Method Article

Mechaniczna dysocjacja tkanek do analizy pojedynczych komórek za pomocą urządzenia z napędem silnikowym

DOI:

10.3791/65866

⸱

November 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland, 2UMD Terrapin Works, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dostępny jest ogólny protokół połączonej enzymatycznej i półautomatycznej mechanicznej dysocjacji tkanek w celu generowania zawiesin jednokomórkowych do dalszych analiz, takich jak cytometria przepływowa. Dołączone są instrukcje dotyczące wytwarzania, montażu i obsługi taniego urządzenia mechanicznego opracowanego dla tego protokołu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Możliwość izolowania i przygotowywania pojedynczych komórek do analizy próbek tkanek szybko stała się kluczowa dla nowych odkryć i badań biomedycznych. Ręczne protokoły izolacji pojedynczych komórek są bardzo czasochłonne i podatne na zmienność użytkownika. Zautomatyzowane protokoły mechaniczne są w stanie skrócić czas przetwarzania i zmienność próbek, ale nie są łatwo dostępne ani opłacalne w środowiskach badawczych o niższych zasobach. Opisywane tutaj urządzenie zostało zaprojektowane do półautomatycznej dysocjacji tkanek przy użyciu dostępnych na rynku materiałów jako tania alternatywa dla laboratoriów akademickich. Dostarczono instrukcje dotyczące wytwarzania, montażu i obsługi konstrukcji urządzenia. Protokół dysocjacji niezawodnie wytwarza zawiesiny jednokomórkowe o porównywalnej wydajności komórek i żywotności próbki do ręcznych preparatów w wielu tkankach myszy. Protokół zapewnia możliwość jednoczesnego przetwarzania do 12 próbek tkanek na urządzenie, dzięki czemu badania wymagające dużych rozmiarów próbek są łatwiejsze do opanowania. Dołączone oprogramowanie pozwala również na dostosowanie protokołu urządzenia do różnych tkanek i ograniczeń eksperymentalnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza pojedynczych komórek szybko stała się kluczowa dla nowych odkryć biomedycznych, czy to dla zastosowań takich jak cytometria przepływowa, identyfikacja różnych typów komórek, sekwencjonowanie pojedynczych komórek, czy też do identyfikacji genomowych lub transkryptomicznych różnic między komórkami1. Wykonanie takiej izolacji komórek z tkanek będących przedmiotem zainteresowania wymaga zmielenia wypreparowanych tkanek i przepchnięcia ich przez drobne sitko komórkowe w celu odfiltrowania tkanki łącznej z pożądanych komórek (Rysunek 1A). Izolowanie przylegających typów komórek, takich jak komórki dendrytyczne lub makrofagi, lub komórek ze szczególnie włóknistych tkanek, wymaga dodatkowych mechanicznych lub enzymatycznych etapów separacji2,3,4. Proces ten jest zazwyczaj wykonywany ręcznie, co sprawia, że jest bardzo czasochłonny i podatny na zmienność użytkownika podczas oceny wydajności komórek i żywotności próbki. Dlatego tak ważne jest wprowadzenie konfigurowalnych opcji automatycznej dysocjacji tkanek. Chociaż podjęto pewne próby zaprojektowania takich systemów, istniejące opcje nie zawsze są łatwo dostępne, szczególnie w laboratoriach akademickich i środowiskach o niższych zasobach, głównie ze względu na zbyt kosztowny charakter tych urządzeń5. Co więcej, urządzenia te nie zawsze dają się dostosować do indywidualnych potrzeb grupy badawczej6.

Tutaj zaprojektowano urządzenie do dysocjacji tkanek, aby zautomatyzować trawienie całych tkanek lub fragmentów tkanek do jednokomórkowych zawiesin za pomocą enzymów trawiennych i mechanicznych zakłóceń. Urządzenie to można łatwo zmontować w laboratorium, umieścić w komorach grzewczych lub chłodzących w celu regulacji temperatury, dostosować do wymaganej liczby tkanek do dysocjacji i zaprogramować z pożądanymi protokołami dysocjacji. Szerokie zastosowanie tego urządzenia może znacznie poprawić odtwarzalność protokołów ekstrakcji komórek i zapewnić oszczędzającą czas alternatywę dla ręcznej dysocjacji.

Konstrukcja pozwala na jednoczesne trawienie do 12 tkanek w zautomatyzowanym procesie. Urządzenie składa się z 12 pojedynczych silników połączonych równolegle i zasilanych standardową wtyczką ścienną poprzez zasilacz AC/DC z regulowanym pokrętłem napięcia do sterowania obrotami/prędkością silników. Silniki obracają sześciokątną, która ściśle przylega do górnej części rur C. Rurki C są utrzymywane na miejscu przez naprężenie w dół na akrylowej płycie, która zatrzaskuje się po obu stronach do górnej płyty, na której zamocowane są silniki (Rysunek 1B). Ponieważ silniki są połączone równolegle, ich prędkość przy danym napięciu nie powinna się zbytnio różnić, ale obciążenie (liczba rurek C zamontowanych na urządzeniu) będzie miało wpływ na prędkość nawet wtedy, gdy napięcie jest utrzymywane na stałym poziomie. Do pomiaru obrotów na minutę (obr./min) zainstalowano obrotomierz z czujnikiem halla i magnesem stałym na jednym z wałów silnika (rysunek uzupełniający 1). Pliki CAD do budowy układów silnikowych znajdują się w Uzupełniającym pliku kodowania 1. W zestawie znajduje się również programowalny przełącznik do odwracania kierunku obrotów poprzez odwrócenie dodatnich/ujemnych ładunków dostarczanych do silników. Wszystkie te funkcje są zintegrowane za pomocą kodowanego oprogramowania (oprogramowanie Arduino IDE, patrz tabela materiałów) na Arduino Nano (Supplementary Coding File 2). Za pomocą połączonych przycisków i panelu LCD (rysunek uzupełniający 2) można tworzyć i uruchamiać zapisane i niestandardowe protokoły, automatycznie odwracać kierunek obrotów w określonych momentach protokołu, dostosowywać prędkość za pomocą napięcia (rysunek uzupełniający 3) oraz wyświetlać aktualną prędkość silnika i czas pozostały do ukończenia zaprogramowanego protokołu (rysunek uzupełniający 4).

Na potrzeby niniejszego badania, monochromatyczne zawiesiny zostały przygotowane przy użyciu zarówno mechaniczno-enzymatycznej dysocjacji tkanek za pomocą tego urządzenia, jak i manualno-enzymatycznej dysocjacji tkanek w celu określenia różnic, jeśli takie istnieją, w komórkach odzyskanych do dalszych zastosowań. Preparaty komórkowe oceniano na podstawie całkowitej wydajności komórek na tkankę i procentu żywotności komórek. Cytometria przepływowa została wykorzystana do porównania różnic potencjałów w ekspresji markerów powierzchniowych. Dane analizowano za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej. Niesparowane testy t Welcha użyto do porównania par próbek lub grup, przy czym wielkość próby n > 4 myszy reprezentowała 2 powtórzone eksperymenty. Szczegółową instrukcję wykonania i montażu tego urządzenia można znaleźć w pliku uzupełniającym 1. Materiały potrzebne do tego protokołu są wymienione w Tabeli Materiałów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół został zatwierdzony przez UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Do badań wykorzystano tkanki od 7 do 9 tygodniowych samic myszy C57BL/6J. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów).

1. Ręczna dysocjacja

UWAGA: Ten krok jest zaadaptowany z Maisel K. et al.7.

  1. Usuń wypreparowaną tkankę i umieść ją w pożywce do hodowli zimnych komórek z 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
  2. Posiekaj tkankę ostrymi nożyczkami do preparowania, aż fragmenty będą mniejsze niż 1 mm w dowolnym wymiarze.
  3. Przenieść zmieloną tkankę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dodać 5 ml pożywki.
  4. Dodaj enzymy trawienne w oparciu o izolowane tkanki i typy komórek. Do prezentowanych eksperymentów należy stosować kolagenazę 4 (1 mg/ml), kolagenazę D (1 mg/ml) i DNazę (40 μg/ml).
  5. Inkubować na wytrząsarce lub kołysce przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, delikatnie mieszając przez cały czas inkubacji. Odpipetować próbkę w górę i w dół 100 razy.
  6. Dodać EDTA, aby uzyskać objętość próbki o stężeniu 5 mM. Odpipetować próbkę w górę i w dół 100 razy, a następnie energicznie pipetować próbkę w górę i w dół 100 razy.
  7. Przepuścić próbkę przez sitko o pojemności 70 μm i zebrać ją do probówki o pojemności 50 ml lub 15 ml.
  8. Odwirować zebrane komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  9. Zneutralizuj bufor do lizy, dodając 9 ml zimnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem 1X (PBS).
  10. Ponownie odwirować zebrane komórki w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w żądanym buforze lub pożywce.

2. Półautomatyczna dysocjacja mechaniczna

  1. Wypreparowaną tkankę umieścić w pożywce do hodowli zimnych komórek z 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS).
    UWAGA: Ten protokół jest przeznaczony do izolacji komórek z tkanek stałych.
  2. Posiekaj tkankę ostrymi nożyczkami do preparowania, aż fragmenty tkanki osiągną około 5 mm w dowolnym wymiarze. Przenieś posiekaną tkankę do rurki C i dodaj 1 ml pożywki.
  3. Załaduj rurkę C do urządzenia. Zamontuj płytkę mocującą rurkę (rysunek uzupełniający 1A) na dnie rurki w kształcie litery D.
  4. Przymocuj rurki do płyty silnika, zatrzaskując ramiona napinające w płycie akrylowej (rysunek uzupełniający 3).
  5. Ustaw program niestandardowy: Do przodu, 30 s; Bieg wsteczny, 10 s; Pętla, 4 razy.
    1. Wybierz tryb niestandardowy z menu głównego, naciskając niebieski przycisk.
    2. W pierwszym menu trybu niestandardowego określ czas obrotu do przodu na 30 s, naciskając czerwony przycisk, aż wartość na ekranie wskaże 30 s. Naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tę wartość i przejść do następnego ekranu menu.
    3. W drugim menu trybu niestandardowego określ czas trwania obrotu wstecznego na 10 s, naciskając czerwony przycisk, aż wartość na ekranie wskaże 10 s. Naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tę wartość i przejść do następnego ekranu menu.
    4. W trzecim menu trybu niestandardowego określ, ile razy mają być powtarzane wybory ustawione w krokach 2.5.2-2.5.3, naciskając czerwony przycisk, aż wartość na ekranie wskaże 4X. Naciśnij niebieski przycisk, aby wybrać tę wartość i uruchomić program.
      UWAGA: Programy niestandardowe nie są przechowywane w pamięci urządzenia, ale można je zaprogramować jako jeden z zaprogramowanych programów w celu szybszego działania (instrukcje programowania urządzenia znajdują się w pliku uzupełniającym 1).
  6. Uruchom program niestandardowy przy 200 obr./min, regulując voltage pokrętło sterujące (Rysunek uzupełniający 3), aż obliczona wartość obrotów w prawym dolnym rogu ekranu LCD wskaże 200 (Rysunek uzupełniający 4).
  7. Dodać enzymy trawiące w pożywce o objętości 4 ml zgodnie z izolowanymi typami tkanek i komórek.
    UWAGA: Do prezentowanych eksperymentów należy użyć kolagenazy 4 (1 mg/ml), kolagenazy D (1 mg/ml) i DNazy (40 μg/ml).
  8. Załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz kroki 2.3-2.6, aby uruchomić następujący program przy 200 obr./min: Do przodu, 30 s; Bieg wsteczny, 10 s; Pętla, 4 razy.
  9. Przenieść urządzenie z nadal załadowanymi probówkami do inkubatora o temperaturze 37 °C na 45 minut.
  10. Załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz kroki 2.3-2.6, aby uruchomić następujący program przy 50 obr./min: Do przodu, 270 s; Bieg wsteczny, 30 s; Pętla, 9 razy.
  11. Dodać EDTA, aby osiągnąć stężenie 5 mM w próbce.
  12. Załaduj rurkę C do urządzenia i powtórz kroki 2.3-2.6, aby uruchomić następujący program przy 100 obr./min: Do przodu, 30 s; Bieg wsteczny, 10 s; Pętla, 2 razy.
  13. Przepchnąć próbkę przez sitko o pojemności 70 μm i zebrać ją do probówki o pojemności 50 ml lub 15 ml.
  14. Odwirować zebrane komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w 1 ml buforu do lizy czerwonych krwinek. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  15. Zneutralizować bufor do lizy za pomocą 9 ml zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
  16. Ponownie odwirować zebrane komórki przy stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety i ponownie zawiesić komórki w żądanym buforze lub pożywce.

3. Analiza danych

  1. Analizuj dane za pomocą oprogramowania do tworzenia wykresów i analizy statystycznej (patrz Spis materiałów).
  2. Użyj niesparowanych testów t Welcha, aby porównać pary próbek lub grupy, przy czym wielkość próby n > 4 myszy reprezentują 2 powtórzone eksperymenty.
    UWAGA: Różnice uznano za statystycznie istotne, gdy (>p < 0,05). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten półautomatyczny protokół mechaniczny może replikować wyniki eksperymentów, w których komórki były przetwarzane ręcznie. Zawiesiny komórkowe przygotowane za pomocą tego urządzenia i przez ręczną dysocjację wykazują porównywalną wydajność komórek i żywotność próbki w tkankach płuc, nerek i serca myszy (Rysunek 2A,B). Populacje komórek odpornościowych, takich jak limfocyty T i komórki dendrytyczne, nie były znacząco dotknięte różnicą w protokole izolacji (Rysunek ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Urządzenie to zostało zaprojektowane z myślą o łatwym montażu w warunkach badawczych w celu zapewnienia zawiesin pojedynczych komórek z całych tkanek do późniejszej analizy pojedynczych komórek. Funkcje, choć podstawowe, są wystarczające, aby zaspokoić potrzeby badaczy w środowisku akademickim i poza nim. Kluczową korzyścią płynącą z zastosowania tego urządzenia jest jego potencjał do poprawy przygotowania zawiesin jednokomórkowych poprzez zmniejszenie zmienności. Ponadto możliwość jednoczesnego przetwarzania 12+ próbek ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie otrzymano od Fischell Department of Bioengineering (KM), T32 GM080201 (MA), Vogel Endowed Summer Fellowship (MA), LAM Foundation (KM) i American Lung Association (KM). Autorzy pragną podziękować Michele Kaluzienski za pomoc w redakcji.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
¼ calowy arkusz akrylowy  12" x 24"Akrylowy Mega StoreN/A
½ calowy arkusz akrylowy 12" x 12"SimbaLuxSL-AS13-12x12
12 G drut ze stali nierdzewnej (do ramion napinających)Przewód elektryczny Everbilt1000847413
16 G (linkowany)Najlepsze połączeniaNie dotyczy
Magnes 2 x 3 mm   SU-CRO0587N/A
2-kanałowa płytka przekaźników (do odwrócenia polaryzacji prądu do silników)AEDIKOAE06233
Silniki prądu stałego o średnicy 37 mm (12 V, 200 obr./min) x 12GreartisanN/AZnamionowy moment obrotowy: 2,2 Kg.cm
Współczynnik redukcji: 1:22
Prąd znamionowy: 0,1 A
D Rozmiar wału wyjściowego: 6 x 14 mm (0,24 "x 0,55") (D x L)
Rozmiar skrzyni biegów: 37 x 25 mm (1,46" x 0,98") (gł. x dł.)
Rozmiar silnika: 36,2 x 33,3 mm (1,43" x 1,31") (gł. x dł.)
Rozmiar otworu montażowego: M3 (brak w zestawie)
Zasilacz AC/C z regulatorem o zmiennym napięciu    (5 Amperów, 3-12 woltów)Mo-guJ19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Precyzyjna przetwornica obniżająca obniżanie napięciaWalfront1A(zasilacz do zasilania Arduino Nano)
Arduino Nano    (Lafvin)Guziki 8541582500
 Myszy AwpeyePrzycisk
C57BL6/J Jackson Laboratory
Collagenase 4WorthingtonCLS4 LS004188
Collagenase D Roche11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)Corning10-013-CVse
Roche11284932001
Dwustronna taśma piankowaSANKAN/A
Dwustronna płytka drukowana do prototypowaniadeyueN/A
EDTASigma- AldrichE7889
Elektryczna lutownica i lutownicaLDK1002P
Taśma izolacyjna3M03429NA
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gibco16140089
gentleMACS CRurki Miltenyi130-093-237
Graphpad PrismGraphPad, La Jolla, CAOprogramowanie do tworzenia wykresów i analizy statystycznej
Czujnik efektu Halla Wymiary: 0,79 x 0,79 x 0,39 calaSunFounder43237-2
Łącznik sześciokątny 6 mm Silnik z otworem Mosiądz x 2 x 12UxcellN/A
z sześciokątnym (śruba z sześciokątnym M4-.70 X 12) x 12FASN/A
(dla Arduino Nano)ELEGOOEL-CP-004
Ekran LCDJANSANEN/A
M3 z sześciokątnym x 12Shenzhen
Baishichuangyou
Technology co. Ltd		310luosditaozhuang
M3 Stal nierdzewnaŚruby maszynowe z sześciokątnym z płaskim (30 mm) x 36Nadal nie śpiąa52400001
Szybkozłącza zaciskoweIEUYO22010064
Bufor do lizy czerwonych krwinek (10x)Sygnalizacja komórkowa46232
Osłona adaptera terminala Płytka rozszerzeń do Arduino Nano  12" x 24"Shenzhen
Weiyapuhua
Technology		60-026-3
LAFVIN przewodów połączeniowych

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wiegleb, G., Reinhardt, S., Dahl, A., Posnien, N. Tissue dissociation for single-cell and single-nuclei RNA sequencing for low amounts of input material. Frontiers in Zoology. 19 (1), 27(2022).
  2. Weiskirchen, S., Tag, C. G., Sauer-Lehnen, S., Tacke, F., Weiskirchen, R. Isolation and culture of primary murine hepatic stellate cells. Fibrosis: Methods and Protocols. Rittié, L. , New York, NY: Springer. 7113-7118 (2017).
  3. Wang, J., et al. The isolation and characterization of endothelial cells from juvenile nasopharyngeal angiofibroma. Acta Biochimica et Biophysica Sinica. 48 (9), 856-858 (2016).
  4. Burja, B., et al. An optimized tissue dissociation protocol for single-cell rna sequencing analysis of fresh and cultured human skin biopsies. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 10, 102022(2022).
  5. McBeth, C., Gutermuth, A., Ochs, J., Sharon, A., Sauer-Budge, A. F. Automated tissue dissociation for rapid extraction of viable cells. Procedia CIRP. 65, 88-92 (2017).
  6. Welch, E. C., Yu, H., Barabino, G., Tapinos, N., Tripathi, A. Electric-field facilitated rapid and efficient dissociation of tissues into viable single cells. Scientific Reports. 12 (1), 10728(2022).
  7. Maisel, K., et al. Pro-lymphangiogenic VEGFR-3 signaling modulates memory T cell responses in allergic airway inflammation. Mucosal Immunology. 14 (1), 144-151 (2021).
  8. Karmakar, T., et al. A pilot study to determine the utility of automated tissue dissociator for flowcytometry based evaluation of hematolymphoid tumor tissue biopsies. Indian Journal of Hematology and Blood Transfusion. 38 (2), 403-410 (2022).
  9. Montanari, M., et al. Automated-mechanical procedure compared to gentle enzymatic tissue dissociation in cell function studies. Biomolecules. 12 (5), 701(2022).
  10. Genova, A., Dix, O., Saefan, A., Thakur, M., Hassan, A. Carpal tunnel syndrome: a review of literature. Cureus. 12 (3), e7333(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Tissue DissociationSingle Cell AnalysisMechanical DissociationMotorized DeviceCell SuspensionFlow CytometryCell ViabilityImmune Cell IsolationSurface Marker ExpressionRed Blood Cell Lysis

Related Articles