Artykuł metodologiczny

Test mikrojądrowy na kriokonserwowanej krwi pełnej

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65855

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  , 
1Radiobiology group, Department of Human Structure and Repair, Ghent University

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół do testu mikrojądrowego z blokiem cytokinezy na kriokonserwowanych próbkach krwi pełnej. Ta zoptymalizowana metoda kriokonserwacji krwi pełnej do analizy mikrojądrowej jest niezawodną techniką do pobierania próbek na dużą skalę i badań wieloośrodkowych i może być również stosowana do innych testów związanych z krwią.

Streszczenie

Test in vitro z mikrojądrem blokowym (CBMN) jest szeroko stosowaną techniką w badaniach radiobiologicznych, dozymetrii biologicznej, badaniach genotoksyczności i testach wrażliwości na promieniowanie in vitro. Ta metoda cytogenetyczna opiera się na wykrywaniu mikrojąder w komórkach dwujądrowych wynikających z opóźnień fragmentów chromosomów podczas podziału komórki. Świeże próbki krwi pełnej są najbardziej preferowanym typem próbki do testu CBMN. Jednak wady pracy ze świeżymi próbkami krwi obejmują natychmiastowe przetwarzanie po pobraniu krwi oraz ograniczoną liczbę powtórzonych analiz, które można wykonać bez dodatkowego pobierania próbek krwi.

Ponieważ zapotrzebowanie na świeże próbki krwi może być logistycznie trudne, test CBMN na kriokonserwowanych próbkach krwi pełnej byłby bardzo korzystny, szczególnie w badaniach na dużą skalę na pacjentach. W artykule opisano protokół zamrażania próbek krwi pełnej i wykonywania testu CBMN na tych zamrożonych próbkach krwi. Próbki krwi od zdrowych ochotników zostały zamrożone i rozmrożone w różnych punktach czasowych, a następnie poddane zmodyfikowanemu protokołowi testów mikrojądrowych. Wyniki pokazują, że ta zoptymalizowana procedura pozwala na wykonanie testu CBMN na zamrożonych próbkach krwi. Opisany protokół kriokonserwacji może być również bardzo przydatny w innych testach cytogenetycznych i różnych testach funkcjonalnych wymagających proliferujących limfocytów.

Wprowadzenie

Od czasu jego odkrycia, użycie promieniowania jonizującego (IR) było przedmiotem dyskusji wśród badaczy ze względu na jego niekorzystny wpływ na żywe istoty. Szkodliwy efekt objawia się zwykle uszkodzeniem DNA, takim jak pęknięcia dwuniciowe (DSB), a brak naprawy tych DSB prowadzi do aberracji chromosomowych i mutacji, które są ważnymi cechami charakterystycznymi raka1,2. Takie aberracje chromosomowe można badać za pomocą testów cytogennych, takich jak test mikrojądrowy z blokiem cytokinezy (CBMN). Mikrojądra to opóźnione fragmenty chromosomów, które nie mogą zostać włączone do jąder potomnych, a zatem pozostają podczas mitozy.

CBMN jest powszechnie używaną, niezawodną techniką cytogenetyczną do oceny uszkodzeń chromosomów u osób narażonych na promieniowanie jonizujące in vivo lub in vitro. W teście CBMN można użyć świeżej krwi pełnej lub izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Świeża krew pełna jest w większości materiałem biologicznym z wyboru, ponieważ izolacja i przetwarzanie PBMC może być czasochłonne i towarzyszy mu utrata osocza surowicy, które działa jako pożywka podtrzymująca przeżycie i wzrost komórek. Aby osiągnąć dobrą wydajność komórek dwujądrowych, świeża krew pełna powinna być przetwarzana natychmiast po pobraniu. Jednak konieczność natychmiastowego przetwarzania może być wyzwaniem logistycznym w przypadku ograniczeń czasowych. Co więcej, gdy wiele próbek ma być pobieranych przez dłuższy czas lub pobieranych w punktach oddalonych od centrów przetwarzania, przechowywanie świeżych próbek krwi może być czynnikiem ograniczającym3,4.

Ponadto, aby umożliwić wielokrotną analizę MN u tej samej osoby/pacjenta, korzystne byłoby zamrożenie próbek krwi. Jednym ze sposobów przechowywania limfocytów do późniejszego zastosowania testu CBMN jest zamrożenie izolowanych PBMCs5,6. Technika ta wymaga jednak kilku etapów przetwarzania, zanim PBMC będą mogły zostać zamrożone. W związku z tym kriokonserwacja krwi pełnej stanowiłaby prostą i efektywną czasowo alternatywę dla kriokonserwacji wyizolowanych PBMC. Dostępnych jest niewiele informacji na temat stosowania mrożonej krwi pełnej do testów cytogenetycznych lub testów wymagających proliferacji limfocytów. Tylko jeden artykuł donosi o zastosowaniu kriokonserwowanej krwi pełnej do analizy metafazowej7.

Ponieważ kriokonserwacja krwi pełnej przyniosłaby wiele korzyści w dziedzinie biomonitoringu, biodozymetrii i oceny wrażliwości na radioterapię, nasza grupa zoptymalizowała protokół kriokonserwacji dla krwi pełnej, który pozwala na zastosowanie testu CBMN8. Wykazaliśmy, że limfocyty obecne w kriokonserwowanych kulturach krwi pełnej zachowują swoją integralność genomową i zdolność proliferacji przez co najmniej 1 rok. W tym artykule szczegółowo opisujemy procedurę kriokonserwacji i protokół testu CBMN, który został zoptymalizowany przez Beyls et al.8, oraz przedstawiamy wyniki uzyskane dla zamrożonych próbek krwi 30 zdrowych osób. W przypadku testu CBMN posiewy krwi napromieniano in vitro dawkami 0,5, 1 i 2 Gy w celu oceny odpowiedzi MN w limfocytach kriokonserwowanych próbek krwi pełnej.

Protokół

W badaniu tym pobrano próbki krwi drogą wenerpunkcji od 30 zdrowych dawców w wieku od 17 do 65 lat. Dane MN od 20 dawców zostały ponownie wykorzystane z pracy Beyls i wsp.8 Pobieranie próbek krwi odbyło się zgodnie z wytycznymi Komisji Etycznej Szpitala Uniwersyteckiego w Gandawie (numer rejestracyjny: 2019/1565), Belgia. Od wszystkich uczestników uzyskano pisemną zgodę na udział w badaniu. Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów i odczynników użytych w tym protokole znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie próbek krwi

  1. Przed rozpoczęciem należy upewnić się, że uzyskano pisemną świadomą zgodę uczestników oraz że przestrzegano odpowiednich wytycznych etycznych.
  2. Krew należy pobrać do probówek z Li-Heparyną i przechowywać w temperaturze pokojowej do momentu rozpoczęcia procesu kriokonserwacji.

2. Krio konserwacja krwi pełnej

UWAGA: Wszystkie etapy aż do momentu zbioru komórek są przeprowadzane aseptycznie w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza.

  1. Aby kriokonserwować 1 mL krwi, należy przygotować 1 mL medium do zamrażania poprzez zmieszanie 800 µL surowicy cielęcej (FCS) i 200 µL dimetylosulfotlenku (DMSO).
    UWAGA: Medium do zamrażania przygotowuje się w objętości równej objętości próbek krwi przeznaczonych do zamrożenia.
  2. W przypadku kriokonserwacji krwi pełnej, należy przenieść próbkę krwi z probówki heparynowanej do probówek do wirowania o pojemności 15 lub 50 mL.
    UWAGA: Pojemność probówki zależy od objętości krwi.
  3. Krew należy mieszać na wstrząsarku typu vortex z niską prędkością, stosując ciągłe, ale kroplowe dodawanie równiej objętości medium do zamrażania.
  4. Przenieść 2 mL mieszaniny krwi i medium do zamrażania do krioprobówek (2 mL) w taki sposób, aby każda alikwota zawierała 1 mL próbki krwi zmieszanej z 1 mL medium do zamrażania.
  5. Stopniowe zamrażanie
    1. Przenieść krioprobówki do kriopudełka zawierającego izopropanol i umieścić w zamrażarce (-80 °C) na noc.
    2. Przenieść krioprobówki do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.

3. Rozmrażanie krio konserwowanej krwi

UWAGA: Aby ograniczyć całkowity czas procesu rozmrażania, jednorazowo należy przetwarzać maksymalnie 8 kriopróbek (po 2 mL każda).

  1. Przygotowanie
    1. Przed rozmrożeniem krwi podgrzać 200 mL sterylnego soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) do temperatury 37 °C.
    2. Przygotować w warunkach sterylnych roztwór roboczy wymaganej pożywki hodowlanej. Należy upewnić się, że pożywka na jedną kulturę zawiera 1,6 mL pełnej pożywki: pożywki Rosewell Park Memorial Institute (RPMI) uzupełnionej o penicylinę/streptomycynę (0,5%), 0,2 mL FCS, 20 µL pirogronianu sodu oraz 2 µL β-merkaptoetanolu.
      UWAGA: Ponieważ podczas rozmrażania może dojść do utraty znacznej liczby komórek krwi, rozmrożoną krew hoduje się w małych dołkach, takich jak płytki 24-dołkowe, przy całkowitej objętości 2 mL. Na jedną dawkę używa się jednej płytki wielodołkowej.
    3. Dla każdego dołka hodowlanego należy wpisać na pokrywce kod dawcy i oznaczenie A/B wraz z datą i dawką, zgodnie z sugestią poniżej (Rycina 1).

Schemat układu mikropłytki przedstawiający rozmieszczenie próbek dawców do analizy biologicznej.
Rycina 1: Sugerowany układ płytki 24-dołkowej do hodowli krwi pełnej w teście mikrądrakądów. Należy oznaczyć dołki i wpisać kody dawców w odpowiednich miejscach na pokrywie. Dla każdej próbki pacjenta dołki powtórne powinny znajdować się obok siebie. Należy zauważyć, że jest to sugerowany układ dla kolimatora 10 x 10 i może on zostać zmieniony w zależności od rozmiaru kolimatora lub liczby próbek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

  1. Kroki rozmrażania i hodowli krwi pełnej
    1. Rozgrzej kąpiel wodną do 37 °C.
    2. Wyjmij odpowiednie kryoprobówki z ciekłego azotu (liczba probówek zależy od wymagań, np. od liczby dawek).
      UWAGA: Jedna kryoprobówka zawiera 1 mL krwi i 1 mL medium do mrożenia. Zatem z jednej kryoprobówki można przygotować dwie hodowle.
    3. Rozmroź częściowo kryoprobówki w ciepłej kąpieli wodnej (do momentu, gdy wciąż widoczne są małe kryształki lodu).
    4. Wyjmij probówki z kąpieli wodnej i oczyść ich zewnętrzne ścianki sterylną chusteczką.
    5. W sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza otwórz probówki bardzo powoli, aby zapobiec wydostaniu się pęcherzyków powietrza powstałych wewnątrz probówek.
    6. Resuspenduj zawartość każdej probówki i przelej je pojedynczo do stożkowych probówek wirówkowych o pojemności 15 mL (jedna probówka na jedną kryoprobówkę).
    7. Do poszczególnych probówek dodawaj kroplami 1 mL ciepłego (37 °C) PBS, delikatnie obracając probówką. Resuspenduj za pomocą pipety P1000.
    8. W celu rozcieńczenia i jednorodnego przemycia dodaj kroplami 7 mL uprzednio ogrzanego PBS (37 °C) i resuspenduj za pomocą pipety P1000.
    9. Wiruj krew przez 8 min przy 180 × g (z ustawieniem acceleration 1, brake 1) w temperaturze pokojowej.
    10. W czasie oczekiwania wypełnij puste dołki (pomijając te, w których będą hodowane komórki) 500 µL PBS.
    11. Umieść płytki wielodołkowe z powrotem w inkubatorze w celu wstępnego ogrzania.
    12. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usuń supernatant, pozostawiając około 1 mL, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
    13. Resuspenduj osad w pozostałym supernatancie za pomocą pipety P1000.
    14. Do poszczególnych probówek dodawaj kroplami 8 mL ciepłego PBS (37 °C), delikatnie obracając probówkami. Następnie resuspenduj za pomocą pipety P1000.
    15. Wiruj zresuspendowaną krew przez 8 min przy 180 × g (z ustawieniem acceleration 9, brake 9).
    16. W czasie oczekiwania przenieś 200 µL medium hodowlanego do każdego z zaznaczonych dołków.
    17. Przechowuj płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
    18. Po wirowaniu usuń supernatant jednym ciągłym ruchem (aby nie naruszyć luźnego osadu komórkowego), pozostawiając około 80 µL supernatantu.
    19. Do osadu dodaj 280 µL FCS (temperatura pokojowa) i zresuspenduj (do całkowitej objętości 360 µL).
    20. Przenieś 180 µL zawiesiny komórkowej do każdego dołka i zresuspenduj (= 0,5 mL „krwi”/hodowli). Całkowita objętość w każdym dołku wynosi teraz 380 µL, co daje 2 mm warstwę medium.
    21. Inkubuj płytki w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez co najmniej 10 min przed napromieniowaniem.

4. Analiza MN w fazie G0

  1. Wyjmij płytki z inkubatora i naświetl kulturę komórek wymaganymi dawkami promieniowania rentgenowskiego, np. 0,5, 1 i 2 Gy (220 kV, 13 mA, 0,15 mm Cu) w temperaturze pokojowej. W celu określenia spontanicznej wydajności MN wykorzystaj próbki poddane pozornej irradiancji jako kontrolę.
  2. Bezpośrednio po naświetlaniu dodaj 1,62 mL pożywki hodowlanej (37 °C) do każdej studzienki.
  3. Aby stymulować podziały limfocytów T, dodaj 40 µL fytohemaglutyniny (PHA) do każdej studzienki i dokładnie resuspenduj.
  4. Umieść płytki z powrotem w inkubatorze (5% CO2, 37 °C).
    UWAGA: Będzie to czas rozpoczęcia testu.
  5. Zablokuj cytokinezę 23 h po stymulacji, dodając 8 µL cytochalazyny B (6 µg/mL) na studzienkę, a następnie odpowiednio resuspenduj.
  6. Zbierz kultury komórkowe 70 h po stymulacji/czasie hodowli. Resuspenduj i przenieś komórki do probówki 15 mL. Przepłucz każdą studzienkę 2 mL PBS i dodaj ten PBS do odpowiedniej probówki 15 mL.
  7. Odwiruj probówki przez 8 min przy 180 × g w temperaturze pokojowej.
  8. Odlej supernatant, pozostawiając około 500 µL nad osadem.
  9. Wymieszaj osad na wortexie (z pełną prędkością), dodając powoli, kroplami, 2 mL zimnego chlorku potasu (KCl, 4 °C) podczas mieszania.
  10. Natychmiast odwiruj komórki przy 180 × g przez 8 min.
  11. Odlej supernatant, pozostawiając około 500 µL.
  12. Wymieszaj osad na wortexie (z pełną prędkością), dodając powoli, kroplami, 2 mL zimnego fixative 1 (mieszanina metanolu, kwasu octowego i roztworu Ringera w stosunku 4:1:5) podczas mieszania.
  13. Przechowuj probówki z próbkami przez noc w temperaturze 4 °C (minimum 12 h, maksimum 96 h).
  14. Odwiruj przez 8 min przy 180 × g.
  15. Odlej supernatant.
  16. Wymieszaj osad na wortexie (z pełną prędkością), dodając powoli, kroplami, 2 mL zimnego fixative 2 (mieszanina metanolu i kwasu octowego w stosunku 4:1) podczas mieszania.
  17. Odwiruj przez 8 min przy 180 × g.
  18. Odlej supernatant.
  19. Wymieszaj osad na wortexie (z pełną prędkością), a następnie dodaj powoli (kroplami) podczas mieszania 2 mL zimnego fixative 2 do osadu.
  20. Przechowuj probówki z próbkami w temperaturze 4 °C (minimum 12 h, maksimum 96 h).
  21. Oczyść szkiełka izopropanolem i odpowiednio je opisz.
    UWAGA: Do opisywania używaj wydrukowanych naklejek, ponieważ tusz z markera łatwo ściera się podczas obróbki.
  22. Odwiruj probówki z próbkami przez 8 min przy 180 × g.
  23. Przenieś supernatant do innej probówki, aby skoncentrować komórki zgodnie z rozmiarem osadu.
  24. Wymieszaj osad na wortexie.
  25. Nanieś 40 µL utrwalonych komórek na suche i czyste szkiełko.
  26. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w temperaturze pokojowej. Przechowuj szkiełka w pudełku lub natychmiast zabarw w celu obserwacji.

5. Barwienie pomarańczową akrydyną (AO)

  1. Zanurz preparaty w barwniku AO na 1 min, następnie szybko opłucz w wodzie destylowanej, a potem umieść preparaty w buforze fosforanowym (pH 6,8) na 1 min.
  2. Wyjmij preparaty z roztworu buforowego i za pomocą czystej chusteczki do osuszania osusz tył szkiełek, a następnie połóż preparaty na czystej chusteczce.
  3. Nanieś 20 µL buforu fosforanowego na szkiełko i delikatnie przykryj je czystym szkiełkiem nakrywką, unikając powstania pęcherzyków powietrza.
  4. Zapieczaeluj preparaty za pomocą cementu silikonowego.
    UWAGA: Ponieważ AO jest światłoczułe i z czasem blaknie, w celu uzyskania dobrego kontrastu i fluorescencji zaleca się ocenę preparatów w ciągu 5 dni od barwienia. Preparaty niepoddawane badaniu należy zawsze przechowywać w chłodni (4 °C).

6. Ocena barwionych preparatów

  1. Umieść preparat pod mikroskopem fluorescencyjnym i przebadaj 1 000 komórek dwątwardych (BNs). Ręcznie policz mikronukleusy (MNs), które stanowią jeden z sześciu biomarkerów toksyczności. W tym celu zleć dwóm niezależnym oceniającym przebadanie 500 komórek BN na preparat przy tym samym powiększeniu.
    UWAGA: Poniżej przedstawiono najważniejsze kryteria oceny zalecane przez Fenecha do analizy barwionych preparatów9
    1. Wybierz komórkę BN, szukając komórek o ładnym, okrągłym kształcie z nienaruszonym cytoplazmą i dwoma wyraźnie odróżnialnymi jądrami o zbliżonej wielkości, regularnym kształcie i wzorze barwienia. Upewnij się, że cytoplazma komórki BN jest odróżnialna od cytoplazmy komórki sąsiedniej.
    2. Zidentyfikuj MN, pamiętając, że jest on morfologicznie identyczny z głównymi jądrami, lecz mniejszy; nawet największy MN nie może mieć średnicy przekraczającej 1/3 średnicy głównych jąder. Licz MN tylko wtedy, gdy nie styka się on z głównymi jądrami lub gdy granica mikronukleusa jest co najmniej odróżnialna od granicy głównych jąder.

Wyniki

Aby potwierdzić powtarzalność protokołu, przeprowadzono test MN na kriokonserwowanych próbkach krwi od 30 zdrowych ochotników w wieku od 17 do 65 lat. Średnia wieku w grupie wynosi 35 lat. Czas kriokonserwacji wynosił od 1 tygodnia do 154 tygodni. Po poddaniu hodowli komórek krwi pełnej różnym dawkom promieniowania (0,5, 1 i 2 Gy) pod mikroskopem zbadano liczbę mikron jąder w 1 000 komórkach BN. Dobrze zaokrąglone komórki dwuukładowe (widoczne na Rysunku 2) świadczą o pomyślnym odzyskaniu zdrowych, żywotnych komórek z kriokonserwowanych próbek krwi pełnej. Warto zauważyć, że odpowiedź limfocytów na promieniowanie pozostała stabilna po długotrwałym przechowywaniu w bardzo niskich temperaturach (ciekły azot). Obserwacja ta jest zgodna z odpowiedzią oczekiwaną w przypadku próbek świeżej krwi.

Mikroskopia fluorescencyjna: mapa ciepła rozkładu cząsteczek; analiza komórkowa, strzałki wskazują skupiska.
Rycina 2: Mikrojądra obserwowane w komórkach dwądrątkowych pobranych z zamrożonej próbki krwi pełnej, która została kriokonserwowana 1 rok temu. (A) powiększenie 200x, (B) powiększenie 400x; strzałki wskazują mikrojądra (MNs). Pasek skali = 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wraz ze wzrostem dawek promieniowania (0,5, 1 i 2 Gy) zaobserwowano liniowo-kwadratowy wzrost liczby mikron jąder (Tabela 1 oraz Rysunek 3). Liczba MN w kontrolnych próbkach poddanych pozornej irradiacji (0 Gy) reprezentuje tło liczby MN, które wynika głównie z obecności chromosomów opóźnionych.

Dawka (Gy)00.512
Średnia18107247601
OD10.823.953.3101.1
CV (%)59.922.321.616.8
Zakres5-41  62-140139-324395-755

Tabela 1: Zakres i współczynnik zmienności wraz z przeciętną liczbą MN, zaobserwowana w kriotrepowanych próbkach krwi pełnej od 30 zdrowych dawców, wskazująca na zmienność międzyosobniczą. Skróty: CV = współczynnik zmienności; SD = odchylenie standardowe.

Wykres zależności dawka-odpowiedź; komórki MN względem dawki (Gy); wykres statystyczny pokazujący korelację efektu biologicznego.
Rysunek 3: Liczba mikrądiciel względem próbek kontrolnych i napromieniowanych kriokonserwowanych próbek krwi pełnej od 30 dawców. Okresy kriokonserwacji wynosiły od 1 tygodnia do 154 tygodni. Wykres punktowy przedstawia wartości indywidualne. Linie w skupieniach reprezentują średnią ± SD grupy. Skróty: MN = mikrądiciele; BN = dwujądrowe. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby zbadać zmienność międzyosobniczą uzysku MN u badanych osób, obliczono współczynnik zmienności (CV) (patrz Tabela 1). W przypadku MN indukowanych promieniowaniem uzyskano CV < 25% dla wszystkich dawek (0,5, 1 i 2 Gy), co wskazuje na dobrą powtarzalność zmodyfikowanego protokołu.

Dyskusja

Zmodyfikowany protokół stosowania testu CBMN jest stosunkowo łatwym i wygodnym sposobem przechowywania próbek krwi luzem. Procedura przedstawia wszystkie drobne, ale ważne szczegóły, o które należy zadbać podczas kriokonserwacji i testu CBMN. Inne protokoły laboratoryjne zwykle używają 10% DMSO w mieszaninie zamrażającej, podczas gdy nasza mieszanka do zamrażania zawiera 20% DMSO wraz z 80% FCS7. Ponieważ ta mieszanina do zamrażania jest dodawana w równych objętościach do próbki krwi pełnej, końcowe stężenie wynosi również 10% DMSO. Aby poprawić przeżywalność komórek i stymulować podział komórek, dodajemy 1% pirogronianu sodu i 0,1% beta-merkaptoetanolu do kompletnej pożywki hodowlanej (cRPMI). Jest to zgodne z protokołem hodowli komórkowej ustalonym przez naszą grupę badawczą 6,8.

Chociaż problem zlepiania się komórek podczas rozmrażania nie mógł zostać całkowicie rozwiązany w tym protokole, segregacja komórek była lepsza niż w innych konwencjonalnych protokołach. Zamiast konsekwentnego, nagłego dodawania pożywek hodowlanych w celu odzyskania komórek po rozmrożeniu, uzyskaliśmy lepsze wyniki, gdy wstępnie podgrzany PBS (37 °C) był dodawany kroplami podczas etapów mycia. Ta poprawa pomaga w zmniejszeniu stresu komórkowego i minimalizuje zlepianie się dzięki udowodnionej wysokiej regeneracji komórek. Co więcej, nie można było zaobserwować wyraźnej różnicy w żywotności komórek, gdy PBS był używany zamiast RPMI. Grupa potwierdziła, że długość okresu kriokonserwacji (do 1 roku) nie wpłynie na wydajność MN, zarówno w próbkach napromieniowanych, jak i nienapromieniowanych 6,8. Badania sugerują, że dobrą żywotność komórek i proliferację PBMC można osiągnąć poprzez stopniowe zamrażanie w niskich temperaturach (ciekły azot), a następnie stopniowe dodawanie wstępnie podgrzanej pożywki podczas rozmrażania10,11. Naukowcy wykazali, że subpopulacje limfocytów T w rozmrożonej krwi pełnej są porównywalne do tych obserwowanych w rozmrożonych PBMC12. Ponadto udowodniono, że podtypy komórek odzyskane z kriokonserwowanych próbek krwi pełnej są podobne do tych obserwowanych w świeżych próbkach krwi pełnej13,14.

Jeśli przeanalizujemy orientacyjne wyniki uzyskane w raporcie, zobaczymy, że liniowy kwadratowy wzrost wraz z dawką (Rysunek 3) jest zgodny z innymi doniesieniami literaturowymi na temat mikrojąder indukowanych liniowym transferem energii (LET)15,16. Zmienność plonów MN obserwowana w kriokonserwowanych próbkach krwi pełnej (Tabela 1) mieści się w zakresie zgłoszonym dla świeżych posiewów krwi pełnej 8,17,18. Szczegółowo opisany tutaj protokół został zwalidowany na świeżej i kriokonserwowanej krwi pełnej 20 zdrowych ochotników8. Wskaźnik podziału jądrowego (NDI), który jest ważnym parametrem proliferacji komórek zaobserwowanym w tymraporcie8, był zgodny z tym sugerowanym dla świeżej krwi pełnej19,20. Podsumowując, ten zoptymalizowany protokół kriokonserwacji krwi pełnej i zmodyfikowany test mikrojądrowy zapewnia lepszą wydajność komórek, a zatem zaleca się dostosowanie tego protokołu do oceny wrażliwości na promieniowanie . Ponieważ odtwarzalność protokołu została już zwalidowana8 , sugeruje się, że ma on zastosowanie w badaniach na dużą skalę i wieloośrodkowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować L. Pietersowi, T. Thironowi i G. De Smetowi za ich wsparcie techniczne. Jesteśmy wdzięczni wszystkim ochotnikom, którzy oddali krew na potrzeby badania. Prace zostały wsparte finansowo przez Fundację Badawczą Flandrii (FWO) w ramach grantu (T000118N).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki wirówkowe 15 mlGreiner188271
24-dołkowa płytka do zawieszania komórek VWR734-2779
96% alkoholuChemLabCL00.1807.2500
Kwas octowyMerck life science8,18,75,52,500
Pomarańcz akrydynowyMerck nauki przyrodnicze235474-5g
CaCl2Merck life scienceC5670-100g
szkiełka nakrywkoweVWR631-136522 x 50
Cryobox (Mr.Frosty)Nalgene, Sigma Aldrich
Cryovials 2mlNovolabA04573
Cytochalina B Merck life scienceC6762-1010 mg
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Merck life scienceD4540-500ml
Surowica cielęca płodu (FCS)Thermo Fischer scientific10270-106
Utrwalacz 1Metanol/kwas octowy/ringer w stosunku 4:1:5
Utrwalacz 2Metanol/kwas octowy w stosunku 4:1
GURR buforThermo Fischer scientific10582013bufor fosforanowy (pH 6,8)
KClMerck life science1,04,93,60,25075 mM
KH2PO4Merck life science1,04,87,30,250
Rurki litowo-heparynoweBD Nauki przyrodnicze367526-LH170 I.U.Odkurzacz BD
Metanolrybak naukowyM/4000/17
Na2HPO2Merck life science10,65,80,500
NaClMerck life scienceS7653-1kg
Prowadnice obiektoweVWRMENZAA00000112E04
Penicylina/StreptomycynaThermo Fischer scientific15140-12210 000 U/ml + 10 000 &mikro; g/ml
Fitohemaglutynina (PHA-M)Thermo Fischer scientific10576-015
Roztwórzawiera NaCl, KCl, CaCl2 rozpuszczony w wodzie destylowanej
RPMI-1640Thermo Fischer scientific52400041
Żel uszczelniający z kauczuku silikonowegoCF-100
PirogroniansoduThermo Fischer scientific11360039
Sterylny ciepły PBS (37 ° C)zawiera NaCl,  Na2HPO2, KH2PO4 rozpuszczone w wodzie destylowanej
i beta;-merkaptoetanoluThermo Fischer scientific31350-010
Ringera

Bibliografia

  1. Grade, M., Difilippantonio, M. J., Camps, J. Patterns of chromosomal aberrations in solid tumors. Recent Results in Cancer Research. 200, 115-142 (2015).
  2. Jiao, Y., Cao, F., Liu, H. Radiation-induced cell death and its mechanisms. Health Physics. 123 (5), 376-386 (2022).
  3. Roederer, M., et al. The genetic architecture of the human immune system: a bioresource for autoimmunity and disease pathogenesis. Cell. 161 (2), 387-403 (2015).
  4. Bankoglu, E. E., et al. Effect of cryopreservation on DNA damage and DNA repair activity in human blood samples in the comet assay. Archives of Toxicology. 95, 1831-1841 (2021).
  5. Zijno, A., Saini, F., Crebelli, R. Suitability of cryopreserved isolated lymphocytes for the analysis of micronuclei with the cytokinesis-block method. Mutagenesis. 22, 311-315 (2007).
  6. Sioen, S., Cloet, K., Vral, A., Baeyens, A. The cytokinesis-block micronucleus assay on human isolated fresh and cryopreserved peripheral blood mononuclear cells. Journal of Personalized Medicine. 10 (3), 125(2020).
  7. Cheng, L., Wang, L. E., Spitz, M. R., Wei, Q. Cryopreserving whole blood for functional assays using viable lymphocytes in molecular epidemiology studies. Cancer Letters. 166 (2), 155-163 (2001).
  8. Beyls, E., Baeyens, A., Vral, A. The cytokinesis-block micronucleus assay for cryopreserved whole blood. International Journal of Radiation Biology. 97 (9), 1252-1260 (2021).
  9. Fenech, M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols. 2 (5), 1084-1104 (2007).
  10. Ramachandran, H., et al. Optimal thawing of cryopreserved peripheral blood mononuclear cells for use in high-throughput human immune monitoring studies. Cells. 1 (3), 313-324 (2012).
  11. Hønge, B. L., Petersen, M. S., Olesen, R., Møller, B. K., Erikstrup, C. Optimizing recovery of frozen human peripheral blood mononuclear cells for flow cytometry. PLoS One. 12 (11), e0187440-e0187517 (2017).
  12. Alam, I., Goldeck, D., Larbi, A., Pawelec, G. Flow cytometric lymphocyte subset analysis using material from frozen whole blood. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 33 (2), 128-139 (2012).
  13. Langenskiöld, C., Mellgren, K., Abrahamsson, J., Bemark, M. Determination of blood cell subtype concentrations from frozen whole blood samples using TruCount beads. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 94B, 660-666 (2018).
  14. Braudeau, C., et al. An easy and reliable whole blood freezing method for flow cytometry immuno-phenotyping and functional analyses. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 100 (6), 652-665 (2021).
  15. Thierens, H., Vral, A., De Ridder, L. Biological dosimetry using the micronucleus assay for lymphocytes: interindividual differences in dose response. Health Physics. 61 (5), 623-630 (1991).
  16. Vral, A., Fenech, M., Thierens, H. The micronucleus assay as a biological dosimeter of in vivo ionising radiation exposure. Mutagenesis. 26 (1), 11-17 (2011).
  17. Vral, A., Thierens, H., Baeyens, A., De Ridder, L. The micronucleus and G2-phase assays for human blood lymphocytes as biomarkers of individual sensitivity to ionizing radiation: limitations imposed by intraindividual variability. Radiation Research. 157 (4), 472-477 (2002).
  18. Pajic, J., et al. Inter-individual variability in the response of human peripheral blood lymphocytes to ionizing radiation: comparison of the dicentric and micronucleus assays. Radiation and Environmental Biophysics. 54, 317-325 (2015).
  19. Fenech, M., et al. Intra- and inter-laboratory variation in the scoring of micronuclei and nucleoplasmic bridges in binucleated human lymphocytes: results of an international slide-scoring exercise by the HUMN project. Mutation Research. 534 (1-2), 45-64 (2003).
  20. Miszczyk, J., Rawojć, K. Effects of culturing technique on human peripheral blood lymphocytes response to proton and X-ray radiation. International Journal of Radiation Biology. 96 (4), 424-433 (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Blokada cytokinezykomórki dwojądroweradiosensytywność chromosomowadosymetria biologicznabadania genotoksycznościtesty cytogenetycznemikroskopia fluorescencyjnaproliferacja limfocytów
Test mikrojądrowy na kriokonserwowanej krwi pełnej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.