Method Article

Izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z biofluidów na podstawie powinowactwa chemicznego do analizy proteomicznej i fosfoproteomicznej

DOI:

10.3791/65844

October 27th, 2023

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy skutecznego izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych moczu za pomocą funkcjonalizowanych kulek magnetycznych. Ponadto obejmuje kolejne analizy, w tym western blotting, proteomikę i fosfoproteomikę.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) z płynów biologicznych zyskały ostatnio znaczną uwagę w dziedzinie płynnej biopsji. Uwalniane przez prawie każdy typ komórek, zapewniają migawkę komórek gospodarza w czasie rzeczywistym i zawierają bogactwo informacji molekularnych, w tym białek, w szczególności tych z modyfikacjami potranslacyjnymi (PTM), takimi jak fosforylacja, jako główny gracz funkcji komórkowych oraz początku i progresji choroby. Jednak izolacja pojazdów elektrycznych z biopłynów pozostaje wyzwaniem ze względu na niską wydajność i zanieczyszczenia wynikające z obecnych metod izolacji pojazdów elektrycznych, co utrudnia dalszą analizę ładunków pojazdów elektrycznych, takich jak fosfoproteiny pojazdów elektrycznych. W tym miejscu opisujemy szybką i skuteczną metodę izolacji EV opartą na funkcjonalizowanych kulkach magnetycznych do izolacji EV z płynów biologicznych, takich jak ludzki mocz oraz dalsza analiza proteomiczna i fosfoproteomiczna po izolacji EV. Protokół umożliwił wysoką wydajność odzyskiwania EV w moczu oraz czułe profile proteomu EV i fosfoproteomu. Ponadto poruszono tu również kwestię wszechstronności tego protokołu i odpowiednich względów technicznych.

Introduction

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to otoczone błoną nanocząsteczki wydzielane przez wszystkie typy komórek i obecne w płynach biologicznych, takich jak krew, mocz, ślina itp.1,2,3,4. EV przenoszą ładunek różnorodnych bioaktywnych cząsteczek, które odzwierciedlają fizjologiczny i patologiczny stan komórek gospodarza, a zatem działają jako kluczowe czynniki w postępie choroby4,5,6. Co więcej, szeroko zakrojone badania wykazały, że markery choroby opa....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie próbki moczu zostały pobrane od zdrowych osób po świadomej zgodzie. Eksperymenty były zgodne ze wszystkimi standardami etycznymi dotyczącymi próbek ludzkich i są zgodne z wytycznymi Programu Ochrony Badań Naukowych na Ludziach Uniwersytetu Purdue.

1. Pobieranie próbek

  1. Odwirować 12 ml próbki moczu w stożkowej probówce wirówkowej o pojemności 15 ml przez 10 minut przy 2 500 x g, 4 °C w celu usunięcia resztek komórek i dużych ciał apoptotycznych.
  2. Przenieść 10 ml supernatantu do nowej probówki o pojemności 15 ml i przystąpić do izolacji EV.
    UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać dzi....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje kompleksowy przebieg procesu od izolacji EV do dalszych analiz proteomicznych i fosfoproteomicznych (Rysunek 1). Potrójne próbki moczu poddano izolacji EV. Wyizolowane EV charakteryzowano za pomocą western blot, a następnie przetworzono w celu przygotowania próbek proteomicznych opartych na spektrometrii mas, w tym ekstrakcji białek, trawienia enzymatycznego i oczyszczania peptydów. Na potrzeby analizy fosfoproteomicznej fosfopeptydy zostały dodatkowo wzbogacone w op.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczna izolacja EV jest niezbędnym warunkiem wstępnym do wykrywania białek i fosfoprotein o niskiej obfitości w EV. Pomimo opracowania wielu metod mających na celu zaspokojenie tej potrzeby, większość z nich nadal cierpi z powodu ograniczeń, takich jak słaba regeneracja lub niska odtwarzalność, które utrudniają ich wykorzystanie w badaniach na dużą skalę i rutynowych warunkach klinicznych. DUC jest ogólnie uważana za najpowszechniejszą metodę izolacji EV, a dodatkowe etapy mycia są zwykle stosowane w celu zwiększenia .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują konkurencyjny interes finansowy. Anton Iliuk i W. Andy Tao są współzałożycielami firmy Tymora Analytical Operations, która opracowała kulki EVtrap i skomercjalizowała zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMAC.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została częściowo sfinansowana przez granty NIH 3RF1AG064250 i R44CA239845.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Probówka do mikrowirówek 1,5 ml Produktyz zakresu nauk przyrodniczychM-1700C-LB
1,5 mL probówka magnetyczna stojak na separatorSergi Lab Supplies1005
15 ml stożkowa probówka wirówkowaCorning 
Stojak na separator magnetyczny w probówce 15 mlSergi Lab Supplies1002
Anty-królicza IgG, technologia sygnalizacji komórek przeciwciał sprzężona z HRP7074P2
Wytrząsarka inkubowana na stoleBioerDIS-87999-3367802Bioer Blok mieszania termokomórek MB-101
CD9 (D3H4P) Technologiasygnalizacji komórkowej13403S
ChloroacetamidSigma -AldrichC0267-100GSłuży do alkilowania zredukowanych grup siarczkowych. Świeżo przygotować 400 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
Octan etylu Fisher Naukowy E145-4Wytrąca detergenty
Evosep One chromatografii cieczowejEvosep
EvotipsEvosepEV2013Ładowanie próbki do systemu Evosep One 
EVtrapTymora AnalityczneFunkcjonalizowane kulki magnetyczne, bufor załadowczy i bufor myjący 
Membrana Immobilon-FL PVDFSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrana 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 do 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini żel białkowy, 12-dołkowy
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1,9Bruker 1893473Kolumna separacyjna 
Koktajl inhibitorów fosfatazy 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, inhibitor fosfotazy.
Koktajl inhibitorów fosfatazy 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Inhibitor fosfotazy.
Zestaw do oznaczania białek Pierce BCAThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP 
Zestaw do wzbogacania fosfopeptydów PolyMACTymora AnalyticalWychwytywanie powinowactwa do jonów metali na bazie polimerów (PolyMAC) do wzbogacania fosfopeptydów
Deoksycholan sodu Sigma -AldrichD6750-10GDetergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
Sarkosynian lauroilu sodu Sigma -AldrichL9150-50GDetergent do buforu do lizy. Przygotować 120 mM w wodzie jako roztwór podstawowy.
timsTOF HTBrukerSpektrometria mas czasu przelotu uwięzionej ruchliwości jonów
TopTip C-18 (10-200 μ L) napiwki GlygenTT2C18.96Metoda odsalania
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLDo elucji EV. 
Bufor bikabonianu trietyloamonuSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Kwas trifluorooctowySigma -Aldrich302031-100ML
Chlorowodorek tris-(2-karboksetylo)fosfinySigma -AldrichC4706Służy do reducynacji wiązań dwusiarczkowych. Przygotować 200 mM w wodzie jako roztwór podstawowy. Podwielokrotnić roztwór podstawowy na małą objętość i przechowywać go w temperaturze 20& stopni; C (unikaj wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania).
Trypsyna/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007
352097 mAb królika System

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abels, E. R., Breakefield, X. O. Introduction to extracellular vesicles: Biogenesis, RNA cargo selection, content, release, and uptake. Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).
  2. Maacha, S., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Extracellular VesiclesEV IsolationBiofluid ProteomicsPhosphoproteomics AnalysisMagnetic Bead IsolationUrinary EVsLiquid BiopsyMass SpectrometryPhosphopeptide EnrichmentPost Translational Modifications

Related Articles