Przetwarzanie tkanek i izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy

Summary

Ten protokół demonstruje niezawodną i skuteczną technikę izolowania pierwotnych fibroblastów z przedmenopauzalnej lub pomenopauzalnej ludzkiej tkanki pochwy. Istniejące protokoły izolacji fibroblastów pochwy nie uwzględniają wyzwań związanych z izolacją komórek z tkanki starczej. Tkankę pochwy pozyskano od kobiet po operacji wypadania narządów miednicy.

Abstract

Wypadanie narządów miednicy jest zaburzeniem, które poważnie wpływa na jakość życia kobiet. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy spadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie. Operacja korygująca wypadanie narządów miednicy jest podstawowym leczeniem. Ostatnio rośnie zainteresowanie badaniem składu tkanek pacjentów z wypadaniem na poziomie komórkowym.

Obecnie nie ma zgody co do wpływu wieku dawcy lub pacjenta na terapie komórkowe. Obecnie opublikowane protokoły izolacji fibroblastów pochwy albo koncentrują się na tkance przedmenopauzalnej, albo zaniedbują komentarz na temat wieku tkanki dawcy. Większość istniejących protokołów wykorzystuje modele zwierzęce. Konsystencja ludzkiej tkanki pochwy jest gęstsza niż tkanek stosowanych w większości protokołów. W tym badaniu ludzka tkanka pochwy została pozyskana głównie od starszych dawców, co prawdopodobnie przyczyniło się do niepowodzenia istniejących protokołów.

Celem tego badania jest opisanie standardowego protokołu niezawodnego pozyskiwania ludzkich fibroblastów pochwy, niezależnie od wieku dawcy i statusu menopauzy. Wyniki odtworzono przy użyciu tkanek pochodzących od dziewięciu różnych dawców, którzy przeszli operację wypadania narządów miednicy. Sześć pacjentek było po menopauzie, przy czym najstarsza dawczyni miała 78 lat. Średni wiek dawców tkanek wynosił 59 lat.

Tutaj opisujemy niezawodną metodę generowania wzbogaconej fibroblastami zawiesiny jednokomórkowej za pomocą kombinacji dysocjacji enzymatycznej i mechanicznej oraz łączenia zawiesiny komórkowej w wielu biopsjach pochwy od jednego dawcy. Wiarygodna izolacja pierwotnych fibroblastów pochwy może być przydatna w badaniu wypadania narządów miednicy, a także interakcji mikrobiom-gospodarz.

Introduction

Nierówność płci w nauce i badaniach jest ciągłym problemem. Badania nad zaburzeniami, które dotykają głównie osoby płci żeńskiej, są niedofinansowane¹. Wypadanie narządów miednicy mniejszej jest zaburzeniem silnie związanym z płcią żeńską. Występuje, gdy mięśnie i więzadła słabną i powodują, że narządy miednicy opadają niżej w miednicy, tworząc wybrzuszenie w pochwie². Niewiele wiadomo na temat interakcji komórkowych w kontekście tej patofizjologii, ani tego, jak czynniki na poziomie tkanek wpływają na powodzenie interwencji chirurgicznych³.

Komórki pierwotne, a nie linie komórkowe, są powszechnie uznawane za niezbędne dla translacyjnych badań klinicznych, zapewniając większą przydatność fizjologiczną⁴. Komórki pierwotne są pobierane bezpośrednio z tkanki ciała będącej przedmiotem zainteresowania i mogą bardziej precyzyjnie naśladować fizjologię in vivo. Izolacja pierwotnych fibroblastów z ludzkiej pochwy może być przydatna do badania biologicznych mechanizmów wypadania narządów miednicy mniejszej i modelowania choroby, biorąc pod uwagę kluczowe cechy dawcy, takie jak wiek i stan menopauzy.

Wypadanie narządów miednicy często dotyka osoby starsze lub po menopauzie. Izolacja i proliferacja pierwotnych komórek fibroblastów w badaniu tego schorzenia jest wyzwaniem ze względu na zmniejszone populacje komórek i zdolność klonogenną od starszych dawców⁵. Z naszego doświadczenia wynika, że zastosowanie wcześniej opisanych protokołów dysocjacji tkanki pochwy nie pozwoliło na ekstrakcję żadnych fibroblastów ze standardowej biopsji tkankowej 1 cm².

Poprzez przegląd literatury stwierdziliśmy, że podobne badania zostały podzielone na dwie grupy: modele zwierzęce, takie jak mysie⁶, oraz modele ludzkie^7,8. Podczas stosowania protokołu mysiego, użycie nożyczek do przetwarzania tkanek ludzkiej tkanki pochwy powodowało niewystarczające trawienie mechaniczne. Ekstrapolacja protokołów z wykorzystaniem tkanki mysiej i innych miejsc tkankowych⁹ nie powiodła się.

Większość prac wykorzystujących próbki z ludzkiej pochwy wykorzystywała tkanki od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy^7,10. Chociaż kilka artykułów opisywało wykorzystanie próbek zarówno od osób przedmenopauzalnych, jak i pomenopauzalnych¹¹, nie opisywały one wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznej izolacji fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie. Izolacja i modelowanie choroby przy użyciu fibroblastów z tkanki pomenopauzalnej może być niezbędne do zrozumienia patofizjologii komórkowej wypadania narządów miednicy, ponieważ stan ten ma najwyższą częstość występowania u osób w dekadzie po menopauzie¹².

Opisujemy metodę izolacji i hodowli wzbogaconej fibroblastami zawiesiny jednokomórkowej z ludzkiej tkanki pochwy przy użyciu kombinacji dysocjacji mechanicznej i enzymatycznej. W tym artykule opisano niezawodny protokół, w jaki sposób można uzyskać ludzkie fibroblasty pochwy po menopauzie lub starzejące się. Potwierdzono, że izolowane komórki są fibroblastami w badaniu morfologicznym przy użyciu mikroskopii z kontrastem fazowym i immunofluorescencji (IF) w celu oceny ekspresji wimentyny, F-aktyny i aktyny α mięśni gładkich (α-SMA).

Protocol

Tkanka pochwy została pobrana od kobiet poddawanych operacji wypadania narządów miednicy. Tkanka pochwy pobrana po operacji została uznana za odpad i w przeciwnym razie zostałaby wyrzucona. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostało zatwierdzone przez Institutional Review Board of Massachusetts General Brigham.

1. Pobranie tkanki z pochwy od pacjentki

1. Zdiagnozuj wypadanie narządów miednicy, zbierając wywiad i wykorzystując wyniki badania miednicy: W klinice uzyskano pomiary ilościowe wypadania narządów miednicy (POP-Q), które wykazały oznaki wypadania narządów miednicy.
2. Stosuj następujące kryteria włączenia: powyżej 18 roku życia, historia objawowego wypadania narządów miednicy, wybór chirurgicznej korekcji wypadania narządów miednicy.
3. Wyklucz następujące elementy: Kobiety w ciąży i pacjenci odmawiający oddania tkanki.
4. Przytnij nadmiar tkanki pochwy jako niezbędny etap operacji wypadania narządów miednicy. Ten nabłonek pochwy jest wycinany w całkowitej grubości po następujących operacjach: kolporrhaphy przednia, kolporrhaphy tylna i colpocleisis.
5. Przenieś tkankę do laboratorium w sterylnym kubku do pobierania próbek z normalną solą fizjologiczną lub pożywką DMEM/F12 (Gibco) bez surowicy. Trzymaj na lodzie.

2. Przetwarzanie i trawienie tkanek

1. Przygotowanie tkanek
   1. Zmierz i przetnij tkankę tak, aby obejmowała całą grubość nabłonka pochwy, tworząc segmenty o długości około 1 cm².
   2. Zapewnić precyzyjny pomiar rozmiaru biopsji 1 cm²,
      UWAGA: Przeszacowanie wielkości biopsji tkanki może upośledzać trawienie tkanek.
   3. Przygotuj 2-3 dodatkowe biopsje pochwy o wymiarach 1^cm2 każda od jednego dawcy i odłóż biopsje na bok.
2. Trawienie mechaniczne
   1. Umieścić biopsję pochwy na 10-centymetrowej szalce Petriego z hodowlą komórkową. Odpipetować 500-1 000 μl pożywki bez surowicy uzupełnionej 100 j./ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny Bonto do tkanki pochwy, aby zapobiec wysuszeniu tkanki.
   2. Zmiel tkankę pochwy na małe fragmenty za pomocą dwóch sterylnych skalpeli (nr 11 lub nr 15) w obu rękach.
   3. Upewnij się, że końcówki ostrzy są prostopadłe do powierzchni tkanki. Wywieraj równy i równomierny nacisk na powierzchnię tkanki za pomocą dwóch skalpeli. Wykonuj naprzemienne ciągnięcie, aby pociąć tkankę na bardzo małe kawałki.
   4. Powtarzać tę technikę mielenia przy użyciu techniki dwóch skalpeli, aż próbka uzyska jednolitą konsystencję z kawałkami o średnicy 1-2 mm.
      UWAGA: Trawienie mechaniczne przy użyciu tej techniki biopsji 1^cm2 przy użyciu dwóch skalpeli powinno zająć około 15-20 minut.
   5. Dodać 2-3 ml bezsurowicowej pożywki DMEM/F12 uzupełnionej 100 j./ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B do płytki, zawieszając zmieloną tkankę. Odpipetować roztwór zawierający fragmenty tkanek w górę i w dół, aby rozbić wszelkie grudki.
3. Trawienie enzymatyczne
   1. Przenieść roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj pożywkę DMEM/F12 bez surowicy do naczynia do hodowli tkankowej, w którym tkanka pochwy została zmielona, aby zebrać wszelkie pozostałe fragmenty tkanki. Przenieść roztwór zawierający fragmenty tkanek do stożkowej probówki. Dodaj dodatkowe podłoża DMEM/F12 bez surowicy, aż całkowita objętość wyniesie 10 ml.
   2. Rozpuścić 5 mg liberazy w 1 ml jałowej wody (5 mg/ml). Przechowywać w 230 μl porcji w temperaturze -20 °C przez okres do miesiąca lub w temperaturze -80 °C przez 6 miesięcy.
   3. Dodać 230 μl liberazy (zapas 13 U/ml) do probówki, o końcowym stężeniu 0,3 U/ml.
      UWAGA: Aktywność liberazy może się różnić w zależności od partii. Rozmrozić każdą porcję bezpośrednio przed użyciem w łaźni wodnej. Unikaj wielokrotnego zamrażania i rozmrażania.
   4. Powtórz kroki 2.1-2.3 dla 2-3 dodatkowych biopsji dopochwowych tego samego dawcy.
      UWAGA: Każdy roztwór zawierający fragmenty tkanek z pojedynczej biopsji należy przechowywać w oddzielnych stożkowych probówkach. Na przykład 4 biopsje pochwy w 4 probówkach. Jest to ważne dla optymalnego granulowania komórek po odwirowaniu.
   5. Inkubować probówki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C, stale i energicznie mieszając, używając mieszalnika do próbek.
   6. Umieścić mieszalnik próbek w inkubatorze_CO2. Utrzymuj stałe poruszenie. (Ustawienia mieszalnika próbek: 25 obr./min ruchu obrotowego przez 5 s, 30° ruchu posuwisto-zwrotnego (obrót przechylony) przez 5 s i 2° ruchu wibracyjnego (wirowego) przez 3 s).
   7. Podczas inkubacji wirować probówki w odstępach 30 minut.
   8. Odwirować próbki o masie 3 000 x g przez 5 minut. Usunąć i wyrzucić supernatant.
   9. Zawiesić osad w 1-2 ml pożywki DMEM/F12 z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny, 2,5 μg/ml amfoterycyny B w celu rozcieńczenia enzymu liberazy. Energicznie pipetować, aż osad zostanie całkowicie zawieszony.

3. Hodowla komórkowa

1. Usuwanie niestrawionych fragmentów tkanek
   1. Umieść sitko o pojemności 100 μm na sterylnym stożkowym pojemniku o pojemności 50 ml.
   2. Zawiesinę komórkową z wielu biopsji tkanek tego samego dawcy należy połączyć ze sobą.
   3. Odcedzić zawiesinę tkankową/enzymatyczną, przeciskając ją tłokiem strzykawki o pojemności 5 ml. Powtarzaj ten krok, aż pozostałe fragmenty tkanki wydają się być całkowicie przeciśnięte.
      UWAGA: Z fragmentów tkanki pochwy może znajdować się śluz, który nie jest w pełni przepuszczany przez sitko. Wyrzuć śluz za pomocą sitka do komórek.
2. Łączenie kultur komórkowych
   1. Zawiesina komórek z puli płytek z wielu biopsji pochwy (od tego samego dawcy) na szalce Petriego (60 mm x 15 mm).
   2. Inkubować szalkę Petriego w inkubatorze CO_{2 w} temperaturze 37 °C przez noc.
   3. Obserwuj i potwierdź obecność nieprzylegających komórek za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
   4. Upewnij się, że ostrość mikroskopu znajduje się na spodzie płytki.
      UWAGA: Na pierwszym planie może znajdować się wiele komórek odpornościowych. Mniejsza liczba fibroblastów zostanie przyczepiona do dolnej części płytki.
   5. Odczekaj 18-24 godziny przed zmianą pożywki do hodowli komórkowych, aby zapewnić odpowiednie przyleganie komórek.
   6. Zmieniaj pożywkę hodowlaną co trzy dni, aż do wystąpienia 80% konfluencji. Gdy komórki osiągną 80-90% konfluencji, rozwiń się do większej kolby lub zamroź porcje komórek do wykorzystania w przyszłości.

Results

Tkanka pochwy została pobrana od 10 niezależnych dawców, którzy przeszli operację wypadnięcia narządów miednicy. Za pomocą opisanego protokołu wyizolowano komórki z ludzkiej tkanki pochwy. Populacje komórek miały charakterystyczny wydłużony, płaski i wrzecionowaty wygląd. Podobnie jak w innych badaniach, zaobserwowaliśmy istotnie wolniejsze podwajanie zdolności komórek i zmniejszającą się zdolność klonogenną fibroblastów wraz z wiekiem dawcy. Różnice te były wyraźne przy porównaniu fibroblastów wyizolowanych od osób starszych (75-78 lat) z tymi wyizolowanymi od osób młodych (35-47 lat). Komórki od dawców w średnim wieku wykazywały profil pośredni (56-61 lat). Tempo proliferacji komórek początkowo oszacowano za pomocą bezpośredniej wizualizacji przy użyciu mikroskopu z kontrastem fazowym o tej samej znanej gęstości wysiewu.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 1 przedstawia schematyczne przedstawienie protokołu dysocjacji i izolacji. Po wykonaniu tych kroków protokół ten przyniósł 90% wskaźnik sukcesu pierwotnej izolacji fibroblastów u dziewięciu na dziesięciu dawców w wystarczającej liczbie komórek, aby umożliwić subkulturację komórek. Średni wiek dawców wynosił 59 lat.

Rozdział

Protokół (Autor, rok)	Tkanka dawcy według oryginalnego protokołu	Liczba darczyńców	Wiek dawcy w latach	Otrzymane fibroblasty	morfologia
Ruiz-Zapata i wsp., 2013	Ludzka pochwa	3	56-78 Rozdział 56-78	Nie	N/a
Khan i wsp., 2016	Ucho i ogon myszy	cyfra arabska	Rozdział 48-65	Nie	N/a
Waise i wsp., 2019	Tkanka ludzka	3	56-75 Rozdział 56-75	Nie	N/a
Nadalutti i wsp., 2020	Napletek ludzki	1	65	Nie	N/a
aktualny	Ludzka pochwa	10	Rejony 35-79	tak	W kształcie wrzeciona

Tabela 1: Porównanie protokołów skutecznej izolacji ludzkich fibroblastów pochwy. Porównanie różnych istniejących protokołów z naszym i potwierdzone wynikami morfologicznymi.

Tabela 1 pokazuje wyniki wykorzystania innych protokołów do próby izolacji fibroblastów pochwy w tym badaniu. Opracowaliśmy standardowy protokół izolacji pierwotnych fibroblastów z błony śluzowej pochwy i starszych dawców⁵.

Przetestowaliśmy kilka sprawdzonych protokołów, w tym te wymienione w Tabeli 1, i nie zaobserwowaliśmy sukcesu w izolacji komórek przy użyciu tych protokołów w naszym badaniu. Proponujemy następujące powody ich ograniczeń.

Protokół opublikowany przez Ruiz et al.³ polega na zeskrobaniu powięzi i pocięciu tkanki na małe kawałki. Z naszego doświadczenia wynika, że trudno jest odróżnić powięź, a próby skrobania mogą skutkować znacznym zmniejszeniem wydajności komórek. Chociaż ta metoda jest prosta, brakuje jej krytycznych szczegółów, co ogranicza jej uogólnienie. Ponadto trawienie mechaniczne w tym protokole wydaje się niewystarczające dla tkanki pomenopauzalnej, która ma tendencję do bycia gęstszym.

Protokoły opublikowane przez Khan et al.⁹ i Waise et al.¹³ wykorzystują nożyczki do mielenia tkanek, które nie wprowadzają znaczących wielokierunkowych sił ścinających w porównaniu do techniki skalpela. Z naszego doświadczenia wynika, że metoda nożyczek również nie działała skutecznie.

Na koniec, protokół Nadalutti et al.¹⁴, który używał metody eksplantacji, nie doprowadził do powstania fibroblastów w naszych rękach. Ta metoda może być mniej skuteczna ze względu na charakter tkanki pomenopauzalnej, która może wymagać bardziej agresywnego przetwarzania mechanicznego i enzymatycznego w celu skutecznej dysocjacji fibroblastów.

Rysunek 2: Obraz kontrastu fazowego zawieszonych komórek w dniu 0. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2 pokazuje zawieszone komórki w dniu 0 przy użyciu naszego protokołu.

Rysunek 3: Obraz z kontrastem fazowym pierwotnych fibroblastów pochwy w 14 dniu hodowli w 100-krotnym powiększeniu z zbiorczej zawiesiny komórek trzech biopsji tkanek o średnicy 1 cm². Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3 pokazuje pierwotne fibroblasty w 100-krotnym powiększeniu z połączonej zawiesiny komórek składającej się z 3 biopsji tkanek o wymiarach 1 cm².

Tożsamość fibroblastów została zbadana za pomocą technik immunofluorescencyjnych, jak opisano wcześniej, z niewielkimi modyfikacjami. Aby zweryfikować pochodzenie komórkowe pierwotnych komórek pochwy, użyliśmy specyficznych biomarkerów pochodzenia fibroblastycznego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego. Komórki zidentyfikowano jako fibroblasty na podstawie pozytywnego barwienia wimentyny (Ryc. 4), F-aktyny i α-SMA z próbek tkanek przed menopauzą i po menopauzie (Ryc. 5). Fibroblasty hodowano w celu ekspansji z wysoką żywotnością (>90%) do wykorzystania w eksperymentach.

Rysunek 4: Pozytywne barwienie wimentyny w fibroblastach pochwy. Wyizolowane pierwotne fibroblasty tkanek przed menopauzą i po menopauzie poddano analizie IF, a obrazy wykonano w 200-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Pozytywne barwienie F-aktyny i α-SMA w fibroblastach pochwy. Wyniki ekspresji białek w porównaniu z kontrolą IgG. Obrazy zostały zebrane w 200-krotnym powiększeniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Wiele wcześniejszych badań opisywało, jak wyizolować pierwotne fibroblasty z ludzkiej pochwy ^3,7. W kilku badaniach wykorzystano ludzką tkankę pochwy od osób przed menopauzą z wypadaniem narządów miednicy. Chociaż kilka prac opisywało wykorzystanie tkanek od osób przed menopauzą i po menopauzie ^7,11, nie opisano w nich wystarczająco szczegółowo protokołu stosowanego do skutecznego izolowania fibroblastów od dawców starszych lub po menopauzie. Ściana pochwy jest grubsza u kobiet po menopauzie z wypadaniem narządów płciowych niż u kobiet przed menopauzą, co może odpowiadać za zwiększoną trudność z izolacją w tej populacji¹³. Skuteczna izolacja od dawców po menopauzie jest niezbędna do modelowania i badania choroby, ponieważ zaburzenia dna miednicy są najbardziej rozpowszechnione w grupach wiekowych po menopauzie lub starszych.

Opracowaliśmy protokół skutecznego i konsekwentnego pobierania i hodowli ludzkich fibroblastów pochwy od dawczyń w wieku 35-78 lat. Pochodzenie komórkowe pierwotnych komórek pochwy zostało potwierdzone przez biomarkery pochodzenia fibroblastycznego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego.

Przedstawiona tu procedura izolacji fibroblastów pochwy umożliwia izolację i hodowlę pierwotnych komórek fibroblastów. Z naszego doświadczenia wynika, że zastosowanie wcześniej opublikowanych protokołów dla tkanki zwierzęcej⁹i ludzkiej ^3,14,16 do dysocjacji komórek pierwotnych nie doprowadziło do ekstrakcji żadnych fibroblastów z próbek ludzkiej pochwy w tym badaniu¹⁴.

Postawiliśmy dwie prawdopodobne przyczyny wyzwań związanych z dysocjacją komórek od ludzkiej tkanki pochwy: (1) grubość skóry śluzowej jest większa u starszych dawców i w porównaniu z tkanką niebłonową od starszych dawców^13,17, co utrudnia dysocjację komórek oraz (2) gęstość fibroblastów może być znacznie zmniejszona u osób starszych¹⁷.

Biorąc pod uwagę te wyzwania, istnieje kilka krytycznych kroków w tym protokole, które nie powinny być modyfikowane. Pierwszym krytycznym krokiem jest wdrożenie bardzo rygorystycznego trawienia mechanicznego. Tutaj stosujemy technikę dwóch skalpeli. Z naszego doświadczenia wynika, że zastąpienie nożyczkami w celu rozdrobnienia tkanki nie daje wystarczająco małych fragmentów, aby oddzielić fibroblasty od ludzkiej tkanki pochwy.

Innym krytycznym krokiem jest zebranie zawiesiny komórek i pobranie 3-4 biopsji pełnej grubości (1 cm²) od jednego dawcy. Jest to konieczne, aby uzyskać wystarczającą ilość komórek do dalszej hodowli. We wszystkich przypadkach pobraliśmy znacznie więcej tkanki niż 1^cm2 , ponieważ nadmiar nabłonka pochwy jest przycinany jako niezbędna część operacji wypadania narządów miednicy. W tym badaniu połączyliśmy tylko zawiesiny komórek, które pochodziły od tego samego dawcy, ponieważ staraliśmy się zbadać i zróżnicować cechy komórkowe i proliferację między różnymi dawcami.

Nasz protokół ma wyraźną zaletę: trawienie mechaniczne i enzymatyczne prowadzi do lepszych plonów tkanki po menopauzie, ale nie ma negatywnego wpływu na próbki przed menopauzą.

Zdajemy sobie sprawę z kilku ograniczeń naszego protokołu. Dostęp do ludzkiej tkanki pochwy może być trudny w sytuacjach, gdy operacja wypadania pochwy nie jest wykonywana. Ograniczeniem może być również konieczność łączenia zawiesin komórkowych z wielu próbek biopsji tkanek.

Podsumowując, ten protokół pozyskiwania ludzkich fibroblastów pochwy będzie użytecznym narzędziem do przyszłych badań nad zaburzeniami dna miednicy, zwłaszcza u osób po menopauzie, a także ważnym dodatkiem do badań nad zdrowiem kobiet.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amfoterycyna B	Bio Techne	B23192
Sitko do komórek (100 μ m)		ThermoFisher Scientific
(15 ml)	Fisher Scientific	14-959-53A
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Jednorazowy skalpel z piór nr 15	Socorex	FB.15
Płodowa surowica bydlęca	Sigma Aldrich	NC1983075
Stożkowe probówki wirówkowe o wysokiej czystości (50 ml)	Fisher Scientific	14-432-22
Mieszalnik próbek HulaMixer	ThermoFisher Scientific	15920D
Ludzka fibronektyna DuoSet ELISA	R& D Systems	DY1918-05
Ludzki Pro-Kolagen I alfa 1 DuoSet ELISA	R& D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Penicylina/Streptomycyna (5000U/ml)	ThermoFisher Scientific	15070063
szalki Petriego, polistyren (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
(10 ml)	ThermoFischer Scientific	170356N
Sterylne strzykawki (5 ml)	Fischer Scientific	14-955-458