Artykuł metodologiczny

Trójwymiarowe biodrukowanie ludzkich kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC do zastosowań przesiewowych

DOI:

10.3791/65856

⸱

29 września 2023

 ,  ,  , 
1MSD Research Laboratories, London, UK, 2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół do produkcji 3D-drukowanych biologicznie kokultur neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC. Ten model kokultury, wygenerowany w rusztowaniu hydrożelowym w formatach 96- lub 384-dołkowych, wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i wzrost neurytów w ciągu 7 dni oraz pokazuje ekspresję markerów dojrzałości dla obu typów komórek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby model komórkowy był użyteczny do badań przesiewowych leków, system musi spełniać wymagania dotyczące przepustowości i jednorodności, a także mieć efektywny czas rozwoju. Jednak wiele opublikowanych modeli 3D nie spełnia tych kryteriów. Ogranicza to zatem ich przydatność we wczesnych zastosowaniach związanych z odkrywaniem leków. Biodruk trójwymiarowy (3D) to nowatorska technologia, którą można zastosować do opracowywania modeli 3D w celu przyspieszenia czasu opracowywania, zwiększenia standaryzacji i zwiększenia przepustowości. Tutaj przedstawiamy protokół opracowywania biodrukowanych w 3D modeli kokultury neuronów glutaminergicznego i astrocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Kokultury te są osadzone w hydrożelowej matrycy bioaktywnych peptydów, białek macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) o pełnej długości i o fizjologicznej sztywności 1,1 kPa. Model można szybko wprowadzić w formaty 96-dołkowe i 384-dołkowe, a średnia żywotność po wydrukowaniu wynosi 72%. Wykazano, że stosunek astrocytów do neuronów w tym modelu wynosi 1:1,5, co mieści się w fizjologicznym zakresie dla ludzkiego mózgu. Te biodrukowane w 3D populacje komórek wykazują również ekspresję markerów dojrzałych komórek nerwowych oraz wzrost projekcji neurytów i astrocytów w ciągu 7 dni od hodowli. W rezultacie model ten nadaje się do analizy przy użyciu barwników komórkowych i technik barwienia immunologicznego wraz z testami wzrostu neurytów. Możliwość tworzenia tych fizjologicznie reprezentatywnych modeli na dużą skalę sprawia, że idealnie nadają się one do stosowania w średnio- i wysokoprzepustowych testach przesiewowych dla celów neurobiologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania nad chorobami ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w branży odkrywania leków rozwijają się1. Jednak wiele powszechnych chorób OUN, takich jak padaczka, schizofrenia i choroba Alzheimera, nadal nie ma leczenia 2,3,4. Brak skutecznych metod leczenia chorób OUN można przynajmniej częściowo przypisać brakowi dokładnych modeli in vitro brain5. Doprowadziło to do powstania luki translacyjnej między obecnymi modelami in vitro a danymi z badań in vivo, a w konsekwencji do powstania wąskiego gardła w wysiłkach badawczych.

Z powodu tej luki translacyjnej, w ostatnich latach nastąpił znaczny wzrost rozwoju nowych modeli komórek 3D, w tym organoidów neuronowych, neurosferoidów i modeli opartych na rusztowaniach6. Struktura 3D tych modeli pomaga w rekapitulacji mikrośrodowiska neuronalnego, w tym stresów biomechanicznych, kontaktów komórka-komórka i macierzy zewnątrzkomórkowej mózgu (ECM)7. ECM mózgu jest dynamicznym elementem neurofizjologii, który zajmuje przestrzeń między typami komórek nerwowych, w tym neuronami, astrocytami, oligodendrocytami i jednostką nerwowo-naczyniową7. Wykazano, że rekapitulacja ECM mózgu wpływa na morfologię neuronów i odpalanie neuronów, a wiele złożonych modeli 3D mózgu wykazało odkładanie się białek ECM przez typy komórek nerwowych8,9,10,11. Modele oparte na rusztowaniach składają się z dojrzałych kokultur neuronowych zawieszonych w porowatej syntetycznej lub biologicznej matrycy hydrożelowej, która reprezentuje mózg ECM12. W przeciwieństwie do systemów organoidowych i sferoidalnych, modele 3D oparte na rusztowaniach pozwalają na dostosowanie obecnych białek ECM i mają dodatkową zaletę w postaci możliwości przestrajania sztywności hydrożelu w celu naśladowania naprężeń biomechanicznych13,14.

Chociaż przytłaczająca większość modeli neuronowych 3D wykazuje zwiększoną rekapitulację mikrośrodowiska mózgu, nie wszystkie modele są dobrze przystosowane do implementacji aplikacji do odkrywania leków15. Aby model 3D mógł zostać wdrożony do procesów przemysłowych, system musi spełniać wymagania dotyczące przepustowości dla aplikacji przesiewowych i mieć stosunkowo krótki czas rozwoju16. Bioprinting 3D to nowatorska technologia, która oferuje potencjał do tworzenia modeli neuronowych opartych na rusztowaniach 3D z szybkim czasem rozwoju, zwiększoną przepustowością i wyższym poziomem precyzyjnej kontroli, wraz z usunięciem zmienności spowodowanej błędem ludzkim17. Protokół ten przedstawia model kokultury 3D ludzkich neuronów glutaminergicznego i astrocytów pochodzących z iPSC w rusztowaniu hydrożelowym. To hydrożelowe rusztowanie zawiera fizjologicznie reprezentatywne peptydy bioaktywne (RGD, IKVAV, YIGSR) i białka ECM o mimetycznej sztywności biomechanicznej. Te pełnowymiarowe białka ECM obejmują pełnowymiarową lamininę-211 i kwas hialuronowy, obfite w korę ludzką, o sztywności 1,1 kPa zgodnie z pomiarami in vivo18. Model ten został zaprojektowany z myślą o praktyczności odkrywania leków i jest tworzony przy użyciu biodrukarki 3D w formacie płytki 96-dołkowej lub 384-dołkowej, odpowiedniej do analizy przesiewowej przy użyciu technik obrazowania z barwnikami komórkowymi i przeciwciałami, wraz z testami wzrostu neurytów. Komórki wykazują ekspresję markerów typu komórek nerwowych oraz wzrost neurytów i projekcji astrocytowych w ciągu 7 dni od hodowli. W związku z tym w protokole tym przedstawiona zostanie metodologia opracowania wysokoprzepustowego modelu 3D kokultury neuronowej do wykorzystania w zastosowaniach związanych z odkrywaniem leków.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Ilustracyjny przegląd metodologii użytej do kokultur biodruku 3D. Ludzkie neurony i astrocyty pochodzące z iPSC są łączone z roztworami aktywatorów i biotuszów zawierającymi bioaktywne peptydy i są biodrukowane na rusztowaniach hydrożelowych w formatach 96-dołkowych lub 384-dołkowych przy użyciu technologii biodruku na żądanie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Biodrukowanie modeli 3D

  1. Generowanie mapy tablic i pliku do druku
    1. Przed wygenerowaniem modelu należy wygenerować mapę tablic, protokół i plik do wydruku za pomocą oprogramowania do tworzenia mapy tablic. Otwórz oprogramowanie do tworzenia mapy płyt i wybierz opcję Komórki hodowlane w 3D.
    2. Z dostępnych opcji w menu rozwijanym wybierz typ modelu, który ma zostać poddany biodrukowi; model ten został zweryfikowany w formatach modelu obrazowania i modelu HTP. Wybierz model obrazowania dla płytek 96-dołkowych i HTP dla płytek 384-dołkowych.
    3. W oknie Matrix Selection wybierz Hydrogel Px02.53, zawierający Laminin-211 i białka kwasu hialuronowego, z peptydami IKVAV, RGD i YIGSR.
    4. W wyskakującym okienku wprowadź typy komórek jako neurony glutaminergiczne i astrocyty i wprowadź gęstość komórek jako 20 milionów komórek/ml.
    5. Użyj oprogramowania, aby zaprojektować żądaną mapę płyt, podświetlając dołki na płycie ekranowej. W projekcie uwzględnij co najmniej 1 rząd kontrolki 2D na plastiku. Kontrola 2D na studzienkach z tworzywa sztucznego polega na tym, że komórki są osadzane bezpośrednio w studni bez żadnego rusztowania hydrożelowego; Pokryj te studzienki zgodnie z krokiem 1.2.
    6. Upewnij się, że model płyty wymieniony w górnej części okna został zmieniony na zamierzony model blachy do użycia (patrz Tabela materiałów).
    7. Pobierz protokół i wydrukuj plik z mapą tablic za pomocą przycisków pobierania i zapisz je na komputerze połączonym z bioprinterem.
  2. Powlekanie sterowania 2D na studniach z tworzywa sztucznego
    1. Co najmniej 24 godziny przed drukowaniem pokryj dołki modelami kontrolnymi 2D pod kątem przylegania komórek, a growth. 3D studzienki modelowe nie wymagają żadnego wstępnego powlekania. Wszystkie procesy należy przeprowadzać w komorze bezpieczeństwa biologicznego, chyba że zaznaczono inaczej. Płyty można powlekane i przygotowywane do 7 dni przed drukiem.
    2. Przygotować 50 ml 1x buforu boranowego, rozcieńczając 2,5 ml 20x roztworu podstawowego boranu z 47,5 ml sterylnego dH2O.
    3. Dodaj 100 μl 50% (w/v) polietylenoiminy (PEI) do 50 ml 1x buforu boranowego, aby utworzyć 0,1% (w/v) roztwór PEI i sterylny filtr przez filtr 0,22 μm.
    4. Dodać 0,1% (w/v) roztwór PEI do każdej studzienki kontrolnej 2D, jak wskazano na mapie płytowej wygenerowanej w kroku 1.1. Dodać 100 μl/basenik, jeśli używasz płytki 96-dołkowej lub 25 μl/basenik, jeśli używasz płytki 384-dołkowej.
    5. Inkubować płytkę przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie odessać 0,1% (m/v) roztwór PEI i przepłukać studzienki 5x PBS. Pozostaw studzienki do całkowitego wyschnięcia w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Rozcieńczyć 100 μl 1 mg/ml roztworu lamininy w 5 ml pożywki neurobazalnej. Dodać 100 μl do każdej studzienki kontrolnej 2D, jeśli używasz płytki 96-dołkowej lub 25 μl, jeśli używasz płytki 384-dołkowej. Inkubować przez 4 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. W przypadku przechowywania płytek należy pozostawić roztwór lamininy na miejscu po inkubacji i przechowywać w temperaturze 4 °C. Przed użyciem podgrzać płytki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  3. Biodruk 3D modeli kokultur
    1. Zawsze utrzymuj sterylną technikę podczas korzystania z biodrukarki i przetrzyj rękawice, wkłady i płytki hodowlane 70% EtOH przed umieszczeniem ich w drukarce. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie procesy należy wykonywać poza biodrukarką w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Włącz kompresor biodrukarki i zainicjuj drukarkę, wybierając przycisk Zainicjuj w oprogramowaniu biodrukarki. Po rozpoczęciu przepływu powietrza w drukarce przetrzyj powierzchnie wewnątrz drukarki chusteczką o zawartości 70% EtOH.
    3. W dniu drukowania należy przeprowadzić proces zielonego oświetlenia na początku dnia, aby zapewnić prawidłowy stan dyszy dla danego wydruku (minimalny stan dyszy 2A2B).
    4. Weź wkład do biodrukarki ze sterylnego opakowania, dodaj 20 ml sterylnego dH2O do komory A i dodaj 6 ml sterylnie przefiltrowanego 70% EtOH do przegródek B1-4. Włóż wkład do lewego uchwytu na wkłady wewnątrz biodrukarki i umieść pokrywę płytki w dedykowanym uchwycie pokrywy.
    5. Wybierz przycisk Zielone oświetlenie na ekranie głównym oprogramowania i potwierdź w oprogramowaniu, że wkład jest na swoim miejscu w biodrukarce i że pokrywa została zdjęta. Zainicjuj proces zielonego światła.
    6. Po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie upewnij się, że nie widać żadnych spójnych kropli ani z lewej, ani z prawej igły. Następnie, po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie, upewnij się, że w komorach B7 i B8 znajduje się woda.
    7. Po tym, jak biodrukarka zakończy samodzielny etap zielonego światła, włóż niepowlekaną, sterylną, 96-dołkową płaską płytkę dolną (oddzieloną od powlekanej płytki do kokultur biodruku) i włóż tę nową płytkę do prawej sekcji uchwytu płytki biodrukarki, gdy pojawi się monit przez oprogramowanie. Upewnij się, że uchwyt płyty jest ustawiony na płytę o wysokim profilu, a pokrywka została zdjęta i umieszczona w dedykowanym uchwycie pokrywy przed rozpoczęciem następnego kroku.
    8. Biodrukarka będzie osadzać kropelki wody w każdym dołku 96-dołkowej płytki. Po zakończeniu umieść płytkę z biodrukarki i upewnij się, że kropelki wody są obecne w każdym dołku płytki.
    9. Wyrzuć 96-dołkową płytkę używaną do zielonego oświetlenia i pozwól biodrukarce zakończyć proces zielonego światła. Po zakończeniu oprogramowanie określi stan dyszy biodrukarki i potwierdzi, że biodrukarka jest gotowa do drukowania modeli. Umieść pokrywę na kasecie drukującej i zdejmij ją do szafki bezpieczeństwa biologicznego, aby wykonać kolejne czynności.
    10. Korzystając z oprogramowania bioprinter, załaduj plik do druku (wygenerowany w kroku 1.1) do oprogramowania za pomocą przycisku oprogramowania Print Run i otwórz protokół drukowania pdf.
    11. Pobrać płyny do biotuszu i aktywatora, jak wskazano w protokole wydruku pdf, z temperatury -20 °C i rozmrażać w temperaturze pokojowej (RT) przez 40 minut. W przypadku matrycy hydrożelowej Px02.53 będzie to obejmować: 1x fiolkę F32, 1x fiolkę F3, 1x fiolkę F261, 1x fiolkę F299. Nie rozmrażaj biotuszu i płynów aktywujących w rękach ani w kąpielach wodnych.
    12. Przynieś 50 ml kompletnej pożywki z doksycykliną i inhibitorem ROCK (kompletna pożywka +DOX/ROCKi) (patrz krok 2.2) do RT podczas rozmrażania biotuszu i aktywatora.
    13. Po rozmrożeniu biotuszy i aktywatorów przygotuj kasetę drukującą zgodnie z instrukcjami na dwóch ostatnich stronach wygenerowanego protokołu drukowania w formacie pdf. Zielony wkład do drukarki zostanie ponownie wykorzystany do etapów drukowania modelu.
      1. Upewnij się, że w przedziale A1 znajduje się 40 mldH2O, a w przedziałach B1 i B2 8 ml 70% EtOH. Dodaj 1,2 ml aktywatora F32 do C1, 1,2 ml F3 do C2 i 200 μl F261 do C4.
      2. Wyjmij z inkubatora płytkę PEI i pokrytą lamininą i umieść ją w drukarce w prawej komorze uchwytu płyty. W tym momencie nie usuwaj roztworu pożywki z lamininą ze studzienek. Upewnij się, że komora uchwytu na talerz jest ustawiona na płytę niskoprofilową, a pokrywa jest zdjęta i znajduje się w uchwycie pokrywy.
    14. Umieść kasetę drukującą w biodrukarce, upewniając się, że pokrywa została zdjęta i umieszczona w uchwycie, a następnie rozpocznij drukowanie w oprogramowaniu, wybierając przycisk Print Inert Base w oprogramowaniu biodrukarki.
    15. Podczas drukowania obojętnej zasady należy pobrać fiolki z neuronami glutaminergicznymi i astrocytami z magazynu ciekłego azotu, rozmrozić i ponownie zawiesić zgodnie z instrukcjami w sekcji 2.
    16. Po rozmrożeniu komórek i dodaniu 8 ml kompletnej pożywki +DOX/ROCKi do każdego typu komórek oddzielnie (jak w sekcji 2), należy odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    17. Odessać supernatant i ponownie zawiesić oba typy komórek oddzielnie w 1 ml kompletnej pożywki +DOX/ROCKi.
    18. Dodać 20 μl zawiesiny komórek do 20 μl błękitu trypanowego i wymieszać przed zliczeniem komórek, aby określić stężenie żywotnych komórek na ml dla każdego typu komórek.
    19. Połącz w sumie 3 miliony neuronów glutaminergicznym z 1 milionem astrocytów w probówce o pojemności 15 ml. Dodaj pożywkę, aby uzyskać łączną objętość 8 ml.
    20. Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w suchej temperaturze miejsca.
    21. Odessać jak najwięcej supernatantu bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić osad komórkowy w 200 μl płynu aktywującego F299.
    22. Należy pamiętać, że płyn aktywujący jest lepki; pipetować w górę i w dół, aby całkowicie zawiesić osad. Typy komórek są delikatne; Zminimalizuj ścinanie i pęcherzyki powietrza, stosując końcówkę do pipet o szerokim otworze i technikę odwróconego pipetowania. Pipetuj mocno w górę i w dół nie więcej niż 3 razy, aby zapobiec utracie komórek.
    23. Po zakończeniu drukowania obojętnego stopnia bazowego umieść pokrywki na kartridżu i płytce hodowlanej, wyjmij je z biodrukarki i umieść w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    24. Dodaj 200 μl zawiesiny komórek w F299 do dołka C3 wkładu drukującego, ponownie włóż wkład do biodrukarki, zdejmij pokrywkę i umieść go w uchwycie pokrywy. Nie wkładaj jeszcze ponownie płytki hodowlanej.
    25. Zainicjuj etap drukowania modeli wydruku. Podczas gdy biodrukarka zalewa płyny, usuń roztwór pożywki z lamininą z dołków kontrolnych 2D płytki i zastąp go 150 μl kompletnej pożywki +DOX/ROCKi w każdej studzience kontrolnej 2D, jeśli używasz płytki 96-dołkowej i 50 μl kompletnej pożywki +DOX/ROCKi, jeśli używasz płytki 384-dołkowej.
    26. Po zalaniu płynów włóż płytkę celowniczą do biodruku do biodrukarki, zdejmij pokrywkę i umieść ją w uchwycie pokrywy.
    27. Rozpocznij proces kierowania biodrukarki.
      1. Po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie do biodrukowania wyjmij płytkę celowniczą z biodrukarki.
      2. Skorzystaj z przewodnika, aby wybrać, gdzie na płytce można zaobserwować kropelki. Ponownie włóż płytkę celowniczą do biodrukarki i powtórz proces drukowania i selekcji kropel.
      3. Po wyświetleniu monitu ponownie wyjmij płytkę celowniczą, a następnie zastąp ją płytką do hodowli komórkowej (zawierającą pożywkę w studzienkach kontrolnych 2D, jak w kroku 1.3.25). Upewnij się, że pokrywka płytki hodowlanej jest zdjęta i umieszczona w uchwycie. Biodrukarka zakończy drukowanie modelu.
    28. Po zakończeniu drukowania modelu postępuj zgodnie z metodami hodowli komórkowych opisanymi w sekcji 2 (krok 2.8), aby dodać pożywkę do studzienek.
    29. Rozpocznij proces czyszczenia biodrukarki, a po jego zakończeniu wyrzuć wkłady i pozostałe płyny zgodnie z protokołami laboratoryjnymi.

2. Hodowla komórkowa

  1. Modele są generowane przy użyciu 1x fiolki neuronów glutaminergicznego (>5 miliona komórek na fiolkę) i 1x fiolki astrocytów (>1 miliona komórek na fiolkę).
  2. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C.
  3. Obie fiolki z komórkami należy przetransportować do laboratorium na suchym lodzie i zanurzyć w łaźni wodnej natychmiast po wyjęciu z suchego lodu. Rozmrozić obie fiolki jednocześnie.
  4. Wyjąć fiolki z łaźni wodnej, gdy pozostaną tylko małe kryształki lodu; zajmie to około 3 minuty po zanurzeniu. Nie wirować ani nie mieszać komórek w łaźni wodnej.
  5. Spryskaj fiolki 70% EtOH i przenieś je do komory bezpieczeństwa biologicznego.
  6. Dodać kroplami 500 μl kompletnej pożywki +DOX/ROCKi do każdej fiolki przed przeniesieniem każdej zawiesiny do oddzielnych probówek o pojemności 15 ml.
  7. Uzupełnij pożywkę w każdej probówce do 8 ml i kontynuuj czynności biodrukowania zgodnie z krokiem 1.3.
  8. Podążając za modelami biodruku (krok 1.3), natychmiast dodaj kompletne podłoża +DOX/ROCKi do wszystkich studzienek kokultury 3D i umieść modele w inkubatorze w temperaturze 37 oC i 5% CO2 . Jeśli używasz płytki 96-dołkowej, dodaj 150 μl pożywki na studzienkę; jeśli używasz płytki 384-dołkowej, użyj 50 μl pożywki na dołek.
  9. Przez pierwsze 48 godzin hodowli nie są wymagane żadne zmiany pożywki.
  10. Podczas wykonywania zmian pożywki w kontrolach i modelach 2D należy zachować ostrożność, aby nie wywołać naprężeń mechanicznych, które mogłyby oderwać kultury 2D lub spowodować deformację hydrożelu. Powoli zasysanie i dodawanie pożywki należy przeprowadzić za pomocą mikropipety skierowanej w dół z boku studzienki.
  11. Po 48 godzinach przeprowadzić 90% wymianę podłoża we wszystkich studzienkach i usunąć ROCKi ze składu pożywki (patrz krok 2.14).
  12. Po 96 godzinach wykonaj kolejną 90% wymianę pożywki we wszystkich studzienkach, aby usunąć DOX ze składu pożywki (patrz krok 2.14).
  13. Po dwóch 90% wymianach mediów po 48 i 96 godzinach, należy przeprowadzić 50% wymianę mediów co 48 godzin, przy czym 50% mediów jest zasysanych i zastępowanych świeżymi, kompletnymi mediami
  14. Skład mediów:
    1. Kompletne pożywki: Pożywki neuropodstawowe z 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanol, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF.
    2. Kompletna pożywka plus doksycyklina (DOX): Pożywka neuropodstawowa z 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanolem, 10 ng/ml neurotrofiny-3 (NT3), 5 ng/μL neurotroficznego czynnika pochodzenia mózgowego (BDNF) i 1 μg/ml doksycykliny.
    3. Kompletna pożywka plus inhibitor DOX/ROCK (ROCKi): Pożywka neuropodstawowa z 1x GlutaMAX, 1x B27, 12,5 nM 2-merkaptoetanolem, 10 ng/ml NT3, 5 ng/μL BDNF, 1 μg/ml doksycykliny i 10 μM inhibitorem ROCK.

3. Analiza wzrostu neurytów

  1. Umieść komórki w mikroskopie żywych komórek w celu obrazowania w jasnym polu natychmiast po dodaniu pożywki po biodruku.
  2. Użyj oprogramowania mikroskopowego, aby zaplanować obrazowanie komórek w 4-krotnym powiększeniu w każdym dołku, w tym w kontrolach 2D, co 12 godzin przez co najmniej 7 dni.
  3. Dokonywać zmian pożywki co 48 godzin, jak opisano w sekcji 2, umieszczając komórki z powrotem w mikroskopie po każdej zmianie pożywki.
  4. Po 7 dniach danych wyeksportuj obrazy z oprogramowania w formacie .jpg
  5. Zaimportuj wszystkie .jpg obrazy do oprogramowania ImageJ i przekonwertuj pliki do formatu 8-bitowego. Załaduj wtyczkę NeuronJ i śledź wzrost neurytów na obrazach, w tym w punktach rozgałęzień, za pomocą narzędzia do śledzenia.
  6. Użyj danych śledzenia neurytów wygenerowanych przez NeuronJ, aby wykreślić wzrost neurytów w czasie.

4. Analiza żywotności komórek

  1. W każdym 24-godzinnym punkcie czasowym hodowli wybarwić 3 lub więcej studzienek w celu analizy żywotności komórek za pomocą zestawu do żywotności żywej/martwej. Powtórz ten krok w 24-godzinnych lub 48-godzinnych punktach czasowych przez cały czas trwania badania.
  2. Przygotować żywy/martwy odczynnik, zawieszając odczynnik z żywych komórek (1x Calcein-AM) i odczynnik martwych komórek (1x homodimer-1 etydyny-1) i 1x barwienie jądrowe żywych komórek (Hoechst 33342) w 10 ml zredukowanej pożywki surowicy bez czerwieni fenolowej (Opti-MEM) 30 minut przed obrazowaniem. Pozwól, aby żywe/martwe pożywki odczynników trafiły do RT. Przechowuj żywe/martwe podłoża odczynników z dala od bezpośredniego światła ze względu na wybielanie fluorescencyjne.
  3. Usuń pożywkę z 3 studzienek zawierających modele komórek/kontrole 2D, ostrożnie zapobiegając zakłóceniom żelu. Umyj modele komórek raz sterylnym PBS RT. Dodać 100 μl żywych/martwych pożywek odczynników do każdego dołka w przypadku płytki 96-dołkowej lub 25 μl w przypadku płytki 384-dołkowej.
  4. Inkubować modele przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  5. Po inkubacji modele są gotowe do obrazowania. Obrazowanie można wykonywać na dowolnym standardowym mikroskopie z kanałami wzbudzenia w kolorze czerwonym (647 nm, martwe komórki), zielonym (488 nm, żywe komórki) i niebieskim (405 nm, barwienie jądrowe). Aby uzyskać najlepsze wyniki w modelach 3D, należy wykonać modele za pomocą mikroskopu konfokalnego o wysokiej zawartości i przeprowadzić obrazowanie za pomocą funkcji stosu Z przy powiększeniu 4x lub 10x.
    UWAGA: W tym badaniu modele komórkowe zostały zobrazowane za pomocą INCell Analyzer 6500HS (system obrazowania o wysokiej zawartości), a analizę przeprowadzono za pomocą Signals Image Artist (platforma analizy obrazu, patrz krok 4.7).
  6. Po zakończeniu obrazowania należy zwrócić modele komórkowe do inkubatora hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Należy jednak pominąć modele komórkowe używane do analizy żywotności w dalszych badaniach ze względu na żywy/martwe pożywki odczynników na długoterminową żywotność.
  7. Analiza obrazów na platformie analizy obrazu
    1. Wybierz każdą płaszczyznę obrazu stosu Z w oprogramowaniu. Łączenie obrazów płaskich jako obrazu projekcji o maksymalnej intensywności.
    2. Utwórz nową analizę, wybierając model biodrukowany jako obszar zainteresowania (ROI), identyfikując fluorescencję z kanału żywej komórki przy długości fali 488 nm (upewnij się, że wszystkie komórki są wybrane w obszarze ROI).
    3. W obszarze zainteresowania użyj oprogramowania do obrazowania, aby zidentyfikować liczbę komórek w ROI przez kanał barwienia jądrowego (405 nm), liczbę żywych komórek w ROI przy użyciu kanału 488 nm oraz liczbę martwych komórek w ROI przy użyciu kanału 647 nm.
    4. Przeprowadź analizę na wszystkich studzienkach modelu żywych / martwych komórek i wyeksportuj tabelę danych zawierającą obszar ROI, całkowitą liczbę komórek, liczbę żywych komórek i liczbę martwych komórek.
    5. Oblicz liczbę żywych i martwych komórek jako procent całkowitej liczby komórek na dzień analizy.

5. Barwienie immunologiczne i analiza populacji komórek

  1. Przed utrwaleniem usuń nośnik z modeli ogniw i umyj modele raz w PBS.
  2. Utrwalić komórki za pomocą 4% (v/v) paraformaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej przez 20 min.
    UWAGA: Wszystkie prace z paraformaldehydem muszą być wykonywane zgodnie z procedurami laboratoryjnymi.
  3. Odessać 4% (v/v) roztwór paraformaldehydu z modeli i umyć modele cztery razy w PBS, aby całkowicie usunąć paraformaldehyd.
  4. Przepuszczalność modeli komórkowych za pomocą 0,2% trytonu-X przez 30 minut w temperaturze pokojowej i trzykrotne przemycie PBS.
  5. Zablokuj modele komórkowe za pomocą 10% (v/v) normalnej surowicy osła (NDS) przez 3 godziny w RT.
  6. Usuń roztwór blokujący i dodaj przeciwciała pierwszorzędowe (rozcieńczone w 1% v/v NDS w PBS) do modeli. Jeśli przeprowadzasz analizę współczynnika populacji komórek (patrz krok 5.11), upewnij się, że uwzględniłeś modele komórek, które są współbarwione dla tubuliny Β-III (z czerwoną koniugacją AF647) i GFAP (z zieloną koniugacją AF488). Inkubować modele z przeciwciałami pierwszorzędowymi przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  7. Po pierwotnej inkubacji umyj modele wybarwione sprzężonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi trzykrotnie w PBS i wybarwiaj przeciwstawnie 20 μM Hoechst przez 30 minut. Obraz zgodnie z opisem w kroku 5.10.
  8. Umyj modele wybarwione niesprzężonymi przeciwciałami pierwszorzędowymi trzy razy w PBS i dodaj przeciwciała drugorzędowe (rozcieńczone w 1% v/v NDS w PBS). Inkubować przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.
  9. Usunąć przeciwciała drugorzędowe przez trzykrotne przemycie w PBS i wybarwić modele przeciwbarwiące 20 μM Hoechst przez 30 minut przed obrazowaniem.
  10. Obrazowanie można wykonywać na standardowych mikroskopach z kanałami wzbudzenia w kolorze czerwonym (647 nm) i zielonym (488 nm). Jednak, aby uzyskać najlepsze wyniki w modelach 3D, należy wykonać modele za pomocą mikroskopu konfokalnego o wysokiej zawartości i przeprowadzić obrazowanie za pomocą funkcji Z-stack przy 4-krotnym lub 10-krotnym powiększeniu.
  11. Analiza wskaźników populacji komórek na platformie analizy obrazu
    1. Uzyskaj analizę populacji komórek przy użyciu modeli barwionych współbarwiono dla GFAP (z koniugacją AF488) i tubuliny Β-III (z koniugacją AF647).
    2. Wybierz każdą płaszczyznę obrazu stosu Z w oprogramowaniu i połącz obrazy płaszczyzny jako obraz projekcji o maksymalnej intensywności.
    3. Utwórz nową analizę, wybierając model biodrukowany jako ROI, identyfikując fluorescencję z kanału tubuliny Β-III przy długości fali 647 nm (upewnij się, że cały obszar zawierający komórkę jest wybrany w obszarze ROI).
    4. W ramach ROI użyj oprogramowania do identyfikacji liczby komórek w kanale Hoechst (405 nm), liczby astrocytów GFAP+ w ROI przy użyciu kanału 488 nm oraz liczby komórek Β-III tubuliny+ w ROI przy użyciu kanału 647 nm.
    5. Przeprowadź analizę na wszystkich dołkach modelu współbarwionego komórek i wyeksportuj tabelę danych zawierającą obszar ROI, całkowitą liczbę komórek, liczbę komórek GFAP+ i liczbę komórek tubuliny Β-III+.
    6. Oblicz liczbę komórek tubuliny GFAP+ i Β-III tubeliny+ jako procent całkowitej liczby komórek.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza wzrostu neurytu
W tym protokole neurony glutaminergiczne i astrocyty pochodzące z iPSC zostały poddane biodrukarce w kokulturze do matrycy hydrożelowej za pomocą biodrukarki 3D. Przez pierwsze 7 dni po wydrukowaniu komórki były obrazowane co 12 godzin za pomocą mikroskopu żywych komórek. Po biodrukowaniu komórki powinny mieć zaokrągloną morfologię i powinny być rozproszone w matrycy hydrożelowej, stopniowo zmieniając się, tworząc mniejsze skupiska komórek z kilkoma wypukłościami w ciągu pierwszych kilku dni hodowli (patrz film uzupełniający 1 dla reprezentatywnego wzrostu zdrowych komórek). Do 4 dnia zdrowe komórki będą migrować w całym żelu, tworząc większe skupiska, które są połączone wyrostkami neurytów. Do 7 dnia prawie nie powinny pozostać żadne pojedyncze komórki, łączące się wiązki neurytów i projekcje astrocytarne powinny wydawać się wzmocnione, a z klastrów można zobaczyć wiele mniejszych wyrostków neurytów (Ryc. 2A). Korzystając z serii obrazów jasnego pola żywych komórek wykonanych w ciągu 7-dniowego okresu wzrostu, przeprowadzono analizę wzrostu neurytów, jak opisano w sekcji 3. Analiza ta wykazała, że wzrost neurytów wzrasta w sposób niemal liniowy (wartość R2 = 0,84) między 12 godzinami a 156 godzinami (Rysunek 2B). W tym okresie wyrastania neurytów skupiska komórek również zwiększają swój rozmiar (patrz Dodatkowe wideo 1), co wskazuje na migrację komórek w całym hydrożelu.

Żywotność komórek i stosunek populacji
W tym protokole stężenie 20 milionów komórek/ml, obejmujące 15 milionów neuronów/ml i 5 milionów astrocytów/ml, jest używane do biodruku modeli komórkowych. Używając barwienia żywych komórek kalceiną-AM (żywe komórki), homodimerem etydyny-1 (martwe komórki) i barwieniem jądrowym, liczbę komórek, które przeżyły w okresie 7 dni, można obliczyć zgodnie z sekcją 4 (Rysunek 3A). Wyniki żywotności komórek dla reprezentatywnych kultur przedstawiono dla dnia 4, gdzie 72% ± 1% (średnio ± SEM) wszystkich komórek jest żywych i wykazuje barwienie na obecność Calceiny-AM, podczas gdy 29% ± 2% (średnia ± SEM) wszystkich komórek jest martwych i wykazuje barwienie homodimerem etydyny-1 (Figura 3B). Reprezentatywne obrazy barwienia komórek za pomocą Calcein-AM i ethidium homodimer-1 można zobaczyć na rysunku uzupełniającym 1. Należy zauważyć, że wartości przeżycia komórek dla kultur 3D nie mogą być bezpośrednio porównywane z kulturami 2D, ponieważ martwe komórki są zatrzymywane w hydrożelu i nie zostaną usunięte podczas procesów odżywiania komórek.

Używając barwienia immunofluorescencyjnego dla tubuliny Β-III i GFAP, jak opisano w sekcji 5 i w Rysunek 4, można przeprowadzić analizę obrazu w celu określenia proporcji populacji komórek między neuronami a astrocytami (Rysunek 3A). Spośród wszystkich komórek na model w reprezentatywnych hodowlach, neurony Β-III tubuliny dodatnie stanowią 49% ± 3% (średnio ± SEM), podczas gdy astrocyty GFAP dodatnie stanowią 30% ± 4% (średnio ± SEM). Daje to stosunek 1:1,5 astrocytów do neuronów. Pozostawia to pozostałość 21% wszystkich komórek na model, które nie barwią się dla żadnego markera komórkowego. Ponieważ analiza żywotności komórek wykazała, że średnia wartość 29% komórek nie jest zdolna do życia w 4. dniu, jest prawdopodobne, że komórki te są martwe w hydrożelu.

Wyrażenie markerów komórkowych
Morfologię biodrukowanych neuronów i astrocytów oceniano za pomocą barwienia immunologicznego dla markera typu komórki neuronalnej (tubulina Β-III) i markera astrocytarnego (GFAP). W reprezentatywnych hodowlach pokazanych barwienie immunologiczne jest zlokalizowane w poszczególnych typach komórek, wykazując zdrową morfologię komórek, przy czym oba typy komórek wykazują wzrost wypukłości komórkowych (Rysunek 4A, B). Ponieważ struktury hydrożelu i komórki są trójwymiarowe, każdy obraz reprezentuje tylko jeden wycinek przez strukturę w Rysunek 4A,B. Rysunek 4C pokazuje połączony stos obrazów w całym hydrożelu, demonstrując widoki lokalizacji komórek w płaszczyznach X, Y i Z. Rysunek 4D pokazuje barwienie immunologiczne tylko dla tubuliny Β-III; podkreślając drobniejsze wyrostki neurytów z klastrów ciała komórki. W celu dalszego zbadania fenotypu neuronów glutaminergicznego można przeprowadzić barwienie immunologiczne markera receptora jonowego glutaminergicznego, GluR2. W obrębie Rysunek 4E, obszar 4E.1 (wstawka) został podświetlony, aby pokazać punktowe barwienie o wyższej rozdzielczości wzdłuż wiązek neurytów. Potwierdza to, że neurony w tej kokulturze mają fenotyp glutaminergiczny . Na wszystkich obrazach barwienia immunologicznego można zaobserwować immunofluorescencyjne barwione struktury niekomórkowe otaczające skupiska komórek i neuryty. Jest prawdopodobne, że struktury te reprezentują szczątki zatrzymane w hydrożelu w połączeniu z niewielkimi ilościami niespecyficznego przeciwciała wiążącego się z hydrożelem. Jest to oczekiwane w hodowlach drukowanych biologicznie, ponieważ w modelach rusztowań 3D martwe komórki i zanieczyszczenia nie są usuwane podczas odżywiania komórek. Reprezentatywny obraz barwienia immunologicznego kontroli ujemnej przedstawiono na rysunku uzupełniającym 2 w celu wykazania niespecyficznego wiązania przeciwciał drugorzędowych przez hydrożel.

figure-results-1
Rysunek 2: Neurony glutaminergiczne i astrocyty zostały wdrukowane biodrukowane do matrycy hydrożelowej za pomocą biodrukarki i były obrazowane co 12 godzin za pomocą mikroskopu jasnego pola. (A) Przykładowy obraz kultur komórkowych w jasnym polu wykonany podczas analizy. Obraz przedstawia punkt czasowy 156 godzin, a podziałka skali reprezentuje 400 μm. (B) Średnia długość wyrostków neurytów (μm) z kultur mierzona przy użyciu pakietu NeuronJ dla ImageJ. Każdy punkt danych to n = 3 neuryty, a dane są wyświetlane jako średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 3: Stężenie 20 milionów komórek/ml roztworu aktywatora zostało użyte do biodruku modeli komórek. (A) Żywotność komórek została obliczona przy użyciu barwników z żywych/martwych komórek (odpowiednio Calcein-AM i ethidium homodimer-1). Wartości pokazują, że 72% ± 1% (średnia ± SEM, n = 3) wszystkich komórek na studzienkę jest żywych, a 29% ± 2% (średnia ± SEM, n = 3) komórek jest martwych z całkowitej populacji komórek na studzienkę w dniu 4. Pokazane wartości reprezentują średnią ± SEM. (B) Procent populacji komórek w neuronach i astrocytach na studzienkę obliczono za pomocą analizy obrazu barwienia pokazanego na Rysunek 4. Neurony reprezentują odsetek komórek barwiących dodatnio na obecność tubuliny Β-III w dniu 7 (49% ± 3%, średnia ± SEM, n = 3), podczas gdy astrocyty reprezentują odsetek komórek barwiących dodatnio na GFAP w dniu 7 (30% ± 4%, średnia ± SEM, n = 3). Pokazane wartości reprezentują średnią ± SEM. Wszystkie obrazowania do obliczeń pokazanych w Rysunek 3 zostały wykonane na systemie obrazowania konfokalnego, a wszystkie analizy zostały przeprowadzone na platformie analizy obrazu i GraphPad Prism zgodnie z metodami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 4: Ekspresja markerów typu komórek nerwowych w biodrukowanych kokulturach 3D neuronów glutaminergicznym i astrocytów w dniu 7. (A,B) Barwienie immunofluorescencyjne markera neuronalnego Β-III tubuliny i markera astrocytów GFAP, zobrazowane na platformie mikroskopu odwróconego w 10-krotnym powiększeniu. Podziałka skali reprezentuje 100 μm. (C) Barwienie immunofluorescencyjne markera neuronalnego tubuliny β-III i markera astrocytów GFAP barwionych jednocześnie z Hoechstem, pokazane w widoku płaszczyzny XYZ, zobrazowane w systemie obrazowania konfokalnego przy 10-krotnym powiększeniu. Stworzony na platformie do analizy obrazu. Podziałka reprezentuje 100 μm. (D) Barwienie immunofluorescencyjne markera neuronalnego tubuliny β-III barwionej jednocześnie z Hoechstem, zobrazowane w systemie obrazowania konfokalnego przy 20-krotnym powiększeniu. Podziałka skali reprezentuje 100 μm. (E) Barwienie immunofluorescencyjne markera glutaminergicznego GluR2 barwionego jednocześnie z Hoechstem, zobrazowane na odwróconej platformie mikroskopowej przy 10-krotnym powiększeniu. W ramce 3E.1 pokazano podświetlone obszary barwienia GluR2. Podziałka skali reprezentuje 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo 1: Neurony glutaminergiczne i astrocyty zostały wydrukowane biologicznie na matrycy hydrożelowej za pomocą biodrukarki i były obrazowane co 12 godzin za pomocą mikroskopu jasnego pola. Film przedstawiający obrazy w jasnym polu wykonane na kulturach komórkowych podczas analizy, punkty czasowe są wskazane w prawym dolnym rogu, a paski skali reprezentują 400 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Przykładowe obrazy analizy żywych/martwych neuronów i astrocytów w dniu 4. Barwienie Calcein-AM pokazane na zielono (488 nm), a barwienie homodimerem etydyny pokazane na czerwono (647 nm). Obraz jest wyświetlany w widoku płaszczyzny XYZ, utworzonej na platformie analizy obrazu. Podziałka odpowiada 100 μm. (A) Obrazowanie przeprowadzono przy użyciu konfokalnego systemu obrazowania przy 4-krotnym powiększeniu. (B) Obrazowanie zostało przeprowadzone przy użyciu systemu obrazowania konfokalnego przy 10-krotnym powiększeniu Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Przykład obrazu kontroli negatywnej po barwieniu immunofluorescencyjnym. Pominięto przeciwciała pierwszorzędowe, a zastosowano przeciwciała drugorzędowe zielone (488 nm) i czerwone (647 nm) zgodnie z protokołami barwienia immunologicznego. Obraz jest wyświetlany w widoku płaszczyzny XYZ, utworzonej na platformie analizy obrazu. Podziałka skali reprezentuje 100 μm. Obrazowanie przeprowadzono za pomocą systemu obrazowania konfokalnego przy 10-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zapotrzebowanie na dokładne modele OUN nigdy nie było większe, a ograniczenia dwuwymiarowych (2D) tradycyjnych modeli hodowli komórkowych doprowadziły w ostatnich latach do generacji złożonych modeli OUN19. Jednak wiele złożonych modeli 3D, które reprezentują interakcje między typami komórek nerwowych a ECM, ma ograniczenia, które uniemożliwiałyby zastosowanie tych modeli w procesach przemysłowych 6,20,21. W tym protokole opracowujemy model kokultury 3D ludzkich neuronów i astrocytów pochodzących z iPSC, który ma na celu rozwiązanie niektórych z tych ograniczeń przy użyciu technologii biodruku 3D w celu stworzenia bioaktywnego rusztowania hydrożelowego w formatach 96-dołkowych i 384-dołkowych.

Metodologia opracowywania tych modeli została uproszczona dzięki oprogramowaniu do projektowania map płyt, automatycznie generowanym protokołom drukowania i sterowanemu procesowi drukowania z biodrukarki. Jednak ze względu na wrażliwy charakter wrażliwych typów komórek pochodzących z iPSC stosowanych w tym protokole, należy zachować ostrożność podczas następujących krytycznych etapów rozmrażania i hodowli. Po pierwsze, włączenie inhibitora ROCK (ROCKi) ma kilka zalet w całym procesie biodrukowania i podczas wczesnej hodowli. Rozmrażanie komórek jest punktem krytycznym, w którym neurony mogą doświadczyć reakcji na stres, a niewłaściwe protokoły rozmrażania mogą zmniejszyć szanse na przeżycie22. Zazwyczaj zaleca się rozmrażanie komórek, dodawanie pożywki i podnoszenie ich do temperatury inkubatora tak efektywnie, jak to możliwe23. Jednak podczas procesu biodrukowania opisanego w tym protokole konieczne jest, aby neurony i astrocyty zostały ponownie zawieszone w roztworze aktywatora, a nie w pożywce, a komórki nie zostaną podniesione powyżej temperatury pokojowej do końca cyklu drukowania (do 30 minut po rozmrożeniu). W związku z tym dodanie ROCKi do pożywki natychmiast po rozmrożeniu i włączenie go podczas dwóch etapów wirowania (kroki 2.1-2.7 i 1.3.15-1.3.20) jest niezbędne do zahamowania szlaków stresu komórkowego, co skutkowałoby niższymi poziomami żywotności24. Ponadto wykazano, że ROCKi sprzyja wzrostowi neurytów i poprawia dojrzewanie neuronów25. W związku z tym suplementacja ROCKi jest kontynuowana przez 48 godzin po bioprintingu. Konieczne jest jednak usunięcie suplementacji ROCKi po 48 godzinach, aby zapewnić całkowite zmycie podczas kolejnych zmian pożywki przed użyciem komórek do testu.

Kolejnym krokiem, który wymaga krytycznej uwagi, jest dodawanie i zmiana nośnika po druku (kroki 2.8-2.13). Rusztowanie hydrożelowe z nadrukiem biologicznym ma równoważną sztywność biomechaniczną wynoszącą zaledwie 1,1 kPa, co odpowiada istocie szarej. Jak opisano w kroku 2.10, bardzo ważne jest, aby delikatnie pipetować bok studzienki podczas dodawania i aspiracji pożywki, aby zapobiec zakłóceniom. Ma to szczególne znaczenie w przypadku płytek 384-dołkowych, w których poziom żelu zajmuje większą część całkowitej objętości studzienki. Metoda ta powinna być również stosowana w studzienkach kontrolnych 2D, aby zapobiec podnoszeniu się krawędzi komórek i ścinaniu wyrostków neurytów. Autorzy chcieliby również podkreślić znaczenie sterylnej techniki w biodrukarce, która powinna być traktowana z taką samą ostrożnością, jak w przypadku komory bezpieczeństwa biologicznego używanej do hodowli komórek pochodzących z iPSC. Obejmuje to sterylne filtrowanie 70% EtOH i dH2O stosowane w procedurach zielonego oświetlenia i drukowania, utrzymywanie pokrywek na wkładach i płytach podczas wsuwania i wysuwania rąk z biodrukarki oraz odkażanie powierzchni wewnątrz biodrukarki za pomocą chusteczek z 70% etanolu przed i po drukowaniu.

Rusztowanie hydrożelowe z nadrukiem biodrukowanym, uformowane z roztworów biotuszu i aktywatora, wybrane do opracowania tego modelu, jest wybierane z szeregu roztworów biotuszy i aktywatorów opracowanych przez Inventia Life Science do użytku w biodrukarce RASTRUM. Laminina i kwas hialuronowy zostały zidentyfikowane jako cząsteczki mające znaczenie dla dojrzewania neuronów pochodzących z iPSC ze względu na ich rolę w prowadzeniu aksonów, tworzeniu synaps i tworzeniu sieci okołoneuronalnej26,27. Ponadto wybrano sztywność biomechaniczną wynoszącą 1,1 kPa, ponieważ wykazano, że hydrożele o mniejszej gęstości umożliwiają lepszy wzrost neurytów z neuronów12. Jeśli do protokołu zostaną wprowadzone modyfikacje przy użyciu neuronów i astrocytów, które zostały zróżnicowane wewnętrznie lub od innego komercyjnego dostawcy, zaleca się wykonanie testu selekcyjnego macierzy w celu określenia najbardziej wspierającego rusztowania hydrożelowego15. Co więcej, może być również konieczna optymalizacja gęstości komórek, jeśli zostaną wprowadzone zmiany w źródłach komórek, aby zapewnić optymalną żywotność i zapobiec przepełnieniu hydrożelu. W przypadku wszelkich modyfikacji i rozwiązywania problemów związanych z funkcją biodrukarki autorzy zalecają skontaktowanie się z producentami i odniesienie się do protokołów producenta.

OUN zawiera szeroki zakres podtypów neuronów i komórek glejowych, z których wszystkie istnieją w różnych niszach mózgu i pełnią określone role przyczyniające się do funkcjonowania neuronów28. W kontekście tego szerokiego zakresu model ten reprezentuje tylko dwa najliczniejsze typy komórek (astrocyty i pobudzające neurony glutaminergiczne). Ważne typy komórek, takie jak mikroglej, oligodendrocyty i komórki śródbłonka tworzące barierę krew-mózg, są pomijane w tym systemie. Włączenie mikrogleju może mieć znaczenie w skupieniu się na interakcjach neuroimmunologicznych, a oligodendrocyty mogą być interesujące w chorobach, które wpływają na centralną mielinizację. Oprócz swojej roli w patologii, komórki, takie jak komórki śródbłonka tworzące barierę krew-mózg, wydzielają enzymy metabolizujące leki, co może wpłynąć na wykorzystanie tego modelu do testów farmakokinetycznych29. Kolejnym ograniczeniem modelu może być stosunek astrocytów do neuronów; Stosunek astrocytów do neuronów różni się znacznie w zależności od regionu mózgu, z sugerowanymi wartościami od 1:1 do 1:3 30,31. Ten model ma przybliżony stosunek astrocytów 1:1,5 do neuronów; W związku z tym model ten może nie mieć znaczenia dla modelowania obszarów mózgu, w których astrocyty są liczniejsze, takich jak obszaryistoty białej 30.

W ostatnich latach opublikowano inne protokoły opracowywania biodrukowanych modeli kokultury 3D. W publikacji Sullivan i in., 2021, przedstawiono biodrukowany model neuronowy 3D przy użyciu nerwowych komórek progenitorowych pochodzących z iPSC, który wykazuje wysoką żywotność po wydrukowaniu i poprawę funkcji neuronów w porównaniu z kulturami2D 32. Jednak w tym protokole neuronalne komórki progenitorowe zostały wykorzystane jako źródło komórek i były utrzymywane w hodowli przez 4 tygodnie. W tym protokole wykorzystano dostępne na rynku neurony glutaminergiczne i astrocyty pochodzące z iPSC. Pozwala to na stworzenie sieci 3D współhodowanych komórek w ciągu zaledwie 7 dni; Jak wykazano w analizie wzrostu neurytów, wzrost neurytów rozpoczyna się w ciągu 24 godzin i trwa w sposób liniowy przez cały okres 156 godzin, w którym monitorowano wzrost komórek. Szybkie tworzenie tych sieci można częściowo przypisać wykorzystaniu neuronów glutaminergiczne, które wykorzystują zoptymalizowaną ekspresję genu NGN2 indukowaną doksycykliną, która wykazuje ekspresję dojrzałych markerów podtypu neuronalnego w ciągu 7 dni, nawet w hodowli2D 33. Skrócenie tego okresu wzrostu przy użyciu tej techniki jest ważne dla wdrażania modeli w przemyśle biofarmaceutycznym, ponieważ opracowanie testu wymaga szybkiej realizacji i opracowania modeli komórkowych15.

Podsumowując, model ten wykazuje potencjał dla modelu 3D neuronów i astrocytów, który jest szybko i wygodnie ustalany do celów przesiewowych. Przyszłe zastosowania tego typu modelu mogą dotyczyć prac nad odkrywaniem leków na różne choroby OUN, z możliwością rozszerzenia na różne choroby przy użyciu linii iPSC pacjenta lub choroby z edytowanymi genami. Co więcej, zastosowanie neuronów glutaminergicznego pochodzących z iPSC o ekspresji NGN2 indukowanej doksycykliną pozwala komórkom osiągnąć dojrzałość w krótszym czasie, co można wykorzystać do opracowania modeli starzejącego się mózgu do badań nad neurodegeneracją. System ten można również rozszerzyć poprzez wykorzystanie dodatkowych typów komórek w kokulturze, w tym mikrogleju i oligodendrocytów.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CW, NC i JB są pracownikami Merck Sharp & Dohme (UK) Limited, Londyn, Wielka Brytania. YH jest pracownikiem Merck Sharp & Dohme LLC, spółki zależnej Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA.

Rysunek pierwszy został utworzony przy użyciu Biorender.com.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Alexowi Volkerlingowi, Martinowi Engelowi i Rachel Bleach za pomoc w opracowaniu protokołu i opinie na temat manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2-merkaptoetanolThermofisher31350010
płytka 384-dołkowaPerkinElmer6057300
Płytka 96-dołkowaPerkinElmer6055300
Aktywator płynu F299Inventia Life ScienceN/A
Aktywator płynu F3Inventia Life ScienceN/A
B27 (50x) minus Vit AThermofisher12587010
Płyn do biotuszu F261Inventia Life ScienceN/A
Płyn do biotuszu F32Inventia Life ScienceN/A Hyklalat
doksycyklinySigma AldrichD5207
GlutaMAX (100x)Thermofisher35050061
Koza anty-mysia IgG H& L Alexa Fluor 647Abcamab150115
Kozia anty-królicza IgG H& L Alexa Fluor 488Abcamab150077
HoechstAbcamab228551
Ludzkie rekombinowane białko BDNFThermofisherPHC7074
Ludzkie białko rekombinowane NT3ThermofisherPHC7036
Astrocyty iCellAnalizator dźwięku Fujifilm CDI1434
INCell 6500HSUrządzenia molekularneNie dotyczysystem obrazowania o wysokiej zawartości
Incucyte S3Sartorius N/A
ioGlutamatergiczne neurony (duża fiolka)Bit.bioe001
Laminina (1 mg / ml)Sigma AldrichL2020
Żywy/martwy zestaw (Calcein-AM, Ethidium homo-dimer-1)InvitrogenL3224
Mysia tubulina anty-BIII NL637 sprzężonaR& Systemy DSC024
Pożywka neuropodstawowaThermofisher21103049
Normalna surowica osłaAbcamab7475
NucBlue Live (Hoechst 33342)ThermofisherR37605
Opti-MEMThermofisher11058021
ParaformaldehydSigma AldrichP6148
PEI 50% w H2OSigma Aldrich181978
Pierce Borate Buffer 20xThermofisher28341
PrismGraphPadOprogramowanie do analizy danych
Królik antyjonotropowy receptor glutamamatre 2 (GluR2)Abcamab206293
RASTRUM(TM) BioprinterInventia Life ScienceN/ABioprinter
Wkłady do biodrukarki RASTRUM(TM)Inventia Life ScienceN/AWkłady do biodrukarki
RASTRUM(TM) Płytka celowniczaInventia Life ScienceN/APłytka celownicza
Inhibitor kinazy Rho (ROCK)Abcamab120129
Owca anty-GFAP NL493 sprzężonaR& D systemsSC024
Sygnały Artysta Obrazu PerkinElmer Nie dotyczyPlatforma do analizy obrazu
Triton X-100ThermofisherHFH10
Zeiss Axio ObserverZeissN/APlatforma mikroskopu odwróconego 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jung, Y. L., Hwang, J., Yoo, H. S. Disease burden metrics the innovations of leading pharmaceutical companies: a global and regional comparative study. Globalization and Health. 16 (1), 80-80 (2020).
  2. Potkin, S. G., et al. The neurobiology of treatment-resistant schizophrenia: paths to antipsychotic resistance and a roadmap for future research. npj Schizophrenia. 6, 1(2020).
  3. Keswani, C., et al. The Global Economic Impact of Neurodegenerative Diseases: Opportunities and Challenges. Bioeconomy for Sustainable Development. , Springer, Singapore. (2019).
  4. Perucca, E. The pharmacological treatment of epilepsy: recent advances and future perspectives. Acta Epileptologica. 3 (1), 22(2021).
  5. Nikolakopoulou, P., et al. Recent progress in translational engineered in vitro models of the central nervous system. Brain. 143 (11), 3181-3213 (2020).
  6. Whitehouse, C., Corbett, N., Brownlees, J. 3D models of neurodegeneration: implementation in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 44 (4), 208-221 (2023).
  7. Rauti, R., Renous, N., Maoz, B. M. Mimicking the brain extracellular matrix in vitro: A review of current methodologies and challenges. Israel Journal of Chemistry. 60 (12), 1141-1151 (2020).
  8. Fawcett, J. W., Oohashi, T., Pizzorusso, T. The roles of perineuronal nets and the perinodal extracellular matrix in neuronal function. Nature Reviews Neuroscience. 20 (8), 451-465 (2019).
  9. Lam, D., et al. Tissue-specific extracellular matrix accelerates the formation of neural networks and communities in a neuron-glia co-culture on a multi-electrode array. Scientific Reports. 9, 4159(2019).
  10. Roll, L., Lessmann, K., Brüstle, O., Faissner, A. Cerebral organoids maintain the expression of neural stem cell-associated glycoepitopes and extracellular matrix. Cells. 11 (5), 760(2022).
  11. Yan, Y., Bejoy, J., Marzano, M., Li, Y. The use of pluripotent stem cell-derived organoids to study extracellular matrix development during neural degeneration. Cells. 8 (3), 242(2019).
  12. Ma, L., et al. 3D bioprinted hyaluronic acid-based cell-laden scaffold for brain microenvironment simulation. Bio-Design and Manufacturing. 3 (3), 164-174 (2020).
  13. Liaw, C. -Y., Ji, S., Guvendiren, M. Engineering 3D hydrogels for personalized in vitro human tissue models. Advanced Healthcare Materials. 7 (4), 1701165(2018).
  14. Ma, J., Huang, C. Composition and mechanism of three-dimensional hydrogel system in regulating stem cell fate. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 498-518 (2020).
  15. Belfiore, L., et al. Generation and analysis of 3D cell culture models for drug discovery. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 163, 105876(2021).
  16. Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6(2018).
  17. Engel, M., Belfiore, L., Aghaei, B., Sutija, M. Enabling high throughput drug discovery in 3D cell cultures through a novel bioprinting workflow. SLAS Technology. 27 (1), 32-38 (2022).
  18. Takamura, T., et al. Influence of age on global and regional brain stiffness in young and middle-aged adults. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 51 (3), 727-733 (2020).
  19. Slanzi, A., Iannoto, G., Rossi, B., Zenaro, E., Constantin, G. In vitro models of neurodegenerative diseases. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 328(2020).
  20. de Souza, N. Organoid variability examined. Nature Methods. 14 (7), 655-655 (2017).
  21. Hernández, D., et al. Culture variabilities of human iPSC-derived cerebral organoids are a major issue for the modelling of phenotypes observed in Alzheimer's disease. Stem Cell Review and Reports. 18 (2), 718-731 (2022).
  22. Li, R., et al. Differentiation of human iPS cells into sensory neurons exhibits developmental stage-specific cryopreservation challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 796960(2021).
  23. Nishiyama, Y., et al. Safe and efficient method for cryopreservation of human induced pluripotent stem cell-derived neural stem and progenitor cells by a programmed freezer with a magnetic field. Neuroscience Research. 107, 20-29 (2016).
  24. Uhrig, M., Ezquer, F., Ezquer, M. Improving cell recovery: Freezing and thawing optimization of induced pluripotent stem cells. Cells. 11 (5), 799(2022).
  25. Harbom, L. J., et al. The effect of rho kinase inhibition on morphological and electrophysiological maturity in iPSC-derived neurons. Cell and Tissue Research. 375 (3), 641-654 (2019).
  26. Koh, H. S., Yong, T., Chan, C. K., Ramakrishna, S. Enhancement of neurite outgrowth using nano-structured scaffolds coupled with laminin. Biomaterials. 29 (26), 3574-3582 (2008).
  27. Tarus, D., et al. Design of hyaluronic acid hydrogels to promote neurite outgrowth in three dimensions. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (38), 25051-25059 (2016).
  28. Brain Initiative Cell Census Network (BICCN). Initiative Cell Census Network (BICCN). A multimodal cell census and atlas of the mammalian primary motor cortex. Nature. 598 (7879), 86-102 (2021).
  29. Dauchy, S., et al. Expression and transcriptional regulation of ABC transporters and cytochromes P450 in hCMEC/D3 human cerebral microvascular endothelial cells. Biochemical Pharmacology. 77 (5), 897-909 (2009).
  30. Herculano-Houzel, S. The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution. Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).
  31. von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
  32. Sullivan, M. A., et al. 3D bioprinting of stem cell-derived central nervous system cells enables astrocyte growth, vasculogenesis and enhances neural differentiation/function. bioRxiv. , (2022).
  33. Pawlowski, M., et al. Inducible and deterministic forward programming of human pluripotent stem cells into neurons, skeletal myocytes, and oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Three-Dimensional Bioprinting of Human iPSC-Derived Neuron-Astrocyte Cocultures for Screening Applications. The Authors section was updated from:

Chloe Ann Whitehouse1
Yufang He2
Janet Brownlees1
Nicola Corbett1
1MSD R&D Innovation Centre Ltd
2Merck & Co., Inc.

to:

Chloe Ann Whitehouse1
Yufang He2
Janet Brownlees1
Nicola Corbett1
1MSD Research Laboratories, London, UK
2Merck & Co., Inc., Rahway, NJ, USA

Tagi

Biodruk 3Dkokultura neuron w i astrocyt wneurony pochodz ce z ludzkich iPSCmatryca hydro elowabia ka macierzy zewn trzkom rkowejmarkery kom rek neuronalnychwysokoprzepustowe przesiewanietest wzrostu neuryt wtechniki immunobarwieniamodele odkrywania lek w

Powiązane artykuły