Ten protokół demonstruje niezawodną i skuteczną technikę izolowania pierwotnych fibroblastów z przedmenopauzalnej lub pomenopauzalnej ludzkiej tkanki pochwy. Istniejące protokoły izolacji fibroblastów pochwy nie uwzględniają wyzwań związanych z izolacją komórek z tkanki starczej. Tkankę pochwy pozyskano od kobiet po operacji wypadania narządów miednicy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Wypadanie narządów miednicy jest zaburzeniem, które poważnie wpływa na jakość życia kobiet. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy spadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie. Operacja korygująca wypadanie narządów miednicy jest podstawowym leczeniem. Ostatnio rośnie zainteresowanie badaniem składu tkanek pacjentów z wypadaniem na poziomie komórkowym.
Obecnie nie ma zgody co do wpływu wieku dawcy lub pacjenta na terapie komórkowe. Obecnie opublikowane protokoły izolacji fibroblastów pochwy albo koncentrują się na tkance przedmenopauzalnej, albo zaniedbują komentarz na temat wieku tkanki dawcy. Większość istniejących protokołów wykorzystuje modele zwierzęce. Konsystencja ludzkiej tkanki pochwy jest gęstsza niż tkanek stosowanych w większości protokołów. W tym badaniu ludzka tkanka pochwy została pozyskana głównie od starszych dawców, co prawdopodobnie przyczyniło się do niepowodzenia istniejących protokołów.
Celem tego badania jest opisanie standardowego protokołu niezawodnego pozyskiwania ludzkich fibroblastów pochwy, niezależnie od wieku dawcy i statusu menopauzy. Wyniki odtworzono przy użyciu tkanek pochodzących od dziewięciu różnych dawców, którzy przeszli operację wypadania narządów miednicy. Sześć pacjentek było po menopauzie, przy czym najstarsza dawczyni miała 78 lat. Średni wiek dawców tkanek wynosił 59 lat.
Tutaj opisujemy niezawodną metodę generowania wzbogaconej fibroblastami zawiesiny jednokomórkowej za pomocą kombinacji dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej oraz łączenia zawiesiny komórkowej w wielu biopsjach pochwy od jednego dawcy. Wiarygodna izolacja pierwotnych fibroblastów pochwy może być przydatna w badaniu wypadania narządów miednicy, a także interakcji mikrobiom-gospodarz.
Wprowadzenie
Nierówność płci w nauce i badaniach jest ciągłym problemem. Badania nad zaburzeniami, które dotykają głównie osoby płci żeńskiej, są niedofinansowane1. Wypadanie narządów miednicy mniejszej jest zaburzeniem silnie związanym z płcią żeńską. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy opadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie2. Niewiele wiadomo na temat interakcji komórkowych w kontekście tej patofizjologii, ani tego, jak czynniki na poziomie tkanek wpływają na powodzenie interwencji chirurgicznych3.
Komórki pierwotne, a nie linie komórkowe, są powszechnie uznawane za niezbędne dla translacyjnych badań klinicznych, zapewniając większą przydatność fizjologiczną4. Komórki pierwotne są pobierane bezpośrednio z tkanki ciała będącej przedmiotem zainteresowania i mogą bardziej precyzyjnie naśladować fizjologię in vivo. Izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy może być przydatna do badania biologicznych mechanizmów wypadania narządów miednicy mniejszej i modelowania choroby, biorąc pod uwagę kluczowe cechy dawcy, takie jak wiek i stan menopauzy.
Wypadanie narządów miednicy często dotyka osoby starsze lub po menopauzie. Izolacja i proliferacja pierwotnych komórek fibroblastów w badaniu tego schorzenia jest wyzwaniem ze względu na zmniejszone populacje komórek i zdolność klonogenną od starszych dawców5. Z naszego doświadczenia wynika, że zastosowanie wcześniej opisanych protokołów dysocjacji tkanki pochwy nie pozwoliło na ekstrakcję żadnych fibroblastów ze standardowej biopsji tkankowej 1 cm2.
Poprzez przegląd literatury stwierdziliśmy, że podobne badania zostały podzielone na dwie grupy: modele zwierzęce, takie jak mysie6, oraz modele ludzkie7,8. Podczas stosowania protokołu mysiego, użycie nożyczek do przetwarzania tkanek ludzkiej tkanki pochwy powodowało niewystarczające trawienie mechaniczne. Ekstrapolacja protokołów z wykorzystaniem tkanki mysiej i innych miejsc tkankowych9 nie powiodła się.
Większość prac wykorzystujących próbki z ludzkiej pochwy wykorzystywała tkanki od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy7,10. Chociaż kilka artykułów opisywało wykorzystanie próbek zarówno od osób przedmenopauzalnych, jak i pomenopauzalnych11, nie opisywały one wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznej izolacji fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie. Izolacja i modelowanie choroby przy użyciu fibroblastów z tkanki pomenopauzalnej może być niezbędne do zrozumienia patofizjologii komórkowej wypadania narządów miednicy, ponieważ stan ten ma najwyższą częstość występowania u osób w dekadzie po menopauzie12.
Opisujemy metodę izolacji i hodowli wzbogaconej fibroblastami zawiesiny jednokomórkowej z ludzkiej tkanki pochwy przy użyciu kombinacji dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. W tym artykule opisano niezawodny protokół, w jaki sposób można uzyskać ludzkie fibroblasty pochwy po menopauzie lub starzejące się. Potwierdzono, że izolowane komórki są fibroblastami w badaniu morfologicznym przy użyciu mikroskopii z kontrastem fazowym i immunofluorescencji (IF) w celu oceny ekspresji wimentyny, F-aktyny i aktyny α mięśni gładkich (α-SMA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Tkanka pochwy została pobrana od kobiet poddawanych operacji wypadania narządów miednicy. Tkanka pochwy pobrana po operacji została uznana za odpad i w przeciwnym razie zostałaby wyrzucona. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Massachusetts General Brigham.
1. Pobranie tkanki z pochwy od pacjentki
- Zdiagnozuj wypadanie narządów miednicy, zbierając wywiad i wykorzystując wyniki badania miednicy: W klinice uzyskano pomiary ilościowe wypadania narządów miednicy (POP-Q), które wykazały oznaki wypadania narządów miednicy.
- Stosuj następujące kryteria włączenia: powyżej 18 roku życia, historia objawowego wypadania narządów miednicy, wybór chirurgicznej korekcji wypadania narządów miednicy.
- Wyklucz następujące elementy: Kobiety w ciąży i pacjenci odmawiający oddania tkanki.
- Przytnij nadmiar tkanki pochwy jako niezbędny etap operacji wypadania narządów miednicy. Ten nabłonek pochwy jest wycinany w całkowitej grubości po następujących operacjach: kolporrhaphy przednia, kolporrhaphy tylna i colpocleisis.
- Przenieś tkankę do laboratorium w sterylnym kubku do pobierania próbek z normalną solą fizjologiczną lub pożywką DMEM/F12 (Gibco) bez surowicy. Trzymaj na lodzie.
2. Przetwarzanie i trawienie tkanek
- Przygotowanie tkanek
- Zmierz i przetnij tkankę tak, aby obejmowała całą grubość nabłonka pochwy, tworząc segmenty o długości około 1 cm2.
- Zapewnić precyzyjny pomiar rozmiaru biopsji 1 cm2,
UWAGA: Przeszacowanie wielkości biopsji tkanki może upośledzać trawienie tkanek. - Przygotuj 2-3 dodatkowe biopsje pochwy o wymiarach 1cm2 każda od jednego dawcy i odłóż biopsje na bok.
- Trawienie mechaniczne
- Umieścić biopsję pochwy na 10-centymetrowej szalce Petriego z hodowlą komórkową. Odpipetować 500-1 000 μl pożywki bez surowicy uzupełnionej 100 j./ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny Bonto do tkanki pochwy, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.
- Zmiel tkankę pochwy na małe fragmenty za pomocą dwóch sterylnych skalpeli (nr 11 lub nr 15) w obu rękach.
- Upewnij się, że końcówki ostrzy są prostopadłe do powierzchni tkanki. Wywieraj równy i równomierny nacisk na powierzchnię tkanki za pomocą dwóch skalpeli. Wykonuj naprzemienne ciągnięcie, aby pociąć tkankę na bardzo małe kawałki.
- Powtarzać tę technikę mielenia przy użyciu techniki dwóch skalpeli, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy 1-2 mm.
UWAGA: Trawienie mechaniczne przy użyciu tej techniki biopsji 1cm2 przy użyciu dwóch skalpeli powinno zająć około 15-20 minut. - Dodać 2-3 ml bezsurowicowej pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 100 j./ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B do płytki, zawieszając zmieloną tkankę. Odpipetować roztwór zawierający fragmenty tkanek w górę i w dół, aby rozbić wszelkie grudki.
- Trawienie enzymatyczne
- Przenieść roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj pożywkę DMEM/F12 bez surowicy do naczynia do hodowli tkankowej, w którym tkanka pochwy została zmielona, aby zebrać wszelkie pozostałe fragmenty tkanki. Przenieść roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki. Dodaj dodatkowe podłoża DMEM/F12 bez surowicy, aż całkowita objętość wyniesie 10 ml.
- Rozpuścić 5 mg liberazy w 1 ml jałowej wody (5 mg/ml). Przechowywać w 230 μl porcji w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca lub w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
- Dodać 230 μl liberazy (zapas 13 U/ml) do probówki, o końcowym stężeniu 0,3 U/ml.
UWAGA: Aktywność liberazy może się różnić w zależności od partii. Rozmrozić każdą porcję bezpośrednio przed użyciem w łaźni wodnej. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania. - Powtórz kroki 2.1-2.3 dla 2-3 dodatkowych biopsji dopochwowych tego samego dawcy.
UWAGA: Każdy roztwór zawierający fragmenty tkanek z pojedynczej biopsji należy przechowywać w oddzielnych stożkowych probówkach. Na przykład 4 biopsje pochwy w 4 probówkach. Jest to ważne dla optymalnego granulowania komórek po odwirowaniu. - Inkubować probówki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, stale i energicznie mieszając, używając mieszalnika do próbek.
- Umieścić mieszalnik próbek w inkubatorzeCO2. Utrzymuj stałe poruszenie. (Ustawienia mieszalnika próbek: 25 obr./min ruchu obrotowego przez 5 s, 30° ruchu posuwisto-zwrotnego (obrót przechylony) przez 5 s i 2° ruchu wibracyjnego (wirowego) przez 3 s).
- Podczas inkubacji wirować probówki w odstępach 30 minut.
- Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 5 minut. Usunąć i wyrzucić supernatant.
- Zawiesić osad w 1-2 ml pożywki DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B w celu rozcieńczenia enzymu liberazy. Energicznie pipetować, aż osad zostanie całkowicie zawieszony.
3. Hodowla komórkowa
- Usuwanie niestrawionych fragmentów tkanek
- Umieść sitko o pojemności 100 μm na sterylnym stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml.
- Zawiesinę komórkową z wielu biopsji tkanek tego samego dawcy należy połączyć ze sobą.
- Odcedzić zawiesinę tkankową/enzymatyczną, przeciskając ją tłokiem strzykawki o pojemności 5 ml. Powtarzaj ten krok, aż pozostałe fragmenty tkanki wydają się być całkowicie przeciśnięte.
UWAGA: Z fragmentów tkanki pochwy może znajdować się śluz, który nie jest w pełni przepuszczany przez sitko. Wyrzuć śluz za pomocą sitka do komórek.
- Łączenie kultur komórkowych
- Zawiesina komórek z puli płytek z wielu biopsji pochwy (od tego samego dawcy) na szalce Petriego (60 mm x 15 mm).
- Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze CO2 w temperaturze 37 °C przez noc.
- Obserwuj i potwierdź obecność nieprzylegających komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
- Upewnij się, że ostrość mikroskopu znajduje się na spodzie płytki.
UWAGA: Na pierwszym planie może znajdować się wiele komórek odpornościowych. Mniejsza liczba fibroblastów zostanie przyczepiona do dolnej części płytki. - Odczekaj 18-24 godziny przed zmianą pożywki do hodowli komórkowych, aby zapewnić odpowiednie przyleganie komórek.
- Zmieniaj pożywkę hodowlaną co trzy dni, aż do wystąpienia 80% konfluencji. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, rozwiń się do większej kolby lub zamroź porcje komórek do wykorzystania w przyszłości.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Tkankę pochwy pobrano od 10 niezależnych dawców poddawanych operacji obniżenia narządów miednicy mniejszej. Zgodnie z opisanym protokołem, komórki wyizolowano z ludzkiej tkanki pochwy. Populacje komórek charakteryzowały się wydłużonym, płaskim i wrzecionowatym wyglądem. Podobnie jak w innych badaniach, zaobserwowano istotnie wolniejszą zdolność do podwajania liczby komórek oraz zmniejszoną zdolność klonogeniczną fibroblastów wraz z wiekiem dawcy. Różnice te były wyraźne przy porównaniu fibroblastów wyizolowanych od osób ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Wiele wcześniejszych badań opisywało, jak wyizolować pierwotne fibroblasty z ludzkiej pochwy 3,7. W kilku badaniach wykorzystano ludzką tkankę pochwy od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy. Chociaż kilka prac opisywało wykorzystanie tkanek od osób przed menopauzą i po menopauzie 7,11, nie opisano w nich wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznego izolowania fibroblastów ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie mamy żadnych konfliktów interesów, które moglibyśmy ujawnić.
Podziękowania
Chcielibyśmy wyrazić naszą wdzięczność wszystkim członkom Centrum Biologii Rozrodu im. Vincenta w Massachusetts General Hospital, a także Fundacji VIncent Memorial Hospital za ich hojne wsparcie. Specjalne podziękowania dla dr Bo Ruedy i jego laboratorium za cenne sugestie i użyczenie nam sprzętu laboratoryjnego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Amfoterycyna B | Bio Techne | B23192 | |
| Sitko do komórek (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | ||
| (15 ml) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Jednorazowy skalpel z piór nr 15 | Socorex | FB.15 | |
| Płodowa surowica bydlęca | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| Stożkowe probówki wirówkowe o wysokiej czystości (50 ml) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Mieszalnik próbek HulaMixer | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Ludzka fibronektyna DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Ludzki Pro-Kolagen I alfa 1 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penicylina/Streptomycyna (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| szalki Petriego, polistyren (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| (10 ml) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Sterylne strzykawki (5 ml) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Bibliografia
- Mirin, A. A. Gender disparity in the funding of diseases by the U.S. J Womens Health. 30 (7), 956-963 (2021).
- MacLennan, A. H., Taylor, A. W., Wilson, D. H., Wilson, D. The prevalence of pelvic floor disorders and their relationship to gender, age, parity, and mode of delivery. BJOG. 107 (12), 1460-1470 (2000).
- Ruiz-Zapata, A. M., Kerkhof, M. H., Zandieh-Doulabi, B., Brölmann, H. A. M., Smit, T. H., Helder, M. N. Fibroblasts from women with pelvic organ prolapse show differential mechanoresponses depending on surface substrates. Int Urogynecol J Pelvic Floor Dysfunct. 24 (9), 1567-1575 (2013).
- Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
- Rorteau, J., et al. Maintenance of chronological aging features in culture of normal human dermal fibroblasts from old donors. Cells. 11 (5), 858(2022).
- Blum, M., Koehler, J., Yangdon, T., Chatterjea, D. Generating primary murine vaginal fibroblast cell lines. MethodsX. 7, 101100(2020).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. comparative characterization of vaginal cells derived from premenopausal women with and without severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (7), 931-943 (2016).
- Ruiz-Zapata, A. M., et al. Vaginal fibroblastic cells from women with pelvic organ prolapse produce matrices with increased stiffness and collagen content. Sci Rep. 6 (1), 22971(2016).
- Khan, M., Gasser, S. Generating primary fibroblast cultures from mouse ear and tail tissues. J Vis Exp. (107), e53565(2016).
- Kufaishi, H., Alarab, M., Drutz, H., Lye, S., Shynlova, O. Static mechanical loading influences the expression of extracellular matrix and cell adhesion proteins in vaginal cells derived from premenopausal women with severe pelvic organ prolapse. Reprod Sci. 23 (8), 978-992 (2016).
- Medel, S., Alarab, M., Kufaishi, H., Drutz, H., Shynlova, O. Attachment of primary vaginal fibroblasts to absorbable and nonabsorbable implant materials coated with platelet-rich plasma. Female Pelvic Med Reconstr Surg. 21 (4), 190-197 (2015).
- Awwad, J., Sayegh, R., Yeretzian, J., Deeb, M. E. Prevalence, risk factors, and predictors of pelvic organ prolapse. Menopause. 19 (11), 1235-1241 (2012).
- Waise, S., et al. An optimized method to isolate human fibroblasts from tissue for ex vivo analysis. Bio Protoc. 9 (23), e3440(2019).
- Nadalutti, C. A., Wilson, S. H. Using human primary foreskin fibroblasts to study cellular damage and mitochondrial dysfunction. Curr Protoc Toxicol. 86 (1), (2020).
- Da Silva Lara, L. A., et al. Menopause Leading to Increased Vaginal Wall Thickness in Women with Genital Prolapse: Impact on Sexual Response. J Sex Med. 6 (11), 3097-3110 (2009).
- Stasio, D. D., Lauritano, D., Iquebal, H., Romano, A., Gentile, E., Lucchese, A. Measurement of oral epithelial thickness by optical coherence tomography. Diagnostics. 9 (3), 90(2019).
- Zorina, A., Zorin, V., Kudlay, D., Kopnin, P. Age-related changes in the fibroblastic differon of the dermis: role in skin aging. Int J Mol Sci. 23 (11), 6135(2022).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
