Artykuł metodologiczny

Podsiatkówkowe dostarczanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych u myszy rd10

DOI:

10.3791/65848

⸱

6 października 2023

 ,  ,  , 
1Singapore National Eye Centre, Singapore Eye Research Institute, 2Centre for Vision Research, Duke-NUS Medical School, 3Ophthalmology and Visual Sciences Academic Clinical Program, DUKE-NUS Medical School, 4Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy szczegółowy protokół przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z kriokonserwacji hESC oraz dostarczania tych komórek do tkanki podsiatkówkowej u myszy rd10.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Regeneracja komórek fotoreceptorowych za pomocą ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych jest obiecującą terapią w leczeniu zarówno dziedzicznych, jak i starzejących się chorób siatkówki w zaawansowanych stadiach. Wykazaliśmy, że ludzka rekombinowana matryca izoformy lamininy specyficzna dla siatkówki jest w stanie wspierać różnicowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) do progenitorów fotoreceptorów. Ponadto wstrzyknięcie tych komórek pod siatkówkę wykazało również częściową odbudowę w modelach gryzoni i królików rd10. Wiadomo, że wstrzyknięcie podsiatkówkowe jest uznaną metodą, która była stosowana do dostarczania związków farmaceutycznych do komórek fotoreceptorów i warstwy pigmentowego nabłonka siatkówki (RPE) oka ze względu na jego bliskość do przestrzeni docelowej. Jest również stosowany do dostarczania wektorów wirusowych związanych z adenowirusem do przestrzeni podsiatkówkowej w celu leczenia chorób siatkówki. Podsiatkówkowe dostarczanie związków farmaceutycznych i komórek w modelu mysim jest trudne ze względu na ograniczenie wielkości mysiej gałki ocznej. Protokół ten opisuje szczegółową procedurę przygotowania komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z hESC do wstrzyknięcia oraz technikę dostarczania tych komórek do siatkówki w genetycznym zwyrodnieniu siatkówki z mutacją rd10. Takie podejście pozwala na terapię komórkową docelowego obszaru, w szczególności zewnętrznej warstwy jądrowej siatkówki, gdzie występują choroby prowadzące do zwyrodnienia fotoreceptorów.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziedziczne choroby siatkówki i związane z wiekiem zwyrodnienie plamki żółtej prowadzą do utraty komórek fotoreceptorów i ostatecznej ślepoty. Fotoreceptor siatkówki to zewnętrzna warstwa segmentu siatkówki składająca się z wyspecjalizowanych komórek odpowiedzialnych za fototransdukcję (tj. konwersję światła na sygnały neuronalne). Komórki fotoreceptorów pręcików i czopków przylegają do warstwy barwnikowej siatkówki (RPE)1. Terapia fotoreceptorowa polegająca na zastępowaniu komórek w celu kompensacji utraty komórek jest wyłaniającym się i rozwijającym się podejściem terapeutycznym. Embrionalne komórki macierzyste (ESC)2,3,4, indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) pochodzące z komórek RPE i komórki progenitorowe siatkówki (RPC)4,5,6,7,8 zostały wykorzystane do odbudowy uszkodzonych komórek fotoreceptorowych. Przestrzeń podsiatkówkowa, zamknięta przestrzeń między siatkówką a RPE, jest atrakcyjnym miejscem do osadzania tych komórek w celu zastąpienia uszkodzonych komórek fotoreceptorowych, RPE i komórek Muellera ze względu na swoje sąsiedztwo9,10,11.

Terapie genowe i komórkowe wykorzystywały przestrzeń podsiatkówkową w medycynie regeneracyjnej dla różnych chorób siatkówki w badaniach przedklinicznych. Obejmuje to dostarczenie funkcjonalnych kopii genu lub narzędzi do edycji genów w postaci terapii oligonukleotydowej przeciwsensownej12,13 lub CRISPR/Cas9 lub edycji zasady za pomocą strategii opartej na wirusach związanych z adenowirusem (AAV)14,15,16, implantacja materiałów (np. arkusz RPE, protetyka siatkówki17,18,19) i zróżnicowane organoidy siatkówki pochodzące z komórek macierzystych20,21,22 do leczenia chorób siatkówki i chorób związanych z RPE. Badania kliniczne z użyciem hESC-RPE31 w przestrzeni podsiatkówkowej w leczeniu wrodzonej ślepoty Lebera (LCA) związanej z RPE6523,24, achromatopsja sprzężona z CNGA325, barwnikowe zapalenie siatkówki związane z MERTK26, choroideremia27,28,29,30 udowodniono, że jest to skuteczne podejście. Bezpośrednie wstrzyknięcie komórek w pobliże uszkodzonego obszaru znacznie zwiększa szansę na osiadanie komórek w odpowiednim regionie, integrację synaptyczną i ostateczną poprawę widzenia.

Mimo że wstrzyknięcie podsiatkówkowe u ludzi i modeli o dużych oczach (np. świnia32,33,34,35, królik36,37,38,39,40 i naczelny niebędący człowiekiem41,42,43) zostało ustalone, takie wstrzyknięcie w modelu mysim jest nadal trudne ze względu na ograniczenie rozmiaru gałki ocznej i ogromną soczewkę zajmującą oko myszy44,45,46. Jednak modele modyfikowane genetycznie są łatwo dostępne tylko u małych zwierząt, a nie u dużych zwierząt (tj. królików i naczelnych innych niż ludzie), dlatego wstrzyknięcie podsiatkówkowe u myszy zwraca uwagę na zbadanie nowych podejść terapeutycznych w genetycznych zaburzeniach siatkówki. Do dostarczania komórek lub AAV do przestrzeni podsiatkówkowej stosuje się trzy główne podejścia, a mianowicie drogę przezrogówkową, drogę przeztwardówkową i drogę pars plana (patrz ryc. 2). Drogi przezrogówkowe i przeztwardówkowe są związane z powstawaniem zaćmy, synechiami, krwawieniem naczyniówkowym i refluksem z miejsca wstrzyknięcia11,44,45,47,48,49. Przyjęliśmy podejście pars plana jako bezpośrednią wizualizację procesu wstrzykiwania, a miejsce wstrzyknięcia można uzyskać w czasie rzeczywistym pod mikroskopem.

Niedawno opisaliśmy metodę, która może różnicować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) w progenitory fotoreceptorów w warunkach wolnych od ksenowolności, chemicznie zdefiniowanych przy użyciu rekombinowanej izoformy lamininy LN523 specyficznej dla ludzkiej siatkówki. Ponieważ stwierdzono, że LN523 jest obecny w siatkówce, postawiliśmy hipotezę, że nisza macierzy zewnątrzkomórkowej ludzkiej siatkówki może zostać ponownie podsumowana in vitro, a tym samym wspierać różnicowanie fotoreceptorów od hESCs36. Analiza transkryptomiczna pojedynczej komórki wykazała, że komórki progenitorowe fotoreceptorów koeksprymujące homeobox stożkowy-pręcik i rekupynę zostały wygenerowane po 32 dniach. Mysi model zmutowanego zwyrodnienia siatkówki 10 (rd10), który naśladuje autosomalne barwnikowe zwyrodnienie siatkówki u ludzi, wykorzystano do oceny skuteczności komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z hESC dnia 32 in vivo. Komórki progenitorowe fotoreceptorów pochodzące z hESC zostały wstrzyknięte do przestrzeni podsiatkówkowej myszy rd10 w P20, gdzie trwa dysfunkcja i degeneracja fotoceptora36. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół przygotowania postkriokonserwowanych komórek progenitorowych fotoreceptorów pochodzących z hESC i dostarczania do przestrzeni podsiatkówkowej myszy rd10. Metoda ta może być również stosowana do podawania AAV, zawiesin komórkowych, peptydów lub substancji chemicznych do przestrzeni podsiatkówkowej u myszy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty in vivo zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i protokołem zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt SingHealth (IACUC) oraz Oświadczenie Stowarzyszenia Badań nad Wzrokiem i Okulistyką (ARVO) dotyczące wykorzystania zwierząt w badaniach okulistycznych i wzrokowych. Młode poddano immunosupresji od P17 (przed przeszczepem) do P30 (po przeszczepie) poprzez karmienie ich wodą pitną zawierającą cyklosporynę (260 g/l).

1. Przygotowanie progenitorów fotoreceptorów pochodzących z hESC w dniu 32 po kriokonserwacji

  1. Wstępnie ogrzane podłoże do różnicowania fotoreceptorów (PRDM) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  2. Pobierz kriowialny kriowialny zawierający komórki progenitorowe fotoreceptorów pochodzących z dnia 32 hESC z ciekłego azotu. Przechowywać na suchym lodzie.
  3. Rozmrażać kriowial w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 3-5 minut. Zawiesić 32 komórki w ciągu dnia w 1 ml PRDM i odwirować przy 130 x g przez 4 minuty.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PRDM.
  5. Usunąć 10 μl mieszaniny do zliczenia komórek. Wymieszaj komórki za pomocą 0,2% błękitu trypanowego zgodnie z instrukcjami producenta. Odpipetować mieszaninę komórek do szkiełka komory zliczania komórek. Określ liczbę komórek i żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.
  6. Przejdź do następnego kroku, gdy żywotność komórki przekroczy 70%. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o sile 130 x g przez 4 minuty. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w PRDM w stężeniu 3 x 105 komórek/μl do przeszczepu.
  7. Obserwuj, czy nie ma widocznych grudek komórek. Kilkakrotnie zawieszaj grudki komórek za pomocą końcówki pipety o pojemności 10 μl w probówce do mikrofuge, aż nie będzie widać zbrylenia komórek. Załadować do strzykawki iniekcyjnej 33G, aby obserwować, czy roztwór komórkowy jest wytłaczany przez igłę.

2. Podsiatkówkowe dostarczanie hESC u myszy rd10

  1. Przygotowanie zwierząt
    1. Znieczulić mysz (P20, samiec/samica, 3-6 g) za pomocą kombinacji ketaminy (20 mg/kg masy ciała) i ksylazyny (2 mg/kg masy ciała) w strzykawce tuberkulinowej o pojemności 1 ml przymocowanej do igły 27G przez dostęp dootrzewnowy. Należy podać myszowi podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg) jako zapobiegawczy środek przeciwbólowy.
    2. Po podaniu znieczulenia należy wkroplić po 1% tropikamidu i 2,5% fenylefryny w celu rozszerzenia źrenicy. Nałóż żel okulistyczny na rogówkę, aby zapobiec wysuszeniu oka i zaćmie związanej ze znieczuleniem.
    3. Umieść mysz w pustej klatce, aż do całkowitego znieczulenia. Oceń właściwy poziom znieczulenia, ściskając opuszkę łapy i sprawdź, czy zwierzę nie reaguje na mocne uszczypnięcie.
    4. Gdy mysz jest w pełni znieczulona, umieść zwierzę na ciepłej podkładce ustawionej na 38 °C.
  2. Podsiatkówkowe dostarczanie komórek
    1. Aby zastosować 1-portowe podejście trans-szkliste pars plana, jak to zrobiono tutaj, wykonaj wstrzyknięcie podsiatkówkowe w sterylnym środowisku. Do wykonania wstrzyknięcia należy użyć pionowego mikroskopu operacyjnego z bezpośrednią ścieżką światła.
    2. Przygotować szklaną strzykawkę o pojemności 10 μl, wyjmując piastę igły. Zamontuj igłę 33G na szklanej strzykawce. Wziąć metalową osłonę piasty i ostrożnie przymocować igłę do strzykawki.
    3. Przepłukać wodą destylowaną, aby sprawdzić, czy nie ma śladów wycieku i drożności igły. Opróżnić strzykawkę i ostrożnie odłożyć ją na bok.
    4. Umieść znieczuloną mysz na poduszce, tak aby oko zabiegowe patrzyło prosto w obiektyw mikroskopu. Zastosuj 0,5% chlorowodorek proparakainy i odczekaj 30 sekund. Nałóż 150 μl żelu okulistycznego na oko i nałóż na nie okrągłe szkiełko nakrywkowe.
    5. Wykonaj zgrubne badanie oka, obserwując rogówkę, tęczówkę, źrenicę, soczewkę i spojówkę. Przez źrenicę zwizualizuj dno oka myszy, dostosowując płaszczyznę ogniskowej. Wyreguluj głowę, aż głowica optyczna znajdzie się na środku źrenicy i zminimalizuj ruch głowy poprzez odpowiednie ułożenie na poduszce.
    6. Delikatnie postukaj kilkakrotnie w podstawę rurki za pomocą hESC, aby uzyskać jednolitą zawiesinę komórek. Używając szklanej strzykawki mikrolitrowej o pojemności 10 μl z igłą 33G, należy pobrać 2 μl komórek/pożywki. Należy pobrać komórki tuż przed wstrzyknięciem, aby uniknąć osiadania/zbrylania się komórek w strzykawce.
    7. Za pomocą jednorazowej igły 30G wykonaj ranę sklerektomiczną 2 mm za rąbkiem. Utrzymuj kąt igły na poziomie ~45°, aby uniknąć dotykania soczewki. Po uwidocznieniu końcówki igły w oku, delikatnie wyjąć igłę. Po użyciu wyrzuć igłę do ostrego pojemnika, aby uniknąć ukłucia igłą.
    8. Weź szklaną strzykawkę i włóż igłę do rany po skleferektomii. Nie dotykając soczewki, przesuwaj igłę, aż dotrze do przeciwległej siatkówki rany wlotowej. Upewnij się, że obszar wstrzyknięcia jest wolny od głównych naczyń krwionośnych siatkówki, aby uniknąć krwawienia.
    9. Delikatnie penetruj siatkówkę, aż zobaczysz gałąź uciskową na twardówce. Trzymaj koniec igły równolegle do twardówki, aby uniknąć przeciekania komórek do przestrzeni ciała szklistego.
    10. Powoli wstrzyknąć 2 μl zawiesiny komórkowej lub pożywki PRDM (kontrola) do przestrzeni podsiatkówkowej, utrzymując delikatny nacisk na strzykawkę. Po udanym wstrzyknięciu w miejscu wstrzyknięcia powinien powstać widoczny pęcherzyk (tj. uniesiona siatkówka z zawiesiną komórkową/pożywką) w miejscu wstrzyknięcia.
      UWAGA: Podczas wstrzykiwania należy stosować wyłącznie delikatny ucisk, aby uniknąć rozerwania siatkówki i zablokowania komórek na końcu igły.
    11. Po potwierdzeniu pęcherzyka odczekaj 10 sekund, aby komórki się uspokoiły. Delikatnie wycofać igłę z oka.
  3. Śródoperacyjna optyczna koherentna tomografia (OCT) skanowania pęcherzyka (opcjonalnie)
    1. Ustaw oko myszy tak, aby uwidocznić pęcherzyk pod mikroskopem, powoli przesuwając głowę. Zabezpiecz pozycję, delikatnie przytrzymując głowę. Nie jest konieczne dodatkowe rozszerzanie źrenic. Nie należy zdejmować szkiełka nakrywkowego i żelu z oka. Daje wyraźny nośnik optyczny do wizualizacji pęcherzyka.
    2. Wykonaj śródoperacyjne OCT za pomocą wbudowanej funkcji iOCT mikroskopu operacyjnego.
    3. Naciśnij opcję Cube na ekranie OCT i ustaw obszar skanowania na blebie, naciskając przyciski strzałek. Dostosuj OCT, przesuwając centrowanie i ostrość, aby uzyskać najlepszą jakość OCT. Naciśnij Capture/Scan, aby uzyskać skan OCT obszaru pęcherzyka. Przejrzyj obrazy, aby sprawdzić jakość skanów.
  4. Odzyskiwania
    1. Usuń szkiełko nakrywkowe i oczyść żel z oka gazą. Nałóż maść z antybiotykiem jeden raz po wstrzyknięciu, aby zapobiec infekcji.
    2. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu w ciepłym świetle, aż odzyska wystarczającą świadomość, aby utrzymać pozycję leżącą mostka i powrócić do klatki domowej. Monitorować zwierzę przez co najmniej 3 dni po wstrzyknięciu pod kątem objawów stanu zapalnego, infekcji i niepokoju.
      UWAGA: Ciepłe światło o mocy 150 W powinno znajdować się w odległości co najmniej 30 cm od klatki dla zwierząt i należy zachować ostrożność, aby uniknąć oparzeń.
    3. Podawać podskórne wstrzyknięcie buprenorfiny (0,05 mg/kg) co 8 godzin przez 1 dzień lub zgodnie z zaleceniem lekarza weterynarii. W przypadku zaobserwowania zapalenia lub infekcji oka skonsultuj się z lekarzem weterynarii w celu uzyskania odpowiedniego leczenia.
  5. Czyszczenie i sterylizacja narzędzi
    1. Przepłukać szklaną strzykawkę mikrolitrową o pojemności 10 μl i igłę 33G 100% etanolem 10x. Zmyć etanol, przemywając strzykawkę wodą destylowaną.
    2. Zdemontować szklaną strzykawkę i igłę. Osuszyć strzykawkę do przechowywania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szklana strzykawka o pojemności 10 μL została zmontowana zgodnie z instrukcjami producenta (Rysunek 1), a igła używana do dostarczania zawiesiny/pożywki komórkowej jest pokazana w Rysunek 1B. Różne podejścia do iniekcji podsiatkówkowej są zilustrowane na Rysunek 2. W tym protokole opisujemy podejście pars plana (Rysunek 2C). igła zamontowana na szklanej strzykawce została wprowadzona przez ranę sklerotomijną i uz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wstrzyknięcie podsiatkówkowe było stosowane do przeszczepu zawiesiny komórkowej w leczeniu RPE i chorób siatkówki 23,25,26,27,28,31,40. Podejście to jest bardzo istotne w badaniach na gryzoniach, nie tylko w celu przeszczepu komórek i terapii genowej, ale także w celu oceny nowych związków t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hwee Goon Tay jest współzałożycielem Alder Therapeutics AB. Inni autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Wei Sheng Tan, Luanne Chiang Xue Yen, Xinyi Lee i Yingying Chung za udzielenie pomocy technicznej w przygotowaniu 32 dzień po kriokonserwacji fotoreceptorów pochodzących z hESC. Prace te były częściowo wspierane przez granty z National Medical Research Council Young Investigator Research Grant Award (NMRC/OFYIRG/0042/2017) oraz National Research Foundation24th Competitive Research Program Grant (CRP24-2020-0083) dla H.G.T.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,3% TobramycynaNovartisNDC   0078-0813-01Tobrex (3,5 g)
0,3% Tobramycyna i 0,1% deksametazonNovartisNDC 0078-0876-01Tobradex (3,5 g)
0,5% chlorowodorek proparakainyAlconNDC 0998-0016-150,5% Alkaina (15 ml)
1 ml Strzykawka tuberkulinowaTuremoSS01T2713
1% TropicamideAlconNDC 0998-0355-151% Mydriacyl (15 ml)
2,5% chlorowodorek fenylefrynyAlconNDC 0998-0342-052,5% Mydfrin (5 mL)
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowychCostar3526
30 G Igła jednorazowaBecton Dickinson (BD)305128
33 G, długość 20 mm igłyHamilton7803-05
Automatyczny licznik komórekNanoEnTekModel: Eve
B27 bez witaminy ALife Technologies125870012%36
BuprenorfinaCevaVetergesic weterynarz (0,3 mg/ml)
CKI-7SigmaC07425 &mikro; M36
CyklosporynaNovartis260 g/L w wodzie pitnej
Dzień 32 Komórki progenitorowe fotoreceptorów pochodzące z hESCMedyczna DUKE-NUS Ludzkieembrionalne komórki macierzyste różnicują się przez 32 dni. Patrz protokół w odnośniku 36.
GauzeWinner Industries Co., Ltd.1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential MediumGibco11710– 035
Linia komórkowa hESC H1Instytut Badawczy WiCellWA01
Czynnik neurotroficzny pochodzenia ludzkiego mózgu (BDNF)Peprotech450-02-5010 ng/mL36
Ludzki rzęskowy czynnik neurotroficzny (CNTF)Prospec-Tany TechnogeneCYT-27210 ng/mL36
Chlorowodorek ketaminy (100 mg/mL)Ceva Santé AnimaleKETALAB03
LN-521BiolaminaLN521-021 &mikro; g36
mFreSRSTEMCELL Technologies5854
Szklana strzykawka mikrolitrowa (10 ml)Hamilton7653-01
N-[N-(3,5-difluorofenacetylo-L-alanyl)]-S-fenyloglicyny ester t-butylowy (DAPT)SelleckchemS221510 µ M36
N-2 suplementLife TechnologiesA13707-011%36
Aminokwasy endogenne (NEAA)Gibco11140– 0501x36
NutriStem XF MediaSatorius05-100-1A
Mikroskop operacyjnyZeissOPMI LUMERA 700z wbudowaną funkcją iOCT
PRDM (pożywka do różnicowania fotoreceptorów, 50ml)SzkołaZobacz skład podłoża36. Podłoże podstawowe, 10 i mikro; M DAPT, 10 ng/ml BDNF, 10 ng/ml CNTF, 0,5 i mikro; M Kwas retinowy, 2% B27 i 1% N2. Podłoże podstawowe: 1x GMEM, 1 mM pirogronian sodu, 0,1 mM B-merkaptoetanol, 1x Aminokwasy endogenne (NEAA).
PirogronianGibco11360– 0701 mM36
Rd10 myszyJackson LaboratoryB6. Myszy CXB1-PDE6BRD10/JPłeć: mężczyzna/kobieta, Wiek: P20 (wstrzyknięcie), Waga: 3-6 g 
Kwas retinowyTocris Bioscience0695/500,5 &mikro; M36
Szkiełko nakrywkowe okrągłe (12 mm)Fisher Scientific12-545-80
SB431542SigmaS43170,5 &mikro; M36
Vidisic Gel (10 g)Dr. Gerhard Mann
Chlorowodorek ksylazyny (20 mg/mL)Troy LaboratoriesLI0605
β-merkaptoetanolLife Technologies21985– 0230,1 mM36
Szkoła Medyczna DUKE-NUS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Molday, R. S., Moritz, O. L. Photoreceptors at a glance. Journal of Cell Science. 128 (22), 4039-4045 (2015).
  2. Aboualizadeh, E., et al. Imaging Transplanted Photoreceptors in Living Nonhuman Primates with Single-Cell Resolution. Stem Cell Reports. 15 (2), 482-497 (2020).
  3. Petrus-Reurer, S., et al. Preclinical safety studies of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells for the treatment of age-related macular degeneration. Stem cells translational medicine. 9 (8), 936-953 (2020).
  4. Wang, S. T., et al. Transplantation of Retinal Progenitor Cells from Optic Cup-Like Structures Differentiated from Human Embryonic Stem Cells In Vitro and In Vivo Generation of Retinal Ganglion-Like Cells. Stem cells and development. 28 (4), 258-267 (2019).
  5. Wang, Z., et al. Intravitreal Injection of Human Retinal Progenitor Cells for Treatment of Retinal Degeneration. Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 26, e921184-e921191 (2020).
  6. Semo, M., et al. Efficacy and Safety of Human Retinal Progenitor Cells. Translational vision science & technology. 5 (4), 6(2016).
  7. Luo, J., et al. Human Retinal Progenitor Cell Transplantation Preserves Vision. The Journal of Biological Chemistry. 289 (10), 6362(2014).
  8. Liu, Y., et al. Long-term safety of human retinal progenitor cell transplantation in retinitis pigmentosa patients. Stem cell research & therapy. 8 (1), 209(2017).
  9. Maia, M., et al. Effects of indocyanine green injection on the retinal surface and into the subretinal space in rabbits. Retina (Philadelphia, Pa). 24 (1), 80-91 (2004).
  10. Nickerson, J. M., et al. Subretinal delivery and electroporation in pigmented and nonpigmented adult mouse eyes. Methods in molecular biology (Clifton, N.J). 884, 53(2012).
  11. Peng, Y., Tang, L., Zhou, Y. Subretinal Injection: A Review on the Novel Route of Therapeutic Delivery for Vitreoretinal Diseases. Ophthalmic Research. 58 (4), 217-226 (2017).
  12. Murray, S. F., et al. Allele-Specific Inhibition of Rhodopsin With an Antisense Oligonucleotide Slows Photoreceptor Cell Degeneration. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (11), 6362(2015).
  13. Cideciyan, A. V., et al. Mutation-independent rhodopsin gene therapy by knockdown and replacement with a single AAV vector. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (36), E8547-E8556 (2018).
  14. Maeder, M. L., et al. Development of a gene-editing approach to restore vision loss in Leber congenital amaurosis type 10. Nature medicine. 25 (2), 229-233 (2019).
  15. Katrekar, D., et al. In vivo RNA editing of point mutations via RNA-guided adenosine deaminases. Nature methods. 16 (3), 239(2019).
  16. Ong, T., Pennesi, M. E., Birch, D. G., Lam, B. L., Tsang, S. H. Adeno-Associated Viral Gene Therapy for Inherited Retinal Disease. Pharmaceutical Research. 36 (2), 34(2019).
  17. Pardue, M. T., et al. Neuroprotective effect of subretinal implants in the RCS rat. Investigative ophthalmology & visual science. 46 (2), 674-682 (2005).
  18. Liu, Z., et al. Surgical Transplantation of Human RPE Stem Cell-Derived RPE Monolayers into Non-Human Primates with Immunosuppression. Stem cell reports. 16 (2), 237-251 (2021).
  19. Martinez Camarillo, J. C., et al. Development of a Surgical Technique for Subretinal Implants in Rats. Journal of visualized experiments: JoVE. (190), e64585(2022).
  20. Xue, Y., et al. The Prospects for Retinal Organoids in Treatment of Retinal Diseases. Asia-Pacific Journal of Ophthalmology. 11 (4), 314-327 (2022).
  21. McLelland, B. T., et al. Transplanted hESC-derived retina organoid sheets differentiate, integrate, and improve visual function in retinal degenerate rats. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 59 (6), 2586-2603 (2018).
  22. Lin, B., et al. Retina organoid transplants develop photoreceptors and improve visual function in RCS rats with RPE dysfunction. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 61 (11), 34(2020).
  23. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: a randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet (London, England). 390 (10097), 849-860 (2017).
  24. Testa, F., et al. Three Year Follow-Up after Unilateral Subretinal Delivery of Adeno-Associated Virus in Patients with Leber Congenital Amaurosis Type 2. Ophthalmology. 120 (6), 1283(2013).
  25. Fischer, M. D., et al. Safety and Vision Outcomes of Subretinal Gene Therapy Targeting Cone Photoreceptors in Achromatopsia: A Nonrandomized Controlled Trial. JAMA ophthalmology. 138 (6), 643-651 (2020).
  26. Ghazi, N. G., et al. Treatment of retinitis pigmentosa due to MERTK mutations by ocular subretinal injection of adeno-associated virus gene vector: results of a phase I trial. Human genetics. 135 (3), 327-343 (2016).
  27. MacLaren, R. E., et al. Retinal gene therapy in patients with choroideremia: initial findings from a phase 1/2 clinical trial. Lancet (London, England). 383 (9923), 1129-1137 (2014).
  28. Lam, B. L., et al. Choroideremia Gene Therapy Phase 2 Clinical Trial: 24-Month Results. American journal of ophthalmology. 197, 65-73 (2019).
  29. Xue, K., et al. Beneficial effects on vision in patients undergoing retinal gene therapy for choroideremia. Nature medicine. 24 (10), 1507-1512 (2018).
  30. Zhai, Y., et al. AAV2-Mediated Gene Therapy for Choroideremia: 5-Year Results and Alternate Anti-sense Oligonucleotide Therapy. American Journal of Ophthalmology. 248, 145-156 (2023).
  31. Schwartz, S. D., Tan, G., Hosseini, H., Nagiel, A. Subretinal Transplantation of Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelium for the Treatment of Macular Degeneration: An Assessment at 4 Years. Investigative ophthalmology & visual science. 57 (5), ORSFc1-ORSFc9 (2016).
  32. Vu, Q. A., et al. Structural changes in the retina after implantation of subretinal three-dimensional implants in mini pigs. Frontiers in Neuroscience. 16, 1010445(2022).
  33. Spindler, L., et al. Controlled injection pressure prevents damage during subretinal injections in pigs. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 59 (9), 5918-5918 (2018).
  34. Yang, K., et al. Robot-assisted subretinal injection system: development and preliminary verification. BMC Ophthalmology. 22 (1), 1-10 (2022).
  35. Olufsen, M. E., et al. Controlled Subretinal Injection Pressure Prevents Damage in Pigs. Ophthalmologica. Journal international d’ophtalmologie. International journal of ophthalmology. Zeitschrift fur Augenheilkunde. 245 (3), 285-293 (2022).
  36. Tay, H. G., et al. Photoreceptor laminin drives differentiation of human pluripotent stem cells to photoreceptor progenitors that partially restore retina function. Molecular therapy the journal of the American Society of Gene Therapy. 31 (3), 825-846 (2023).
  37. Petrus-Reurer, S., et al. Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell Derived-retinal Pigment Epithelial Cells into a Large-eyed Model of Geographic Atrophy. Journal of visualized experiments: JoVE. (131), e56702(2018).
  38. Petrus-Reurer, S., et al. Integration of subretinal suspension transplants of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in a large-eyed model of geographic atrophy. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 58 (2), 1314-1322 (2017).
  39. Babu, V. S., et al. Depleted Hexokinase1 and lack of AMPKα activation favor OXPHOS-dependent energetics in Retinoblastoma tumors. Translational research the journal of laboratory and clinical medicine. (23), 00108-00111 (2023).
  40. Plaza Reyes, A., et al. Xeno-Free and Defined Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells Functionally Integrate in a Large-Eyed Preclinical Model. Stem cell reports. 6 (1), 9-17 (2016).
  41. Takahashi, K., et al. The influence of subretinal injection pressure on the microstructure of the monkey retina. PLoS ONE. 13 (12), e0209996(2018).
  42. Tan, G. S. W., et al. Hints for Gentle Submacular Injection in Non-Human Primates Based on Intraoperative OCT Guidance. Translational Vision Science & Technology. 10 (1), 10-10 (2021).
  43. Yiu, G., et al. Suprachoroidal and Subretinal Injections of AAV Using Transscleral Microneedles for Retinal Gene Delivery in Nonhuman Primates. Molecular therapy. Methods & clinical development. 16, 179-191 (2020).
  44. Mühlfriedel, R., Michalakis, S., Garrido, M. G., Biel, M., Seeliger, M. W. Optimized Technique for Subretinal Injections in Mice. Methods in Molecular Biology. 935, 343-349 (2012).
  45. Huang, P., et al. Subretinal injection in mice to study retinal physiology and disease. Nature Protocols. 17 (6), 1468-1485 (2022).
  46. Huang, P., et al. The Learning Curve of Murine Subretinal Injection Among Clinically Trained Ophthalmic Surgeons. Translational Vision Science & Technology. 11 (3), 13(2022).
  47. Qi, Y., et al. Trans-Corneal Subretinal Injection in Mice and Its Effect on the Function and Morphology of the Retina. PLOS ONE. 10 (8), e0136523(2015).
  48. Irigoyen, C., et al. Subretinal Injection Techniques for Retinal Disease: A Review. Journal of Clinical Medicine. 11 (16), 4717(2022).
  49. Parikh, S., et al. An Alternative and Validated Injection Method for Accessing the Subretinal Space via a Transcleral Posterior Approach. Journal of visualized experiments: JoVE. (118), e54808(2016).
  50. Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: Administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Iniekcja podsiatk wkowaludzkie embrionalne kom rki macierzystedegeneracja siatk wkizapalenie siatk wki pigmentowemacierz lamininytransplantacja kom rekoptyczna koherentna tomografiachirurgia oka myszyywotno kom rek

Powiązane artykuły