Artykuł metodologiczny

Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65867

⸱

26 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiono protokół do oceny, czy małe EV (sEVs) wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelując jeden aspekt stanu przedrzucawkowego) naruszają barierę krew-mózg u dorosłych samic myszy niebędących w ciąży.

Streszczenie

Powikłania naczyniowo-mózgowe, w tym obrzęk mózgu oraz udar niedokrwienny i krwotoczny, stanowią główną przyczynę śmiertelności matek związanych ze stanem przedrzucawkowym. Mechanizmy leżące u podstaw tych powikłań naczyniowo-mózgowych pozostają niejasne. Są one jednak związane z dysfunkcją łożyska i zaburzeniem bariery krew-mózg (BBB). Niemniej jednak związek między tymi dwoma odległymi od siebie narządami jest nadal ustalany. Coraz więcej dowodów sugeruje, że łożysko uwalnia cząsteczki sygnałowe, w tym pęcherzyki zewnątrzkomórkowe, do krążenia matczynego. Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są klasyfikowane według ich wielkości, przy czym małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (sEV o średnicy mniejszej niż 200 nm) są uważane za krytyczne cząstki sygnałowe zarówno w stanach fizjologicznych, jak i patologicznych. W stanie przedrzucawkowym występuje zwiększona liczba krążących sEV w krążeniu matczynym, których funkcja sygnalizacyjna nie jest dobrze poznana. Łożysko uwalniane w stanie przedrzucawkowym lub z normalnych łożysk ciążowych narażonych na niedotlenienie wywołuje dysfunkcję śródbłonka mózgu i zaburzenie bariery krew-mózg. W tym protokole oceniamy, czy sEV wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia (modelowanie jednego aspektu stanu przedrzucawkowego) zaburzają barierę krew-mózg in vivo.

Wprowadzenie

Około 70% zgonów matek z powodu stanu przedrzucawkowego, nadciśnieniowego zespołu ciążowego charakteryzującego się upośledzonymi procesami łożyskowania, dysfunkcją śródbłonka układowego matki, a w ciężkich przypadkach niewydolnością wielonarządową1,2, są związane z ostrymi powikłaniami naczyniowo-mózgowymi3,4. Większość zgonów matek ma miejsce w krajach o niskich i średnich dochodach5. Jednak mechanizmy leżące u podstaw są nadal niejasne, pomimo klinicznego i epidemiologicznego znaczenia powikłań naczyniowo-mózgowych związanych ze stanem przedrzucawkowym.

Z drugiej strony, pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) (średnica ~30-400 nm) są niezbędnymi mediatorami komunikacji międzykomórkowej między tkankami i narządami, w tym interakcji matczyno-łożyskowej6. Oprócz białek i lipidów na powierzchni zewnętrznej, pojazdy elektryczne przenoszą ładunek w środku (białka, RNA i lipidy). EV można podzielić na (1) egzosomy (średnica ~50-150 nm, zwane również małymi EV (sEVs)), (2) średnie/duże EV i (3) ciała apoptotyczne, które różnią się wielkością, biogenezą, zawartością i potencjalną funkcją sygnalizacyjną. Skład EV zależy od komórek, z których pochodzą, oraz od typu choroby7. EV pochodzące z syncytiotroblastów wyrażają łożyskową fosfatazę alkaliczną (PLAP)8,9, która wykrywa krążące małe EV pochodzące z łożyska (PDsEVs) w ciąży. Ponadto PLAP pomaga dostrzec zmiany w ładunku PDsEVs i ich wpływ na ciąże przedrzucawkowe w porównaniu z ciążami normotensyjnymi10,11,12,13,14,15.

Łożysko zostało uznane za niezbędny składnik w patofizjologii stanu przedrzucawkowego16 lub powikłań mózgowych związanych z tą chorobą17,18,19. Nie wiadomo jednak, w jaki sposób ten odległy narząd może wywoływać zmiany w krążeniu mózgowym. Ponieważ sEV odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej ze względu na ich zdolność do przenoszenia składników bioaktywnych z komórek dawcy do biorcy6,20,21, coraz więcej badań wiąże łożyskowe sEVs z powstawaniem dysfunkcji śródbłonka matki21,22,23,24, w tym komórki śródbłonka mózgu25,26u kobiet ze stanem przedrzucawkowym. W związku z tym upośledzenie funkcji śródbłonka mózgu może prowadzić do zakłócenia bariery krew-mózg (BBB), krytycznego składnika powikłań naczyniowo-mózgowych związanych ze stanem przedrzucawkowym3,27.

Niemniej jednak, wyniki badań przedklinicznych z wykorzystaniem naczyń mózgowych szczurów wystawionych na działanie surowicy kobiet ze stanem przedrzucawkowym28 lub komórek śródbłonka ludzkiego mózgu wystawionych na osocze kobiet ze stanem przedrzucawkowym29 wykazały, że krążący czynnik(i) wywołują zakłócenie bariery krew-mózg. Pomimo kilku kandydatów, którzy mogą zaszkodzić barierze krew-mózg obecnej w krążeniu matki podczas stanu przedrzucawkowego, takich jak podwyższony poziom cytokin prozapalnych (tj. czynnika martwicy nowotworu)18,28 lub regulatory naczyniowe (tj. czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF))29,30,31lub cząsteczki utleniające, takie jak utlenione lipoproteiny (oxo-LDL)32,33, między innymi34, żadna z nich nie ustanawia bezpośredniego połączenia między łożyskiem a barierą krew-mózg. Ostatnio sEV wyizolowane z niedotlenionych łożysk wykazały zdolność do zakłócania bariery krew-mózg u nieciężarnych samic myszy 25. Ponieważ łożyskowe sEV mogą przenosić większość wymienionych czynników krążących ze zdolnością do zakłócania BBB, sEV są uważane za odpowiednich kandydatów do połączenia uszkodzonego łożyska, bycia nosicielem szkodliwych czynników krążących i zakłócania BBB w stanie przedrzucawkowym.

Ten protokół pozwala nam zbadać, czy sEV wyizolowane z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia mogą zakłócić barierę krew-mózg u samic myszy niebędących w ciąży, jako wskaźnik do zrozumienia patofizjologii powikłań mózgowych podczas stanu przedrzucawkowego.

Protokół

Badania zostały przeprowadzone zgodnie z zasadami wyrażonymi w Deklaracji Helsińskiej i za zgodą odpowiednich Komisji Oceny Etycznej. Wszyscy uczestnicy wyrazili świadomą zgodę przed pobraniem próbki, jak zgłoszono wcześniej25. Ponadto Komisja Bioetyki i Bezpieczeństwa Biologicznego Uniwersytetu Bío-Bío zatwierdziła ten projekt (grant Fondecyt 1200250). Praca na zwierzętach została przeprowadzona zgodnie z kardynalnymi zasadami trzech R w wykorzystywaniu zwierząt w eksperymentach35, oraz zgodnie z zaleceniami wytycznych dotyczących opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych opublikowanych przez amerykański Narodowy Instytut Zdrowia. Zwierzęta były trzymane w odpowiednich warunkach w wiwarium Uniwersytetu Bío-Bío. Świeże łożyska (n = 4) uzyskano w ciągu 1 godziny po planowym cięciu cesarskim od matek (w wieku 28-31 lat) z prawidłowym ciążem w terminie (od 38 do 41 tygodnia ciąży). Cesarskie cięcie przeprowadzono w Szpitalu Klinicznym Herminda Martin w Chillan w Chile, jak wcześniej informowaliśmy25. Do zastosowania modelu in vivo wykorzystano 4-6-miesięczne samice myszy niebędących w ciąży (szczep C57BLACK/6). Podzielono ich na trzy grupy eksperymentalne: (1) kontrolną (bez leczenia), (2) leczoną sEVs z normoksji (sEVs-Nor) oraz (3) leczoną sEVs z niedotlenionych łożysk hodowlanych (sEVs-Hyp), które wykorzystano do oceny zaburzenia BBB in vivo25. Wszystkie wstrzykiwane roztwory były sterylne. Przygotowanie sEV przeprowadzono również w warunkach aseptycznych i pod kapturem bezpieczeństwa biologicznego klasy II, aby uniknąć zanieczyszczenia.

1. Eksplantaty z hodowli łożyskowej

  1. Aby wyodrębnić eksplantaty łożysk z normalnej ciąży, sprawdź metodę opublikowaną przez Miller et al. 200536.
  2. Ostrożnie usuń skrzepy z płytki podstawy ludzkiego łożyska za pomocą wysterylizowanych kleszczy. Ekstrahować małe eksplantaty, aby uzyskać końcową ekstrakcję tkanek o masie 10 g.
  3. Upewnij się, że eksplantaty łożyskowe zostały usunięte z czterech ćwiartek matczynej części łożyska. Upewnij się, że zdewitalizowane tkanki i zwapniałe obszary są wykluczone.
  4. Aby manipulować tkanką łożyska, rób to na lodzie, w sterylnych warunkach i w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  5. Przemyć eksplantaty (co najmniej trzy razy) dużą ilością (pięć objętości eksplantatów) zimnego (4 °C) roztworu buforu fosforanowego (PBS 1x, pH 7,4) w celu usunięcia jak największej ilości krwi. Wirować (252 x g przez 10 min) w temperaturze pokojowej między praniami.
  6. Zawiesić 10 g umytych eksplantatów w 20 ml pożywki hodowlanej uzupełnionej 2% płodową surowicą bydlęcą, 100 j.m./ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny (patrz tabela materiałów).
  7. Umieścić zawiesinę w naczyniu hodowlanym o średnicy 100 mm. Pozostawić eksplantaty na 2 godziny w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 21% tlenem i 5% CO2 .
  8. Następnie ponownie umyj eksplantaty 1x PBS w temperaturze 37 °C (trzy razy). Wirować (252 x g przez 10 min) w temperaturze pokojowej między praniami.
  9. Następnie ponownie zawiesić tkankę w 20 ml pożywki hodowlanej uprzednio pozbawionej nanocząstek.
    UWAGA: W celu zubożenia nanocząstek należy przeprowadzić ultrawirowanie (120 000 x g przez 18 godzin w temperaturze pokojowej) i mikrofiltrację (filtr 0,22 μm).
  10. Podziel zawieszone eksplantaty na dwie szalki z kulturami (100 mm). Każde naczynie hodowlane musi zawierać 10 ml zawieszonych eksplantatów.
  11. Następnie umieścić jedną z szalek zawierających eksplantaty łożyskowe w standardowych warunkach hodowli (37 °C z 8% tlenu i 5% CO2 ), a drugą umieścić w komorze hipoksycznej z 1% O2,
    UWAGA: (OPCJONALNIE) Analizę żywotności tkanek można przeprowadzić przy użyciu tych samych ekstrakcji tkanek i testu bromku 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolowego (test MTT), jak opisano w innym miejscu37,38. Użyj całkowitego stężenia białka mierzonego w homogenatach eksplantatów, aby znormalizować wartości MTT.
  12. Po 18 godzinach w uprawie zbierz kondycjonowane podłoże z eksplantatów do nowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Na tym etapie kondycjonowane media można zamrozić (-80 °C) na dłuższy okres (tygodnie).

2. Izolacja sEVs pochodzących z łożyska

  1. Odizoluj sEV od kondycjonowanego podłoża za pomocą protokołu wirowania różnicowego i mikrofiltracji zgodnie z wcześniej opublikowanymi raportami25,39.
  2. Przeprowadzić sekwencyjne wirowanie zebranego kondycjonowanego podłoża. Kolejne etapy wirowania to: (1) 300 x g przez 10 minut, (2) 2000 x g przez 10 minut, (3) 10 000 x g przez 30 minut i (4) 120 000 x g przez 2 godziny. Wykonaj wirowanie w temperaturze pokojowej.
  3. We wszystkich tych wirowaniach, używając pipety o pojemności 20-100 μl, ostrożnie zbierz supernatant i wyrzuć osad.
  4. Po zakończeniu przepuść ostatni zebrany supernatant przez filtr 0,22 μm (patrz Tabela materiałów). Następnie wykonać jedno dodatkowe odwirowanie przy 120 000 x g przez 18 godzin w temperaturze pokojowej.
  5. Następnie wyrzucić supernatant podczas ponownego zawieszania osadu (który zawiera łożyskowe sEV) w 500 μl PBS (pH 7,4) i ponownie przepuścić przez filtr 0,22 μm. Na koniec wykonaj ostatnie wirowanie przy 120 000 x g przez 3 godziny w temperaturze pokojowej.
  6. Następnie ponownie zawiesić osad (który zawiera łożyskowe sEV) w 500 μl PBS (pH 7,4, uprzednio zubożony w sEVs) i przepuścić przez filtr 0,22 μm.
  7. Oznacz próbki jako zapas sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) lub sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
    UWAGA: Przygotuj 50-100 μl podwielokrotności izolowanych sEV do dalszych eksperymentów. Małe pojazdy elektryczne mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C przez dłuższy czas (miesiące).
  8. Scharakteryzuj łożyskowe sEVs według rozmiaru, liczby i markera białkowego sEVs, jak opisano wcześniej25. Idealna średnia średnica cząstek sEV wynosi 50-150 nm.
    UWAGA: Charakterystyka sEVs obejmuje pozytywne wykrywanie CD63, Tsg101, Alix i HSP70 (tj. w celu scharakteryzowania populacji sEV wzbogaconej w egzosomy). Użyj również PLAP jako znacznika pochodzenia łożyska25.
  9. Zmierzyć całkowitą ilość białka w roztworze sEVs za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA, postępując zgodnie z instrukcjami producenta (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Rysunek 1 pokazuje przegląd hodowli eksplantatów łożyskowych i izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych.

3. Wstrzyknięcie myszom

  1. Znieczulić zwierzę w anestezjologicznej komorze indukcyjnej z 5% dystrybucją izofluranu (patrz tabela materiałów). Sprawdź poziom znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi.
  2. Po ~40 s włóż mysz do systemu znieczulenia za pomocą maski na twarz i utrzymuj poziom znieczulenia 2% izofluranu.
  3. Następnie umieść zwierzę na platformie grzewczej (patrz Tabela materiałów) w temperaturze pokojowej 28 °C. Utrzymuj oczy nawilżone sztucznymi łzami.
  4. Przed wstrzyknięciem należy rozcieńczyć łożysko (200 μg białka całkowitego) buforem fosforanowym (pH, 7,4) aż do osiągnięcia końcowej objętości 70 μl.
  5. Zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia za pomocą 70% etanolu i bawełnianych wacików. Upewnij się, że używasz strzykawki insulinowej z igłą 30 G do wstrzykiwania roztworu sEVs.
    UWAGA: Strzykawkę można ustawić na platformie grzewczej na 5 minut, aby uzyskać temperaturę fizjologiczną.
  6. Następnie wstrzyknąć roztwór do żyły szyjnej zewnętrznej. Ten krok wymaga specjalnego szkolenia.
    UWAGA: Zabieg należy wykonywać ostrożnie, powoli cofając igłę i delikatnie zasysając do oznak refluksu krwi.
  7. Po wstrzyknięciu należy lekko uciskać miejsce wstrzyknięcia przez ~15 s suchym wacikiem. Następnie zwróć zwierzęta do odpowiednich klatek.
  8. Upewnij się, że oceniasz przytomność i zachowanie przez 15 minut. Wskaźnikiem osiągnięcia świadomości jest odzyskanie przez zwierzę całkowitej aktywności motorycznej.
    UWAGA: Upewnij się, że w klatkach zwierząt panuje ciepła temperatura.

4. Skala szybkiej mysiej śpiączki i zachowania (RMCBS)

  1. Użyj RMCBS, aby ocenić parametry neurologiczne i dobrostan zwierząt40.
    UWAGA: RMCBS umożliwia szybką ocenę (~ 3 min) przy minimalnym stresie zwierząt spowodowanym interwencją operatora. RMCBS ma dziesięć parametrów (każdy wynik wynosi 0-2).
  2. Oceń samopoczucie myszy za pomocą skali RMCBS po 0 godzinach (przed wstrzyknięciem sEV) i 3 godzinach, 6 godzinach, 12 godzinach i 24 godzinach po wstrzyknięciu.
    UWAGA: Przeprowadź analizę klaudyny-5 (po 6 godzinach od wstrzyknięcia sEVs) i niebieskiego wynaczynienia Evana (po 24 godzinach od wstrzyknięcia sEVs), aby ocenić zakłócenie BBB (Rysunek 2).

5. Analiza niebieskiego wynaczynienia Evana

  1. Po wstrzyknięciu łożyska (24 godziny) znieczulić myszy zgodnie z opisem w kroku 3.1.
  2. Przygotować roztwór Evan's Blue (2%, rozcieńczony w roztworze buforu fosforanowego, 1x) (patrz Tabela Materiałów).
  3. Korzystając z dostępu retro-orbitalnego25, wstrzyknąć roztwór Evan's Blue w stężeniu 2 ml/kg.
  4. Pozwól niebieskiemu roztworowi Evana krążyć przez 20 minut pod utrzymaniem znieczulenia.
  5. Następnie wykonaj perfuzję wewnątrzsercową zgodnie z wcześniej opisanym protokołem41 roztworem soli fizjologicznej (~3 ml, 0,9%, w/v), aby usunąć niebieski barwnik Evana z krążenia. Ten krok jest obowiązkowy.
    UWAGA: W przypadku tej procedury zwiększ znieczulenie do 5% i sprawdź głęboką płaszczyznę znieczulenia (tj. drastyczne zmniejszenie częstości oddechów).
  6. Odsłonić serce za pomocą torakotomii przyśrodkowej41 (Ryc. 3).
  7. Następnie utrwal całe zwierzę za pomocą dosercowego wlewu roztworu paraformaldehydu (4% w PBS, v/v).
    UWAGA: Sprawdź sztywność ogona w celu monitorowania odpowiedniego mocowania.
  8. Ponadto, gdy fiksacja jest zakończona, ostrożnie wydobądź mózg, zważ go i sfotografuj41. Rób zdjęcia z całym mózgiem blisko linijki42.
  9. Następnie umieść mózg w maszynce do krajalnicy myszy mózgowej (patrz tabela materiałów).
  10. Rozbij mózg na dziewięć sekcji, żurawia i ogona, w tym móżdżek (100 μm każda sekcja).
  11. Po sekcji wizualizuj i uchwyć obrazy wycinków mózgu w mikroskopie stereoskopowym (patrz Tabela materiałów).
  12. Użyj przechwyconych obrazów, aby określić ilościowo niebieskie wynaczynienie Evana za pomocą oprogramowania ImageJ (patrz tabela materiałów).
    UWAGA: Aby przeanalizować obecność niebieskiego barwnika Evana, ustaw niebieskie wartości Evana za pomocą pozytywnej kontroli sekcji mózgu (od zwierzęcia kontrolnego, któremu wstrzyknięto barwnik, ale bez perfuzji wewnątrzsercowej). Niebieskie wartości Evana osiągnięte z kontroli pozytywnej wynoszą na ogół od 75 do 110 w histogramie intensywności kanału niebieskiego (Rysunek 4).
  13. Upewnij się, że obrazy mózgu są analizowane na ślepo przez odpowiednią grupę eksperymentalną, aby uniknąć stronniczości obserwatora. Alternatywnie, określ ilościowo niebieskie wynaczynienie Evana przez homogenizację mózgu, a następnie spektroskopię43.
    UWAGA: W oddzielnych eksperymentach, przy użyciu świeżo wyizolowanych mózgów od myszy, którym wstrzyknięto sEV (6 godzin), przeanalizuj poziomy białka klaudyny 5 (CLND-5) (patrz Tabela materiałów), krytycznego ścisłego połączenia zaangażowanego w szczelność BBB44 (Ryc. 5).

Wyniki

Niniejszy protokół ocenia zdolność sEV pochodzących z łożysk hodowanych w warunkach hipoksji do zaburzania barier krew-mózg (BBB) u myszy nieciężarnych. Metoda ta pozwala na lepsze zrozumienie potencjalnego związku między łożyskiem a mózgiem w warunkach prawidłowych i patologicznych. W szczególności metoda ta może służyć jako model do analizy udziału łożyskowych sEV w powstawaniu powikłań mózgowych w przebiegu preeklampsji.

W przeciwieństwie do myszy wstrzykniętych sEVs-Nor, myszy wstrzyknięte sEVs-Hyp wykazują postępujący spadek oceny neurologicznej do 24 h (Tabela 1), co sugeruje zdolność sEVs-Hyp do upośledzenia funkcji mózgu.

Ponadto mózgi myszy z grupy wstrzykniętej sEVs-Hyp wykazują wyższą masę świeżą niż mózgi izolowane od myszy wstrzykniętych sEVs-Nor lub myszy kontrolnych (odpowiednio 0,51 ± 0,008; 0,46 ± 0,008; 0,47 ± 0,01 g), co może stanowić ogólny wskaźnik obrzęku mózgu45.

Zgodnie z tym znaleziskiem, niniejszy protokół pozwala zidentyfikować przenikanie błękitu Evansa jako wskaźnik przerwania BBB. W związku z tym, mózgi myszy wstrzykniętych sEVs-Hyp wykazują wyższe przenikanie błękitu Evansa niż mózgi z grupy sEVs-Nor (Rycina 5A).

Chociaż w ramach niniejszego protokołu nie przeanalizowano mechanizmu zaburzenia BBB wywołanego przez sEVs-Hyp, wyniki wskazują również, że u myszy po wstrzyknięciu sEVs-Hyp stwierdzono zmniejszoną ilość białka CLND-5 w obszarach, w których BBB była najbardziej dotknięta (tj. w obszarach tylnych) (Rysunek 5B). W związku z tym jest prawdopodobne, że sEVs-hyp upośledza ekspresję lub funkcję tego kluczowego białka złączeń ścisłych śródbłonka.

Kultura eksplantów łożyska, ultrawirówka sEV, analiza nanotrackingowa, schemat Western blotting.
Rycina 1: Protokół hodowli eksplantów łożyska i izolacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych. (A) Kultury eksplantów prawidłowego łożyska. (B) Eksplanty są dzielone na dwie grupy w celu biogenezy łożyskowych małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (sEVs): normoksja (sEVs-Nor, 8% O2) lub hipoksja (sEVs-Hyp, 1% O2) przez 18 h. (C) Pożywka warunkująca jest zbierana, filtrowana i wirowana w celu usunięcia resztek komórkowych. (D) sEVs są izolowane metodą ultrawirowania. (E) sEVs są charakteryzowane przy użyciu analizy nanotrackingowej oraz Western blot. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat badania na myszach: wstrzykiwanie sEV z łożyska, sekcjonowanie mózgu, analiza zaburzenia BBB za pomocą wstrzykiwania barwnika.
Rycina 2: In vivo ocena protokołu zaburzenia bariery krew-mózg. Wykorzystano nieciężarne myszy C57BL6/J w wieku 4-6 miesięcy. (A) Poprzez zewnętrzną żyłę szyjną zwierzęta otrzymały sEV (200 μg całkowitego białka) wyizolowane z hodowli łożyskowych w warunkach normoksji (sEVs-Nor, 8% O2) lub hipoksji (sEVs-Hyp, 1% O2). RMCBS monitorowano w czasie od 0 do 24 h po wstrzyknięciu. (B) 6 h po wstrzyknięciu sEV wyextractorowano mózgi i podzielono je na dziewięć segmentów w celu ekstrakcji białek. Analizowano poziom białka Claudin 5 (CLDN5) w homogenatach tych dziewięciu sekcji. (C) Analizę ekstrawazacji błękitu Evansa (24 h po wstrzyknięciu sEV) przeprowadzono po wstrzyknięciu za pomocą nakłucia zakątka ocznego w każdym z dziewięciu segmentów. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Procedura chirurgiczna u gryzoni: A) porównanie przed operacją; B) otwarcie jamy ciała z widocznymi narządami wewnętrznymi.
Rysunek 3: Dokumentacja fotograficzna protokołu barwienia błękitem Evan'sa i perfuzji wewnątrzsercowej. (A) Mysz otrzymała błękit Evan'sa poprzez wstrzyknięcie w okolicę oczodołu. (Lewo) Zwierzę przed i (Prawo) po wstrzyknięciu błękitu Evan'sa (15 s). (B) Torakotomia w celu przeprowadzenia perfuzji wewnątrzsercowej roztworem buforu fosforanowego (1x PBS) i paraformaldehydem (4% PFA). Lewa komora jest wskazana końcówką igły. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Proces sekcjonowania mózgu z diagramami, przekrojami mózgu i analizą histogramu; badania neuroanatomiczne.
Rysunek 4: Analiza przesięku błękitu Evansa po wstrzyknięciu sEVs. (A) Reprezentatywny obraz całego mózgu wykazujący przesięk błękitu Evansa. Linia przerywana reprezentuje dziewięć sekcji uzyskanych z całego mózgu. (B) Mózg wycięty przy użyciu urządzenia do sekcjonowania mózgów myszy. (C) Reprezentatywne obrazy przekrojów mózgu 24 h po wstrzyknięciu sEVs. Kontrola (CTL), łożysko w warunkach normoksji (sEVs-Nor) lub hipoksji (sEVs-Hyp). Pasek skali = 0.4 cm. (D) Cyfrowe obrysowanie przekroju mózgu za pomocą programu ImageJ. (E) Histogram w kanale niebieskim. Wartości między 75-110 wiążą się z przesiękiem błękitu Evansa. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres słupkowy porównujący przenikanie błękitu Evansa oraz poziom CLDN5/β ACTIN w różnych przekrojach mózgu.
Rysunek 5: Przenikanie błękitu Evansa i poziomy claudyny-5 u myszy wstrzyknięto sEV wyizolowane z eksplantów łożyska. (A) Procent przenikania błękitu Evansa (EB) z uwzględnieniem całych przekrojów mózgu. Grupa kontrolna (CTL, niebieski), łożysko w warunkach normoksji (sEVs-Nor, czerwony) lub hipoksji (sEVs-Hyp, zielony). (B) Względne poziomy claudyny 5 (CLDN5) w dziewięciu przekrojach mózgu uzyskane z trzech grup eksperymentalnych. β-actin służy jako kontrola ładowania. Wartości przedstawiono jako średnia ± rozstęp międzykwartylowy. Każda kropka reprezentuje pojedynczy obiekt badawczy. *p < 0.05, **p < 0.005. ****p < 0.0001. ***p < 0.001; test ANOVA z następującym po nim post-testem Bonferroniego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Czas (h)KontrolasEVs-NormoksjasEVs-HipoksjaANOVA
018.75 ± 0.25018.5 ± 0.28818.75 ± 0.250ns
318.5 ± 0.86617 ± 0.70713.25 ± 1.750*α0.006
619.25 ± 0.75017 ± 0.57711.75 ± 1.250*α0.002
1218.5 ± 0.64516.75 ± 1.10913 ± 0.816*α0.001
2419.5 ± 0.28817.75 ± 0.25010.25 ± 0.853*α<0.0001
*p < 0.01 w stosunku do kontroli. αp < 0.01 w stosunku do sEVs-Normoksja

Tabela 1: Szybka skala śpiączki i zachowania myszy (RMCBS) po 24 h od wstrzyknięcia sEVs. Wynik przedstawiono jako średnia ± SEM. Wyniki zwierząt najbliższe 20 są standardowe, natomiast im niższy wynik, tym większa dysfunkcja OUN.

Dyskusja

Badanie to ujawnia nowe informacje na temat potencjalnych szkód wynikających z wyizolowanych przez sEV z eksplantatów łożyskowych hodowanych w warunkach niedotlenienia na zakłócenie bariery krew-mózg gryzoni. Mechanizm patologiczny polega na zmniejszeniu CLND-5 w tylnej części mózgu25.

Wcześniejsze badania wykazały, że osocze sEV od osób ze stanem przedrzucawkowym indukuje dysfunkcję śródbłonka w różnych narządach przy użyciu modeli in vitro 46,47. W tym badaniu w szczególności przeanalizowano barierę krew-mózg, oferując nowe spojrzenie na sEV wyizolowane z łożyska hodowanego w niedotlenieniu, które zaburza tę istotną barierę. Odkrycia te wprowadzają nową sferę badań, w której sEV mogą służyć jako kanał komunikacyjny między łożyskiem a mózgiem zarówno w normalnych, jak i patologicznych scenariuszach, takich jak stan przedrzucawkowy.

Przedstawiony protokół jest prosty, ale warto wspomnieć o kilku krytycznych krokach. Protokół ten wymaga świeżego łożyska w ciągu 1 godziny po porodzie. Odradzamy również wydłużanie okresu hodowli powyżej 24 godzin, aby zapobiec degradacji tkanek. Protokół ten łagodzi potencjalne zanieczyszczenie sEV wytwarzane przez łożyska myszy. Cyfrowa analiza niebieskiego wynaczynienia Evana jest czasochłonna. Co więcej, niebieskie zabarwienie Evana jest mniej widoczne po sekcji mózgu. W związku z tym zalecana jest wstępna konfiguracja w celu identyfikacji niebieskiego zakresu za pomocą kontroli pozytywnej. Można również zastosować kontrolę negatywną, taką jak mózg myszy, która nie została poddana niebieskiemu zastrzykowi Evana. Ślepa analiza grup eksperymentalnych jest niezbędna, aby uniknąć potencjalnej stronniczości obserwatora.

W związku z tym protokołem może pojawić się kilka wyzwań. Istotnym ograniczeniem jest zmienność biologiczna pochodząca zarówno z łożyska ludzkiego, jak i myszy, którym wstrzyknięto implanty. Aby zapewnić powtarzalność eksperymentów z niebieskim wynaczynieniem Evana, sugeruje się ustalenie dawek sEV wyizolowanych z ludzkich łożysk. Zdecydowaliśmy się na dawkę 200 μg białka ogółem; jednak ilość ta może się wahać w zależności od czystości pęcherzyków, skuteczności wstrzyknięcia do szyi, niebieskiego podawania Evana, jego usuwania z układu krążenia i, co nie mniej ważne, biologicznego wpływu sEV biorąc pod uwagę ich zawartość.

Mechanizmy komórkowe, za pomocą których sEV z ludzkiego łożyska mogą zakłócać barierę krew-mózg, wymagają dodatkowych eksperymentów. Niemniej jednak metoda ta ma znaczenie, wskazując na potencjalną komunikację między łożyskiem a mózgiem, co uzasadnia dalsze badania. W związku z tym zachęca się do dalszych badań, koncentrując się na sEV i ich interakcjach z barierą krew-mózg, a także na wpływie ich ładunku na tkanki neuronalne. To, czy upośledzenie bariery krew-mózg prowadzi do trwałych konsekwencji dla mózgu matki, wymaga dalszych badań.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy chcieliby podziękować naukowcom należącym do GRIVAS Health za ich cenny wkład. Również położne i personel kliniczny z Oddziału Położnictwa i Ginekologii należą do Hospital de Chillan w Chile. Założony przez Fondecyt Regular 1200250.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dorosłe myszy matryca mózgowa drukowana w 3DPlik otwartego dostępuDorosłe myszyKrajalnica do mózgu dorosłych myszy. Wydrukowane w filamentu PLA.
Przeciwciało pierwszorzędowe anty &beta-aktynyPrzeciwciało Sigma-AldrichClon AC-74do kontroli obciążenia (Western blot)
Przeciwciało pierwotne anty-Claudin5Santa cruz Biotechnologysc-374221Przeciwciało pierwszorzędowe dla białka ścisłego połączenia CLDN5 myszy Zestaw białek BBB (Western blot)
Zestaw białekThermo Scientific23225Zestaw do pomiaru stężenia białka
Pożywka hodowlana #200 500 mlThermo Fisher Scientificm200500Pożywka hodowlana do eksplantatów łożyskowych
D180 Inkubator CO2RWD Nauki przyrodniczeD180Standardowy inkubator do estabilizacji eksplantatów i hodowli sEVs-Nor
Evans niebieski barwnik  > 75% 10 gSigma-AldrichE2129.10GBarwnik do analizy zaburzenia bariery krew-mózg IN VIVO
Surowica bydlęca płodu 500 mlThermo Fisher Scientific16000044Addytywny czynnik wzrostu do pożywek hodowlanych 200
Himac Ultrawirówka CP100NXgrupy Himac eppendorf 5720410101Ultrawirówka do kondycyjnych pożywek > 1,20 000 x g
OprogramowanieImageJ NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Izofluran x 100 mlUSP Baxter212-094Lotny wziewny środek znieczulający dla myszy
Zestaw CellTiter 96 Nieradioaktywny Test Promega0000105232In vitro na żywotność eksplantatów
Mysie przeciwciało drugorzędowe IgGThermo Fisher ScientificMO 63103Przeciwciało drugorzędowe dla CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Analiza nanośledząca cząstek z eksplantatów łożyskowych Kondycjonowane podłoża
Paraformaldehide E 97% roztwór 500 mlThermo Fisher ScientificA11313.22Roztwór utrwalający do wycinków tkanki mózgowej i perfuzji wewnątrzsercowej (po rozcieńczeniu)
PBS 1 X pH 7,4 500 mlThermo Fisher Scientific10010023Roztwór do płukania eksplantatów
łożyska Peniciline-streptomicine 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antybiotyki do pożywek
hodowlanych z eksplantatów łożyskowychProOX C21 Cytocentryczny regulator O2 i CO2BioSpherixSCR_021131regulator CO2 do wywoływania niedotlenienia w szczelnej komorze dla sEVs-Hyp
Tiopental sodu 1 gChemie7061humanitarny środek eutanazyjny
System znieczulenia o niskim przepływie SomnosuiteScientificsSS-01Waporyzator izofluranowy dla małych gryzoni
Chirurgiczna platforma rozgrzewającaKent ScientificsA41166Platforma rozgrzewająca do znieczulenia podtrzymującego u myszy
Filtry strzykawkowe, Politetrafluoroetylen (PTFE), Hydrofobowy, 0,22 i mikro; m, Sterylny, 25 mmPołudniowe naczynia laboratoryjne10026Filtracja kondensowanych pożywek zebranych z eksplantatów łożyskowych 
Stołowe mikrowirówki szybkoobrotowe  HITACHI himac CT15E/CT15REHitachi medical systems6020Wirowanie seryjne kondycyjnych mediów < 1,20 000 x g
Trójokularowy mikroskop stereoskopowy światło transmidowe i odbite 10x-160x Center Medical2597Mikroskop stereoskopowy do rejestracji wycinków mózgu
łożyskowych Kent

Bibliografia

  1. Lisonkova, S., Joseph, K. S. Incidence of preeclampsia: risk factors and outcomes associated with early- versus late-onset disease. Am J Obstet Gynecol. 209 (544), 544.e1-544.e12 (2013).
  2. Sibai, B., Dekker, G., Kupferminc, M. Preeclampsia. Lancet. 365 (9461), 785-799 (2005).
  3. Hammer, E. S., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction in preeclamptic pregnancies. Curr Hypertens Rep. 17 (8), 64(2015).
  4. Okanloma, K. A., Moodley, J. Neurological complications associated with the preeclampsia/eclampsia syndrome. Int J Gynaecol Obstet. 71, 223-225 (2000).
  5. Frias, A. E., Belfort, M. A. Post magpie: how should we be managing severe preeclampsia. Curr Opin Gynecol Obstet. 15 (6), 489-495 (2003).
  6. Familari, M., Cronqvist, T., Masoumi, Z., Hansson, S. R. Placenta-derived extracellular vesicles: Their cargo and possible functions. Reprod Fertil Dev. 29 (3), 433-447 (2017).
  7. Montoro-Garcia, S., Shantsila, E., Marin, F., Blann, A., Lip, G. Y. Circulating microparticles: new insights into the biochemical basis of microparticle release and activity. Basic Res Cardiol. 106, 911-923 (2011).
  8. Germain, S. J., Sacks, G. P., Sooranna, S. R., Sargent, I. L., Redman, C. W. Systemic inflammatory priming in normal pregnancy and preeclampsia: the role of circulating syncytiotrophoblast microparticles. J Immunol. 178 (9), 5949-5956 (2007).
  9. Tannetta, D., Masliukaite, I., Vatish, M., Redman, C., Sargent, I. Update of syncytiotrophoblast derived extracellular vesicles in normal pregnancy and preeclampsia. J Reprod Immunol. 119, 98-106 (2017).
  10. Collett, G. P., Redman, C. W., Sargent, I. L., Vatish, M. Endoplasmic reticulum stress stimulates the release of extracellular vesicles carrying danger-associated molecular pattern (DAMP) molecules. Oncotarget. 9 (6), 6707-6717 (2018).
  11. Cooke, W. R., et al. Maternal circulating syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles contain biologically active 5'-tRNA halves. Biochem Biophys Res Commun. 518 (1), 107-113 (2019).
  12. Gill, M., et al. Placental syncytiotrophoblast-derived extracellular vesicles carry active nep (neprilysin) and are increased in preeclampsia. Hypertension. 73 (5), 1112-1119 (2019).
  13. Kandzija, N., et al. Placental extracellular vesicles express active dipeptidyl peptidase IV; levels are increased in gestational diabetes mellitus. J Extracell Vesicles. 8 (1), 1617000(2019).
  14. Motta-Mejia, C., et al. Placental vesicles carry active endothelial nitric oxide synthase and their activity is reduced in preeclampsia. Hypertension. 70 (2), 372-381 (2017).
  15. Sammar, M., et al. Reduced placental protein 13 (PP13) in placental derived syncytiotrophoblast extracellular vesicles in preeclampsia - A novel tool to study the impaired cargo transmission of the placenta to the maternal organs. Placenta. 66, 17-25 (2018).
  16. Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy. Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).
  17. Warrington, J. P., et al. Placental ischemia in pregnant rats impairs cerebral blood flow autoregulation and increases blood-brain barrier permeability. Physiological Reports. 2 (8), e12134-e12134 (2014).
  18. Warrington, J. P., Drummond, H. A., Granger, J. P., Ryan, M. J. Placental Ischemia-induced increases in brain water content and cerebrovascular permeability: Role of TNFα. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (11), R1425-R1431 (2015).
  19. Johnson, A. C., et al. Magnesium sulfate treatment reverses seizure susceptibility and decreases neuroinflammation in a rat model of severe preeclampsia. PLoS ONE. 9 (11), e113670(2014).
  20. Escudero, C. A., et al. Role of extracellular vesicles and microRNAs on dysfunctional angiogenesis during preeclamptic pregnancies. Front Physiol. 7, 1-17 (2016).
  21. Salomon, C., et al. Placental exosomes as early biomarker of preeclampsia: Potential role of exosomalmicrornas across gestation. J Clin Endocrinol Metab. 102 (9), 3182-3194 (2017).
  22. Knight, M., Redman, C. W., Linton, E. A., Sargent, I. L. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol. 105 (6), 632-640 (1998).
  23. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and extracellular vesicles. Curr Hypertens Rep. 18 (9), 68(2016).
  24. Dutta, S., et al. Hypoxia-induced small extracellular vesicle proteins regulate proinflammatory cytokines and systemic blood pressure in pregnant rats. Clin Sci (Lond). 134 (6), 593-607 (2020).
  25. Leon, J., et al. Disruption of the blood-brain barrier by extracellular vesicles from preeclampsia plasma and hypoxic placentae: attenuation by magnesium sulfate. Hypertension. 78 (5), 1423-1433 (2021).
  26. Han, C., et al. Placenta-derived extracellular vesicles induce preeclampsia in mouse models. Haematologica. 105 (6), 1686-1694 (2020).
  27. Amburgey, O. A., Chapman, A. C., May, V., Bernstein, I. M., Cipolla, M. J. Plasma from preeclamptic women increases blood-brain barrier permeability: role of vascular endothelial growth factor signaling. Hypertension. 56 (5), 1003-1008 (2010).
  28. Cipolla, M. J., et al. Pregnant serum induces neuroinflammation and seizure activity via TNFalpha. Exp Neurol. 234 (2), 398-404 (2012).
  29. Bergman, L., et al. Preeclampsia and increased permeability over the blood brain barrier - a role of vascular endothelial growth receptor 2. Am J Hypertens. 34 (1), 73-81 (2021).
  30. Torres-Vergara, P., et al. Dysregulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 phosphorylation is associated with disruption of the blood-brain barrier and brain endothelial cell apoptosis induced by plasma from women with preeclampsia. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (9), 166451(2022).
  31. Schreurs, M. P., Houston, E. M., May, V., Cipolla, M. J. The adaptation of the blood-brain barrier to vascular endothelial growth factor and placental growth factor during pregnancy. FASEB J. 26 (1), 355-362 (2012).
  32. Schreurs, M. P., Cipolla, M. J. Cerebrovascular dysfunction and blood-brain barrier permeability induced by oxidized LDL are prevented by apocynin and magnesium sulfate in female rats. J Cardiovasc Pharmacol. 63 (1), 33-39 (2014).
  33. Schreurs, M. P. H., et al. Increased oxidized low-density lipoprotein causes blood-brain barrier disruption in early-onset preeclampsia through LOX-1. FASEB J. 27 (3), 1254-1263 (2013).
  34. Escudero, C., et al. Brain vascular dysfunction in mothers and their children exposed to preeclampsia. Hypertension. 80 (2), 242-256 (2023).
  35. Russell, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique. Universities Federation of Animal Welfare. , https://awionline.org/lab-animal-search/russell-w-m-s-burch-r-l-1959-principles-humane-experimental-technique-methuen-co (1959).
  36. Miller, R. K., et al. Human placental explants in culture: approaches and assessments. Placenta. 26 (6), 439-448 (2005).
  37. Troncoso, F. A. J., Herlitz, K., Ruiz, F., Bertoglia, P., Escudero, C. Elevated pro-angiogenic phenotype in feto-placental tissue from gestational diabetes mellitus. Placenta. 36 (4), 2(2015).
  38. Zhang, H. C., et al. Microvesicles derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells stimulated by hypoxia promote angiogenesis both in vitro and in vivo. Stem Cells Dev. 21 (18), 3289-3297 (2012).
  39. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. Chapter 3 (Unit 3), 22(2006).
  40. Carroll, R. W., et al. A rapid murine coma and behavior scale for quantitative assessment of murine cerebral malaria. PLoS One. 5 (10), e13124(2010).
  41. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  42. Walchli, T., et al. Quantitative assessment of angiogenesis, perfused blood vessels and endothelial tip cells in the postnatal mouse brain. Nat Protoc. 10 (1), 53-74 (2015).
  43. Wang, H. L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, 6588(2014).
  44. Morita, K., Sasaki, H., Furuse, M., Tsukita, S. Endothelial claudin: claudin-5/TMVCF constitutes tight junction strands in endothelial cells. J Cell Biol. 147 (1), 185-194 (1999).
  45. Lara, E., et al. Abnormal cerebral microvascular perfusion and reactivity in female offspring of reduced uterine perfusion pressure (RUPP) mice model. J Cereb Blood Flow Metab. 42 (12), 2318-2332 (2022).
  46. Chang, X., et al. Exosomes from women with preeclampsia induced vascular dysfunction by delivering sflt (soluble fms-like tyrosine kinase)-1 and seng (soluble endoglin) to endothelial cells. Hypertension. 72, 1381-1390 (2018).
  47. Smarason, A. K., Sargent, I. L., Starkey, P. M., Redman, C. W. The effect of placental syncytiotrophoblast microvillous membranes from normal and pre-eclamptic women on the growth of endothelial cells in vitro. BJOG. 100 (10), 943-949 (1993).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Hipoksja o yskowamodel mysi przedeklampsjidysfunkcja r db onka m zgowegoekstrawazacja b kitu Evansahodowla eksplant w o yskawirowanie sekwencyjneiniekcja do y y szyjnejocena skali neurologicznej
Przerwanie mysiej bariery krew-mózg przez małe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe z niedotlenionych ludzkich łożysk
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.