Artykuł metodologiczny

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

DOI:

10.3791/65844

⸱

27 października 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z płynów biologicznych zyskały ostatnio znaczną uwagę w dziedzinie płynnej biopsji. Uwalniane przez prawie każdy typ komórek, zapewniają migawkę komórek gospodarza w czasie rzeczywistym i zawierają bogactwo informacji molekularnych, w tym białek, w szczególności tych z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM), takimi jak fosforylacja, jako główny gracz funkcji komórkowych oraz początku i progresji choroby. Jednak izolacja pojazdów elektrycznych z biopłynów pozostaje wyzwaniem ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia wynikające z obecnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, co utrudnia dalszą analizę ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak fosfoproteiny pojazdów elektrycznych. W tym miejscu opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji EV opartą na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych do izolacji EV z płynów biologicznych, takich jak ludzki mocz oraz dalsza analiza proteomiczna i fosfoproteomiczna po izolacji EV. Protokół umożliwił wysoką wydajność odzyskiwania EV w moczu oraz czułe profile proteomu EV i fosfoproteomu. Ponadto poruszono tu również kwestię wszechstronności tego protokołu i odpowiednich względów technicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to otoczone błoną nanocząsteczki wydzielane przez wszystkie typy komórek i obecne w płynach biologicznych, takich jak krew, mocz, ślina itp.1,2,3,4. EV przenoszą ładunek różnorodnych bioaktywnych cząsteczek, które odzwierciedlają fizjologiczny i patologiczny stan komórek gospodarza, a zatem działają jako kluczowe czynniki w postępie choroby4,5,6. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że markery choroby oparte na EV można zidentyfikować przed wystąpieniem objawów lub fizjologicznym wykryciem nowotworów5,6,7.

Fosforylacja działa jako kluczowy mechanizm w sygnalizacji i regulacji komórkowej. Dlatego fosfoproteiny stanowią cenne źródło do odkrywania biomarkerów, ponieważ nieprawidłowe zdarzenia fosforylacji są związane z rozregulowanymi szlakami sygnalizacji komórkowej i rozwojem chorób przerzutowych, takich jak rak8,9,10. Chociaż profilowanie dynamiki fosforylacji pozwala na identyfikację specyficznych dla choroby sygnatur fosfoprotein jako potencjalnych biomarkerów, niska liczebność i dynamiczna natura fosfoprotein stanowią poważne wyzwanie w rozwoju fosfoprotein jako biomarkerów11,12. Warto zauważyć, że nisko występujące fosfoproteiny zamknięte w EV są chronione przed zewnętrznym trawieniem enzymatycznym w środowisku zewnątrzkomórkowym8. W związku z tym EV i fosfoproteiny pochodzące z EV stanowią idealne źródło do odkrywania biomarkerów we wczesnym stadium wykrywania raka i innych chorób.

Chociaż analiza fosforylacji białek w EVs stanowi cenne źródło do zrozumienia sygnalizacji raka i wczesnego stadium diagnozowania choroby, brak skutecznych metod izolacji EV stanowi główną barierę. Izolację EV zwykle osiąga się za pomocą różnicowego ultrawirowania (DUC)13. Jednak ta metoda jest czasochłonna i nie nadaje się do implikacji klinicznych ze względu na niską przepustowość i słabą odtwarzalność13,14. Alternatywne podejścia do izolacji EV, takie jak wytrącanie indukowane polimerami15, są ograniczone niską specyficznością ze względu na współwytrącanie białek innych niż EV. Podejścia oparte na powinowactwie, w tym wychwytywanie powinowactwa oparte na przeciwciałach16 i filtracja powinowactwa17, oferują zwiększoną specyficzność, ale są ograniczone do stosunkowo niskiego współczynnika odzysku ze względu na małą objętość.

Aby rozwiązać problemy związane z badaniem dynamiki fosfoprotein w EVs, nasza grupa opracowała technikę całkowitego odzyskiwania i oczyszczania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EVtrap) opartą na chemicznym powinowactwie do wychwytywania EV na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych18. Poprzednie wyniki wykazały, że ta metoda izolacji EV oparta na kulkach magnetycznych jest wysoce skuteczna w izolowaniu EV z szerokiej gamy próbek płynów biologicznych i jest w stanie osiągnąć znacznie wyższą wydajność EV przy jednoczesnej minimalizacji zanieczyszczenia w porównaniu z DUC i innymi istniejącymi metodami izolacji18,19. Z powodzeniem wykorzystaliśmy EVtrap i metodę wzbogacania fosforeptydem na bazie tytanu opracowaną przez naszą grupę20 do profilowania fosfoproteomu EV pochodzących z różnych płynów biologicznych i wykrywania potencjalnych biomarkerów fosfoprotein dla różnych chorób19,21,22.

Tutaj prezentujemy protokół oparty na EVtrap do izolacji krążących EV. Protokół koncentruje się na EV w moczu. Pokazujemy również charakterystykę izolowanych pojazdów elektrycznych za pomocą western blotting. Następnie szczegółowo opisujemy przygotowanie próbki i akwizycję spektrometrii mas (MS) zarówno do analiz proteomicznych, jak i fosfoproteomicznych. Protokół ten zapewnia wydajny i powtarzalny przebieg pracy do profilowania proteomu EV i fosfoproteomu w moczu, co ułatwi dalsze badania nad EV i ich zastosowaniami klinicznymi23.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki moczu zostały pobrane od zdrowych osób po świadomej zgodzie. Eksperymenty były zgodne ze wszystkimi standardami etycznymi dotyczącymi próbek ludzkich i są zgodne z wytycznymi Programu Ochrony Badań Naukowych na Ludziach Uniwersytetu Purdue.

1. Pobieranie próbek

  1. Odwirować 12 ml próbki moczu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przez 10 minut przy 2 500 x g, 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i dużych ciał apoptotycznych.
  2. Przenieść 10 ml supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml i przystąpić do izolacji EV.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C i rozmrażać w temperaturze 37 °C po użyciu.

2. Izolacja EV przy użyciu podejścia EVtrap

  1. Dodać 0,5 ml bufora ładującego (stosunek 1:10 v/v) i 100 μl zawiesiny kulkowej EVtrap (stosunek 1:50 v/v) do próbki zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Inkubować próbkę przez rotację od końca do końca przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Osadzać próbkę, umieszczając stożkową probówkę o pojemności 15 ml na stojaku separatora magnetycznego. Usunąć supernatant.
  4. Zawiesić kulki w 1 ml buforu do przemywania i przenieść zawiesinę do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Delikatnie odpipetować, aby ponownie zawiesić kulki związane z EV.
  5. Umieścić probówkę na stojaku separatora magnetycznego w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odessać supernatant. Użyj pipety P200, aby całkowicie zassać supernatant i uniknąć zasysania kulek.
  6. Umyj koraliki 1 ml buforu do mycia. Dodać bufor natychmiast po zassaniu supernatantu, aby zapobiec wysychaniu kulek.
  7. Przemyj kulki 2x 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) w temperaturze pokojowej.
  8. Inkubować kulki ze 100 μl świeżo przygotowanej 100 mM trietyloaminy przez 10 minut w temperaturze pokojowej i zebrać eluowany roztwór zawierający EV za pomocą 1,5 ml stojaka na separator magnetyczny w probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: Aby przygotować 1 ml 100 mM trietyloaminy, rozcieńczyć 14 μl roztworu trietyloaminy w wodzie.
  9. Powtórz krok 2.8 i połącz eluowane roztwory. Wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: W tym miejscu eksperyment można wstrzymać. Wysuszone próbki EV mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez kilka miesięcy bez negatywnego wpływu na kolejne etapy lub wyniki.

3. Charakterystyka EV za pomocą western blotting

  1. Zawiesić 5% wysuszonej próbki EV (co odpowiada 0,5 ml próbki moczu) w 20 μl 1x buforu próbki dodecylosiarczanu litu (LDS) z 10 mM ditiotreitolem (DTT).
    UWAGA: EV od 0,5 ml moczu wystarczą do wykrycia sygnału CD9 (marker EV24) w western blotting.
  2. Gotować próbkę przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Załadować próbkę do żelu poliakrylamidowego i przeprowadzić elektroforezę oraz immunoblotting zgodnie ze standardowymi protokołami25.
  3. Po przeniesieniu białek na membranę z polifluorku winylidenu o niskiej fluorescencji (PVDF), zablokuj błonę 1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) w buforowanym trisem soli fizjologicznej tween-20 (TBST) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Aby przygotować 1 l buforu TBST, dodaj 19 mM zasady Tris, 137 mM NaCl i 1 ml Tween-20; dostosować pH do 7,4 za pomocą HCl.
  4. Inkubować błonę z króliczym przeciwciałem anty-CD9 w stosunku 1:5 000 w 1% BSA w TBST w temperaturze 4 °C przez noc lub przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  5. Umyj membranę 3x po 5 minut za pomocą TBST. Inkubować błonę z przeciwciałem drugorzędowym anty-króliczym IgG, sprzężonym z HRP w stosunku 1:5000 w 1% BSA w TBST przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  6. Umyj membranę 3x po 5 minut za pomocą TBST. Dodać uzyskane komercyjnie substraty wzmocnionej chemiluminescencji (ECL) (w stosunku 1:1) do membrany i wykryć sygnały w systemie obrazowania chemiluminescencyjnego.

4. Przygotowanie próbki do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

  1. Przygotować świeży bufor do lizy zawierający 12 mM deoksycholanu sodu (SDC), 12 mM lauroilosarkozynianu sodu (SLS), 100 mM buforu wodorowęglanu trietyloamonu (TEAB), 10 mM tris-(2-karboksetylo)fosfiny (TCEP), 40 mM chloroacetamidu (CAA) i 1x koktajle inhibitorów fosfatazy.
    UWAGA: Roztwory podstawowe są wymienione w opisie w Tabeli materiałów. Bufor do lizy przygotowuje się przez dodanie roztworów podstawowych w celu osiągnięcia pożądanych stężeń w zależności od wymaganej objętości.
  2. Wysuszoną próbkę EV rozpuścić w 100 μl buforu do lizy i podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 95 °C z wytrząsaniem przy 1 100 obr./min.
  3. Po schłodzeniu próbki do temperatury pokojowej należy ją rozcieńczyć pięciokrotnie, dodając 400 μl 50 mM TEAB.
  4. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania BCA zgodnie z instrukcjami producenta. Użyć buforu do lizy rozcieńczonego pięciokrotnie 50 mM TEAB jako ślepej próby.
  5. Dodać mieszaninę trypsyny/Lys-C w stosunku 1:50 w/w enzymu do białka i inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez noc, wytrząsając przy 1 100 obr./min.
  6. Dodać 50 μl 10% kwasu trifluorooctowego (TFA) w celu zakwaszenia próbki.
  7. Dodać 600 μl octanu etylu do próbek i wirować mieszaninę przez 2 minuty.
  8. Odwirować próbkę przez 3 minuty przy 20 000 x g i usunąć górną warstwę (warstwę organiczną). Unikaj zakłócania interfejsu podczas aspiracji.
  9. Powtórz kroki 4.7-4.8. Wysuszyć fazę wodną za pomocą koncentratora wirówki próżniowej.
  10. Ponownie zawiesić wysuszoną próbkę w 200 μl 0,1% TFA w celu zakwaszenia peptydów i odsolić próbkę za pomocą końcówki odsalającej C18 zgodnie z instrukcjami producenta. Kondycjonuj końcówkę 200 μl 0,1% TFA w 80% acetonitrylu, a następnie 2x 200 μl 0,1% TFA. Załaduj zakwaszoną próbkę peptydu do końcówki, a następnie umyj końcówkę 3x 200 μl 0,1% TFA. Eluować peptydy za pomocą 200 μl 0,1% TFA w 80% acetonitrylu.
  11. Wysuszyć eluat za pomocą koncentratora wirówki próżniowej. Wysuszyć oddzielnie 2% próbki peptydu (co odpowiada 0,2 ml próbki moczu) do analizy proteomicznej. Resztę (98%) próbki należy wykorzystać do analizy fosfoproteomicznej.
  12. Wzbogać fosfopeptydy z próbki za pomocą zestawu do wzbogacania fosfopeptydów zgodnie z instrukcjami producenta. Wykonaj czynności opisane poniżej w celu wzbogacenia.
    1. Zawiesić wysuszoną próbkę w 200 μl buforu ładującego. Dodać 50 μl kulek do próbki i energicznie wstrząsać przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Załadować próbkę z kulkami do spiekanej końcówki i wirować przez 1 minutę przy 100 x g.
    2. Przepłukać końcówkę 200 μl buforu ładującego, następnie przepłukać buforem 1, a następnie buforem płuczącym 2. Wykonaj wszystkie trzy etapy mycia, odwirowując raz przez 2 minuty przy 20 x g i raz przez 1 minutę przy 100 x g.
    3. Umieść końcówkę z koralikami w nowej tubie, aby zebrać wymyte fosfopeptydy. Dodać 50 μl buforu elucyjnego do końcówki i odwirować raz przez 2 minuty przy 20 x g. Dodać kolejne 50 μl buforu elucyjnego do końcówki i odwirować raz przez 2 minuty przy 20 x g. Odwirować po raz ostatni przez 1 minutę przy 100 x g.
  13. Wysuszyć eluowane fosfopeptydy za pomocą koncentratora wirówki próżniowej.

5. Analiza LC-MS/MS

UWAGA: Można używać różnych systemów/ustawień LC-MS/MS i metod pozyskiwania danych, takich jak akwizycja zależna od danych (DDA).

  1. Wysuszone próbki proteomu/fosfoproteomu zawiesić ponownie w 0,1% kwasie mrówkowym (rozpuszczalnik A) i załadować próbki zgodnie z instrukcjami producenta.
  2. Wstrzyknąć próbki do uwięzionego MS czasu przelotu z ruchliwością jonów za pomocą systemu chromatografii cieczowej (LC) i użyć wstępnie ustawionej znormalizowanej metody Whisper 40 próbek dziennie. Peptydy rozdziela się na 15 cm kolumnie C18 (średnica wewnętrzna 75 μm, wielkość cząstek 1,9 μm), jak podano w tabeli materiałów.
  3. Do analizy proteomicznej należy pozyskiwać dane za pomocą równoległej akumulacji szeregowej w połączeniu z metodą akwizycji niezależnej od danych (dia-PASEF) z zakresem masy na rampę obejmującą od 300-1200 m/z i od 0,6-1,50 1/K0 z czasem cyklu 1,38 s.
  4. W przypadku analizy fosfoproteomicznej należy pozyskać dane za pomocą metody akwizycji dia-PASEF o zakresie mas na rampę w zakresie 400-1550 m/z i 0,6-1,50 1/K0 z czasem cyklu 1,38 s.
  5. Załaduj surowe pliki do oprogramowania proteomicznego i przeprowadź ekstrakcję, identyfikację i kwantyfikację sygnałów, korzystając z niezależnego od biblioteki przepływu pracy akwizycji danych.
    1. Aby uzyskać ustawienia wyszukiwania, użyj bazy danych Homo sapiens, określonych typów trawienia z enzymami trypsyny / P, 7 minimalnej długości peptydu, 52 maksymalnej długości peptydu, dwóch pominiętych rozszczepienia, karbamidometylu w cysteinie jako ustalonej modyfikacji, białka acetylowego N-term, utleniania w metioninie i fosforylacji w serynie, treoninie i tyrozynie (do analizy fosfoproteomicznej) jako modyfikacje zmiennych i 5 jako maksymalne modyfikacje zmiennych. Ustaw FDR na PSM, peptyd i grupę białkową na 0,01,
      UWAGA: W tym protokole użyto oprogramowania Spectronaut. Powszechnie stosowane są również inne programy do wyszukiwania danych DIA, takie jak DIA-NN i PEAKS. Jeśli dane zostały pozyskane w trybie DDA, zastosowanie ma oprogramowanie takie jak MaxQuant i Proteome Discoverer.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje kompleksowy przebieg procesu od izolacji EV do dalszych analiz proteomicznych i fosfoproteomicznych (Rysunek 1). Potrójne próbki moczu poddano izolacji EV. Wyizolowane EV charakteryzowano za pomocą western blot, a następnie przetworzono w celu przygotowania próbek proteomicznych opartych na spektrometrii mas, w tym ekstrakcji białek, trawienia enzymatycznego i oczyszczania peptydów. Na potrzeby analizy fosfoproteomicznej fosfopeptydy zostały dodatkowo wzbogacone w op...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna izolacja EV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do wykrywania białek i fosfoprotein o niskiej obfitości w EV. Pomimo opracowania wielu metod mających na celu zaspokojenie tej potrzeby, większość z nich nadal cierpi z powodu ograniczeń, takich jak słaba regeneracja lub niska odtwarzalność, które utrudniają ich wykorzystanie w badaniach na dużą skalę i rutynowych warunkach klinicznych. DUC jest ogólnie uważana za najpowszechniejszą metodę izolacji EV, a dodatkowe etapy mycia są zwykle stosowane w celu zwiększenia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują konkurencyjny interes finansowy. Anton Iliuk i W. Andy Tao są współzałożycielami firmy Tymora Analytical Operations, która opracowała kulki EVtrap i skomercjalizowała zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez granty NIH 3RF1AG064250 i R44CA239845.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml Produktyz zakresu nauk przyrodniczychM-1700C-LB
1,5 mL probówka magnetyczna stojak na separatorSergi Lab Supplies1005
15 ml stożkowa probówka wirówkowaCorning 
Stojak na separator magnetyczny w probówce 15 mlSergi Lab Supplies1002
Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórek przeciwciał sprzężona z HRP7074P2
Wytrząsarka inkubowana na stoleBioerDIS-87999-3367802Bioer Blok mieszania termokomórek MB-101
CD9 (D3H4P) Technologiasygnalizacji komórkowej13403S
ChloroacetamidSigma -AldrichC0267-100GSłuży do alkilowania zredukowanych grup siarczkowych. Świeżo przygotować 400 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
Octan etylu Fisher Naukowy E145-4Wytrąca detergenty
Evosep One chromatografii cieczowejEvosep
EvotipsEvosepEV2013Ładowanie próbki do systemu Evosep One 
EVtrapTymora AnalityczneFunkcjonalizowane kulki magnetyczne, bufor załadowczy i bufor myjący 
Membrana Immobilon-FL PVDFSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrana 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 12-dołkowy
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1,9Bruker 1893473Kolumna separacyjna 
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, inhibitor fosfotazy.
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Inhibitor fosfotazy.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP 
Zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMACTymora AnalyticalWychwytywanie powinowactwa do jonów metali na bazie polimerów (PolyMAC) do wzbogacania fosfopeptydów
Deoksycholan sodu Sigma -AldrichD6750-10GDetergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
Sarkosynian lauroilu sodu Sigma -AldrichL9150-50GDetergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
timsTOF HTBrukerSpektrometria mas czasu przelotu uwięzionej ruchliwości jonów
TopTip C-18 (10-200 μ L) napiwki GlygenTT2C18.96Metoda odsalania
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLDo elucji EV. 
Bufor bikabonianu trietyloamonuSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Kwas trifluorooctowySigma -Aldrich302031-100ML
Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfinySigma -AldrichC4706Służy do reducynacji wiązań dwusiarczkowych. Przygotować 200 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. Podwielokrotnić roztwór podstawowy na małą objętość i przechowywać go w temperaturze 20& stopni; C (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).
Trypsyna/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007
352097 mAb królika System

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al. Extracellular vesicles-mediated intercellular communication: roles in the tumor microenvironment and anti-cancer drug resistance. Mol Cancer. 18 (1), 55(2019).
  3. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (4), 213-228 (2018).
  4. Becker, A., et al. extracellular vesicles in cancer: cell-to-cell mediators of metastasis. Cancer Cell. 30 (6), 836-848 (2016).
  5. Bebelman, M. P., Smit, M. J., Pegtel, D. M., Baglio, S. R. Biogenesis and function of extracellular vesicles in cancer. Pharmacol Ther. 188, 1-11 (2018).
  6. Urabe, F., et al. Extracellular vesicles as biomarkers and therapeutic targets for cancer. Am J Physiol Cell Physiol. 318 (1), C29-C39 (2020).
  7. Chang, W. H., Cerione, R. A., Antonyak, M. A. Extracellular Vesicles and Their Roles in Cancer Progression. Methods Mol Biol. 2174, 143-170 (2021).
  8. Chen, I. H., et al. Phosphoproteins in extracellular vesicles as candidate markers for breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (12), 3175-3180 (2017).
  9. Harsha, H. C., Pandey, A. Phosphoproteomics in cancer. Mol Oncol. 4 (6), 482-495 (2010).
  10. Singh, V., et al. Phosphorylation: Implications in Cancer. Protein J. 36 (1), 1-6 (2017).
  11. Delom, F., Chevet, E. Phosphoprotein analysis: from proteins to proteomes. Proteome Sci. 4, 15(2006).
  12. Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Larsen, M. R. Analytical strategies for phosphoproteomics. Proteomics. 9 (6), 1451-1468 (2009).
  13. Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
  14. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  15. Zeringer, E., et al. Methods for the extraction and RNA profiling of exosomes. World J Methodol. 3 (1), 11-18 (2013).
  16. Mathivanan, S., et al. Proteomics analysis of A33 immunoaffinity-purified exosomes released from the human colon tumor cell line LIM1215 reveals a tissue-specific protein signature. Mol Cell Proteomics. 9 (2), 197-208 (2010).
  17. Enderle, D., et al. Characterization of RNA from exosomes and other extracellular vesicles isolated by a novel spin column-based method. PLoS ONE. 10 (8), e0136133(2015).
  18. Wu, X., Li, L., Iliuk, A., Tao, W. A. Highly Efficient Phosphoproteome Capture and Analysis from Urinary Extracellular Vesicles. J Proteome Res. 17 (9), 3308-3316 (2018).
  19. Iliuk, A., et al. Plasma-derived extracellular vesicle phosphoproteomics through chemical affinity purification. J Proteome Res. 19 (7), 2563-2574 (2020).
  20. Iliuk, A. B., Martin, V. A., Alicie, B. M., Geahlen, R. L., Tao, W. A. In-depth analyses of kinase-dependent tyrosine phosphoproteomes based on metal ion-functionalized soluble nanopolymers. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2162-2172 (2010).
  21. Hadisurya, M., et al. Quantitative proteomics and phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles define diagnostic and prognostic biosignatures for Parkinson’s Disease. Commun Med. 3 (1), 64(2023).
  22. Hadisurya, M., et al. Data-independent acquisition phosphoproteomics of urinary extracellular vesicles enables renal cell carcinoma grade differentiation. Mol Cell Proteomics. 22 (5), 100536(2023).
  23. Wu, X., Liu, Y. K., Iliuk, A. B., Tao, W. A. Mass spectrometry-based phosphoproteomics in clinical applications. Trends Analyt Chem. 163, 117066(2023).
  24. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nat Commun. 12 (1), 4389(2021).
  25. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
  26. Keerthikumar, S., et al. ExoCarta: A web-based compendium of exosomal cargo. J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).
  27. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 3 (22), (2006).
  28. Livshits, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Sci Rep. 5, 17319(2015).
  29. Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Res Int. 2018, (2018).
  30. Webber, J., Clayton, A. How pure are your vesicles. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
  31. Erdjument-Bromage, H., Huang, F. K., Neubert, T. A. Sample preparation for relative quantitation of proteins using tandem mass tags (TMT) and mass spectrometry (MS). Methods Mol Biol. 1741, 135-149 (2018).
  32. Charles Jacob, H. K., et al. Identification of novel early pancreatic cancer biomarkers KIF5B and SFRP2 from “first contact” interactions in the tumor microenvironment. J Exp Clinl Cancer Res. 41 (1), 258(2022).
  33. Nunez Lopez, Y. O., et al. Extracellular vesicle proteomics and phosphoproteomics identify pathways for increased risk in patients hospitalized with COVID-19 and type 2 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract. 197, 110565(2023).
  34. Hinzman, C. P., et al. A multi-omics approach identifies pancreatic cancer cell extracellular vesicles as mediators of the unfolded protein response in normal pancreatic epithelial cells. J Extracell Vesicles. 11 (6), e12232(2022).
  35. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  36. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Sci Rep. 6, 22519(2016).
  37. Searle, B. C., et al. Generating high quality libraries for DIA MS with empirically corrected peptide predictions. Nat Commun. 11 (1), 1548(2020).
  38. Skowronek, P., et al. Rapid and in-depth coverage of the (Phospho-)proteome with deep libraries and optimal window design for dia-PASEF. Mol Cell Proteomics. 21 (9), 100279(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Extracellular VesiclesEV IsolationBiofluid ProteomicsPhosphoproteomics AnalysisMagnetic Bead IsolationUrinary EVsLiquid BiopsyMass SpectrometryPhosphopeptide EnrichmentPost Translational Modifications

Powiązane artykuły