Mikroskopia dwufotonowa do badania ścięgien

Podsumowanie

Ten artykuł opisuje proces przygotowania, ustawiania i obrazowania ścięgien za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Dodatkowo obejmuje zastosowanie SHG do analizy wyrównania włókien kolagenowych i tworzenia reprezentacji 3D ścięgien. Metodologia ta okazuje się bardzo cenna w charakterystyce komórek ścięgien i ich ECM podczas urazu i rozwoju.

Streszczenie

Mikroskopia dwufotonowa stała się potężnym narzędziem do oceny głębokich komórek tkankowych i charakteryzowania wyrównania macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) w różnych systemach biologicznych. Technika ta opiera się na nieliniowych oddziaływaniach światło-materia w celu wykrycia dwóch odrębnych sygnałów: sygnału dyfuzyjnego generowanego przez drugą harmoniczną (SHG), który ułatwia wizualizację włókien kolagenowych i ich orientacji, oraz sygnału wzbudzenia w bliskiej podczerwieni do obrazowania autofluorescencji wzbudzonej ultrafioletem.

Obrazowanie SHG okazuje się szczególnie skuteczne w wizualizacji włókien kolagenowych ze względu na niecentryczną strukturę krystaliczną fibrylarnego kolagenu I. Biorąc pod uwagę, że ścięgna są tkankami bogatymi w macierz z ograniczoną liczbą komórek, ich wysoka zawartość kolagenu sprawia, że są idealnymi kandydatami do analizy przy użyciu mikroskopii dwufotonowej. W związku z tym mikroskopia dwufotonowa stanowi cenny środek do analizy i charakterystyki nieprawidłowości kolagenu w ścięgnach. Jego zastosowanie rozciąga się na badanie rozwoju ścięgien, urazów, gojenia i starzenia się, umożliwiając kompleksową charakterystykę komórek ścięgien i ich interakcji z ECM w różnych warunkach przy użyciu narzędzi do mikroskopii dwufotonowej. Protokół ten przedstawia zastosowanie mikroskopii dwufotonowej w biologii ścięgien i przedstawia dostosowaną metodologię w celu uzyskania skutecznego obrazowania i charakterystyki komórek ścięgien podczas rozwoju i po urazie. Metoda ta pozwala na wykorzystanie cienkich mikroskopijnych skrawków w celu stworzenia kompleksowego obrazu ECM w ścięgnach i komórkach, które oddziałują z tą matrycą. W szczególności w artykule przedstawiono technikę generowania obrazów 3D za pomocą mikroskopii dwufotonowej w modelach zwierzęcych.

Wprowadzenie

Aby prawidłowo funkcjonować i przekazywać siłę z mięśnia na kość¹, ścięgna polegają na międzycząsteczkowych i wewnątrzcząsteczkowych wiązaniach między włóknami kolagenowymi. Skomplikowany samoorganizacja, sieciowanie i wyrównanie włókien kolagenowych skutkują ustanowieniem wysoce zorganizowanej matrycy, która przyczynia się do biomechanicznej wytrzymałości i elastyczności tkanki ścięgna^2,3,4. Chociaż inne białka ECM również przyczyniają się do stabilności sieci fibrylarnej w ścięgnach⁵, sucha masa ścięgna to około 86% collagen⁶, przy czym kolagen I stanowi do 96% całkowitej zawartości kolagenu^7,8. To ostatecznie sprawia, że struktura kolagenu jest kluczowym wyjściem dla prawidłowego zdrowia i funkcji ścięgien.

Niektóre metody obrazowania klinicznego stosowane do ścięgien to MRI i/lub ultradźwięki. Podczas gdy technologia ultrasonograficzna dostarcza obrazów struktury pęczkowej ścięgna i ujawnia część struktury fibrylarnej w tissue⁹, rozdzielczość nie jest idealna do kwantyfikacji. MRI ma lepszą rozdzielczość przestrzenną niż obrazowanie ultrasonograficzne, ale nadal jest ograniczona. Jednak metody te są również ograniczone pod względem potencjalnej głębokości obrazowania przez tkankę. W bardziej mikroskali do oceny struktury włókienek kolagenowych i ewentualnych nieprawidłowości można wykorzystać mało- i szerokokątne rozpraszanie światła oraz mikroskopię konfokalną.

Natomiast mikroskopia generacji drugiej harmonicznej (SHG) różni się od innych metod obrazowania, ponieważ może uchwycić zewnętrzną powłokę włókien kolagenowych. Włókna kolagenu I w ścięgnach są zorganizowane w jednoosiowy sposób równoległy przez ECM ścięgna i mają charakter niecentryczny^4,10. Właściwości te można wykorzystać do obrazowania za pomocą mikroskopu wielofotonowego, który może uzyskać wyraźne obrazy, które są do 2-3 razy głębsze niż obrazowanie konfokalne¹¹. Pozwala nam to również na generowanie lepszej jakości odcinków optycznych ścięgna. Kiedy światło jest rzutowane na badaną próbkę, wytwarzany jest sygnał SHG i to rozpraszanie światła może zostać uchwycone. W ścięgnach daje to obraz struktury i wyrównania kolagenu, co pozwala nam ocenić potencjalne morfologiczne i patologiczne konsekwencje tendinopatii, urazów itp.

Ponieważ kolagen stanowi większość suchej masy ścięgien i przyczynia się do ich funkcjonowania^6,12, zakłócenia w strukturze kolagenu mogą wpływać na właściwości biomechaniczne ścięgien. W związku z tym analiza jego struktury może pomóc nam lepiej zrozumieć wpływ i ciężkość urazów, a także stworzyć metrykę skuteczności leczenia. W artykule dokonano przeglądu metody wykorzystującej mikroskopię wielofotonową i SHG do analizy, w jaki sposób rozwój i urazy wpływają na strukturę i wyrównanie włókienek kolagenu I oraz do generowania obrazów 3D ECM ścięgien w modelach zwierzęcych. Dlatego nasza metoda obrazowania ścięgien może pomóc naukowcom scharakteryzować komórki ścięgien i ECM podczas rozwoju lub po urazie.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protokół #2013N0000062) oraz AAALAC w Massachusetts General Hospital. W niniejszym badaniu wykorzystano BHLHE40 myszy z nokautem zerowym lub heterozygotycznych samic myszy w tle Scx-GFP, w wieku 30 dni. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Przygotowanie i utrwalenie tkanek

1. Aby przygotować tkankę, należy poddać myszy eutanazji w komorze CO₂ (zgodnie z instytucjonalnie zatwierdzonymi protokołami), a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
2. Aby zmniejszyć ilość sierści, która może przyklejać się do próbki tkanki, spryskaj mysz 70% EtOH, aż futro zostanie nasycone. Oskóruj tylne kończyny, a następnie za pomocą nożyczek usuń dwie tylne kończyny, przecinając staw biodrowy.
3. Umieścić dwie tylne kończyny w fiolce scyntylacyjnej o pojemności 20 ml i zanurzyć je w 4% PFA, tak aby fiolka została napełniona. Umieścić fiolki w temperaturze 4 °C z mieszaniem przez noc.
4. Myć kończyny tylne w 1x PBS w temperaturze pokojowej (RT) z mieszaniem przez 10 minut i powtórzyć w sumie 3 razy. Zanurzyć kończyny tylne w 0,5 M EDTA (pH 8,0) w temperaturze 4 °C z mieszaniem na okres do 2 tygodni, zastępując świeżym EDTA co 2-3 dni.
5. Myć kończyny tylne w 1x PBS w temperaturze pokojowej z mieszaniem przez 10 minut, powtarzając mycie w sumie 3 razy.
6. Zanurz kończyny w świeżym 1x PBS i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu, aż zostaną użyte do obrazowania.

2. Przerwanie ścięgna i przygotowanie tkanki do obrazowania

1. Trzymając stopę kleszczami, wsuń jeden koniec ostrza nożyczek sprężynowych (patrz Tabela materiałów) pod ścięgno Achillesa i upewnij się, że tniesz jak najbliżej połączenia mięśniowo-ścięgnistego.
2. Przytrzymaj odcięty mięśniowaty koniec ścięgna kleszczami i użyj nożyczek sprężynowych, aby wyciąć ścięgno jak najbliżej kości.
   UWAGA: W razie potrzeby użyj kleszczy, aby utrzymać ścięgno Achillesa z dala od reszty kończyny tylnej podczas pierwszego cięcia. Upewnij się, że nie zmiażdżysz ani nie uszkodzisz tkanki, ponieważ wpłynie to na wyrównanie kolagenu podczas obrazowania.
3. Aby przepuszczalność i uzyskanie przeciwbarwienia jądrowego, zanurz wycięte ścięgno w PBT (1% Triton-X w PBS) z 0,1% Draq5 (stężenie podstawowe, 5 mM, patrz Tabela materiałów). Umieść ścięgno w probówce do mikrowirówki o pojemności 2 ml i dodaj 1 μl Draq5 do 1 ml PBT. Inkubować przez noc w RT na bujaku. Ponieważ Draq5 jest wrażliwy na światło, przykryj probówki mikrowirówek folią aluminiową i chroń próbki przed światłem.
4. Przed obrazowaniem usuń roztwór Draq5 i zastąp go dPBS. Upewnij się, że nadal chronisz próbkę przed światłem.
   UWAGA: Draq5 ma toksyczność kategorii trzeciej i jest uważany za niebezpieczny przez normę OSHA dotyczącą informowania o zagrożeniach. Unikaj kontaktu i wyrzuć go do oznakowanego pojemnika na odpady.
5. Za pomocą dziurkacza do biopsji o średnicy wewnętrznej 6 mm wytnij kawałek pianki żelowej (patrz Tabela Materiałów) i umieść go na małej szalce Petriego o wymiarach 60 x 15 mm. Dodaj ddH₂O do naczynia, aby żelowa piana mogła się rozszerzyć.
6. Umieść wypreparowane ścięgno Achillesa na piance żelowej. Używając szkiełka nakrywkowego przyklejonego do podkładki, ostrożnie umieść podkładkę na ścięgnie, aż szkiełko nakrywkowe zetknie się z tkanką. Aby uniknąć problemów podczas obrazowania, upewnij się, że między próbką a szkiełkiem nakrywkowym nie ma pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby dodać więcej ddH₂O do naczynia, aby przykryć próbkę i myjkę szkiełkiem nakrywkowym.

3. Obrazowanie za pomocą mikroskopu wielofotonowego

1. Za pomocą wielofotonowego mikroskopu laserowego FVMPE-RS, obiektywu 25x, który można zanurzyć w wodzie, lasera impulsowego na podczerwień HPDS-O i lasera impulsowego na podczerwień (patrz tabela materiałów), zlokalizuj próbkę i obszar zainteresowania, które zostaną zobrazowane za pomocą ścieżki światła EPI. Po zlokalizowaniu próbki ustaw kamerę na mięśniowatym lub przyczepnym końcu ścięgna Achillesa.
2. Przełącz ścieżkę światła na LSH, dostosuj ustawienie lasera IR Laser 2 na 840 nm i aktywnie wyrównaj. Dostosuj siłę HV, aby móc zobaczyć tkankę i sygnał SHG, nie przekraczając 20%. Nie reguluj wzmocnienia i utrzymuj przesunięcie równe 0.
3. Następnie skonfiguruj parametry z-stack, aby uzyskać przykładowe obrazy. Użyj rozmiaru skanowania 1024 x 1024 i ustaw rozmiar kroku na 0,4 mikrona. Stosy Z mają średnio około 150 warstw i zaczynają się od zewnętrznej osłonki i przesuwają się w kierunku środka ścięgna, aż sygnał SHG nie jest już wyraźny, tworząc strzałkowe przekroje optyczne¹³.
4. Dostosuj moc lasera do trybu Bright Z, aby umożliwić standaryzację wykrywania sygnału. Po ustaleniu parametrów start/stop Z-stack ustaw intensywność lasera od 4 na początku obrazowania i 6 na końcu obrazowania. Pomaga to utrzymać spójność sygnalizacji SHG, ponieważ obraz z zakresu jest głębszy w tkance.
5. Po wygenerowaniu stosów z przetwarzaj je dalej w ImageJ/FIJI, aby utworzyć film z przekrojami optycznymi w orientacji poprzecznej. Aby to zrobić, otwórz ImageJ/FIJI software¹⁴ i kliknij Image > Stacks > Reslice. Pozwoli nam to na uzyskanie poprzecznego widoku ścięgna Achillesa, odsłaniając gwiaździstą morfologię tenocytów i ich orientację w macierzy kolagenowej.

Wyniki

Ten protokół jest przydatny do charakteryzowania komórek ścięgien i ich macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) po urazie, podczas rozwoju lub w stanie zmutowanym. Dzięki starannemu rozbiorowi i przygotowaniu próbki, przez tkankę można wygenerować filmy ze stosem z w orientacji strzałkowej (Wideo 1 i Wideo 2). Używając ImageJ/FIJI do przetwarzania i ponownego cięcia obrazów, tworzony jest poprzeczny widok ścięgna Achillesa (Filmy 3 i Wideo 4). Ujawnia to gwiaź...

Dyskusja

W artykule przedstawiono metodę przygotowania, analizy i obrazowania ścięgna Achillesa myszy, wykorzystując niecentrosymetryczne właściwości krystaliczne ścięgna ECM. Kluczowe etapy przygotowania tkanek obejmują przepuszczalność dla przeciwbarwień i zapewnienie prawidłowego umieszczenia tkanki na szalce Petriego podczas obrazowania. Zamiast Draq5, Hoechst 33258 może być stosowany w rozcieńczeniu 1:100 000¹³, ale Draq5 jest preferowany ze względu na wysoką przepuszczalność, fotostabilność i minimal...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	AM9262
2 ml probówki do mikrowirówek	USA Scientific	1620-2700
20 ml fiolka scyntylacyjna	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% paraformaldehydowa	mikroskopia elektronowa Sciences	50-980-487	Użyj ampułki PFA do stworzenia 4% roztworu PFA
Narzędzie do dziurkacza do biopsji 6 mm Ted	Pella Inc.	15111-60
			Petriego 60 x 15 mm
BHLHE40 myszy z nokautem zerowym lub heterozygotyczne na tle Scx-GFP	Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Szkiełka nakrywkowe	Fisher	12-544-F	Można użyć dowolnego szkiełka nakrywkowego, które obejmuje obszar podkładki M20
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Cienkie nożyczki Krawędź tnąca 21 mm	Fine Science Tools	14060-10
Laser wielofotonowy FVMPE-RS mikroskop skaningowy	Olympus
Gelfoam Sterylna gąbka Rozmiar 50	Pfizer	00009-0323-01
Laser impulsowy IR INSIGHT X3-OL	Laser impulsowy Olympus
MaiTai HPDS-O IR	Olympus
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1x)	Invitrogen	AM9625	Rozcieńczyć 10x PBS w wodzie mili-Q, aby uzyskać 1x roztwór
Podkładka płaska M20 ze stali nierdzewnej	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Rozcieńczyć Triton X-100 w dPBS, aby uzyskać 1% roztwór
Nożyczki sprężynowe Vannas Krawędź tnąca 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Obiektyw

Szalka