Artykuł metodologiczny

Multipleksowe barwienie immunohistochemiczne tkanki raka płuc zatopionej w parafinie

DOI:

10.3791/65850

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  , 
1Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Center of Precision Medicine, West China Hospital, Sichuan University, 2Institute of Clinical Pathology, West China Hospital, Sichuan University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten eksperymentalny protokół opisuje i optymalizuje metodę barwienia metodą immunohistochemii multipleksowej (IHC), głównie poprzez optymalizację warunków inkubacji przeciwciał jednokanałowych i dostosowanie ustawień przeciwciał i kanałów do rozwiązania problemów autofluorescencji i przesłuchu kanałowego w tkankach raka płuc pochodzenia klinicznego.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rak płuc jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności związanej z nowotworami złośliwymi na całym świecie, a złożone mikrośrodowisko guza jest uważane za główną przyczynę zgonów u pacjentów z rakiem płuc. Złożoność mikrośrodowiska guza wymaga skutecznych metod zrozumienia relacji między komórkami w tkankach nowotworowych. Technika immunohistochemii multipleksowej (mIHC) stała się kluczowym narzędziem do wnioskowania o związku między ekspresją białek przed i za szlakami sygnałowymi w tkankach nowotworowych oraz opracowywania diagnoz klinicznych i planów leczenia. mIHC to wieloznakowa metoda barwienia immunofluorescencyjnego oparta na technologii wzmacniania sygnału tyraminy (TSA), która może jednocześnie wykrywać wiele cząsteczek docelowych na tej samej próbce wycinka tkanki w celu uzyskania różnej analizy koekspresji i kolokalizacji białek. W tym protokole eksperymentalnym zatopione w parafinie skrawki tkanki płaskonabłonkowego płuca pochodzenia klinicznego poddano wielopoziomowemu barwieniu immunohistochemicznemu. Optymalizując protokół eksperymentalny, uzyskano multipleksowe barwienie immunohistochemiczne znakowanych komórek docelowych i białek, rozwiązując problem autofluorescencji i przesłuchów kanałowych w tkankach płucnych. Ponadto barwienie immunohistochemiczne multipleksowe jest szeroko stosowane w eksperymentalnej walidacji wysokoprzepustowego sekwencjonowania związanego z nowotworem, w tym sekwencjonowania pojedynczych komórek, proteomiki i sekwencjonowania przestrzeni tkankowej, zapewniając intuicyjne i wizualne wyniki walidacji patologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzmacnianie sygnału tyramyny (TSA), które ma ponad 20-letnią historię, to klasa technik testowych, które wykorzystują peroksydazę chrzanową (HRP) do znakowania in situ o dużej gęstości docelowych antygenów i jest szeroko stosowana w testach immunoenzymatycznych (ELISA), hybrydyzacji in situ (ISH), immunohistochemii (IHC) i innych technikach wykrywania antygenów biologicznych, Znaczna poprawa czułości wykrywanego sygnału1. Barwienie polichromatyczne opalizowe oparte na technologii TSA zostało niedawno opracowane i szeroko stosowane w kilku badaniach2,3,4,5. Tradycyjne barwienie immunofluorescencyjne (IF) zapewnia naukowcom łatwe narzędzie do wykrywania i porównywania rozmieszczenia białek w komórkach i tkankach różnych organizmów modelowych. Opiera się na wiązaniu specyficznym dla przeciwciała/antygenu i obejmuje podejścia bezpośrednie i pośrednie6. Bezpośrednie barwienie immunologiczne polega na zastosowaniu sprzężonego z fluoroforem przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko badanemu antygenowi, co umożliwia bezpośrednie wykrywanie fluorescencyjne za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Podejście do pośredniego barwienia immunologicznego polega na zastosowaniu przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z fluoroforem przeciwko niesprzężonemu przeciwciału pierwszorzędowemu6,7.

Tradycyjne, jednoznacznikowe, immunofluorescencyjne metody barwienia mogą zabarwić tylko jeden, dwa, a w niektórych przypadkach trzy antygeny w tkankach, co jest głównym ograniczeniem w wydobywaniu bogatych informacji zawartych w skrawkach tkanek. Interpretacja wyników ilościowych często zależy od obserwacji wizualnej i dokładnej kwantyfikacji za pomocą oprogramowania do obrazowania, takiego jak ImageJ. Istnieją ograniczenia techniczne, takie jak ograniczenie gatunków przeciwciał, słabe sygnały znaczników fluorescencyjnych i nakładanie się kolorów barwników fluorescencyjnych (Tabela 1). Technika Opal multiplex IHC (mIHC) opiera się na wyprowadzeniu TSA, które umożliwia barwienie multipleksowe i znakowanie różnicowe więcej niż 7-9 antygenów na tym samym odcinku tkanki, bez ograniczeń co do pochodzenia przeciwciała pierwszorzędowego, ale wymaga wysokiej swoistości odpowiedniego przeciwciała przeciwko antygenowi. Procedura barwienia jest podobna do normalnego barwienia immunofluorescencyjnego, z wyjątkiem dwóch różnic: każda runda barwienia obejmuje użycie tylko jednego przeciwciała i dodaje się etap elucji przeciwciał. Przeciwciała związane z antygenem wiązaniami niekowalencyjnymi można usunąć przez elucję mikrofalową, ale sygnał fluorescencyjny TSA związany z powierzchnią antygenu wiązaniami kowalencyjnymi jest zachowywany.

Aktywowane cząsteczki tyraminy (T) znakowane barwnikiem są wysoce wzbogacone w antygen docelowy, co pozwala na skuteczne wzmocnienie sygnału fluorescencyjnego. Pozwala to na bezpośrednie znakowanie antygenu bez ingerencji przeciwciał, a następnie można uzyskać wielokolorowe znakowanie po wielu cyklach barwienia8,9,10 (Rysunek 1). Chociaż technologia ta zapewnia wiarygodne i dokładne obrazy do badania chorób, stworzenie użytecznej strategii barwienia metodą immunohistochemii fluorescencji multipleksowej (mfIHC) może być czasochłonne i wymagające ze względu na potrzebę szeroko zakrojonej optymalizacji i projektowania. W związku z tym ten protokół panelu multipleksowego został zoptymalizowany w automatycznym barwieniu IHC z krótszym czasem barwienia niż w przypadku protokołu ręcznego. Podejście to może być bezpośrednio zastosowane i zaadaptowane przez każdego badacza do badań immunoonkologicznych na próbkach tkanek ludzkich utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE)11. Co więcej, metody przygotowania preparatów, optymalizacji przeciwciał i projektowania multipleksów będą pomocne w uzyskiwaniu solidnych obrazów, które reprezentują dokładne interakcje komórkowe in situ oraz w skróceniu okresu optymalizacji dla analizy ręcznej12.

mfIHC obejmuje głównie akwizycję obrazów i analizę danych. Jeśli chodzi o akwizycję obrazu, wielobarwne, złożone próbki barwione muszą być wykrywane za pomocą profesjonalnego sprzętu do obrazowania spektralnego, aby zidentyfikować różne mieszane sygnały kolorystyczne i uzyskać obrazy o wysokim stosunku sygnału do szumu bez zakłóceń spowodowanych autofluorescencją tkanek. Obecny sprzęt do obrazowania spektralnego obejmuje głównie spektralne mikroskopy konfokalne i wielospektralne systemy obrazowania tkanek. Wielospektralny system obrazowania tkanek jest profesjonalnym systemem obrazowania przeznaczonym do analizy ilościowej skrawków tkanek, a jego najważniejszą cechą jest pozyskiwanie informacji spektralnych obrazu, które dostarczają zarówno informacji o strukturze morfologicznej, jak i mapowaniu optycznym próbek tkanek biologicznych13,14. Każdy piksel na obrazie widmowym zawiera pełną krzywą spektralną, a każdy barwnik (w tym autofluorescencja) ma odpowiadające mu widmo charakterystyczne, co umożliwia pełne zarejestrowanie i dokładną identyfikację mieszanych i nakładających się na siebie sygnałów wieloetykietowych.

Pod względem analizy danych, próbki znakowane wielokolorowo są niezwykle skomplikowane ze względu na strukturę morfologiczną i komórki składowe próbek tkanek. Zwykłe oprogramowanie nie jest w stanie automatycznie zidentyfikować różnych typów tkanek. W związku z tym inteligentne oprogramowanie do ilościowej analizy tkanek jest wykorzystywane do ilościowej analizy ekspresji antygenu w określonych regionach15,16,17,18.

Przede wszystkim, wieloznakowe barwienie immunofluorescencyjne połączone z technologią obrazowania wielospektralnego i ilościowej analizy patologicznej ma zalety dużej liczby celów wykrywania, skutecznego barwienia i dokładnej analizy, a zatem może znacznie poprawić dokładność analizy histomorfologicznej, ujawnić przestrzenne relacje między białkami z rozdzielczością na poziomie komórkowym oraz pomóc w wydobyciu bogatszych i bardziej wiarygodnych informacji z sekcji tkanek samples19 (Tabela 1).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół jest zatwierdzony przez wytyczne Komitetu Etyki Szpitala Zachodniochińskiego, Uniwersytet Syczuański, Chiny. Próbki tkanki raka płuc zostały pobrane podczas operacji w Centrum Raka Płuc w Szpitalu Zachodniochińskim i uzyskano świadomą zgodę od każdego pacjenta.

1. Przygotowanie sekcji tkanek

  1. Przygotowanie FFPE
    1. Zanurz tkanki kliniczne w obojętnym roztworze formaliny na dłużej niż 72 godziny.
    2. Zakończ proces odwadniania tkanek za pomocą ksylenu i stopniowanych roztworów alkoholowych20.
    3. Ręczne zatapianie parafiny i cięcie tkanek przy grubości przekroju 4 μm. Użyj szkiełek mikroskopowych adhezyjnych, aby upewnić się, że plastry tkanki nie wypadną.
    4. Piecz szkiełka w piekarniku w temperaturze 65 °C przez 2 godziny, aby chusteczka i szkiełka były suche. Przechowywać w pudełku na szkiełka w temperaturze pokojowej.
  2. Wstępne leczenie przekroju tkanki
    1. Preparaty tkankowe należy wstępnie poddać obróbce w piecu w temperaturze 65 °C przez 5 minut, a następnie kolejno zanurzyć w roztworach ksylenu przez 2 x 15 min, bezwodnych roztworach etanolu przez 2 x 15 min, 90% roztworze etanolu przez 10 minut, 85% roztworze etanolu przez 10 minut, 80% roztworze etanolu przez 10 minut i 75% roztworze etanolu przez 10 minut, następnie umyć szkiełka wysterylizowaną wodą przez 3 x 1 min.
      UWAGA: Ta eksperymentalna technika może być stosowana tylko do tkanki FFPE, a nie do tkanki mrożonej lub świeżej, ponieważ proces naprawy antygenu w wielu wysokich temperaturach powoduje odpadanie tkanki ze szkiełka.

2. Optymalizacja przeciwciał pierwszorzędowych

UWAGA: Konwencjonalne eksperymenty IHC zostały wykorzystane do określenia warunków inkubacji dla poszczególnych przeciwciał, głównie w tym stężenia przeciwciał i warunków naprawy antygenu. Zapoznaj się z warunkami w instrukcji obsługi przeciwciał.

  1. Należy stosować stężenie przeciwciał nieco wyższe niż zalecany zakres stężeń i wartości pośrednie.
  2. Zoptymalizuj procedury buforowania odzyskiwania antygenu PH6 i PH9 zgodnie z lokalizacją ekspresji białka. Użyj PH9 dla białek ulegających ekspresji w jądrze i użyj rutynowej (PH6 lub PH9) dla innych białek.

3. metoda barwienia mIHC

UWAGA: Barwienie Opal mIHC jest jedną z dostępnych metod mIHC. W tym eksperymentalnym protokole 5-kolorowym, ponieważ każda próbka tkanki musi być wybarwiona czterema przeciwciałami, cztery inkubacje przeciwciał pierwotnych, inkubacje przeciwciał wtórnych i inkubacje chromogenne wzmacniające sygnał TSA, a także pięć uzupełnień antygenu. Na koniec wykonuje się barwienie 4'6-diamidyn-2-fenyloindolem (DAPI) i uszczelnianie antyfluorescencyjnym środkiem pękającym.

  1. Przygotowanie głównego odczynnika
    UWAGA: Określ ilość odczynnika, który należy dodać, w zależności od wielkości szkiełek tkankowych. Użyj wystarczającej objętości, aby całkowicie pokryć wycinek tkanki (zwykle 50-150 μl na szkiełko). Roztwory robocze wymagane do eksperymentu przygotowuje się w następujący sposób:
    1. Roztwór roboczy buforu do płukania: rozcieńczyć 20x bufor do płukania w stosunku 1:20 wodą podwójnie destylowaną i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    2. Roztwór roboczy buforu PH6: Rozcieńczyć 100x bufor PH6 w stosunku 1:100 wodą podwójnie destylowaną. Przygotuj przed użyciem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    3. Roztwór roboczy buforu PH9: Rozcieńczyć 50x bufor PH9 w stosunku 1:50 wodą podwójnie destylowaną. Przygotuj przed użyciem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    4. Polimer HRP: Przygotować ten gotowy do użycia roztwór tylko dla pierwszorzędowych przeciwciał pochodzenia króliczego i mysiego.
    5. Roztwór roboczy fluoroforu: Rozpuść każdy proszek fluoroforowy (z wyjątkiem fluoroforu 780) w 75 μl DMSO. Przed każdym zabiegiem rozcieńczyć fluorofor w 1x rozcieńczalniku do amplifikacji w stosunku 1:100. Wyrzucić wszelkie niewykorzystane części roztworu roboczego fluoroforu.
    6. Roztwór roboczy Fluorophore 780: Rozpuść TSA-DIG w 75 μl DMSO, a proszek fluoroforowy 780 w 300 μl podwójnie destylowanej wody. Przed zabiegiem rozcieńczyć TSA-DIG w 1x rozcieńczalniku do amplifikacji w stosunku 1:100, a fluorofor 780 rozcieńczalnik Ab w stosunku 1:25.
    7. Roztwór roboczy DAPI: Rozcieńczyć roztwór DAPI w stosunku 1:50 wodą podwójnie destylowaną lub PBS. Przygotować przed użyciem i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż 48 godzin
      NUTA. Szkiełka należy myć wyłącznie wodą podwójnie destylowaną i świeżo przygotowanym roztworem roboczym buforu do płukania podczas tego wieloznakowego eksperymentu barwienia fluorescencyjnego. Skrawki tkanek nie mogą mieć kontaktu z wodą z kranu; Zanieczyszczenia w wodzie z kranu mogą przylegać do skrawków tkanek i powodować autofluorescencję. Trzymaj próbki z dala od światła przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Pobieranie antygenu
    1. Umieść szkiełka w pudełku do barwienia i naprawy i napełnij je roztworem roboczym buforowym PH6 lub PH9, przykryj pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 x 8 minut przy 100% mocy.
      UWAGA: Dodaj podwójnie destylowaną wodę do pudełka naprawczego podczas procesu podgrzewania, aby zapobiec nadmiernemu parowaniu, które może spowodować wysuszenie plastrów.
    2. Przed kontynuowaniem (30-60 min) pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj szkiełka 3 x 2 minuty wodą podwójnie destylowaną. Użyj hydrofobowego pisaka barierowego, aby otoczyć sekcję tkanki na szkiełku.
  3. Blokowanie
    1. Zanurzyć skrawki tkanek w buforze do mycia, zalać roztworem blokującym i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
  4. Inkubacja przeciwciał pierwotnych
    1. Usunąć roztwór blokujący ze szkiełek i pokryć skrawki tkanki pierwotnym roztworem roboczym przeciwciała. Szkiełka należy inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub przez noc w temperaturze 4 °C w lodówce.
      UWAGA: Nie pozwól, aby szkiełka wyschły.
  5. Wprowadzenie polimeru HRP
    1. Myć szkiełka w roztworze roboczym buforu do przemywania przez 3 x 2 min. Dodać polimer HRP bezpośrednio kroplami do skrawków tkanek i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: W przypadku szkiełek przechowywanych w lodówce należy je przechowywać w temperaturze pokojowej przez około 30 minut przed umyciem w celu usunięcia przeciwciała pierwszorzędowego.
  6. Generowanie wzmocnienia sygnału tyraminy (TSA)
    1. Przemyć szkiełko roztworem roboczym buforu do przemywania przez 3 x 2 min, dodać roztwór roboczy fluoroforu bezpośrednio kroplami do skrawków tkanek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Myć szkiełko roztworem roboczym buforu myjącego przez 3 x 2 min.
  7. Procedura specjalna dla fluoroforu 780
    UWAGA: Fluorofor 780 jest słaby i rutynowo umieszczany na końcu schematu dopasowywania kolorów całego eksperymentu. Fluorofor 780 nie jest zwykle stosowany w tym protokole eksperymentalnym, ale ze względu na jego specyfikę, jego etapy eksperymentalne są wymienione.
    1. Wprowadzenie TSA-DIG
      1. Przemyć szkiełko roztworem roboczym buforu do przemywania przez 3 x 2 min, stopniowo dodawać roztwór roboczy TSA-Drg do skrawków tkanek i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Obróbka mikrofalowa
      1. Myć szkiełka roztworem roboczym buforu do płukania przez 3 x 2 min.
      2. Umieść szkiełka w pudełku do barwienia i naprawy, napełnij je roztworem naprawczym, przykryj pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 x 8 minut przy 100% mocy. Przed kontynuowaniem (30-60 min) pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej.
      3. Myj szkiełka przez 3 x 2 minuty wodą podwójnie destylowaną.
    3. Generowanie sygnału Fluorophore 780
      1. Zanurzyć skrawki w buforze do mycia, zalać roztworem roboczym fluoroforu 780 i inkubować szkiełka w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
      2. Umyć szkiełka roztworem roboczym buforu do płukania przez 3 x 2 min.
        UWAGA: NIE WOLNO wykonywać obróbki mikrofalowej po tym kroku.
    4. Użyj fluorophore 780 jako ostatniego kroku całego przepływu pracy, a następnie wybarwić jądra bezpośrednio roztworem roboczym DAPI.
      UWAGA: Pomiń krok 3.7, jeśli nie używasz fluoroforu 780.
  8. Obróbka mikrofalowa
    UWAGA: Ten krok mikrofalowy usuwa pierwszorzędowo-drugorzędowy kompleks HRP i ponownie eksponuje antygeny, umożliwiając wprowadzenie następnego przeciwciała pierwszorzędowego.
    1. Umieść szkiełka w pudełku do barwienia i naprawy, napełnij je roztworem roboczym buforowym PH6 lub PH9, przykryj pokrywką i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 2 x 8 minut przy 100% mocy.
    2. Przed kontynuowaniem (30-60 min) pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka 3 x 1 min wodą podwójnie destylowaną.
    3. Zanurz szkiełka w roztworze roboczym buforu płuczącego na 2 minuty. Wykonaj następną inkubację przeciwciał.
  9. Następna inkubacja przeciwciał
    1. Powtórz kroki 3.2-3.8 (z wyjątkiem kroku 3.7).
  10. Barwienie jądra komórkowego i uszczelnianie tkanek
    1. Przykryj skrawki tkanki roztworem roboczym DAPI i inkubuj szkiełka w wilgotnej komorze przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Myj szkiełka przez 3 x 2 minuty wodą podwójnie destylowaną.
    2. Usuń kropelki wody ze szkiełek, dodaj 10-20 μl środka antyfluorescencyjnego do każdego szkiełka i uszczelnij szkiełka nakrywkowe mikroskopu.
    3. Gotowe szkiełka należy przechowywać w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem, przez ponad 1 miesiąc.
      UWAGA: Uważaj, aby uniknąć pęcherzyków powietrza.

4. Ustaw kontrolę negatywną

  1. Przetwarzaj szkiełka kontroli ujemnej, takie jak szkiełka zawierające tkanki, ale bez dodawania odczynników, takich jak przeciwciała pierwszorzędowe, przeciwciała drugorzędowe, odczynniki TSA i DAPI, które są używane do usuwania autofluorescencji tkanek podczas skanowania filmu.

5. W pełni automatyczne skanowanie preparatów tkankowych

UWAGA: Sprzęt używany do obrazowania spektralnego to w pełni zautomatyzowany wielospektralny analizator kwantyfikacji tkanek, a obrazowanie i wizualizacja analizy 5-kolorowych preparatów może być wykonywana przy użyciu systemu referencyjnego (patrz Tabela materiałów). System wykorzystuje obrazowanie wielospektralne do ilościowego rozmieszania wielu fluoroforów i autofluorescencji tkankowej.

  1. Ręcznie ustaw czas ekspozycji i program skanowania dla każdego kanału fluorescencji i upewnij się, że przyrząd zakończył w pełni automatyczną ekspozycję i skanowanie szkiełek tkankowych.
    UWAGA: Powierzchnia zjeżdżalni musi być czysta i wolna od filmu wodnego. Uważaj na ilość uszczelniacza: zbyt duża ilość spowoduje, że szkiełko nakrywkowe ześlizgnie się i instrument zgłosi błąd.

6. Analiza fluorescencji

  1. Kliknij dwukrotnie oprogramowanie (patrz Spis materiałów), przeciągnij plik wielokolorowego obrazu fluorescencji uzyskany z oryginalnego skanu do oprogramowania i ustaw typ obrazu na fluorescencję.
  2. Kliknij przycisk Jasność i kontrast i sprawdź kanały na panelu. Kliknij na zewnątrz, a następnie na kanale, aby wybrać interesujący Cię kanał fluorescencyjny. Przeciągnij wyświetlacz Min i Max display, aby dostosować jasność i kontrast każdego kanału.
  3. Po analizie określ widok, który ma zostać zapisany, kliknij Pokaż przegląd slajdu i Pokaż położenie kursora, aby usunąć te dwie zawartości, zachowaj pasek skali i kliknij Plik | Eksport migawki | Bieżąca zawartość przeglądarki do wyeksportowania pliku png.
    UWAGA: Każdy kanał fluorescencyjny i scalona figura muszą zostać wyeksportowane do przyszłej analizy.
  4. Do dalszej analizy dodatniej wartości komórek docelowych należy użyć oprogramowania do identyfikacji i segmentacji komórek21 (patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoptymalizowaliśmy schemat dopasowania pierwszorzędowego przeciwciała CD8 i fluoroforów. Oba zestawy wyników fluorescencji odpowiadały dokładnie tym samym warunkom inkubacji przeciwciał w grupie eksperymentalnej, z wyjątkiem zmiany w fluoroforze dopasowanym do przeciwciała. Jak pokazano w Rysunek 2, zaobserwowano istotną różnicę w dopasowaniu kanałów limfocytów T CD8 + z fluoroforem 480 i fluoroforem 690. Kanał z fluoroforem 690 wykazuje niezwykle silne tło fluorescencyjne - duży obszar czerwonej nier...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

mIHC jest niezastąpioną techniką eksperymentalną w dziedzinie badań naukowych do ilościowej i przestrzennej analizy wielu markerów białkowych na poziomie pojedynczej komórki w pojedynczym wycinku tkanki, dostarczającą intuicyjnych i dokładnych danych do badania patologii choroby poprzez skupienie się na szczegółowej strukturze tkanki i interakcjach komórkowych w kontekście oryginalnej tkanki. Powszechne zastosowanie technologii mIHC będzie wymagało zoptymalizowanych i skutecznych protokołów eksperymentalnych. Aby rozwiąz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszyscy autorzy deklarują, że nie występują konflikty interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować członkom Instytutu Badań nad Patologią Kliniczną Szpitala Zachodniochińskiego, którzy przyczynili się do uzyskania technicznych wskazówek dotyczących jakości multipleksowej immunofluorescencji i przetwarzania IHC. Protokół ten był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (82200078).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Abcamab237709/100, PH9
Anty-CD68Abcamab955Przeciwciało pierwszorzędowe, 1/300, PH9
Anty-CK5/6MilliporeMAB1620Przeciwciało pierwszorzędowe, 1/150, PH9
Anty-HMGCS1GeneTexGTX112346Przeciwciało pierwszorzędowe, 1/300, PH6
Zwierzęca surowica nieimmunologicznaMXB BiotechnologiesSP KIT-B3Blokowanie antygenu
Fluormount-GSouthernBiotech0100-01Antyfluorescencyjny wybuch
Opal PolarisTM 7-kolorowy ręczny zestaw IHCAkoyaNEL861001KTOpal mIHC Bufor do barwienia
DakoK8000/K8002/K8007/K8023Mycie szkiełek
higienicznychSoftware
HALOinteligentne oprogramowanie do ilościowej analizy tkankowej, płatne oprogramowanie
inForminteligentne oprogramowanie do ilościowej analizy tkanek, płatne oprogramowanie
PerkinElmer Vectra, w pełni automatyczne skanowanie preparatów tkankowych.
QuPath 0.3.2, oprogramowanie typu open source, użyte w tym eksperymencie.
Przeciwciało pierwszorzędowe , 1Wielospektralne systemy obrazowania tkanekInteligentne oprogramowanie do ilościowej analizy tkanek

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zaidi, A. U., Enomoto, H., Milbrandt, J., Roth, K. A. Dual fluorescent in situ hybridization and immunohistochemical detection with tyramide signal amplification. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48 (10), 1369-1375 (2000).
  2. Lovisa, S., et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nature Medicine. 21 (9), 998-1009 (2015).
  3. Nghiem, P. T., et al. PD-1 blockade with pembrolizumab in advanced Merkel-cell carcinoma. The New England Journal of Medicine. 374 (26), 2542-2552 (2016).
  4. Zaretsky, J. M., et al. Mutations associated with acquired resistance to PD-1 blockade in melanoma. The New England Journal of Medicine. 375 (9), 819-829 (2016).
  5. Wang, C., et al. The heterogeneous immune landscape between lung adenocarcinoma and squamous carcinoma revealed by single-cell RNA sequencing. Signal Transduction and Targeted Therapy. 7 (1), 289(2022).
  6. Becheva, Z. R., Gabrovska, K. I., Godjevargova, T. I. Comparison between direct and indirect immunofluorescence method for determination of somatic cell count. Chemical Papers. 72, 1861-1867 (2018).
  7. Niedenberger, B. A., Geyer, C. B. Advanced immunostaining approaches to study early male germ cell development. Stem Cell Research. 27, 162-168 (2018).
  8. Granier, C., et al. Tim-3 expression on tumor-infiltrating PD-1+CD8+ T cells correlates with poor clinical outcome in renal cell carcinoma. Cancer Research. 77 (5), 1075-1082 (2017).
  9. Badoual, C., et al. PD-1-expressing tumor-infiltrating T cells are a favorable prognostic biomarker in HPV-associated head and neck cancer. Cancer Research. 73 (1), 128-138 (2013).
  10. Meany, D. L., Hackler, L. Jr, Zhang, H., Chan, D. W. Tyramide signal amplification for antibody-overlay lectin microarray: a strategy to improve the sensitivity of targeted glycan profiling. Journal of Proteome Research. 10 (3), 1425-1431 (2011).
  11. Surace, M., et al. Automated multiplex immunofluorescence panel for immuno-oncology studies on formalin-fixed carcinoma tissue specimens. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), 58390(2019).
  12. Lazarus, J., et al. Optimization, design and avoiding pitfalls in manual multiplex fluorescent immunohistochemistry. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (149), 59915(2019).
  13. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  14. Mansfield, J. R. Multispectral imaging: a review of its technical aspects and applications in anatomic pathology. Veterinary Pathology. 51 (1), 185-210 (2014).
  15. Gustavson, M. D., et al. Development of an unsupervised pixel-based clustering algorithm for compartmentalization of immunohistochemical expression using Automated QUantitative Analysis. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 17 (4), 329-337 (2009).
  16. Lu, S., et al. Comparison of biomarker modalities for predicting response to PD-1/PD-L1 checkpoint blockade: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncology. 5 (8), 1195-1204 (2019).
  17. Humphries, M. P., Maxwell, P., Salto-Tellez, M. QuPath: The global impact of an open source digital pathology system. Computational and Structural Biotechnology Journal. 19, 852-859 (2021).
  18. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Scientific Reports. 7 (1), 16878(2017).
  19. Stack, E. C., Wang, C., Roman, K. A., Hoyt, C. C. Multiplexed immunohistochemistry, imaging, and quantitation: a review, with an assessment of Tyramide signal amplification, multispectral imaging and multiplex analysis. Methods. 70 (1), 46-58 (2014).
  20. Chapter 4, Experimental Pathology Techniques of Respiratory System. Atlas of Experimental Pathology Techniques. , 125-126 (2012).
  21. Wilson, C. M., et al. Challenges and opportunities in the statistical analysis of multiplex immunofluorescence data. Cancers. 13 (12), 3031(2021).
  22. Mori, H., et al. Characterizing the tumor immune microenvironment with Tyramide-based multiplex immunofluorescence. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 417-432 (2020).
  23. Mansfield, J. R. Cellular context in epigenetics: quantitative multicolor imaging and automated per-cell analysis of miRNAs and their putative targets. Methods. 52 (4), 271-280 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tkanka zatopiona w parafiniemikro rodowisko guzabarwienie immunofluorescencyjnetyraminowe wzmocnienie sygna uretrieval antygenuprzes uch mi dzykana oweko lokalizacja bia eklimfocyty T CD8

Powiązane artykuły