Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65851

⸱

1 grudnia 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Physiology and Biochemistry Research Group-PHYSIS, Faculty of Medicine, University of Antioquia

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół uzyskiwania enzymatycznie zdysocjowanych włókien o różnych długościach i typach z sześciu mięśni dorosłych myszy: trzy z nich już opisane (zginacz palca krótkiego, prostownik palca długiego, płaszczkowaty) i trzy z nich pomyślnie zdysocjowane po raz pierwszy (prostownik palucha długiego, mięsień długi długi, peroneus digiti quarti).

Streszczenie

Włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji mięśni myszy są użytecznym modelem do eksperymentów fizjologicznych. Jednak większość prac dotyczy krótkich włókien zginacza palca brevis (FDB), co ogranicza zakres wyników dotyczących typów włókien, ogranicza ilość dostępnego materiału biologicznego i utrudnia wyraźny związek między zjawiskami fizjologicznymi komórek a wcześniejszą wiedzą biochemiczną i dynamiczną uzyskaną w innych mięśniach.

Ten artykuł opisuje, jak uzyskać nienaruszone włókna z sześciu mięśni o różnych profilach i długościach włókien. Używając dorosłych myszy C57BL / 6, pokazujemy protokół rozwarstwienia mięśni i izolacji włókien oraz wykazujemy przydatność włókien do badań przejściowych Ca2 + i ich charakterystykę morfometryczną. Przedstawiono również skład rodzaju włókien w mięśniach. Po dysocjacji wszystkie mięśnie stały się nienaruszone, żywe włókna, które kurczą się energicznie przez ponad 24 godziny. FDB dało krótkie (<1 mm), mięsień strzałkowy długi (PDQA) i mięsień strzałkowy długi (PL) dały pośrednie (1-3 mm), podczas gdy mięśnie prostownika długiego palca (EDL), prostownika palucha długiego (EHL), a mięśnie płaszczkowate uwolniły długie (3-6 mm) włókna.

Podczas rejestrowania za pomocą szybkiego barwnika Mag-Fluo-4, stany przejściowe Ca2+ włókien PDQA, PL i EHL wykazywały szybką, wąską kinetykę przypominającą morfologię typu II (MT-II), o której wiadomo, że odpowiada włóknom typu IIX i IIB. Jest to zgodne z faktem, że mięśnie te mają ponad 90% włókien typu II w porównaniu z FDB (~80%) i płaszczkowatym (~65%). Wychodząc poza FDB, po raz pierwszy pokazujemy dysocjację kilku mięśni, które tworzą włókna o długości od 1 do 6 mm. Włókna te są żywotne i dają szybkie stany przejściowe Ca2+, co wskazuje, że MT-II można uogólnić na szybkie włókna IIX i IIB, niezależnie od ich źródła mięśniowego. Wyniki te zwiększają dostępność modeli do badań dojrzałych mięśni szkieletowych.

Wprowadzenie

Dojrzały mięsień szkieletowy ssaków jest tkanką wielofunkcyjną. Silnie reguluje przemianę materii, jest głównym źródłem produkcji ciepła, a jego właściwości dynamiczne nadają mu kluczową rolę w oddychaniu, ruchu segmentów ciała czy przemieszczaniu się z jednego punktu do drugiego1,2,3. Mięśnie szkieletowe są również istotne dla patofizjologii wielu chorób, w tym chorób dziedzicznych i przewlekłych, takich jak miopaty, dystrofie czy sarkopenia, a także wielu przewlekłych schorzeń niezwiązanych z mięśniami, takich jak choroby kardiometaboliczne3,4,5,6,7,8.

Badanie ex vivo strukturalnych i funkcjonalnych właściwości dojrzałych mięśni szkieletowych w kontekście zdrowia i choroby było możliwe głównie dzięki dwóm eksperymentalnym modelom: całym mięśniom i izolowanym włóknom. W XX wieku naukowcy wykorzystali właściwości całego, nienaruszonego mięśnia prostownika długiego palca długiego (EDL), mięśnia płaszczkowatego, piszczelowego przedniego i mięśnia brzuchatego łydki różnych małych gatunków jako kluczowe modele, aby dowiedzieć się o jednostkach motorycznych, typach włókien i właściwościach dynamicznych, takich jak siła i kinetyka skurczu i relaksacji9,10,11,12,13,14,15,16. Jednak pojawienie się bardziej wyrafinowanych badań biologii komórki przesunęło tę dziedzinę w kierunku badania pojedynczych włókien mięśniowych. Pionierskie prace umożliwiły następnie wyizolowanie nienaruszonych włókien zginacza digitorum brevis (FDB) szczurów poprzez dysocjację enzymatyczną w celu późniejszej charakterystyki17,18,19. Chociaż włókna FDB można również uzyskać przez ręczną sekcję20, łatwość i wysoka przepustowość enzymatycznej dysocjacji mięśni mysich, oprócz ich przydatności do różnych podejść eksperymentalnych, sprawiły, że ten ostatni model był szeroko stosowany w ciągu ostatnich dwóch dekad.

Krótkie włókna FDB nadają się do badań elektrofizjologicznych i innych badań biofizycznych, analiz biochemicznych, metabolicznych i farmakologicznych, eksperymentów z mikroskopią elektronową i fluorescencyjną, transfekcji dla podejść biologii komórki lub jako źródło komórek macierzystych w badaniach miogenezy5,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32. Jednak używanie wyłącznie włókien FDB w eksperymentach mięśniowych zawęża zakres badań zajmujących się rodzajami włókien i ogranicza ilość materiału biologicznego dostępnego dla niektórych technik metodologicznych lub dla uzyskania większej ilości informacji od jednego zwierzęcia. Ograniczenia te utrudniają wyraźną korelację zjawisk fizjologicznych w komórkach z wcześniejszymi badaniami biochemicznymi i dynamicznymi wykonywanymi w różnych całych mięśniach (np. EDL, płaszczkowaty, peronei).

Pokonując te ograniczenia, niektórym grupom udało się oddzielić dłuższe mięśnie EDL i płaszczkowate24,33,34,35,36,37,38,39,40, otwierając drzwi do dalszego rozszerzenia metody na inne istotne mięśnie. Jednak stosowanie włókien EDL i płaszczkowatych jest nadal rzadkie, prawdopodobnie z powodu braku szczegółów metodologicznych dotyczących otrzymywania ich jako włókien nienaruszonych. W tym miejscu szczegółowo opisujemy, jak wyizolować włókna o różnej długości i typie z sześciu mięśni: trzy z nich zostały już opisane (FDB, EDL i płaszczkowaty) oraz trzy z nich po raz pierwszy z powodzeniem zdysocjowane (prostownik palucha długiego [EHL], mięsień strzałkowy długi [PL] i mięsień strzałkowy palca czworokątnego [PDQA]). Wyniki niniejszej pracy potwierdzają, że model włókien dysocjowanych enzymatycznie nadaje się do szerokiego zakresu badań i przyszłych korelacji z wcześniej publikowanymi danymi, zwiększając tym samym dostępność modeli do badań dojrzałych mięśni szkieletowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki w Eksperymentach na Zwierzętach Uniwersytetu Antioquia (UdeA) (protokół nr 104 z dnia 21 czerwcast, 2016, oraz 005 z 15 kwietniath, 2021), zgodnie z ustawą 84 z 1989 roku oraz rezolucją 8430 z 1993 roku wydaną przez rząd Kolumbii; przeprowadzono je i zaraportowano zgodnie z Badania na zwierzętach: raportowanie eksperymentów in vivo wytyczne (ARRIVE)41Wszystkie przedstawione tutaj wyniki pochodzą od zdrowych samców myszy szczepu C57BL/6 w wieku od 7 do 13 tygodni o masie ciała od 20 do 26 g. Rycina 1 przedstawia ogólny schemat badania oraz kolejność procedur. Wszystkie szczegóły dotyczące odczynników, materiałów i sprzętu wymieniono w Tabela materiałów.

1. Zwierzęta

  1. Umieścić maksymalnie sześć myszy w każdej akrylowej, przezroczystej, prostokątnej klatce z podścieliskiem z drewna, w warunkach kontrolowanej temperatury (21 ± 2 °C) i cyklu światła:ciemności (12:12 h).
  2. Zapewnić zwierzętom swobodny dostęp do pokarmu i wody kranowej w pomieszczeniach dla zwierząt wolnych od specyficznych patogenów, bez wzbogacania środowiska.

2. Disekcja

  1. Roztwory, materiały i odczynniki
    1. Przygotować i przefiltrować (0,22 µm) roztwory robocze o następującym składzie (wszystkie stężenia w mM):
      1. Tyrode: 5,4 KCl, 1 MgCl2, 140 NaCl, 0,33 NaH2PO4, 2 CaCl2, 10 glukozy, 10 HEPES, pH 7,3
      2. Do dysocjacji: 2,7 KCl, 1,2 KH2PO4, 0,5 MgCl2, 138 NaCl, 0,1 Na2HPO4, 1 CaCl2, pH 7,4
      3. Fosforanowy bufor solny (PBS): 137 NaCl, 8,6 Na2HPO4, 2,8 KH2PO4, pH 7,34
    2. Przygotować dwie komory do sekcji, stereomikroskop, nożyce chirurgiczne, nożyczki precyzyjne, pęsety precyzyjne oraz czyste, przezroczyste, niestożkowe szklane fiolki o szerokości 1-1,5 cm i całkowitej objętości 3-4 mL z nakrętkami. Przygotować układ do elektrycznej stymulacji mięśni w komorach do sekcji.
    3. Przygotować wypalane nad palnikiem szklane pipety Pasteura o końcówkach o różnych szerokościach: 5, 4, 3, 2 i 1 mm.
    4. Ustawić kąpiel wodną na 37 °C. Odważyć alikwoty po 3 mg kolagenazy typu 2.
  2. Procedura
    1. Uśmiercić mysz metodami zatwierdzonymi przez lokalny Komitet Etyki. Zaleca się zwichnięcie szyi, ponieważ jest to metoda szybka, mniej stresująca i pozwala uniknąć kontaktu z lekami, które mogą wpływać na tkankę mięśniową (takimi jak CO2 lub niektóre środki znieczulające). Natychmiast przystąpić do sekcji, aby uzyskać lepsze wyniki.
    2. Umieścić mysz na powierzchni piankowej i przymocować przednie kończyny taśmą lub szpilkami. Odciąć obie kończyny tylne powyżej kolan za pomocą nożyc chirurgicznych, przenieść każdą z nich do oddzielnej komory do sekcji i dodać zimny (10-20 °C) roztwór Tyrode, aby pokryć tkankę.
      UWAGA: Z każdej kończyny tylnej można uzyskać sześć różnych mięśni w następującej kolejności: FDB, mięsień płatkowaty (soleus), EDL, EHL, PL oraz PDQA. Szczegółowe informacje anatomiczne dotyczące sekcji sześciu mięśni w całości, od ścięgna do ścięgna, przedstawiono na Rysunku 2 oraz w literaturze42.
    3. Przytwierdzić pierwszą kończynę tylną do komory do sekcji w pozycji, w której widoczna jest tylna strona nóg. Usunąć skórę pod powiększeniem, a następnie odsłonić i wyciąć mięsień FDB (Rysunek 2). Przechowywać go w jednej opisanej szklanej fiolce z 1 mL roztworu Tyrode.
      UWAGA: Odpowiednie powiększenie i wcześniejsze przeszkolenie są niezbędne, aby uniknąć przypadkowych nacięć tkanki mięśniowej.
    4. Odsłonić, wyciąć i przechowywać mięsień płatkowaty w oddzielnej fiolce z 1 mL roztworu Tyrode. Użyć precyzyjnych nożyczek, aby najpierw oddzielić mięsień brzuchaty łydki, a następnie wyciąć mięsień płatkowaty, zgodnie z Rysunkiem 2.
    5. Odsłonić przednią stronę nogi, usunąć skórę i zidentyfikować dystalne ścięgna mięśnia piszczelowego przedniego oraz mięśnia EDL w okolicy kostki. Usunąć i odrzucić mięsień piszczelowy; następnie przeciąć dystalne ścięgna EDL (Rysunek 2). Kontynuować sekcję aż do usunięcia EDL i umieścić go w oddzielnej szklanej fiolce z 1 mL roztworu Tyrode.
    6. Usunąć mięsień EHL, który znajduje się bezpośrednio za i przyśrodkowo względem EDL. Rozpocząć sekcję od zidentyfikowania i śledzenia ścięgna do 1szego palca, jak wskazano na odpowiednim panelu Rysunku 2. Przechowywać mięsień w oddzielnej szklanej fiolce z 1 mL roztworu Tyrode.
    7. Zidentyfikować i śledzić najbardziej zewnętrzne ścięgno mięśni strzałkowych, aby je przeciąć i usunąć mięsień PL (Rysunek 2). Umieścić mięsień w oddzielnej szklanej fiolce z 1 mL roztworu Tyrode.
    8. Zidentyfikować i śledzić ścięgno do 4tego palca; przeciąć je i usunąć mięsień PDQA (Rysunek 2). Umieścić go w oddzielnej szklanej fiolce z 1 mL roztworu Tyrode.
    9. Powtórzyć procedurę z drugą kończyną tylną.
    10. Zebrać oba mięśnie tego samego typu do jednej opisanej szklanej fiolki lub małej szalki Petriego z roztworem Tyrode.
      ​UWAGA: Jeśli podczas jednej sesji planowana jest sekcja więcej niż dwóch par mięśni, należy zaangażować dwóch badaczy do przeprowadzenia procedury.

3. Protokół izolacji włókien mięśniowych

  1. Wymień roztwór Tyrode'a w komorach sekcyjnych, aby usunąć zanieczyszczenia i sierść myszy. Przelej mięśnie FDB do jednej komory sekcyjnej, sprawdź ich integralność i przenieś je do nowej szklanej fiolki zawierającej 1 ml roztworu dysocjującego. Powtórz tę procedurę dla mięśni EHL, PL i PDQA.
    UWAGA: Jeśli mięsień wydaje się nadmiernie skurczony, jest przecięty lub nie reaguje na stymulację elektryczną, nie należy przechodzić do następnego kroku protokołu. Zamiast tego należy zoptymalizować protokół sekcji poprzez weryfikację jakości roztworów (pH, zanieczyszczenia, osmolarity) oraz doskonalenie umiejętności sekcyjnych (Rycina 1C i Film uzupełniający S1).
  2. Wykonaj cięcia podłużne lub ukośne mięśnia płaszczowatego oraz mięśnia prostownika długiego palców, zgodnie z orientacją włókien (Rysunek 2). W przypadku mięśnia soleus (płaszczowatego) należy prowadzić cięcie wzdłuż ścięgna centralnego, przecinając około 80% jego długości. W przypadku EDL (prostownika długiego palców) należy prowadzić cięcie wzdłuż jednego lub dwóch ścięgien na podobnej długości jak w przypadku mięśnia soleus. Każdą parę mięśni należy umieścić w szklanych fiolkach z 1 ml roztworu do dysocjacji.
    UWAGA: Ta procedura zmniejsza rozmiar m. prostownika długiego palców (EDL) oraz m. płaszczowatego, co umożliwia lepszą penetrację tkanki przez kolagenazę. Niezbędne jest zastosowanie odpowiedniego powiększenia (40-50x) oraz precyzyjnych nożyczek i pęsety. Przed przejściem do kolejnego etapu protokołu dysocjacji należy zawsze sprawdzić integralność próbki poprzez inspekcję wizualną i stymulację elektryczną.
  3. Do każdej probówki zawierającej 1 ml roztworu do dysocjacji i parę mięśni należy dodać 3 mg kolagenazy typu 2 (o aktywności 250–300 U/mg). Należy ustandaryzować dokładną ilość kolagenazy, biorąc pod uwagę aktywność wykorzystanej partii enzymu.
  4. Inkubować pary mięśni w kąpieli wodnej przez 65–90 min w temperaturze 36,8-37 °Cprzy delikatnym wstrząsaniu.
    UWAGA: Należy rygorystycznie przestrzegać kontroli temperatury. Należy zestandaryzować procedurę w taki sposób, aby mięśnie nie pozostawały w kolagenazie przez więcej niż 100 min, aby uniknąć ich uszkodzenia.
  5. Kontrolować zawartość fiolek pod stereomikroskopem co 5 min po 65.th min inkubacji. Gdy mięśnie wydają się lekko pofalowane, poszarpane i luźne, delikatnie potrząśnij probówką i sprawdź, czy niektóre włókna zaczynają łatwo się oddzielać. Jeśli tak się stanie, przemyj mięśnie roztworem Tyrode'a w temperaturze pokojowej, aby dezaktywować i usunąć kolagenazę.
    UWAGA: Płukanie należy przeprowadzać ostrożnie, unikając dotykania mięśni pipetami. Należy rozpocząć od dodania 0,8 ml roztworu Tyrode, a następnie usunąć 0,8 ml roztworu. Procedurę tę należy powtórzyć 4–5 razy i upewnić się, że roztwór stał się całkowicie przejrzysty.
  6. Oddziel więcej włókien z głównej masy mięśniowej, stosując bardzo delikatną tryturację w roztworze Tyrode'a za pomocą zestawu wypalanych pipet Pasteura. Rozpocznij od mieszania roztworu wokół mięśnia za pomocą najszerszej pipety (koncówka 5 mm), a następnie delikatnie wciągaj i wypuszczaj mięsień z pipety 3–4 razy. Gdy mięsień zacznie uwalniać włókna i stanie się cieńszy, powtórz procedurę z kolejną pipetą (koncówka 4 mm).
    UWAGA: Włókna uzyskane za pomocą tej procedury pozostają pobudliwe i gwałtownie kurczą się przez ponad 24 h, co wykazano na przykładzie włókien mięśni PL, EDL, EHL oraz mięśnia soleus w Film uzupełniający S2, Film uzupełniający S3, Film uzupełniający S4, i Film uzupełniający S5.

4. Procedury eksperymentalne

UWAGA: Do szacowania stężenia Ca2+ w sarkoplazmie, pomiarów morfometrycznych oraz badań ekspresji ciężkiego łańcucha miozyny (MHC) wykorzystano izolowane włókna.

  1. Pomiar stężenia wapnia w sarkoplazmie2+ stężenie podczas pojedynczego skurczu
    1. Zamocuj czyste szkiełko przedmiotowe w komorze kąpieli eksperymentalnej. Pokryj szkiełko warstwą 2-3 µL z lamininy i pozostawić do wyschnięcia przez 30 s przed wlaniem ~400 µL zawiesiny włókien na szkiełko. Pozostawić włókna do przyczepienia się do lamininy na 10–15 min w temperaturze pokojowej.
    2. Zamocuj komorę eksperymentalną na stoliku mikroskopu odwróconego wyposażonego w epifluorescencję (Rycina 3A).
    3. Wywołaj pojedyncze skurcze w celu weryfikacji żywotności włókien, przykładając prostokątne impulsy prądowe (0,8–1,2 ms) za pomocą dwóch elektrod platynowych umieszczonych po obu stronach komory eksperymentalnej. Nawet w przypadku przytwierdzenia do lamininy, skurcz włókien jest widoczny głównie na ich końcach.
    4. Obciąż włókna 3,5-4.5 µM szybkiego Ca2+ barwnik Mag-Fluo-4, AM przez 4–5 min w roztworze Tyrodea. Po tym czasie delikatnie przemyć roztworem Tyrodea, aby usunąć barwnik z przestrzeni pozakomórkowej. Pozostawić barwnik wewnątrzkomórkowy do odesteryfikacji przez ok. 15–20 min w ciemności. Zawsze utrzymywać temperaturę poniżej 22 °C aby uniknąć kompartymentacji barwnika.
      UWAGA: Należy przygotować roztwór zapasowy Mag-Fluo-4, AM wyłącznie w dimetylosulfotlenku (DMSO), tak aby końcowe stężenie DMSO w ładującym roztworze Tyrode było mniejsze niż 0,5%.
    5. Oświetl włókno za pomocą białej diody elektroluminescencyjnej (LED) oraz zestawu filtrów o następujących długościach fal dla wzbudzenia/dichroicznego/emisji: 450-490/510/515 nm (Rycina 3A).
      UWAGA: Alternatywne źródła wzbudzenia to lampy fluorescencyjne rtęciowe i ksenonowe. Należy stosować jak najniższą intensywność i jak najmniejszą wielkość plamki wzbudzenia, aby uniknąć fotoblaknięcia barwnika oraz uszkodzenia komórki.
    6. Wzbudź Ca w włóknie2+ odpowiedź (wapń sarkoplazmatyczny Ca2+ przejściowe) poprzez przyłożenie prostokątnych impulsów prądowych (0,8–1,2 ms) za pomocą dwóch elektrod platynowych umieszczonych po obu stronach komory eksperymentalnej przy 20-22 °C.
    7. Sygnały świetlne należy zbierać i zapisywać za pomocą 40-krotnego obiektywu immersyjnego olejowego o dużej odległości roboczej, odpowiedniego do fluorescencji, oraz fotopowielacza (PMT) podłączonego do digitalizatora (Rysunek 3A i Film uzupełniający S6). W oprogramowaniu akwizycyjnym należy ustawić skalę od 0 do 200 jednostek dowolnych (AU) oraz określić fluorescencję spoczynkową (Fodpoczynek) zakresu eksperymentu do 10 AU w tej skali poprzez modulowanie rozmiaru plamki wzbudzenia oraz wzmocnienia PMT. Po zestandaryzowaniu procedury należy zachować niezmienione wzmocnienie pomiędzy kolejnymi eksperymentami, a skalę ustawiać wyłącznie poprzez niewielkie korekty rozmiaru plamki.
      UWAGA: W przypadku wystąpienia artefaktów ruchowych należy zastosować 20-30 µM N-benzylowo-p-toluensulfonamid (BTS) w roztworze Tyrode'a.
    8. Analizę i kalibrację sygnałów należy przeprowadzić w następujący sposób:
      1. Zastosuj filtr dolnoprzepustowy dla całego przebiegu z częstotliwością odcięcia 1 kHz.
      2. Oblicz Fodpoczynek w 1 s śladu, dostosuj Fodpoczynek do 0, a następnie zmierz szczytowe stężenie Ca w sarkoplazmie2+ amplituda stanów przejściowych (Fpiki). Przedstaw amplitudę zgodnie z równaniem (1):
        Wzór na równowagę statyczną, ΔF/F = Fpeak/Frest, wyrażenie matematyczne dla analizy stanu równowagi.   (1)
      3. Oblicz szczytowe stężenie Ca2+2+ stężenie ([Ca2+], µM) przy użyciu równania (2)26 oraz następujące parametry: in situ stała dysocjacji (Kd) = 1.65 × 105 µM2, maksymalna fluorescencja (Fmaks.) wynoszącej 150,9 AU, minimalna fluorescencja (Fmin) przy 0,14 AU, stężenie Mag-Fluo-4 [D]T z 229.1 µM26. Fpik został już otrzymany w kroku 4.1.8.2.
        Równanie stężenia jonów wapnia, symbol, istotne dla analizy biochemicznej i spektroskopowej.   (2)
      4. Zmierz czas narostu od 10% do 90% amplitudy (RT, ms), szerokość połówkową (HW, ms) oraz czas spadku od 90% do 10% amplitudy (DT, ms). Następnie oszacuj kinetykę zaniku na podstawie dopasowania do funkcji bieksponencjalnej (równanie 3):
        Wzór na podwójny wykładniczy zanik Y=A₁exp(x-x₀/τ₁)+A₂exp(x-x₀/τ₂)+C, równanie matematyczne.   (3)
      5. Zapisz wartości stałych czasowych wygasania τ1 oraz τ2 (ms) i amplitudy A1 oraz A226.
  2. Pomiary morfometryczne
    1. Zamocuj czystą szklaną lamellkę w komorze kąpieli eksperymentalnej. Pokryj lamellkę warstwą 2-3 µL z lamininy i pozostawić do wyschnięcia przez 30 s przed wlaniem ~400 µL zawiesiny włókien na szkiełko. Pozostawić włókna do przywarcia do lamininy na 10–15 min w temperaturze pokojowej.
    2. Wywołaj pojedyncze skurcze w celu weryfikacji żywotności włókien, przykładając prostokątne impulsy prądu (0,8–1,2 ms) poprzez dwie elektrody platynowe umieszczone po obu stronach komory eksperymentalnej. Nawet w przypadku przytwierdzenia do lamininy, skurcz włókien jest nadal widoczny głównie na ich końcach.
    3. Należy wykonać obrazy żywych włókien przy użyciu obiektywów 10x i 20x oraz kamery o rozdzielczości co najmniej 5 megapikseli zamontowanej na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym. Obrazy należy zapisać w formacie .TIFF w celu przeprowadzenia analiz offline.
      UWAGA: do pełnego uchwycenia długiego włókna może być potrzebny zestaw około 2–6 obrazów.
    4. Należy wykonać obraz skalówki mikrometrycznej mikroskopu przy tym samym powiększeniu. Obrazy należy zapisać w formacie .TIFF w celu przeprowadzenia analiz offline.
    5. Pomiar długości i średnic włókien należy przeprowadzić za pomocą narzędzia kalibracyjnego w bezpłatnym oprogramowaniu do analizy obrazu w następujący sposób:
      1. Ustal zależność między pikselami a znaną odległością (µm) na obrazach przy pomocy mikrometrycznej podziałki kalibracyjnej mikroskopu, wykorzystując Narzędzie Analiza/Ustawienie skali jak pokazano na Rycina uzupełniająca S1.
      2. Zmierz raz długość włókna od jednego końca do drugiego oraz jego średnicę w 2–6 różnych miejscach wzdłuż włókna (1–2 pomiary na obraz, w zależności od jego długości), zgodnie z Rycina uzupełniająca S1.
      3. Podaj wartość długości (µm lub mm) oraz średnią wszystkich średnic (µm) zmierzone na pojedyncze włókno.
  3. Badania nad ekspresją ciężkich łańcuchów miozyny
    UWAGA: Szczegóły dotyczące oznaczania MHC metodą immunofluorescencji43 oraz elektroforezę w żelu poliakrylamidowym z dodecylosiarczanem sodu (SDS-PAGE)33,44,45,46 w całych mięśniach, prosimy sprawdzić Plik uzupełniający 1Protokół typowania włókien za pomocą immunofluorescencyjnego oznaczania MHC w zawiesinie włókien wyizolowanych metodą FDB przebiega następująco:
    1. Powlecz pięć czystych szkiełek przedmiotowych 2-3 µL z lamininy i pozostawić do wyschnięcia przez 30 s przed wlaniem ~300 µL zawiesiny włókien na każdy szkiełko. Pozostawić włókna do przyczepienia się do lamininy na 4 h w temperaturze pokojowej.
    2. Utrawialaj preparaty w schłodzonym w zamrażarce acetonie przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    3. Przemyć delikatnie 3 razy buforem PBS.
    4. Przeprowadzić permeabilizację błon komórkowych w buforze PBS z dodatkiem 0,7% Triton X-100 przez 15 min w temperaturze pokojowej.
    5. Przemyć delikatnie 3 razy w PBS z dodatkiem 0,2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 0,04% Triton X-100, a następnie blokować w PBS z 2% BSA, 2% surowicy koziej i 0,4% Triton X-100 przez 30 min w temperaturze pokojowej.
    6. Przemyć delikatnie 3 razy buforem PBS z dodatkiem 0,2% BSA i 0,04% Triton X-100, a następnie inkubować z przeciwciałami pierwszorzędowymi w następujący sposób:
      1. Rozcieńczyć każde przeciwciało pierwszorzędowe anty-MHC w osobnej probówce w buforze PBS z dodatkiem 1% BSA i 0,04% Triton X-100: anty-I (1:1500), anty-II (1:600), anty-IIA (użyć całej pożywki warunkującej z hybrydomy) oraz anty-IIB (1:500).
      2. Inkubować każde szkiełko z jednym przeciwciałem, a pozostałe szkiełko z PBS jako kontrolę, przez 12–16 h w temperaturze 4 °C.
        UWAGA: W niniejszym protokole włókna typu IIX pozostały nieoznaczone we wszystkich próbkach.
    7. Przemyć delikatnie 3 razy buforem PBS, a następnie inkubować wszystkie preparaty z przeciwciałem wtórnym (1:800) sprzężonym z zielonym fluorochromem przez 1–2 h w temperaturze pokojowej.
    8. Barwienie jąder komórkowych za pomocą 1 µg/mL Hoechst przez 15 min.
    9. Przemyć delikatnie 3x w PBS, a następnie ostrożnie dodać 20-40 µL mediumu montażowego, a następnie nałożyć szkiełko coverglass.
      UWAGA: Delikatna wymiana roztworów i przemywanie zapewniają przyleganie do szkiełka wielu dziesiątek włókien, co gwarantuje istotność statystyczną eksperymentu.
    10. Obrazuj każdy preparat przy użyciu obiektywu 10x odpowiedniego dla fluorescencji oraz zestawu filtrów o następujących długościach fal dla wzbudzenia/dichroizmu/emisji: 450-490/510/515 nm, a następnie policz wszystkie włókna pozytywne i negatywne. Alternatywnie, wykonaj obrazy fluorescencyjne przy zastosowaniu tych samych parametrów technicznych i kamery o rozdzielczości co najmniej 5 megapikseli zamontowanej na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym i zapisz je w formacie .TIFF do późniejszych analiz offline.
    11. Zarejestruj liczbę włókien pozytywnych i negatywnych dla każdego preparatu w bazie danych, a następnie oblicz procentowy udział włókien typu I, IIA, IIB oraz całkowitą liczbę włókien typu II, w odniesieniu do całkowitej liczby włókien obecnych w odpowiednim preparacie. Oblicz procentowy udział włókien IIX, odejmując sumę włókien IIA+IIB od procentowego udziału całkowitej liczby włókien typu II. Oszacuj procentowy udział włókien hybrydowych I/IIA, odejmując sumę włókien I+II od wartości 100%. Na koniec odejmij procentowy udział komórek hybrydowych od całkowitej liczby włókien typu I i II, aby uzyskać liczbę czystych włókien typu I i II.
      UWAGA: W badaniach nad składem MHC typy włókien oznacza się wielką literą, natomiast izoformy małą literą46.
  4. Barwienie hematoksyliną i eozyną
    1. Pokryj czystą szkiełko przedmiotowe 2-3 µL lamininy i pozostawić do wyschnięcia przez 30 s przed wylaniem ~300 µL zawiesiny włókien na szkiełko. Pozostawić włókna do przyczepienia do lamininy na 4 h w temperaturze pokojowej.
    2. Utrwal preparat w roztworze Carnoy’a (60% etanol absolutny, 30% chloroform, 10% kwas octowy) przez 5 min w temperaturze pokojowej.
    3. Inkubować z hematoksyliną przez 90 s.
    4. Przemyć delikatnie 3 razy wodą z kranu.
    5. Inkubować z 1% roztworem eozyny Y przygotowanym w 70% etanolu przez 30 s.
    6. Przemyć delikatnie 3 razy wodą z kranu.
    7. Zanurzyć 3 razy w etanolu absolutnym.
    8. Inkubować w ksylenie przez 60 s.
    9. Dodaj 20-40 µL medium do montowania i wizualizować za pomocą konwencjonalnego mikroskopu. Należy wykonać zdjęcia przy pożądanym powiększeniu, używając kolorowej kamery o rozdzielczości co najmniej 5 megapikseli.

5. Analizy statystyczne i tworzenie wykresów

UWAGA: Jednostką eksperymentalną jest włókno mięśniowe.

  1. Wyniki należy przedstawić jako średnią ± odchylenie standardowe oraz obliczyć 95% przedziały ufności (CI95%) dla wybranych analiz.
  2. W celu porównania długości, średnicy oraz kinetyki przejściowych stężeń Ca2+ pomiędzy grupami, należy przeprowadzić analizę wariancji (ANOVA) oraz testy post-hoc z korektą Bonferroniego.
  3. Normalność rozkładu oraz jednorodność wariancji należy ocenić odpowiednio za pomocą testu Shapiro-Wilka i testu Levene'a.
  4. Różnice uznaje się za istotne statystycznie, gdy p < 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Sarkoplazmatyczny Ca2+ stężenie podczas pojedynczego skurczu
Aby wykazać możliwość przeprowadzania eksperymentów fizjologicznych na zestawie dysocjowanych włókien oraz rozszerzyć nasze wcześniejsze odkrycia dotyczące sprzężenia wzbudzenie-skurcz (ECC) i typów włókien, Ca2+ rejestrowano przejściowe zmiany w włóknach ze wszystkich mięśni. W pierwszej kolejności w FDB (n = 5) i EDL (n = 7) wykazano Ca2+ kinetyka znana jako morfologia typu II (MT-II). Są to szybkie, szpik...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby uzupełnić modele dostępne do badania biologii dojrzałych mięśni szkieletowych, tutaj demonstrujemy udaną dysocjację enzymatyczną szeregu mięśni myszy z krótkimi, pośrednimi i długimi włóknami. Włókna te pozwalają na wykazanie uogólnienia kinetyki MT-II stanów nieustalonych Ca2+ w mięśniach szkieletowych. Ponadto sklasyfikowano rodzaje włókien w nienaruszonych, całych mięśniach. Biorąc pod uwagę, że FDB jest najczęściej używanym mięśniem do eksperymentów fizjologicznych, oceniono rodzaje włókien obecnych w ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

Autorzy wyrażają swoją wdzięczność profesorowi Robinsonowi Ramírezowi z UdeA za pomoc przy zwierzętach i kilku zdjęciach oraz Carolinie Palacios za wsparcie techniczne. Johan Pineda z firmy Kaika pomógł nam skonfigurować kamery kolorowe i fluorescencyjne. Shyuan Ngo z University of Queensland uprzejmie poprosiła o korektę manuskryptu. Badanie to zostało sfinansowane przez CODI-UdeA (2020-34909 od 22 lutego 2021r. i 2021-40170 od 31 marca 2022r., SIU) oraz Biuro Planowania-UdeA (E01708-K i ES03180101), Medellín, Kolumbia, na rzecz JCC. Grantodawcy nie brali udziału w gromadzeniu i analizie danych, pisaniu lub składaniu manuskryptów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Reodczynniki
Etanol absolutnySigma Aldrich32221
AcetonMerck179124
AkrylamidGibco BRL15512-015
Nadsiarczan amonuPanreac141138.1610
Przeciwciało anty miozyny ISigma AldrichM4276Przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty miozyny IISigma AldrichM8421Przeciwciało pierwszorzędowe
Przeciwciało anty miozyny IIAKolekcja kultur typu amerykańskiegoSC-71Przeciwciało pierwszorzędowe. Pochodzi z HB-277 hybridoma Przeciwciało
anty miozyny IIBBadania rozwojowe Hybridoma BankBF-F3-c Przeciwciało pierwszorzędowe
Bis-akryloamidAMRESCO0172
Albumina surowicy bydlęcejThermo ScientificB14
Odczynnik BradfordMerck1.10306.0500
Błękit bromofenolowyCarlo Erba428658
Węglan wapniaMerck102066
Dichlorek wapnia (CaCl2)Merck2389
ChloroformSigma Aldrich319988
Kolagenaza typ 2WorthingtonCLS-2/LS004176
Consul-MountThermo Scientific9990440
Coomassie Błękit brylantowy R 250 Merck112553
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma AldrichD2650
Ditiotreitol (DTT)AMRESCO0281
Kwas edetynowy (EDTAAMRESCO0322
Eozyna YSigma AldrichE4009
GlicerolPanreac 
GlycinePanreac151340.1067
Kozia surowicaSigma AldrichG9023
HematoxylinThermo Scientific6765015
HEPESAMRESCO0511
Hoechst 33258Sigma Aldrich861405
ImidazolAMRESCOM136
IzopentanSigma AldrichM32631
LamininSigma AldrichL2020
Mag-Fluo-4, AMInvitrogenM14206Przygotowany tylko w DMSO. Kwas pluronowy nie jest wymagany i nie powinien być stosowany, aby uniknąć degradacji włókien.
Aplikacja merkaptoetanoluA11080100
MetanolProtokimicaMP10043
myszyKilkaKilka W tym manuskrypcie użyliśmy tylko myszy C57BL / 6. Jednak niektóre wstępne wyniki wykazały, że protokół działa dobrze w przypadku szwajcarskich myszy Webster w tym samym wieku i o tej samej wadze.
Mowiol 4-88Sigma Aldrich81381
N,N,N',N'-tetrametyloetano-1,2-diamina (TEMED)PromegaV3161
N-benzylo-p-toluenosulfonamid (BTS)Tocris1870
Optymalna masa tnąca (OCT)Thermo Scientific6769006
Przeciwciało drugorzędoweThermo ScientificA-11001Kozie przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo, Alexa Fluor 488
Dodecyl siarczan soduPanreac 
TRIS 0,5 M, pH 6,8 AMRESCOJ832
Tris(hydroksymetylo)aminometanAMRESCOM151
Triton X-100AMRESCOM143
Materiały
Komora prosektoryjnaWykonane
Prowadnice ładowaneErie Scientific5951PLUS
Eksperymentalna komora do kąpieliWarner InstrumentsRC-27NE2Wąska komora do kąpieli ze stymulacją polową, umieszczona na podgrzewanej platformie PH-6
Szczypce do drobnych robótekWorld Precision Instruments500338, 500230
Drobne nożyczkiWorld Precision InstrumentsVannas Nożyczki 501778
szklane pipety PasteuraKilkakońcówek
polerowanych ogniowoSzklane fiolki z nakrętkąKilkaobjętości 2-3 ml
Precision Instruments501223-G
Sprzęt
WirówkaThermo ScientificSL 8R
Mikroskop konfokalnyOlympusFV1000
KriostatLeicaCM1850
Aparat cyfrowyZeissErc 5s i Axio 305Axio 305, sprzężony ze stereoskopem Stemi 508, służył do wykonywania zdjęć podczas sekcji, natomiast Erc 5s lub Axio 208, sprzężony z mikroskopem Axio Observer A1, służył do wykonywania zdjęć izolowanych włókien i testów immunofluorescencyjnych
DigitizerMolecular Devices1550A Digidata
Komora do elektroforezyBio RadMini-Protean IV
Mikroskop odwrócony sprzężony z fluorescencjąZeissAxio Observer A1Sprzężony z odpowiednim źródłem światła, filtrami i obiektywami do fluorescencji
FotopowielaczRurka HoribaR928, Hamamatsu, w fotometrze D104, HoribaSprzężony z bocznym portem mikroskopu fluorescencyjnego
StereoskopZeissStemi 508
Stymulator Instrumenty trawiaste S6
Łaźnia wodna MemmertWNE-22
XilolSigma Aldrich808691
Software
Free oprogramowanie do analiz elektroforetycznychUniversity of KentuckyGelBandFitter v1.7http://www.gelbandfitter.org
Darmowe oprogramowanie do analizy obrazu i morfometriiNational Institutes of HealthImageJ v1.54https://imagej.nih.gov/ij/index.html
Licencjonowane oprogramowanie do akwizycji i analizy sygnałów Ca2+Urządzenia molekularnepCLAMP v10.05https://www.moleculardevices.com
Licencjonowane oprogramowanie do analiz statystycznych i wykresówOriginLabOriginPro 2019https://www.originlab.com/
14232912111323631209na zamówienie nożyczek o World

Bibliografia

  1. Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcif Tissue Int. 96 (3), 183-195 (2015).
  2. Barclay, C., Launikonis, B. Components of activation heat in skeletal muscle. J Muscle Res Cell Motil. 42 (1), 1-16 (2021).
  3. Gallo-Villegas, J. A., Calderón, J. C. Epidemiological, mechanistic, and practical bases for assessment of cardiorespiratory fitness and muscle status in adults in healthcare settings. Eur J Appl Physiol. 123 (5), 945-964 (2023).
  4. Cardamone, M., Darras, B. T., Ryan, M. M. Inherited myopathies and muscular dystrophies. Semin Neurol. 28 (2), 250-259 (2008).
  5. Sánchez-Aguilera, P., et al. Role of ABCA1 on membrane cholesterol content, insulin-dependent Akt phosphorylation and glucose uptake in adult skeletal muscle fibers from mice. Biochim Biophys Acta. 1863 (12), 1469-1477 (2018).
  6. Cruz-Jentoft, A. J., et al. Sarcopenia: revised European consensus on definition and diagnosis. Age Ageing. 48 (1), 16-31 (2019).
  7. Narvaez-Sanchez, R., Calderón, J. C., Vega, G., Trillos, M. C., Ospina, S. Skeletal muscle as a protagonist in the pregnancy metabolic syndrome. Med Hypotheses. 126, 26-37 (2019).
  8. Gallo-Villegas, J., et al. Efficacy of high-intensity interval- or continuous aerobic-training on insulin resistance and muscle function in adults with metabolic syndrome: a clinical trial. Eur J Appl Physiol. 122 (2), 331-344 (2022).
  9. Close, R. Properties of motor units in fast and slow skeletal muscles of the rat. J Physiol. 193 (1), 45-55 (1967).
  10. Barnard, R. J., Edgerton, V. R., Furukawa, T., Peter, J. B. Histochemical, biochemical, and contractile properties of red, white, and intermediate fibers. Am J Physiol. 220, 410-414 (1971).
  11. Bär, A., Pette, D. Three fast myosin heavy chains in adult rat skeletal muscle. FEBS letters. 235 (1-2), 153-155 (1988).
  12. Schiaffino, S., et al. Myosin heavy chain isoforms and velocity of shortening of type 2 skeletal muscle fibres. Acta Physiol Scand. 134 (4), 575-576 (1988).
  13. Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (3), 197-205 (1989).
  14. Ranatunga, K., Thomas, P. Correlation between shortening velocity, force-velocity relation and histochemical fibre-type composition in rat muscles. J Muscle Res Cell Motil. 11 (3), 240-250 (1990).
  15. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. J Histochem Cytochem. 41 (5), 733-743 (1993).
  16. Agbulut, O., Li, Z., Mouly, V., Butler-Browne, G. S. Analysis of skeletal and cardiac muscle from desmin knock-out and normal mice by high resolution separation of myosin heavy-chain isoforms. Biol Cell. 88 (3), 131-135 (1996).
  17. Bekoff, A., Betz, W. Properties of isolated adult rat muscle fibres maintained in tissue culture. J Physiol. 271 (2), 537-547 (1977).
  18. Bekoff, A., Betz, W. Physiological properties of dissociated muscle fibres obtained from innervated and denervated adult rat muscle. J Physiol. 271 (1), 25-40 (1977).
  19. Schuetze, S. M. The acetylcholine channel open time in chick muscle is not decreased following innervation. J Physiol. 303, 111-124 (1980).
  20. Youhanna, S., Bruton, J., Jardemark, K., Westerblad, H., Lauschke, V. M. Calcium measurements in enzymatically dissociated or mechanically microdissected mouse primary skeletal muscle fibers. STAR Protoc. 4 (2), 102260(2023).
  21. Wozniak, A. C., Anderson, J. E. Single-fiber isolation and maintenance of satellite cell quiescence. Biochem Cell Biol. 83 (5), 674-676 (2005).
  22. Anderson, J. E., Wozniak, A. C., Mizunoya, W. Single muscle-fiber isolation and culture for cellular, molecular, pharmacological, and evolutionary studies. Methods Mol Biol. 798, 85-102 (2012).
  23. Bolaños, P., Guillen, A., Gámez, A., Caputo, C. Quantifying SOCE fluorescence measurements in mammalian muscle fibres. The effects of ryanodine and osmotic shocks. J Muscle Res Cell Motil. 34 (5-6), 379-393 (2013).
  24. Lopez, R., et al. Raptor ablation in skeletal muscle decreases Cav1.1 expression and affects the function of the excitation-contraction coupling supramolecular complex. Biochem J. 466 (1), 123-135 (2015).
  25. Tarpey, M. D., et al. Characterization and utilization of the flexor digitorum brevis for assessing skeletal muscle function. Skelet Muscle. 8 (1), 14(2018).
  26. Milán, A. F., et al. Calibration of mammalian skeletal muscle Ca2+ transients recorded with the fast Ca2+ dye Mag-Fluo-4. Biochim Biophys Acta. 1865 (9), 129939(2021).
  27. Park, K. H., et al. Assessment of calcium sparks in intact skeletal muscle fibers. J Vis Exp. (84), e50898(2014).
  28. Wei-LaPierre, L., Groom, L., Dirksen, R. T. Acute exposure to extracellular BTP2 does not inhibit Ca2+ release during EC coupling in intact skeletal muscle fibers. J Gen Physiol. 154 (9), 202112976(2022).
  29. Banks, Q., et al. Voltage sensor movements of Ca(V)1.1 during an action potential in skeletal muscle fibers. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (40), 2026116118(2021).
  30. Jaque-Fernandez, F., et al. Preserved Ca2+ handling and excitation-contraction coupling in muscle fibres from diet-induced obese mice. Diabetologia. 63 (11), 2471-2481 (2020).
  31. Ravenscroft, G., et al. Dissociated flexor digitorum brevis myofiber culture system--a more mature muscle culture system. Cell Motil Cytoskeleton. 64 (10), 727-738 (2007).
  32. Leduc-Gaudet, J. -P., et al. MYTHO is a novel regulator of skeletal muscle autophagy and integrity. Nat Commun. 14 (1), 1199(2023).
  33. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Myosin heavy chain isoform composition and Ca2+ transients in fibres from enzymatically dissociated murine soleus and extensor digitorum longus muscles. J Physiol. 588 (1), 267-279 (2010).
  34. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Kinetic changes in tetanic Ca2+ transients in enzymatically dissociated muscle fibres under repetitive stimulation. J Physiol. 589 (21), 5269-5283 (2011).
  35. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. Tetanic Ca2+ transient differences between slow- and fast-twitch mouse skeletal muscle fibres: a comprehensive experimental approach. J Muscle Res Cell Motil. 35 (5-6), 279-293 (2014).
  36. Li, R., et al. Development of a high-throughput method for real-time assessment of cellular metabolism in intact long skeletal muscle fibre bundles. J Physiol. 594 (24), 7197-7213 (2016).
  37. Chemello, F., et al. Microgenomic analysis in skeletal muscle: expression signatures of individual fast and slow myofibers. PloS One. 6 (2), 16807(2011).
  38. Williams, D. A., Head, S. I., Bakker, A. J., Stephenson, D. G. Resting calcium concentrations in isolated skeletal muscle fibres of dystrophic mice. J Physiol. 428 (1), 243-256 (1990).
  39. Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and culture of individual myofibers and their satellite cells from adult skeletal muscle. J Vis Exp. (73), e50074(2013).
  40. Brun, C. E., et al. GLI3 regulates muscle stem cell entry into G(Alert) and self-renewal. Nat Commun. 13 (1), 3961(2022).
  41. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. J Physiol. 598 (18), 3793-3801 (2020).
  42. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLoS One. 11 (4), 0147669(2016).
  43. Enríquez, V., Granados, S., Arias, M. P., Calderón, J. C. Muscle fiber types of gluteus medius in the Colombian creole horse. J Equine Vet Sci. 35 (6), 524-530 (2015).
  44. Sartorius, C. A., et al. Myosin heavy chains IIa and IId are functionally distinct in the mouse. J Cell Biol. 141 (4), 943-953 (1998).
  45. Talmadge, R. J., Roy, R. R. Electrophoretic separation of rat skeletal muscle myosin heavy-chain isoforms. J Appl Physiol. 75 (5), 2337-2340 (1993).
  46. Hämäläinen, N., Pette, D. Patterns of myosin isoforms in mammalian skeletal muscle fibres. Microsc Res Tech. 30 (5), 381-389 (1995).
  47. Bolaños, P., Calderón, J. C. Excitation-contraction coupling in mammalian skeletal muscle: Blending old and last-decade research. Front Physiol. 13, 989796(2022).
  48. Gineste, C., et al. Enzymatically dissociated muscle fibers display rapid dedifferentiation and impaired mitochondrial calcium control. iScience. 25 (12), 105654(2022).
  49. Calderón, J. C., Bolaños, P., Caputo, C. The excitation-contraction coupling mechanism in skeletal muscle. Biophys Rev. 6 (1), 133-160 (2014).
  50. Lainé, J., Skoglund, G., Fournier, E., Tabti, N. Development of the excitation-contraction coupling machinery and its relation to myofibrillogenesis in human iPSC-derived skeletal myocytes. Skelet Muscle. 8 (1), (2018).
  51. Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue. Nat Commun. 9 (1), 126(2018).
  52. Cea, L. A., et al. The absence of dysferlin induces the expression of functional connexin-based hemichannels in human myotubes. BMC Cell Biology. 17 (15), 127-136 (2016).
  53. Nakada, T., et al. Physical interaction of junctophilin and the Ca(V)1.1 C terminus is crucial for skeletal muscle contraction. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), 4507-4512 (2018).
  54. Cully, T. R., Edwards, J. N., Murphy, R. M., Launikonis, B. S. A quantitative description of tubular system Ca2+ handling in fast- and slow-twitch muscle fibres. J Physiol. 594 (11), 2795-2810 (2016).
  55. Lim, J. -Y., Frontera, W. R. Single skeletal muscle fiber mechanical properties: a muscle quality biomarker of human aging. Eur J Appl Physiol. 122 (6), 1383-1395 (2022).
  56. Gonzalez, E., Messi, M. L., Zheng, Z., Delbono, O. Insulin-like growth factor-1 prevents age-related decrease in specific force and intracellular Ca2+ in single intact muscle fibres from transgenic mice. J Physiol. 552, 833-844 (2003).
  57. Luedeke, J. D., McCall, R. D., Dillaman, R. M., Kinsey, S. T. Properties of slow- and fast-twitch skeletal muscle from mice with an inherited capacity for hypoxic exercise. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 138 (3), 373-382 (2004).
  58. Asmussen, G., Schmalbruch, I., Soukup, T., Pette, D. Contractile properties, fiber types, and myosin isoforms in fast and slow muscles of hyperactive Japanese waltzing mice. Exp Neurol. 184 (2), 758-766 (2003).
  59. Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57BL6J mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
  60. Wang, L. C., Kernell, D. Fibre type regionalisation in lower hindlimb muscles of rabbit, rat and mouse: a comparative study. J Anat. 199, 631-643 (2001).
  61. Abbassi-Daloii, T., et al. Quantitative analysis of myofiber type composition in human and mouse skeletal muscles. STAR Protoc. 4 (1), 102075(2023).
  62. Tulloch, L. K., Perkins, J. D., Piercy, R. J. Multiple immunofluorescence labelling enables simultaneous identification of all mature fibre types in a single equine skeletal muscle cryosection. Equine Vet J. 43 (4), 500-503 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Izolacja włókien mięśniowychprzejścia wapnioweskład typów włókiencharakterystyka morfometrycznasprzężenie wzbudzenie-skurcztrawienie kolagenaząmikroskopia epifluorescencyjna
Nienaruszone krótkie, pośrednie i długie włókna mięśni szkieletowych uzyskane w wyniku enzymatycznej dysocjacji sześciu mięśni kończyn tylnych myszy: poza zginaczem digitorum brevis
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.