Method Article

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

DOI:

10.3791/65851

⸱

December 1st, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji mięśni myszy są użytecznym modelem do eksperymentów fizjologicznych. Jednak większość prac dotyczy krótkich włókien zginacza palca brevis (FDB), co ogranicza zakres wyników dotyczących typów włókien, ogranicza ilość dostępnego materiału biologicznego i utrudnia wyraźny związek między zjawiskami fizjologicznymi komórek a wcześniejszą wiedzą biochemiczną i dynamiczną uzyskaną w innych mięśniach.

Ten artykuł opisuje, jak uzyskać nienaruszone włókna z sześciu mięśni o różnych profilach i długościach włókien. Używając dorosłych myszy C57BL / 6, pokazujemy protokół rozwarstwienia mięśni i izolacji włókien oraz wykazujemy przydatność włókien do badań przejściowych Ca2 + i ich charakterystykę morfometryczną. Przedstawiono również skład rodzaju włókien w mięśniach. Po dysocjacji wszystkie mięśnie stały się nienaruszone, żywe włókna, które kurczą się energicznie przez ponad 24 godziny. FDB dało krótkie (<1 mm), mięsień strzałkowy długi (PDQA) i mięsień strzałkowy długi (PL) dały pośrednie (1-3 mm), podczas gdy mięśnie prostownika długiego palca (EDL), prostownika palucha długiego (EHL), a mięśnie płaszczkowate uwolniły długie (3-6 mm) włókna.

Podczas rejestrowania za pomocą szybkiego barwnika Mag-Fluo-4, stany przejściowe Ca2+ włókien PDQA, PL i EHL wykazywały szybką, wąską kinetykę przypominającą morfologię typu II (MT-II), o której wiadomo, że odpowiada włóknom typu IIX i IIB. Jest to zgodne z faktem, że mięśnie te mają ponad 90% włókien typu II w porównaniu z FDB (~80%) i płaszczkowatym (~65%). Wychodząc poza FDB, po raz pierwszy pokazujemy dysocjację kilku mięśni, które tworzą włókna o długości od 1 do 6 mm. Włókna te są żywotne i dają szybkie stany przejściowe Ca2+, co wskazuje, że MT-II można uogólnić na szybkie włókna IIX i IIB, niezależnie od ich źródła mięśniowego. Wyniki te zwiększają dostępność modeli do badań dojrzałych mięśni szkieletowych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dojrzały mięsień szkieletowy ssaków jest tkanką wielofunkcyjną. Silnie reguluje przemianę materii, jest głównym źródłem produkcji ciepła, a jego właściwości dynamiczne nadają mu kluczową rolę w oddychaniu, ruchu segmentów ciała czy przemieszczaniu się z jednego punktu do drugiego1,2,3. Mięśnie szkieletowe są również istotne dla patofizjologii wielu chorób, w tym chorób dziedzicznych i przewlekłych, takich jak miopaty, dystrofie czy sarkopenia, a także wielu przewlekłych schorzeń niezwiązanych z mięśniami, takich jak choroby kardiometaboliczne3,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Etyki w Eksperymentach na Zwierzętach Uniwersytetu Antioquia (UdeA) (protokół 104 z 21 czerwca 2016r. i 005 z 15 kwietnia 2021 r.), zgodnie z Ustawą 84 z 1989 r. i Rezolucją 8430 z 1993 r. wydanymi przez rząd kolumbijski i zostały przeprowadzone i zgłoszone zgodnie z Badaniami na Zwierzętach: Wytyczne dotyczące raportowania eksperymentów in vivo (ARRIVE)41. Wszystkie przedstawione tutaj wyniki pochodzą od zdrowych, 7-13 tygodniowych, 20-26 g, samców myszy C57BL/6. Rysunek 1 pokazuje ogólny projekt tego badania i kolejność pro....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sarkoplazmatyczne stężenie Ca2+ podczas drgania
Aby zademonstrować wykonalność eksperymentów fizjologicznych w zestawie zdysocjowanych włókien i rozszerzyć nasze wcześniejsze odkrycia dotyczące sprzężenia wzbudzenia-skurczu (ECC) i typów włókien, stany przejściowe Ca2+ uzyskano we włóknach ze wszystkich mięśni. Po pierwsze, FDB (n = 5) i EDL (n = 7) wykazały kinetykę Ca2+ znaną jako morfologia typu II (MT-II). Są to szybkie, kolczaste sygnały, których RT trwa ~1 ms; j.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby uzupełnić modele dostępne do badania biologii dojrzałych mięśni szkieletowych, tutaj demonstrujemy udaną dysocjację enzymatyczną szeregu mięśni myszy z krótkimi, pośrednimi i długimi włóknami. Włókna te pozwalają na wykazanie uogólnienia kinetyki MT-II stanów nieustalonych Ca2+ w mięśniach szkieletowych. Ponadto sklasyfikowano rodzaje włókien w nienaruszonych, całych mięśniach. Biorąc pod uwagę, że FDB jest najczęściej używanym mięśniem do eksperymentów fizjologicznych, oceniono rodzaje włókien obecnych w .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność profesorowi Robinsonowi Ramírezowi z UdeA za pomoc przy zwierzętach i kilku zdjęciach oraz Carolinie Palacios za wsparcie techniczne. Johan Pineda z firmy Kaika pomógł nam skonfigurować kamery kolorowe i fluorescencyjne. Shyuan Ngo z University of Queensland uprzejmie poprosiła o korektę manuskryptu. Badanie to zostało sfinansowane przez CODI-UdeA (2020-34909 od 22 lutego 2021r. i 2021-40170 od 31 marca 2022r., SIU) oraz Biuro Planowania-UdeA (E01708-K i ES03180101), Medellín, Kolumbia, na rzecz JCC. Grantodawcy nie brali udziału w gromadzeniu i analizie danych, pisaniu lub składaniu manuskryptów.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reodczynniki
Etanol absolutnySigma Aldrich32221
AcetonMerck179124
AkrylamidGibco BRL15512-015
Nadsiarczan amonuPanreac141138.1610
Przeciwciało anty miozyny ISigma AldrichM4276Przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty miozyny IISigma AldrichM8421Przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty miozyny IIAKolekcja kultur typu amerykańskiegoSC-71Przeciwciało pierwszorzędowe. Pochodzi z HB-277 hybridoma Przeciwciało
anty miozyny IIBBadania rozwojowe Hybridoma BankBF-F3-c Przeciwciało pierwszorzędowe
Bis-akryloamidAMRESCO0172
Albumina surowicy bydlęcejThermo ScientificB14
Odczynnik BradfordMerck1.10306.0500
Błękit bromofenolowyCarlo Erba428658
Węglan wapniaMerck102066
Dichlorek wapnia (CaCl2)Merck2389
ChloroformSigma Aldrich319988
Kolagenaza typ 2WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
Coomassie Błękit brylantowy R 250 Merck112553
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650
Ditiotreitol (DTT)AMRESCO0281
Kwas edetynowy (EDTAAMRESCO0322
Eozyna YSigma AldrichE4009
GlicerolPanreac 
GlycinePanreac151340.1067
Kozia surowicaSigma AldrichG9023
HematoxylinThermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazolAMRESCOM136
IzopentanSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206Przygotowany tylko w DMSO. Kwas pluronowy nie jest wymagany i nie powinien być stosowany, aby uniknąć degradacji włókien.
Aplikacja merkaptoetanoluA11080100
MetanolProtokimicaMP10043
myszyKilkaKilka W tym manuskrypcie użyliśmy tylko myszy C57BL / 6. Jednak niektóre wstępne wyniki wykazały, że protokół działa dobrze w przypadku szwajcarskich myszy Webster w tym samym wieku i o tej samej wadze.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diamina (TEMED)PromegaV3161
N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS)Tocris1870
Optymalna masa tnąca (OCT)Thermo Scientific6769006
Przeciwciało drugorzędoweThermo ScientificA-11001Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488
Dodecyl siarczan soduPanreac 
TRIS 0,5 M, pH 6,8 AMRESCOJ832
Tris(hydroksymetylo)aminometanAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
Materiały
Komora prosektoryjnaWykonane
Prowadnice ładowaneErie Scientific5951PLUS
Eksperymentalna komora do kąpieliWarner InstrumentsRC-27NE2Wąska komora do kąpieli ze stymulacją polową, umieszczona na podgrzewanej platformie PH-6
Szczypce do drobnych robótekWorld Precision Instruments500338, 500230
Drobne nożyczkiWorld Precision InstrumentsVannas Nożyczki 501778
szklane pipety PasteuraKilkakońcówek
polerowanych ogniowoSzklane fiolki z nakrętkąKilkaobjętości 2-3 ml
Precision Instruments501223-G
Sprzęt
WirówkaThermo ScientificSL 8R
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1000
KriostatLeicaCM1850
Aparat cyfrowyZeissErc 5s i Axio 305Axio 305, sprzężony ze stereoskopem Stemi 508, służył do wykonywania zdjęć podczas sekcji, natomiast Erc 5s lub Axio 208, sprzężony z mikroskopem Axio Observer A1, służył do wykonywania zdjęć izolowanych włókien i testów immunofluorescencyjnych
DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
Komora do elektroforezyBio RadMini-Protean IV
Mikroskop odwrócony sprzężony z fluorescencjąZeissAxio Observer A1Sprzężony z odpowiednim źródłem światła, filtrami i obiektywami do fluorescencji
FotopowielaczRurka HoribaR928, Hamamatsu, w fotometrze D104, HoribaSprzężony z bocznym portem mikroskopu fluorescencyjnego
StereoskopZeissStemi 508
Stymulator Instrumenty trawiaste S6
Łaźnia wodna MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
Free oprogramowanie do analiz elektroforetycznychUniversity of KentuckyGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu i morfometriiNational Institutes of HealthImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licencjonowane oprogramowanie do akwizycji i analizy sygnałów Ca2+Urządzenia molekularnepCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
Licencjonowane oprogramowanie do analiz statystycznych i wykresówOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/
14232912111323631209na zamówienie nożyczek o World

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. G....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Skeletal Muscle FibersEnzymatic DissociationMuscle Fiber IsolationHindlimb MusclesCalcium TransientsFiber Type CompositionMorphometric CharacterizationExcitation Contraction CouplingCollagenase DigestionEpifluorescence Microscopy

Related Articles