Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

Wzmacnianie sygnału tyramyny (TSA), które ma ponad 20-letnią historię, to klasa technik testowych, które wykorzystują peroksydazę chrzanową (HRP) do znakowania in situ o dużej gęstości docelowych antygenów i jest szeroko stosowana w testach immunoenzymatycznych (ELISA), hybrydyzacji in situ (ISH), immunohistochemii (IHC) i innych technikach wykrywania antygenów biologicznych, Znaczna poprawa czułości wykrywanego sygnału1. Barwienie polichromatyczne opalizowe oparte na technologii TSA zostało niedawno opracowane i szeroko stosowane w kilku badaniach^2,3,4,5. Tradycyjne barwienie immunofluorescencyjne (IF) zapewnia naukowcom łatwe narzędzie do wykrywania i porównywania rozmieszczenia białek w komórkach i tkankach różnych organizmów modelowych. Opiera się na wiązaniu specyficznym dla przeciwciała/antygenu i obejmuje podejścia bezpośrednie i pośrednie⁶. Bezpośrednie barwienie immunologiczne polega na zastosowaniu sprzężonego z fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko badanemu antygenowi, co umożliwia bezpośrednie wykrywanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Podejście do pośredniego barwienia immunologicznego polega na zastosowaniu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem przeciwko niesprzężonemu przeciwciału pierwszorzędowemu^6,7.

Tradycyjne, jednoznacznikowe, immunofluorescencyjne metody barwienia mogą zabarwić tylko jeden, dwa, a w niektórych przypadkach trzy antygeny w tkankach, co jest głównym ograniczeniem w wydobywaniu bogatych informacji zawartych w skrawkach tkanek. Interpretacja wyników ilościowych często zależy od obserwacji wizualnej i dokładnej kwantyfikacji za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ. Istnieją ograniczenia techniczne, takie jak ograniczenie gatunków przeciwciał, słabe sygnały znaczników fluorescencyjnych i nakładanie się kolorów barwników fluorescencyjnych (Tabela 1). Technika Opal multiplex IHC (mIHC) opiera się na wyprowadzeniu TSA, które umożliwia barwienie multipleksowe i znakowanie różnicowe więcej niż 7-9 antygenów na tym samym odcinku tkanki, bez ograniczeń co do pochodzenia przeciwciała pierwszorzędowego, ale wymaga wysokiej swoistości odpowiedniego przeciwciała przeciwko antygenowi. Procedura barwienia jest podobna do normalnego barwienia immunofluorescencyjnego, z wyjątkiem dwóch różnic: każda runda barwienia obejmuje użycie tylko jednego przeciwciała i dodaje się etap elucji przeciwciał. Przeciwciała związane z antygenem wiązaniami niekowalencyjnymi można usunąć przez elucję mikrofalową, ale sygnał fluorescencyjny TSA związany z powierzchnią antygenu wiązaniami kowalencyjnymi jest zachowywany.

Aktywowane cząsteczki tyraminy (T) znakowane barwnikiem są wysoce wzbogacone w antygen docelowy, co pozwala na skuteczne wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego. Pozwala to na bezpośrednie znakowanie antygenu bez ingerencji przeciwciał, a następnie można uzyskać wielokolorowe znakowanie po wielu cyklach barwienia^8,9,10 (Rysunek 1). Chociaż technologia ta zapewnia wiarygodne i dokładne obrazy do badania chorób, stworzenie użytecznej strategii barwienia metodą immunohistochemii fluorescencji multipleksowej (mfIHC) może być czasochłonne i wymagające ze względu na potrzebę szeroko zakrojonej optymalizacji i projektowania. W związku z tym ten protokół panelu multipleksowego został zoptymalizowany w automatycznym barwieniu IHC z krótszym czasem barwienia niż w przypadku protokołu ręcznego. Podejście to może być bezpośrednio zastosowane i zaadaptowane przez każdego badacza do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek ludzkich utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)¹¹. Co więcej, metody przygotowania preparatów, optymalizacji przeciwciał i projektowania multipleksów będą pomocne w uzyskiwaniu solidnych obrazów, które reprezentują dokładne interakcje komórkowe in situ oraz w skróceniu okresu optymalizacji dla analizy ręcznej¹².

mfIHC obejmuje głównie akwizycję obrazów i analizę danych. Jeśli chodzi o akwizycję obrazu, wielobarwne, złożone próbki barwione muszą być wykrywane za pomocą profesjonalnego sprzętu do obrazowania spektralnego, aby zidentyfikować różne mieszane sygnały kolorystyczne i uzyskać obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu bez zakłóceń spowodowanych autofluorescencją tkanek. Obecny sprzęt do obrazowania spektralnego obejmuje głównie spektralne mikroskopy konfokalne i wielospektralne systemy obrazowania tkanek. Wielospektralny system obrazowania tkanek jest profesjonalnym systemem obrazowania przeznaczonym do analizy ilościowej skrawków tkanek, a jego najważniejszą cechą jest pozyskiwanie informacji spektralnych obrazu, które dostarczają zarówno informacji o strukturze morfologicznej, jak i mapowaniu optycznym próbek tkanek biologicznych^13,14. Każdy piksel na obrazie widmowym zawiera pełną krzywą spektralną, a każdy barwnik (w tym autofluorescencja) ma odpowiadające mu widmo charakterystyczne, co umożliwia pełne zarejestrowanie i dokładną identyfikację mieszanych i nakładających się na siebie sygnałów wieloetykietowych.

Pod względem analizy danych, próbki znakowane wielokolorowo są niezwykle skomplikowane ze względu na strukturę morfologiczną i komórki składowe próbek tkanek. Zwykłe oprogramowanie nie jest w stanie automatycznie zidentyfikować różnych typów tkanek. W związku z tym inteligentne oprogramowanie do ilościowej analizy tkanek jest wykorzystywane do ilościowej analizy ekspresji antygenu w określonych regionach^15,16,17,18.

Przede wszystkim, wieloznakowe barwienie immunofluorescencyjne połączone z technologią obrazowania wielospektralnego i ilościowej analizy patologicznej ma zalety dużej liczby celów wykrywania, skutecznego barwienia i dokładnej analizy, a zatem może znacznie poprawić dokładność analizy histomorfologicznej, ujawnić przestrzenne relacje między białkami z rozdzielczością na poziomie komórkowym oraz pomóc w wydobyciu bogatszych i bardziej wiarygodnych informacji z sekcji tkanek samples¹⁹ (Tabela 1).

Protokół jest zatwierdzony przez wytyczne Komitetu Etyki Szpitala Zachodniochińskiego, Uniwersytet Syczuański, Chiny. Próbki tkanki raka płuc zostały pobrane podczas operacji w Centrum Raka Płuc w Szpitalu Zachodniochińskim i uzyskano świadomą zgodę od każdego pacjenta.

1. Przygotowanie sekcji tkanek

1. Przygotowanie FFPE
   1. Zanurz tkanki kliniczne w obojętnym roztworze formaliny na dłużej niż 72 godziny.
   2. Zakończ proces odwadniania tkanek za pomocą ksylenu i stopniowanych roztworów alkoholowych²⁰.
   3. Ręczne zatapianie parafiny i cięcie tkanek przy grubości przekroju 4 μm. Użyj szkiełek mikroskopowych adhezyjnych, aby upewnić się, że plastry tkanki nie wypadną.
   4. Piecz szkiełka w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 2 godziny, aby chusteczka i szkiełka były suche. Przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze pokojowej.
2. Wstępne leczenie przekroju tkanki
   1. Preparaty tkankowe należy wstępnie poddać obróbce w piecu w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie kolejno zanurzyć w roztworach ksylenu przez 2 x 15 min, bezwodnych roztworach etanolu przez 2 x 15 min, 90% roztworze etanolu przez 10 minut, 85% roztworze etanolu przez 10 minut, 80% roztworze etanolu przez 10 minut i 75% roztworze etanolu przez 10 minut, następnie umyć szkiełka wysterylizowaną wodą przez 3 x 1 min.
      UWAGA: Ta eksperymentalna technika może być stosowana tylko do tkanki FFPE, a nie do tkanki mrożonej lub świeżej, ponieważ proces naprawy antygenu w wielu wysokich temperaturach powoduje odpadanie tkanki ze szkiełka.

2. Optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych

UWAGA: Konwencjonalne eksperymenty IHC zostały wykorzystane do określenia warunków inkubacji dla poszczególnych przeciwciał, głównie w tym stężenia przeciwciał i warunków naprawy antygenu. Zapoznaj się z warunkami w instrukcji obsługi przeciwciał.

1. Należy stosować stężenie przeciwciał nieco wyższe niż zalecany zakres stężeń i wartości pośrednie.
2. Zoptymalizuj procedury buforowania odzyskiwania antygenu PH6 i PH9 zgodnie z lokalizacją ekspresji białka. Użyj PH9 dla białek ulegających ekspresji w jądrze i użyj rutynowej (PH6 lub PH9) dla innych białek.

3. metoda barwienia mIHC

UWAGA: Barwienie Opal mIHC jest jedną z dostępnych metod mIHC. W tym eksperymentalnym protokole 5-kolorowym, ponieważ każda próbka tkanki musi być wybarwiona czterema przeciwciałami, cztery inkubacje przeciwciał pierwotnych, inkubacje przeciwciał wtórnych i inkubacje chromogenne wzmacniające sygnał TSA, a także pięć uzupełnień antygenu. Na koniec wykonuje się barwienie 4'6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) i uszczelnianie antyfluorescencyjnym środkiem pękającym.

1. Przygotowanie głównego odczynnika
   UWAGA: Określ ilość odczynnika, który należy dodać, w zależności od wielkości szkiełek tkankowych. Użyj wystarczającej objętości, aby całkowicie pokryć wycinek tkanki (zwykle 50-150 μl na szkiełko). Roztwory robocze wymagane do eksperymentu przygotowuje się w następujący sposób:
   1. Roztwór roboczy buforu do płukania: rozcieńczyć 20x bufor do płukania w stosunku 1:20 wodą podwójnie destylowaną i przechowywać w temperaturze pokojowej.
   2. Roztwór roboczy buforu PH6: Rozcieńczyć 100x bufor PH6 w stosunku 1:100 wodą podwójnie destylowaną. Przygotuj przed użyciem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
   3. Roztwór roboczy buforu PH9: Rozcieńczyć 50x bufor PH9 w stosunku 1:50 wodą podwójnie destylowaną. Przygotuj przed użyciem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
   4. Polimer HRP: Przygotować ten gotowy do użycia roztwór tylko dla pierwszorzędowych przeciwciał pochodzenia króliczego i mysiego.
   5. Roztwór roboczy fluoroforu: Rozpuść każdy proszek fluoroforowy (z wyjątkiem fluoroforu 780) w 75 μl DMSO. Przed każdym zabiegiem rozcieńczyć fluorofor w 1x rozcieńczalniku do amplifikacji w stosunku 1:100. Wyrzucić wszelkie niewykorzystane części roztworu roboczego fluoroforu.
   6. Roztwór roboczy Fluorophore 780: Rozpuść TSA-DIG w 75 μl DMSO, a proszek fluoroforowy 780 w 300 μl podwójnie destylowanej wody. Przed zabiegiem rozcieńczyć TSA-DIG w 1x rozcieńczalniku do amplifikacji w stosunku 1:100, a fluorofor 780 rozcieńczalnik Ab w stosunku 1:25.
   7. Roztwór roboczy DAPI: Rozcieńczyć roztwór DAPI w stosunku 1:50 wodą podwójnie destylowaną lub PBS. Przygotować przed użyciem i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 48 godzin
      NUTA. Szkiełka należy myć wyłącznie wodą podwójnie destylowaną i świeżo przygotowanym roztworem roboczym buforu do płukania podczas tego wieloznakowego eksperymentu barwienia fluorescencyjnego. Skrawki tkanek nie mogą mieć kontaktu z wodą z kranu; Zanieczyszczenia w wodzie z kranu mogą przylegać do skrawków tkanek i powodować autofluorescencję. Trzymaj próbki z dala od światła przez cały czas trwania eksperymentu.
2. Pobieranie antygenu
   1. Umieść szkiełka w pudełku do barwienia i naprawy i napełnij je roztworem roboczym buforowym PH6 lub PH9, przykryj pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 x 8 minut przy 100% mocy.
      UWAGA: Dodaj podwójnie destylowaną wodę do pudełka naprawczego podczas procesu podgrzewania, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu, które może spowodować wysuszenie plastrów.
   2. Przed kontynuowaniem (30-60 min) pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej.
   3. Umyj szkiełka 3 x 2 minuty wodą podwójnie destylowaną. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć sekcję tkanki na szkiełku.
3. Blokowanie
   1. Zanurzyć skrawki tkanek w buforze do mycia, zalać roztworem blokującym i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
   1. Usunąć roztwór blokujący ze szkiełek i pokryć skrawki tkanki pierwotnym roztworem roboczym przeciwciała. Szkiełka należy inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub przez noc w temperaturze 4 °C w lodówce.
      UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka wyschły.
5. Wprowadzenie polimeru HRP
   1. Myć szkiełka w roztworze roboczym buforu do przemywania przez 3 x 2 min. Dodać polimer HRP bezpośrednio kroplami do skrawków tkanek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W przypadku szkiełek przechowywanych w lodówce należy je przechowywać w temperaturze pokojowej przez około 30 minut przed umyciem w celu usunięcia przeciwciała pierwszorzędowego.
6. Generowanie wzmocnienia sygnału tyraminy (TSA)
   1. Przemyć szkiełko roztworem roboczym buforu do przemywania przez 3 x 2 min, dodać roztwór roboczy fluoroforu bezpośrednio kroplami do skrawków tkanek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełko roztworem roboczym buforu myjącego przez 3 x 2 min.
7. Procedura specjalna dla fluoroforu 780
   UWAGA: Fluorofor 780 jest słaby i rutynowo umieszczany na końcu schematu dopasowywania kolorów całego eksperymentu. Fluorofor 780 nie jest zwykle stosowany w tym protokole eksperymentalnym, ale ze względu na jego specyfikę, jego etapy eksperymentalne są wymienione.
   1. Wprowadzenie TSA-DIG
      1. Przemyć szkiełko roztworem roboczym buforu do przemywania przez 3 x 2 min, stopniowo dodawać roztwór roboczy TSA-Drg do skrawków tkanek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   2. Obróbka mikrofalowa
      1. Myć szkiełka roztworem roboczym buforu do płukania przez 3 x 2 min.
      2. Umieść szkiełka w pudełku do barwienia i naprawy, napełnij je roztworem naprawczym, przykryj pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 x 8 minut przy 100% mocy. Przed kontynuowaniem (30-60 min) pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej.
      3. Myj szkiełka przez 3 x 2 minuty wodą podwójnie destylowaną.
   3. Generowanie sygnału Fluorophore 780
      1. Zanurzyć skrawki w buforze do mycia, zalać roztworem roboczym fluoroforu 780 i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Umyć szkiełka roztworem roboczym buforu do płukania przez 3 x 2 min.
         UWAGA: NIE WOLNO wykonywać obróbki mikrofalowej po tym kroku.
   4. Użyj fluorophore 780 jako ostatniego kroku całego przepływu pracy, a następnie wybarwić jądra bezpośrednio roztworem roboczym DAPI.
      UWAGA: Pomiń krok 3.7, jeśli nie używasz fluoroforu 780.
8. Obróbka mikrofalowa
   UWAGA: Ten krok mikrofalowy usuwa pierwszorzędowo-drugorzędowy kompleks HRP i ponownie eksponuje antygeny, umożliwiając wprowadzenie następnego przeciwciała pierwszorzędowego.
   1. Umieść szkiełka w pudełku do barwienia i naprawy, napełnij je roztworem roboczym buforowym PH6 lub PH9, przykryj pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 x 8 minut przy 100% mocy.
   2. Przed kontynuowaniem (30-60 min) pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 3 x 1 min wodą podwójnie destylowaną.
   3. Zanurz szkiełka w roztworze roboczym buforu płuczącego na 2 minuty. Wykonaj następną inkubację przeciwciał.
9. Następna inkubacja przeciwciał
   1. Powtórz kroki 3.2-3.8 (z wyjątkiem kroku 3.7).
10. Barwienie jądra komórkowego i uszczelnianie tkanek
    1. Przykryj skrawki tkanki roztworem roboczym DAPI i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka przez 3 x 2 minuty wodą podwójnie destylowaną.
    2. Usuń kropelki wody ze szkiełek, dodaj 10-20 μl środka antyfluorescencyjnego do każdego szkiełka i uszczelnij szkiełka nakrywkowe mikroskopu.
    3. Gotowe szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez ponad 1 miesiąc.
       UWAGA: Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

4. Ustaw kontrolę negatywną

1. Przetwarzaj szkiełka kontroli ujemnej, takie jak szkiełka zawierające tkanki, ale bez dodawania odczynników, takich jak przeciwciała pierwszorzędowe, przeciwciała drugorzędowe, odczynniki TSA i DAPI, które są używane do usuwania autofluorescencji tkanek podczas skanowania filmu.

5. W pełni automatyczne skanowanie preparatów tkankowych

UWAGA: Sprzęt używany do obrazowania spektralnego to w pełni zautomatyzowany wielospektralny analizator kwantyfikacji tkanek, a obrazowanie i wizualizacja analizy 5-kolorowych preparatów może być wykonywana przy użyciu systemu referencyjnego (patrz Tabela materiałów). System wykorzystuje obrazowanie wielospektralne do ilościowego rozmieszania wielu fluoroforów i autofluorescencji tkankowej.

1. Ręcznie ustaw czas ekspozycji i program skanowania dla każdego kanału fluorescencji i upewnij się, że przyrząd zakończył w pełni automatyczną ekspozycję i skanowanie szkiełek tkankowych.
   UWAGA: Powierzchnia zjeżdżalni musi być czysta i wolna od filmu wodnego. Uważaj na ilość uszczelniacza: zbyt duża ilość spowoduje, że szkiełko nakrywkowe ześlizgnie się i instrument zgłosi błąd.

6. Analiza fluorescencji

1. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie (patrz Spis materiałów), przeciągnij plik wielokolorowego obrazu fluorescencji uzyskany z oryginalnego skanu do oprogramowania i ustaw typ obrazu na fluorescencję.
2. Kliknij przycisk Jasność i kontrast i sprawdź kanały na panelu. Kliknij na zewnątrz, a następnie na kanale, aby wybrać interesujący Cię kanał fluorescencyjny. Przeciągnij wyświetlacz Min i Max display, aby dostosować jasność i kontrast każdego kanału.
3. Po analizie określ widok, który ma zostać zapisany, kliknij Pokaż przegląd slajdu i Pokaż położenie kursora, aby usunąć te dwie zawartości, zachowaj pasek skali i kliknij Plik | Eksport migawki | Bieżąca zawartość przeglądarki do wyeksportowania pliku png.
   UWAGA: Każdy kanał fluorescencyjny i scalona figura muszą zostać wyeksportowane do przyszłej analizy.
4. Do dalszej analizy dodatniej wartości komórek docelowych należy użyć oprogramowania do identyfikacji i segmentacji komórek²¹ (patrz Tabela materiałów).

Zoptymalizowaliśmy schemat dopasowania pierwszorzędowego przeciwciała CD8 i fluoroforów. Oba zestawy wyników fluorescencji odpowiadały dokładnie tym samym warunkom inkubacji przeciwciał w grupie eksperymentalnej, z wyjątkiem zmiany w fluoroforze dopasowanym do przeciwciała. Jak pokazano w Rysunek 2, zaobserwowano istotną różnicę w dopasowaniu kanałów limfocytów T CD8 + z fluoroforem 480 i fluoroforem 690. Kanał z fluoroforem 690 wykazuje niezwykle silne tło fluorescencyjne - duży obszar czerwonej nieregularnej fluorescencji w żółtym okręgu pokazuje kolor, co powoduje dużą interferencję w analizie lokalizacji limfocytów T CD8 + (Rysunek 2C, D). Jednak kanał z fluoroforem 480 wykazuje bardzo specyficzną dodatniość błony komórkowej CD8 i brak tła fluorescencyjnego. Tak więc żółte kółka pokazują bardzo wyraźną dodatnią błonę komórkową (Rysunek 2A), co w pełni ilustruje znaczenie dopasowania przeciwciał i kanałów fluorescencyjnych w tym protokole.

Zbadano rozmieszczenie makrofagów i cytotoksycznych limfocytów T w tkankach niedrobnokomórkowego raka płaskonabłonkowego płuc, a także zweryfikowano ekspresję charakterystycznego białka HMGCS1 w komórkach nowotworowych i odpornościowych. Jak pokazano w Rysunek 3, obrazy pochodzą z QuPath 0.3.2. Panel mIHC składał się z fluoroforów 480, 520, 620, 690 i DAPI, a odpowiadającymi im markerami przeciwciał były CK5/6, marker komórek raka płaskonabłonkowego płuc; CD8, marker limfocytów T; CD68, marker makrofagów; i HMGCS1, który jest specyficzny dla komórek nowotworowych osocOCZA. Makrofagi i limfocyty T CD8 + wykazywały silny naciek i były rozmieszczone wokół i wewnątrz ognisk raka płaskonabłonkowego, podczas gdy HMGCS1 ulegał szerokiej ekspresji w osoczu komórek raka płaskonabłonkowego, wykazując silną dodatniość komórek nowotworowych.

Rysunek 1: Przebieg procesu barwienia immunohistochemicznego multipleksu dla tkanki FFPE. Skrót: FFPE = utrwalony w formalinie i zatopiony w parafinie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Optymalizacja protokołów dopasowywania dla CD8 i fluoroforów. Stwierdzono istotną różnicę w dopasowaniu kanałów limfocytów T CD8 + z fluoroforem 480 i fluoroforem 690. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Zwielokrotnione barwienie immunohistochemiczne w raku płaskonabłonkowym płuca. Rozmieszczenie makrofagów i cytotoksycznych limfocytów T w tkankach niedrobnokomórkowego raka płaskonabłonkowego płuc oraz ekspresja charakterystycznego białka HMGCS1 w komórkach nowotworowych i komórkach odpornościowych. CK5/6 jest markerem komórek raka płaskonabłonkowego płuc; CD8 jest markerem limfocytów T; CD68 jest markerem makrofagów; a HMGCS1 jest specyficzny dla komórek plazmotycznych komórek nowotworowych. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Porównanie technologii immunofluorescencji Opal z wieloma znakami i tradycyjnej technologii immunofluorescencji.

Wszyscy autorzy deklarują, że nie występują konflikty interesów.