Szczurzy model łagodnego urazu urazowego z zamkniętą głową i jego walidacja

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy model szczura z zamkniętą głową z łagodnym urazowym uszkodzeniem mózgu (mTBI) i jego walidację, wykazując niezwykłe podobieństwo do ludzkiego mTBI pod względem objawów behawioralnych podczas ostrych i podostrych etapów.

Streszczenie

Modele zwierzęce są kluczowe dla pogłębienia naszej wiedzy na temat łagodnego urazowego uszkodzenia mózgu (mTBI) i kierowania badaniami klinicznymi. Aby uzyskać znaczące informacje, niezbędne jest opracowanie stabilnego i powtarzalnego modelu zwierzęcego. W niniejszym badaniu przedstawiono szczegółowy opis modelu mTBI z zamkniętą głową oraz reprezentatywną metodę walidacji z wykorzystaniem szczurów Sprague-Dawley w celu weryfikacji efektu modelowania. Model polega na upuszczeniu 550 g masy z wysokości 100 cm bezpośrednio na głowę szczura na zniszczalną powierzchnię, a następnie obróceniu o 180 stopni. Aby ocenić uraz, szczury przeszły serię ocen neurobehawioralnych 10 minut po urazie, w tym czas utraty przytomności, czas pierwszego zachowania poszukiwawczego, zdolność ucieczki i test zdolności równoważenia wiązki. W ostrym i podostrym etapie po urazie przeprowadzono testy behawioralne w celu oceny zdolności koordynacji ruchowej (zadanie Beam), lęku (test Open Field) oraz zdolności uczenia się i zapamiętywania (test Morris Water Maze). Model mTBI z zamkniętą głowicą zapewnił spójną reakcję na uraz przy minimalnej śmiertelności i odtworzył rzeczywiste sytuacje. Metoda walidacji skutecznie zweryfikowała opracowanie modelu oraz zapewniła stabilność i spójność modelu.

Wprowadzenie

Łagodne urazowe uszkodzenie mózgu (mTBI), czyli wstrząśnienie mózgu, jest najbardziej rozpowszechnionym rodzajem urazu i może prowadzić do różnych krótkotrwałych i przewlekłych objawów¹. Objawy te mogą obejmować między innymi zawroty głowy, bóle głowy, depresję i anhedonię, co prowadzi do znacznego cierpienia u osób dotkniętych mTBI². Ponieważ większość mTBI jest spowodowana przez uraz spowodowany narzędziem³, konieczne staje się opracowanie modeli zwierzęcych, które dokładnie naśladują takie urazy. Modele te są niezbędne do lepszego zrozumienia urazu i jego mechanizmów leżących u jego podstaw, oferując kontrolowane środowisko o zmniejszonej zmienności i niejednorodności w porównaniu z badaniami na ludziach.

Wiele dobrze znanych modeli gryzoni zostało opracowanych dla urazowego uszkodzenia mózgu (TBI), w tym uszkodzenia płynnego uderzenia (FPI)⁴, kontrolowanego uderzenia korowego (CCI)5, uraz spowodowany spadkiem ciężaru⁶, urazowe uszkodzenie mózgu spowodowane wybuchem⁷, i inne. Jednak modele te koncentrują się przede wszystkim na replikowaniu scenariuszy TBI o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego. W przeciwieństwie do tego, modele eksperymentalne zaprojektowane specjalnie do symulacji mTBI spotkały się ze stosunkowo mniejszym zainteresowaniem i pozostają niedostatecznie zbadane⁸. W związku z tym istnieje pilna potrzeba stworzenia stabilnego i powtarzalnego modelu zwierzęcego, który dokładnie odzwierciedla mTBI. Taki model znacznie poszerzyłby naszą wiedzę na temat neurobiologicznych i behawioralnych konsekwencji związanych z mTBI.

Nie można odróżnić deficytów funkcjonalnych u szczurów mTBI od normalnych szczurów poprzez przypadkową obserwację po tym, jak efekty znieczulenia przeminęły. W związku z tym konieczne jest przeprowadzenie określonych testów. U ludzi do oceny pacjentów stosuje się szeroki zakres ocen klinicznych^9,10,11. Podobnie, ustanowienie udanego modelu w modelu szczurzym wymaga również użycia narzędzi szybkiej oceny w celu określenia jego trafności.

W tym badaniu prezentujemy model szczura mTBI z zamkniętą głową, umożliwiając badanie mTBI w sposób najbardziej zbliżony do stanu ludzkiego. Szczegółowy opis modelu i jego procedury walidacji zapewnia kompleksowe zrozumienie podejścia eksperymentalnego stosowanego w badaniu mTBI.

Protokół

Eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Centralnego Południa. Wszystkie badania zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami dobrostanu i etyki zwierząt laboratoryjnych.

1. Karmienie zwierząt i procedura znieczulenia

1. W grupie trzyma się 280-320 g samców szczurów Sprague-Dawley i utrzymuje je w cyklu 12 godzin/12 godzin światła/ciemności z dostępem do pożywienia i wody ad libitum. Wykonaj badanie po aklimatyzacji szczurów przez 6 dni.
2. Znieczulij szczura 3% izofluranem przy przepływie powietrza 0,6 l/min w pudełku indukcyjnym, aż przestanie reagować na szczypanie łapy lub ogona. Utrzymuj natężenie przepływu przez 30 s.
   UWAGA: Nie stosowano leków przeciwbólowych, ponieważ zakłócałyby one reakcję szczura w ocenach neurobehawioralnych.

2. Przygotowanie przedoperacyjne

1. Gąbkę o twardości 35D (waga 35 kg/m3 gąbki), o identycznej długości i szerokości, ale grubości 12 cm, należy umieścić w akrylowym pudełku (15 cm x 22 cm x 43 cm) bez górnej pokrywy.
2. Przyciąć folię aluminiową (o grubości 20 μm) i przymocować ją do akrylowego pudełka za pomocą taśmy klejącej, aby utworzyć zniszczalną powierzchnię zdolną do utrzymania ciężaru szczura. Dodatkowo zaznacz linię cięcia o długości około 10 cm, która ma być wyznaczonym miejscem do ułożenia głowy szczura.
3. Za pomocą żelaznego stojaka mocno przymocuj rurkę PVC na miejscu. Przygotuj perforowany obciążnik o wadze 550 gramów i średnicy 18 milimetrów. Przymocuj ciężarek do żyłki wędkarskiej na wysokości 1 metra wewnątrz rurki z polichlorku winylu lub PVC. i wyreguluj położenie rurki prowadzącej 3 centymetry nad folią aluminiową.
4. Przygotuj kask i poduszkę. Zrób kask za pomocą dysku ze stali nierdzewnej o średnicy 10 mm i grubości 3 mm. Przygotuj poduszkę z gąbki w kształcie klina, którą umieścisz pod głową szczura, upewniając się, że jest prostopadła do kierunku grawitacji.
   UWAGA: Schemat ideowy aparatu udarowego jest przedstawiony na rysunku Rysunek 1. Kask służy do identyfikacji miejsca uderzenia i poprawy rozkładu siły zewnętrznej. Poduszka służy do gwarantowania równomiernych i stabilnych uszkodzeń.

3. indukcja mTBI

1. Szybko połóż znieczulonego szczura na klatce piersiowej na folii aluminiowej.
   UWAGA: Do indukcji mTBI wymagane są dwa operatory - jeden do przygotowania, a drugi do weryfikacji.
2. Przygotowanie: Umieść poduszkę pod szczurem, upewniając się, że jego głowa jest równoległa do papieru foliowego. Dopasuj kask do uszu szczura i zabezpiecz go na miejscu.
3. Weryfikacja: Sprawdź, czy rura PVC jest umieszczona bezpośrednio nad kaskiem. Gdy obaj operatorzy potwierdzą poprawną konfigurację, przejdź do następnego kroku.
4. Indukcja obrotu głowy: Zwolnij ciężar, pozwalając mu opaść i uderz w głowę szczura, wywołując upadek na gąbkę i obrót o 180°.
5. Umieść szczura na plecach w czystej klatce.

4. Indukcja pozorna

1. Traktuj szczura w taki sam sposób, jak w poprzednim opisie indukcji mTBI, ale nie narażaj go na uderzenie głową.

5. Procedura walidacji: Ostre oceny neurobehawioralne

UWAGA: Poniższe oceny zostały zmodyfikowane na podstawie Neurological Severity Scores⁹ oraz protokołu Flierl et al.¹⁰. Wszystkie te oceny przeprowadzono 10 minut po tym, jak szczur odzyskał odruch prostowania.

1. Czas utraty przytomności: Zapisz czas od momentu znieczulenia szczura do momentu odzyskania odruchu prostego.
   UWAGA: Odruch prostowania to proces, w którym szczur przewraca się po umieszczeniu na plecach. Utrata odruchu prostowania ma być uważana za humanitarny punkt końcowy, a zwierzę musi zostać poddane eutanazji zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
2. Czas pierwszego zachowania poszukiwawczego: Zapisz czas od momentu, gdy szczur jest znieczulony, do momentu, gdy po raz pierwszy wykazuje zachowanie poszukiwawcze.
   UWAGA: Poszukiwanie zachowań jest oznaką zainteresowania otoczeniem, reakcją fizjologiczną.
3. Możliwość ucieczki
   1. Umieść szczura w środku okrągłego aparatu (0,5 m średnicy i 0,3 m wysokości) z wyjściem (12,5 cm długości i 9 cm szerokości).
   2. Zapisz czas potrzebny szczurowi na opuszczenie kręgu.
      UWAGA: Jeśli szczur nie opuści kręgu w ciągu 180 s, zapisz czas jako 180 s.
4. Test zdolności wyważenia wiązki
   1. Umieść szczura na belce o szerokości 3 cm, 2 cm i 1.5 cm na 1 minutę.
   2. Jeśli szczur utrzymuje równowagę przy stabilnej postawie na belce, oceń go na 0.
   3. Jeśli szczur chwyci bok belki, daj wynik 1. Jeśli szczur przytuli się do belki, a jedna kończyna z niej spadnie, oceń ją jako 2.
   4. Jeśli szczur przytuli się do belki, a dwie kończyny spadną z niej lub obrócą się na niej (>60 s), oceń ją jako 3.
   5. Jeśli szczur próbuje utrzymać równowagę na belce, ale spada (> 40 s), oceń go jako 4.
   6. Jeśli szczur próbuje utrzymać równowagę na belce, ale spadnie (>20 s), oceń go na 5.
   7. Jeśli szczur nie spróbuje utrzymać równowagi lub zawiesić się na belce i spadnie w ciągu 20 s, oceń go jako 6,
      UWAGA: Test wyważenia belki nie wymaga próby wstępnej.

6. Procedura walidacji: Ocena neurobehawioralna

UWAGA: Przed eksperymentami behawioralnymi, szczury były traktowane przez 2 minuty dziennie przez 3 kolejne dni, aby zminimalizować stres i zakłócenia nowości. Wszystkie eksperymenty behawioralne przeprowadzono poprzez umieszczenie zwierząt w środowisku testowym na 60 minut przed rozpoczęciem eksperymentu.

1. Zdolność koordynacji ruchowej (zadanie wiązki)
   1. Konfiguracja eksperymentalna
      1. Umieść szczury na jednym końcu równoważni (1,5 m długości i 75 cm nad podłogą). Umieść skrzynkę ewakuacyjną (pochyłą klatkę domową z pościelą) na drugim końcu.
      2. Umieść piankową wyściółkę poniżej belki, aby zmniejszyć potencjalne ryzyko obrażeń szczurów w przypadku upadków podczas badania.
      3. Włącz kamerę wideo.
      4. Zaplanuj dni testów w określonych punktach czasowych po urazie lub po leczeniu pozorowanym (np. dzień 1, dzień 3 i dzień 7).
   2. Faza szkoleniowa (2 dni)
      1. Naucz szczury, aby przekroczyły belkę o szerokości 4 cm 3 razy z rzędu, a następnie wykonaj dwie próby na belce o szerokości 2 cm.
      2. Podczas treningu delikatnie prowadź szczury po belce, aż będą mogły je łatwo przekroczyć bez przeszkód.
   3. Eksperyment z równoważnią
      1. Umieść szczury na belce o szerokości 2 cm na 5 kolejnych prób.
      2. Zapisuj początek i koniec każdej próby, gdy nos szczura przecina odpowiednio linię startu i mety.
      3. Po zakończeniu eksperymentu szczury należy umieścić w ich klatkach.
   4. Badanie podstawowe
      1. Przeprowadź eksperyment z równoważnią przed urazem lub leczeniem.
      2. Oblicz średnie wartości z tych 5 kolejnych prób, aby ustalić punkt odniesienia dla każdego szczura.
   5. analiza danych
      1. Przeanalizuj czas do przejścia przez belkę i całkowitą liczbę poślizgnięć tylnej części stopy za pomocą analizy wideo przeprowadzonej przez badaczy ślepych na warunki eksperymentalne.
2. Lęk (test w otwartym polu)
   1. Konfiguracja eksperymentalna
      1. Przygotuj arenę na otwartym polu, upewniając się, że jest czysta i wolna od wszelkich wcześniejszych sygnałów zapachowych. Podziel arenę na trzy strefy: centralną strefę wewnętrzną (33 cm x 33 cm), strefę środkową (66 cm x 66 cm) i strefę zewnętrzną.
   2. Faza testowania
      1. Umieść szczura na środku areny na otwartym polu i uruchom stoper. Pozwól szczurowi swobodnie eksplorować arenę przez 5 minut. Po 5 minutach ostrożnie i delikatnie wróć do domowej klatki.
   3. Gromadzenie danych
      1. Zmierz całkowitą odległość przebytą przez szczura podczas 5-minutowego okresu eksploracji. Określ czas, jaki szczur spędza w centralnej, wewnętrznej, środkowej i zewnętrznej strefie.
   4. analiza danych
      1. Użyj całkowitego przebytego dystansu jako miary ogólnego zachowania eksploracyjnego i zdolności lokomotorycznych. Oblicz czas spędzony w centralnej strefie wewnętrznej jako wskaźnik reakcji podobnych do lęku.
3. Zdolności uczenia się i zapamiętywania (test labiryntu wodnego Morrisa)
   1. Upewnij się, że urządzenie do labiryntu wodnego jest w odpowiednim stanie. Farbuj wodę na czarno i umieść wskazówki w czterech głównych kierunkach. Ustaw platformę 2.5 cm poniżej powierzchni wody.
   2. Skonfiguruj system monitorowania, aby rejestrować i obserwować zachowanie szczurów.
   3. Dzień na szlaku
      1. Szybko umieść szczura w wodnym labiryncie. Jeśli szczur nie dotrze do platformy w ciągu 2 minut, delikatnie poprowadź go za pomocą drewnianego patyczka.
      2. Pozwól szczurowi zapoznać się z otoczeniem labiryntu, stojąc na platformie przez 20 sekund, a następnie usuń go. Gdy szczur znajdzie się na platformie, pozwól mu pozostać przez 20 sekund, a następnie usuń go.
   4. Codzienne powtarzanie
      1. Powtórz procedurę dnia treningowego, umieszczając szczura w wodzie z różnych kwadrantów. Powtórz krok 6.3.3. Kontynuuj trening przez 5 kolejnych dni.
   5. Dzień testu sondy: 6 dnia zdejmij platformę i umieść szczura w tej samej ćwiartce na 2 minuty.
   6. Obserwacja i rejestracja: Wykorzystaj system monitorowania do monitorowania zachowania szczura w dniach prób i testów sondy.
   7. Czyszczenie: Po wyjęciu szczura z wodnego labiryntu należy go dokładnie wysuszyć ręcznikiem.

Wyniki

Aparatura wykorzystana w niniejszej pracy była zmodyfikowaną wersją modelu Kane'a oraz pediatrycznego modelu Richelle Mychasiuk^11,12. W badaniu szczury linii SD przypisano do grup pozorowanych (sham) oraz mTBI. Aby wykazać powtarzalność tego modelu, przeprowadzono trzy niezależne powtórzenia wraz z ostrą oceną neurobehawioralną, przy czym w każdym eksperymencie uczestniczyło od 8 do 12 szczurów. W badaniu wykorzystano ponad 30 szc...

Dyskusja

Model ten z powodzeniem symuluje mTBI z zamkniętą głową bez konieczności nacinania skóry głowy lub otwierania czaszki, zapewniając dokładniejsze odwzorowanie scenariusza uderzenia obserwowanego w przypadkach ludzi. Unikanie nacięć skóry głowy pomaga zapobiegać reakcjom zapalnym, które mogą nie być zgodne z rzeczywistą sytuacją. W porównaniu z modelem pediatrycznym¹² Richelle Mychasiuk, model zastosowany w tym badaniu jest specjalnie dostosowany do dorosłych szczurów o wadze od 280 do 320 g, co poz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pudełko akrylowe	In-house	N/A	15 cm x 22 cm x 43 cm
Anestezjolog	RWD Life Science Co.	Myszy R540 i Kask do znieczulenia szczurów i zwierząt
			Średnica 150 cm, wysokość 50 cm, średnica platformy 35 cm
Otwarte pole	RWD Life Science Co.	63007	Szerokość100 cm, wysokość 40 cm
Panlab SMART V3.0	RWD Life Science Co.	SMART v3.0
Obciążnik perforowany	Nie	dotyczy	Waga 550 g i średnica 18 mm
Poduszka	Własna	dotyczy	Gąbka w kształcie klina do umieszczenia pod głową szczura

Nie dotyczy Dysk ze stali nierdzewnej o średnicy 10 mm i grubości 3 mm Labirynt wodny Morris RWD Life Science Co. nie