Artykuł metodologiczny

Przestrzenna analiza poziomów ekspresji genów w ścięgnach w wysokiej rozdzielczości

733 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65852

⸱

8 marca 2024

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje, jak przeprowadzić zoptymalizowany protokół in situ dla ścięgien. W tej metodzie omówiono przygotowanie tkanek, przepuszczalność sekcji, konstrukcję sondy i metody wzmacniania sygnału.

Streszczenie

W ostatnich latach opracowano wiele protokołów transkryptomiki o wysokiej rozdzielczości w wielu różnych dziedzinach medycyny i biologii. Jednak tkanki bogate w macierz, a w szczególności ścięgna, pozostały w tyle ze względu na ich niską liczbę komórek, niską ilość RNA na komórkę i wysoką zawartość matrycy, co utrudniało ich analizę. Jednym z najnowszych i najważniejszych narzędzi jednokomórkowych jest analiza przestrzenna poziomów ekspresji genów w ścięgnach. Te narzędzia przestrzenne RNA mają szczególnie duże znaczenie w ścięgnach do lokalizowania określonych komórek nowych i nieznanych populacji, walidacji wyników sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i dodawania kontekstu histologicznego do danych sekwencyjnych RNA pojedynczych komórek. Te nowe metody umożliwią analizę RNA w komórkach z wyjątkową czułością i wykrywanie celów pojedynczej cząsteczki RNA na poziomie pojedynczej komórki, co pomoże w molekularnej charakterystyce ścięgien i będzie promować badania nad ścięgnami.

W tym artykule o metodzie skupimy się na dostępnych metodach analizy poziomów ekspresji genów przestrzennych na odcinkach histologicznych za pomocą nowatorskich testów hybrydyzacji in situ do wykrywania docelowego RNA w nienaruszonych komórkach na poziomie pojedynczej komórki. Po pierwsze, skupimy się na tym, jak przygotować tkankę ścięgna do różnych dostępnych testów i jak wzmocnić sygnały specyficzne dla celu bez szumów tła, ale z wysoką czułością i wysoką swoistością. Następnie w artykule zostaną opisane konkretne metody przenikania, różne konstrukcje sond oraz obecnie dostępne strategie wzmacniania sygnału. Te unikalne metody analizy poziomów transkrypcji różnych genów w rozdzielczości pojedynczej komórki umożliwią identyfikację i charakterystykę komórek tkanki ścięgien w młodych i starszych populacjach różnych modeli zwierzęcych i tkanek ludzkich ścięgien. Metoda ta pomoże również analizować poziomy ekspresji genów w innych tkankach bogatych w macierz, takich jak kości, chrząstki i więzadła.

Wprowadzenie

Ścięgna to tkanki łączne, które umożliwiają przenoszenie siły między mięśniami a kośćmi1. Rozwojowo, tenocyty osiowe pochodzą z komórek mezenchymalnych w obrębie sklerotomu somitów2; ścięgna kończyn wywodzą się z mezodermy płytki bocznej; a ścięgna czaszkowe wywodzą się z linii grzebienia nerwowego czaszki3,4. Ścięgno można scharakteryzować za pomocą ekspresji czynnika transkrypcyjnego twardówki5, chociaż kilka markerów również odgrywa kluczową rolę w rozwoju ścięgien, w tym tenomodulina, irokez i wczesna reakcja wzrostu 1/26,7,8,9.

Pomimo kilku znanych markerów ścięgna, ogólnie rzecz biorąc, bardziej szczegółowa charakterystyka pozostaje wyzwaniem, ponieważ ścięgno zawiera komórki, które rozciągają się w poprzek gradientu właściwości biomechanicznych. Od połączenia mięśniowo-ścięgnistego, ścięgna w środkowej części ciała i bardziej zwapnionego przyczepu ścięgnistego, komórki ścięgien znajdują się w matrycach zewnątrzkomórkowych o różnych właściwościach rozciągania. Ponieważ ścięgno musi wytrzymać naprężenia rozciągające spowodowane różnicą w wytrzymałości mechanicznej między tkanką miękką i twardą, organizacja przestrzenna komórek w ścięgnie jest szczególnie ważna dla jego funkcji. Jednak niewiele wiadomo o tych subpopulacjach ścięgien.

Wiele narzędzi transkryptomicznych przestrzennych o wysokiej rozdzielczości może być użytych do rozpoczęcia wyjaśniania subpopulacji komórek, w tym między innymi do sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki lub hybrydyzacji in situ. Jednakże, podczas gdy te testy profilowania przestrzennego pomagają odkryć ekspresję RNA w tkance po mikrodysekcji lub sekcji, metody te mogą być trudne, gdy są wykonywane na tkance ścięgna. Ścięgna to tkanki bogate w macierz składające się z prawie 86% kolagenu w suchej masie10, co utrudnia ekstrakcję komórek do sekwencjonowania. Ze względu zarówno na komplikacje związane z izolacją komórek od macierzy, hipokomórkowy charakter ścięgna11, jak i stosunkowo niską liczbę RNA, ścięgno jest trudną tkanką do analizy.

W tym artykule prezentujemy metodę optymalizacji nowatorskich testów hybrydyzacji in situ, aby wykorzystać je do ścięgien, zapewniając metody przygotowania tkanek, permeabilizacji i projektowania sond. W połączeniu z istniejącymi technologiami sekwencjonowania, może to pomóc naukowcom w przestrzennym scharakteryzowaniu subpopulacji ścięgien w rozwijających się, dorosłych lub uszkodzonych ścięgnach ze zwiększoną czułością i swoistością testu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) i AAALAC. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z zatwierdzonym protokołem #2013N000062 w Massachusetts General Hospital. W tym badaniu wykorzystano myszy C57BL / J6 (w wieku 5 tygodni i P0). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów, odczynników i przyrządów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie i utrwalenie próbki

  1. Eutanazja myszy w komorze CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy jako wtórna metoda eutanazji. Następnie użyj nożyczek, aby przeciąć tylne kończyny myszy wzdłuż stawu biodrowego12. W fiolce scyntylacyjnej zanurz tylną kończynę myszy w ilości 4% roztworu paraformaldehydu (PFA), aby całkowicie pokryć próbkę, i utrwal tkankę przez 24 godziny < br / > UWAGA: Zamiast 4% PFA, do utrwalania można również użyć 10% formaliny. Po utrwaleniu próbka może być przechowywana w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) do czasu dalszego przetwarzania. Unieruchamiając całą kończynę tylną, jesteśmy w stanie zachować napięcie na ścięgnie i mamy możliwość zbadania przyczepu ścięgnistego, ścięgna środkowego ciała, czy połączenia mięśniowo-ścięgnistego.
  2. Po wyjęciu PFA z fiolki scyntylacyjnej przemywać próbkę przez 3 x 10 minut 1x PBS, dodając tyle PBS, aby pokryć próbkę. Następnie zanurzyć kończyny tylne w 0,5 M EDTA w temperaturze 4 °C z mieszaniem na 1-2 tygodnie, zastępując świeżym EDTA co 2-3 dni.
  3. Po usunięciu EDTA przemyć próbkę przez 3 x 10 minut 1x PBS, odwodnić próbki w 70% EtOH i zanurzyć je w parafinie w pożądanej orientacji. Użyj konwencjonalnych technik cięcia FFPE, aby przeciąć tkankę o grubości 3 μm i przenieść skrawki na traktowane, naładowane szkiełko mikroskopowe (patrz Tabela Materiałów)13.
    UWAGA: Sekcje można przechowywać w temperaturze 4 °C przed przejściem do kolejnych kroków.
  4. Deparafinizacja
    1. Piecz szkiełka na gorącej płycie w temperaturze 60 °C przez 1 godzinę, a następnie pozwól szkiełkom osiągnąć temperaturę pokojową (RT). Aby usunąć wosk parafinowy ze szkiełek, umieść szkiełka na stojaku na szkiełka i opuść je do naczynia barwiącego wypełnionego ksylenem. Powtórz w świeżym ksylenie przez 3 x 5 min.
      UWAGA: Ksylen jest niebezpieczny; Obchodź się ostrożnie.
    2. Aby ponownie nawodnić sekcje, zanurz szkiełka w następujących miejscach na 5 minut na pranie, wszystko w temperaturze pokojowej: umyć 2x w 100% EtOH, 1x w 75% EtOH rozcieńczonym w dH2O, 1x w 50% EtOH rozcieńczonym w PBS, 1x w 25% EtOH rozcieńczonym w PBS i 2x w PBS.
      UWAGA: Wszystkie etapy nawadniania są wykonywane za pomocą szkiełek na stojaku do szkiełek oraz za pomocą różnych roztworów EtOH w naczyniach do barwienia.

2. Protokół RNAscope (skomercjalizowany ISH)14 adaptacja

  1. Przygotowanie roztworów i sond
    1. Przygotować roztwór TEG do wstępnej obróbki pokrojonych próbek, łącząc 25 mM Tris-HCl o pH 8, 10 mM EDTA i 50 mM glukozy. Przygotować objętość wystarczającą dla wszystkich próbek, które mają być poddane obróbce, lub przygotować nadmiar; filtrować-sterylizować i przechowywać w RT; Dokładnie wymieszaj roztwór przed użyciem.
    2. Przygotuj wystarczającą ilość 1x bufora do płukania (patrz tabela materiałów) do wszystkich prań i przechowuj go w RT.
    3. W łaźni wodnej lub inkubatorze o temperaturze 40 °C ogrzewać sondy przez 10 minut. Następnie przygotuj sondy zgodnie z protokołem ISH14.
  2. Obróbka wstępna próbek
    1. Zamiast stosować zalecany roztwór do obróbki wstępnej, należy zanurzyć szkiełka w naczyniu barwiącym zawierającym bufor TEG na 4 godziny w temperaturze 60 °C.
      UWAGA: Inkubacja buforu TEG może być przedłużona do 6 godzin, jeśli tkanka jest szczególnie gęsta lub jeśli odzyskanie antygenu interesującego motywu wiązania RNA jest trudne. W takim przypadku można dodać punkt zatrzymania, wysuszyć szkiełka i przechowywać je przez noc w lodówce o temperaturze 4 °C.
    2. Wyjąć próbki z buforu i pozostawić do wyschnięcia. Następnie narysować próbki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego, zanurzyć je w innym naczyniu barwiącym zawierającym proteazę IV i inkubować w piecu przez 45 minut w temperaturze 40 °C.
      UWAGA: Zalecamy proteazę IV dla dorosłych myszy. W przypadku korzystania z młodszych myszy, takich jak P0, zalecamy stosowanie łagodniejszego enzymu, takiego jak proteaza III, przez 30 minut. Podczas rozwiązywania problemów dla różnych grup wiekowych obserwuj integralność ścięgna i sprawdź, czy nie ma degradacji. Jeśli tkanka dysocjuje lub ulega degradacji, skróć czas inkubacji lub zmień zastosowaną proteazę.
    3. Ponownie umyj próbki w buforze TEG przez 30 minut, a następnie zhybrydyzuj sondy zgodnie z protokołem ISH14.
    4. Dodać 50-100 μl odczynnika montażowego na próbkę. Umieść szkiełko nakrywkowe na próbkach do mikroskopii. Podczas obrazowania użyj dużego powiększenia (obiektyw 40x lub większy), aby view sygnał.

3. Protokół HCR ISH15 adaptacja

  1. Postfiksacja
    1. Przygotuj 4% PFA (w PBS), roztwór PBT (0,1% Tween-20 w PBS) i proteinazę K w PBS (stężenie podstawowe 10 mg/ml, stężenie końcowe 5 μg/ml).
    2. Aby rozpocząć pierwszy etap postfix, zanurz szkiełka w naczyniu barwiącym zawierającym 4% PFA na 5 minut, a następnie usuń 4% roztwór PFA i przechowuj go do użycia w późniejszych krokach. Płukać szkiełka przez 2 x 5 minut w roztworze PBT i usunąć roztwór PBT. Umieścić szkiełka w naczyniu barwiącym zawierającym roztwór proteinazy K (5 μg/ml) na 5 minut i wypłukać je w roztworze PBT 2 x 5 min.
    3. Rozpocznij drugi krok przyrostkowy i zanurz szkiełka w 4% PFA na 5 min.
      UWAGA: Jest to te same 4% PFA zapisane w kroku 3.1.2.
    4. Płukać szkiełka przez 3 x 5 minut w roztworze PBT.
      UWAGA: Wszystkie etapy postfiksacji są wykonywane za pomocą szkiełek na stojaku do slajdów oraz w naczyniach barwiących zawierających odpowiednie roztwory.
  2. Acetylacja
    1. Przygotować roztwór acetylacyjny zawierający 625 μl bezwodnika octowego, 3,3 ml 1 M buforu trietanoloaminy (TEA) i 246 ml ddH2O. Pamiętaj, aby dobrze wymieszać i użyć natychmiast po przygotowaniu.
    2. Umieść szkiełka w roztworze acetylacyjnym na 10 minut, a następnie spłucz 3 x 5 minut w roztworze PBT. Opłucz szkiełka w ddH2O i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 30 minut. Następnie obrysuj próbki za pomocą hydrofobowego pisaka barierowego.
      UWAGA: Wszystkie etapy acetylacji są wykonywane za pomocą szkiełek na stojaku do szkiełek oraz w naczyniach barwiących zawierających odpowiednie roztwory
  3. krzyżowanie
    1. Podgrzej bufor hybrydyzacyjny do temperatury 37 °C i ogrzej wilgotną komorę do temperatury 37 °C.
      UWAGA: Bufor zawiera formamid, materiał niebezpieczny. Jeśli szkiełka nie są wystarczająco suche, osusz krawędzie chusteczką laboratoryjną, aby usunąć nadmiar dH2O.
    2. Przygotować roztwory sondy, dodając 0,4 pmol każdej mieszaniny sondy do 100 μl buforu hybrydyzacyjnego.
      UWAGA: W przypadku korzystania z obrazowania dHCR należy użyć sondy o wyższym stężeniu, aby poprawić wydajność hybrydyzacji sondy.
    3. Przygotować 4 l buforu cytrynianu sodu chlorku sodu (20x SSC), łącząc 3 M NaCl (701,1 g NaCl w końcowej objętości 4 l) i 0,3 M Na3CH6H5O7•2H2O (352,8 g), a następnie dostosowując końcowe pH do 7 przez dodanie HCl lub 10 N NaOH. Dodać tyleH2O, aby osiągnąć 4 L. Przygotować 5x SSCT, rozcieńczając 20x SSC do 5x i dodając tyle 10% Tween 20, aby uzyskać 0,1% całkowitej objętości.
    4. Dodać 200 μl buforu hybrydyzacyjnego do próbki, umieścić szkiełka w wilgotnej komorze i pozostawić szkiełka do inkubacji przez 10 minut. Usunąć roztwór hybrydyzacyjny i odcedzić nadmiar buforu na szkiełku, osuszając krawędzie chusteczką laboratoryjną.
    5. Dodać 100 μl przygotowanego roztworu sondy na próbkę i umieścić szkiełko nakrywkowe na próbce. Inkubować w piecu przez noc lub przez około 12-16 godzin w komorze nawilżonej roztworem zawierającym 5x SSC i 50% formamidu. Ustaw temperaturę na 37 °C.
      UWAGA: Ponieważ inkubacja odbywa się przez noc, dodanie szkiełka nakrywkowego ma na celu zminimalizowanie parowania.
    6. Pozostawić podwielokrotność 5 x roztworu SSCT w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, a drugą podwielokrotność w temperaturze pokojowej uwagi. Przewidywać potrzebne objętości tych podwielokrotności w oparciu o numer próbki i liczbę przemyć w następnym kroku.
  4. mycie
    1. Korzystając z uprzednio podgrzanego roztworu 5x SSCT, przygotuj 75% roztwory buforu do płukania/25% 5x SSCT, 50% buforu do płukania/50% 5x SSCT i 25% buforu do płukania/75% 5x roztworu SSCT.
    2. Aby usunąć nadmiar sond, zanurz szkiełka szeregowo na 15 minut na pranie w temperaturze 37 °C w 75% buforze do płukania/25% 5x SSCT, 50% buforze do płukania/50% 5x SSCT i 25% buforze do płukania/75% 5x SSCT. Pozwolić, aby szkiełka nakrywkowe odpłynęły od próbek.
    3. Inkubować szkiełka 2 x 15 min ze 100% 5x SSCT, a następnie zanurzyć je w 5x SSCT na 5 minut przy RT.
      UWAGA: Etapy mycia można wykonać za pomocą szkiełek na stojaku do szkiełek oraz w naczyniach do barwienia zawierających odpowiednie roztwory lub z roztworami dodawanymi w postaci kropel.
  5. wzmocnienie
    1. Przygotować 6 pmol spinki do włosów h1 i 6 pmol spinki h2 poprzez błyskawiczne schłodzenie 2 μl bulionu o wielkości 3 μM (podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 90 s i schłodzić do temperatury RT). Podczas tego procesu należy chronić spinki do włosów przed światłem.
      UWAGA: Spinki do włosów HCR h1 i h2 są dostarczane w buforze do przechowywania spinek do włosów i są gotowe do natychmiastowego chłodzenia. Zatrzaśnij fajne spinki do włosów h1 i h2 w osobnych tubkach.
    2. Osusz szkiełka, osuszając ich krawędzie chusteczką laboratoryjną. Następnie dodać 200 μl buforu amplifikacyjnego na wierzch próbki i umieścić ją w wilgotnej komorze na 30 minut w temperaturze pokojowej. Przygotować mieszaninę spinek do włosów, dodając schłodzone zatrzaskowo spinki do włosów h1 i spinki do włosów h2 chłodzone zatrzaskowo do 100 μl buforu wzmacniającego w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć bufor wzmacniający i spuścić nadmiar płynu ze szkiełka, osuszając krawędzie chusteczką laboratoryjną. Dodać 100 μl wcześniej przygotowanej mieszanki spinki do włosów i umieścić parafilm na wierzchu próbki. Inkubować szkiełka przez co najmniej 4 godziny lub przez noc w ciemnej, wilgotnej komorze o temperaturze pokojowej.
    4. Aby usunąć nadmiar spinek do włosów, zanurz szkiełka w 5x SSCT w naczyniu barwiącym i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Powtórz mycie w świeżym 5x SSCT przez 30 minut, a trzeci raz przez 5 minut.
    5. Osuszyć szkiełka, osuszając krawędzie chusteczką laboratoryjną i dodać 50-100 μl odczynnika montażowego na wierzch próbki. Umieść szkiełko nakrywkowe na próbkach do mikroskopii. Podczas obrazowania użyj dużego powiększenia (obiektyw 40x lub większy), aby view sygnał.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Ekspresja RNA Poly A w ścięgnie Achillesa dorosłej myszy za pomocą RNAScope. Reprezentatywny obraz udanego znakowania Poly A w ścięgnie Achillesa myszy (lewy panel) przy użyciu skomercjalizowanego testu ISH. Kolokalizacja z DAPI potwierdza specyfikę sondy (środkowy i prawy panel), pozwalając na kontrolę szumów tła. Zdjęcia zostały wykonane z powiększeniem 63x za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SPE. Podziałka = 20 μm. Skróty: ISH = hybrydyzacja in situ; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Ekspresja RNA Poly A w ścięgnie Achillesa myszy P0 za pomocą RNAScope. Reprezentatywny obraz udanego znakowania Poly A w kości piętowej myszy P0 (lewy panel) przy użyciu skomercjalizowanego testu ISH. Kolokacja z DAPI i minimalny szum tła potwierdzają specyfikę sondy (środkowy i prawy panel). Ścięgno jest oznaczone linią przerywaną. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu ZEISS Axio Imager. Podziałka = 20 μm. Skróty: ISH = hybrydyzacja in situ; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ten protokół pomoże badaczom wykorzystać dostępne na rynku narzędzia do hybrydyzacji in situ i dostosować je do stosowania w tkance ścięgien dorosłych. To ostatecznie pozwala nam analizować poziomy transkrypcji różnych genów w przestrzennie informowanej rozdzielczości pojedynczej komórki. Pomyślne przeprowadzenie testu ISH będzie charakteryzować się wysoką swoistością dla celów będących przedmiotem zainteresowania i minimalnym szumem tła. Protokół może być stosowany zarówno w ścięgnach Achillesa u dorosłych, jak i u noworodków (Rysunek 1, Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4). Poly A może być używany jako kontrola, aby pomóc w walidacji udanego przebiegu poprzez jakościowe potwierdzenie, że w próbce występują oczekiwane poziomy RNA.

Istnieje jednak kilka sposobów, w jakie protokoły ISH mogą wymagać rozwiązania problemów. Na przykład, Rysunek 5 pokazuje niewystarczającą hybrydyzację poli A w ścięgnie, tak że kilka obszarów ścięgna nie miało sygnału Poly A, mimo że przeciwbarwienie DAPI pokazujące, że komórki były rzeczywiście obecne. Ponadto, jeśli tkanka jest nadmiernie trawiona na etapach postfiksowych w HCR poprzez wydłużony czas inkubacji proteinazy K (Figura 6) lub na etapach wstępnego leczenia w RNAScope poprzez przedłużoną inkubację proteazy IV, wówczas morfologia tkanki może zostać zakłócona. Na koniec, Rysunek 7 jest przykładem tego, jak wyglądałaby kontrola negatywna, gdyby sonda hybrydyzacji RNA nie została dodana, ale nadal używana jest przeciwbarwienie jądrowe.

figure-results-3
Rysunek 3: Ekspresja RNA twardówki w ścięgnie Achillesa dorosłej myszy przy użyciu HCR. Reprezentatywny obraz udanego znakowania RNA twardówki w ścięgnie Achillesa dorosłej myszy (lewy panel) przy użyciu HCR. DAPI jest używany jako przeciwbarwnik jądrowy (panel środkowy). Kolokalizacja z DAPI potwierdza specyfikę sondy (prawy panel). Zdjęcia zostały wykonane z powiększeniem 63x za pomocą mikroskopu konfokalnego Leica SPE. Podziałka = 20 μm. Skróty: HCR = reakcja łańcuchowa hybrydyzacji; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Ekspresja RNA Poly A w ścięgnie Achillesa myszy P0 przy użyciu HCR. Reprezentatywny obraz znakowania RNA Poly A w ścięgnie Achillesa myszy P0 przy użyciu HCR. DAPI i Poly A oznaczają zarówno kość, jak i ścięgno Achillesa na kości piętowej (odpowiednio lewy i prawy panel). Kolokalizacja sond DAPI i Poly A w obu tkankach oraz minimalny szum tła potwierdzają pomyślne uruchomienie HCR (prawy panel). Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu ZEISS Axio Imager. Podziałka = 20 μm. Skróty: HCR = reakcja łańcuchowa hybrydyzacji; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Nieudany przebieg HCR z sondami RNA Poly A w ścięgnie Achillesa myszy P0. Reprezentatywny obraz nieudanego znakowania RNA Poly A w ścięgnie Achillesa myszy P0 przy użyciu HCR. DAPI znakowało jądra w kości i ścięgnie kości piętowej (lewy panel), ale sonda Poly A HCR nie przenikała przez całe ścięgno (środkowy i prawy panel, patrz białe groty strzałek). Jednak Poly A z powodzeniem oznaczył większość kości. Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu ZEISS Axio Imager. Podziałka = 20 μm. Skróty: HCR = reakcja łańcuchowa hybrydyzacji; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Przykład znakowania HCR Poly-A u nadmiernie strawionego ścięgna Achillesa dorosłej myszy. Reprezentatywny obraz znakowania RNA Poly A w nadmiernie strawionym ścięgnie Achillesa dorosłej myszy przy użyciu HCR. Poly A i DAPI prawidłowo kolokalizują się w tej próbce (prawy panel), ale typowa jednoosiowa morfologia ścięgna jest zaburzona (białe groty strzałek). Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu ZEISS Axio Imager. Podziałka = 20 μm. Skróty: HCR = reakcja łańcuchowa hybrydyzacji; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-7
Rysunek 7: Negatywna kontrola RNAscope Poly A w ścięgnie Achillesa dorosłej myszy. Reprezentatywny obraz kontroli ujemnej znakowania Poly A RNA, w którym nie dodano sondy Poly A, ale sondy amplifikacyjne zostały dodane. Zgodnie z oczekiwaniami, DAPI pomyślnie oznaczył jądro (lewy panel), ale nie było sygnału dla Poly A (środkowy panel). Zdjęcia wykonano za pomocą mikroskopu ZEISS Axio Imager. Podziałka = 20 μm. Skrót: DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym artykule opisujemy modyfikacje wprowadzone w celu wykorzystania istniejących narzędzi ISH tak, aby mogły być stosowane w tkance ścięgien z wysokim stopniem swoistości i czułości. Ponieważ ścięgno jest tkanką o dużej gęstości macierzy, często konieczne jest dostosowanie protokołu, aby osiągnąć podobny stopień penetracji sondy i swoistości. Te specyficzne metody przepuszczalności i strategie wzmacniania sygnału tkanki ścięgna są integralną częścią poprawy skuteczności omawianych protokołów ISH. Bez tych kroków trudno jest sondom mieć silną i specyficzną interakcję z RNA w ścięgnie.

W RNAscope14 należy dokonać korekt w zastosowanym buforze do obróbki wstępnej, aby protokół działał skuteczniej w tkance ścięgna. Mówiąc dokładniej, zastosowanie buforu TEG jako obróbki wstępnej poprawia dostęp sond do docelowego RNA. Oprócz buforu TEG, leczenie proteazą IV jest przedłużone poza standardowy czas, tak że trwa od 45 minut do 1 godziny. W HCR15 długość płukania została zwiększona, a przed rozpoczęciem testu RNA-FISH dodano etapy przyrostkowe. Etapy postfiksowe obejmowały dodanie etapów inkubacji w 4% PFA, PBT, proteinazie K i roztworze acetylacyjnym. Łącznie modyfikacje te pomagają poprawić dostęp sondy do RNA ścięgna i zredukować szum tła16,17. Jednakże, chociaż te modyfikacje protokołu pomagają zwiększyć specyficzność i czułość sond stosowanych w ISH poprzez modyfikację stosowanych roztworów do obróbki wstępnej i dodanie etapów postfiksacji w celu zwiększenia dostępności wiązania sondy z RNA, istnieją ograniczenia wynikające z konstrukcji sondy.

Aby złagodzić wyzwania związane z dostępnością RNA dla sond, można wprowadzić dodatkowe modyfikacje w celu optymalizacji testów ISH. Jeśli będzie stosowane obrazowanie dHCR - metoda cyfrowej bezwzględnej oceny ilościowej mRNA15 - zaleca się zwiększenie stężenia sondy w celu poprawy wydajności hybrydyzacji sondy. Co więcej, zastosowanie krótszego okresu na etapach amplifikacji zapewnia, że kropki pojedynczej cząsteczki są ograniczone dyfrakcją. Dłuższe okresy inkubacji mogą skutkować wyższą autofluorescencją mięśnia podczas obrazowania. Jeśli wybrane ścięgno jest gęstsze i/lub większe niż dorosłe mysie ścięgno Achillesa, zalecamy wydłużenie czasu trwania etapu mocowania PFA do 4%.

Te modyfikacje wyżej wymienionych komercyjnych protokołów ISH są najbardziej pomocne w przypadku dorosłej tkanki mysiej lub gęstszych tkanek, które wymagają dłuższego etapu wstępnego leczenia lub utrwalenia. Chociaż te modyfikacje istniejących protokołów pomagają poprawić dostępność sond do RNA, niektóre sondy mogą wymagać wyższego stężenia lub dłuższego czasu inkubacji u starszych myszy niż u młodszych myszy lub noworodków, w zależności od dostępności docelowych motywów RNA, z którymi sondy będą się wiązać w różnych kohortach wiekowych. Jeśli chodzi o stosowanie proteazy na etapach wstępnego leczenia RNAscope, zalecamy stosowanie proteazy IV przez 45 minut w przypadku ścięgien dorosłych myszy, ale proteazy III przez 30 minut w przypadku ścięgien noworodków. Aby ocenić skuteczność testu, ocenić wszelkie dostosowania protokołu lub ogólnie porównać ekspresję między próbkami, można zastosować kilka kontroli. Na przykład sondę Poly A można porównać z przeciwbarwieniem jądrowym używanym do oceny specyficzności przebiegu, do oceny rozkładu/degradacji RNA w próbce oraz do potwierdzenia, że RNA było dostępne dla sond. Podobnie, sondy genów porządkowych mogą również służyć jako kontrola dostępu do RNA. Kontrole dodatnie z celami, które mają znane wzorce ekspresji, pomagają potwierdzić swoistość, a kontrole ujemne pomogą ocenić potencjalne niespecyficzne wiązanie.

Ogólnie rzecz biorąc, w związku z tym, że opracowywanych jest kilka technik mających na celu lepsze zrozumienie przestrzennego profilu ekspresji genów w tkankach, potrzeba więcej metod do walidacji wyników. W szczególności testy takie jak sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki stają się popularnymi narzędziami do oceny ekspresji genów, ale ich wyniki muszą być badane przestrzennie w wyższej rozdzielczości. Aby w tym pomóc, testy ISH mogą być wykorzystywane do lepszego zrozumienia i walidacji kontekstu przestrzennego danych transkryptomicznych generowanych przez bardziej ilościowe testy. W ścięgnach parowanie, takie testy, pomoże w dalszym scharakteryzowaniu komórek znajdujących się w poprzek przyczepu ścięgnistego, ścięgna środkowego ciała i połączenia mięśniowo-ścięgnistego poprzez przestrzenną walidację markerów specyficznych dla unikalnych populacji komórek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Jennie Galloway i członkom Galloway Lab za wsparcie i zachętę w rozwoju i rozwiązywaniu problemów z tymi protokołami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 M bufor
10% roztwór
10% Tween-20
20x Bufor
soli fizjologicznej 4% PFA
ACD RNAscope Zestaw odczynników fluorescencyjnych Multiplex V2ACD323100
octowy Bezwodnik
Axio Mikroskop MikroskopZEISS
C57BL/J6 myszy JAX ID: 000664
Szkiełka nakrywkoweFisher 12-541-042
ddH2O
ETDAThermofisherAM9262
EtOH
GlukozaVWR Chemicals BDHBDH9230-500G
HCR RNA-FISH BundleMolecular Instruments Inc.
System hybrydyzacji HybEZ IIPióro barierowe ACD
ImmedgeVector LaboratoriesH4000
Mikroskop konfokalny Leica SPE Sól fizjologicznaLeica
ParafilmFisher
(PBS, 1x)InvitrogenAM9625Rozcieńczyć 10x PBS w wodzie mili-Q, aby uzyskać 1x roztwór
Proteinaza
RNAscope H2O2 i odczynniki proteazyACDPN 322381zawarte w zestawie odczynników fluorescencyjnych ACD RNAscope Multiplex V3
Zestaw do wykrywania fluorescencyjnego RNAscope MultiplexACDPN 323110Zawarte w ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2
Odczynniki RNAscope Target RetrievalACD322000Zawarte w ACD RNAscope Fluorescent Multiplex Fluorescent Reagent Kit V4
RNAscope Wash BufferACDPN 310091Zawarte w ACD RNAscope Fluorescencyjny Multiplex Zestaw odczynników fluorescencyjnych V5
RNAscope  Rozcieńczalniksondy ACD300041
Uchwyt do szkiełekStatLab4465A
Naczynie barwiące z pokrywkąStatLabLWS20WH
Superfrost Plus Szkiełka mikroskopoweFisher1255015poddane obróbce, naładowane szkiełka
Tris-HCl
KsylenSigma-Aldrich534056-4L
trietanoloaminyformalinycytrynianu sodu buforowana fosforanem proteazy IV Roche 3115836001

Bibliografia

  1. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
  2. Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
  3. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  4. Chen, J. W., Galloway, J. L. The development of zebrafish tendon and ligament progenitors. Development. 141 (10), 2035-2045 (2014).
  5. Schweitzer, R., et al. Analysis of the tendon cell fate using Scleraxis, a specific marker for tendons and ligaments. Development. 128 (19), 3855-3866 (2001).
  6. Tsai, S., Nödl, M., Galloway, J. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics. 250 (3), 393-413 (2021).
  7. Kannus, P., et al. Location and distribution of non-collagenous matrix proteins in musculoskeletal tissues of rat. The Histochemical Journal. 30 (11), 799-810 (1998).
  8. Kannus, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 10 (6), 312-320 (2000).
  9. Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
  10. Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
  11. Grinstein, M., et al. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
  12. Villaseñor, S., Grinstein, M. Two-photon microscopy for the study of tendons. Journal of Visualized Experiments. , e65853(2023).
  13. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  14. Wang, F., et al. RNAscope®: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  15. Choi, H. M. T., et al. Third-generation situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), 165753(2018).
  16. Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53968(2016).
  17. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przestrzenna ekspresja gen wtkanka ci gnistahybrydyzacja in situpojedyncze kom rki RNAmetody transkryptomicznewzmacnianie sygna uprojektowanie sondtkanki bogate w macierzskrawki histologiczneanaliza ekspresji gen w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły