC | Tymora Analytical | Wychwytywanie powinowactwa do jonów metali na bazie polimerów (PolyMAC) do wzbogacania fosfopeptydów | |
| Deoksycholan sodu | Sigma -Aldrich | D6750-10G | Detergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. |
| Sarkosynian lauroilu sodu | Sigma -Aldrich | L9150-50G | Detergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. |
| timsTOF HT | Bruker | Spektrometria mas czasu przelotu uwięzionej ruchliwości jonów | |
| TopTip C-18 (10-200 μ L) napiwki | Glygen | TT2C18.96 | Metoda odsalania |
| Triethylamine | Sigma -Aldrich | 471283-100ML | Do elucji EV. |
| Bufor bikabonianu trietyloamonu | Sigma -Aldrich | T7408-100ML | 1 M |
| Kwas trifluorooctowy | Sigma -Aldrich | 302031-100ML | |
| Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfiny | Sigma -Aldrich | C4706 | Służy do reducynacji wiązań dwusiarczkowych. Przygotować 200 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. Podwielokrotnić roztwór podstawowy na małą objętość i przechowywać go w temperaturze 20& stopni; C (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania). |
| Trypsyna/Lys-C MIX | ThermoFisher | PIA41007 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie