Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku

2.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65869

⸱

3 listopada 2023

 ,  , 
1Institute for Environmental Assessment and Water Research (IDAEA-CSIC), 2Research and Development Center (CID-CSIC)

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy kompleksowy zestaw testów behawioralnych, w tym nowatorski zbiornik, Shoaling i testy preferencji społecznych, aby skutecznie określić potencjalne neurotoksyczne skutki chemikaliów (np. metamfetaminy i glifosatu) na dorosłe rybki danio pręgowane za pomocą jednego zbiornika. Metoda ta jest istotna dla badań neurotoksycznych i środowiskowych.

Streszczenie

Obecność efektów neuropatologicznych okazała się przez wiele lat głównym punktem końcowym oceny neurotoksyczności substancji chemicznej. Jednak w ciągu ostatnich 50 lat wpływ substancji chemicznych na zachowanie gatunków modelowych był aktywnie badany. Stopniowo behawioralne punkty końcowe zostały włączone do protokołów badań przesiewowych neurotoksykologicznych, a te funkcjonalne wyniki są obecnie rutynowo wykorzystywane do identyfikacji i określenia potencjalnej neurotoksyczności substancji chemicznych. Testy behawioralne u dorosłych danio pręgowanego zapewniają ustandaryzowany i niezawodny sposób badania szerokiego zakresu zachowań, w tym lęku, interakcji społecznych, uczenia się, pamięci i uzależnień. Testy behawioralne u dorosłych danio pręgowanego zazwyczaj polegają na umieszczeniu ryby na arenie eksperymentalnej oraz rejestrowaniu i analizowaniu jej zachowania za pomocą oprogramowania do śledzenia wideo. Ryby mogą być narażone na różne bodźce, a ich zachowanie można określić ilościowo za pomocą różnych wskaźników. Nowatorski test zbiornika jest jednym z najbardziej akceptowanych i szeroko stosowanych testów do badania zachowań podobnych do lęku u ryb. Testy płycizny i preferencji społecznych są przydatne w badaniu zachowań społecznych danio pręgowanego. Ten test jest szczególnie interesujący, ponieważ badane jest zachowanie całej ławicy. Testy te okazały się wysoce powtarzalne i wrażliwe na manipulacje farmakologiczne i genetyczne, co czyni je cennymi narzędziami do badania obwodów neuronalnych i mechanizmów molekularnych leżących u podstaw zachowania. Ponadto testy te mogą być wykorzystywane w badaniach przesiewowych leków w celu identyfikacji związków, które mogą być potencjalnymi modulatorami zachowania.

W tej pracy pokażemy, jak zastosować narzędzia behawioralne w neurotoksykologii ryb, analizując wpływ metamfetaminy, narkotyku rekreacyjnego, i glifosatu, zanieczyszczenia środowiska. Wyniki wskazują na znaczący wkład testów behawioralnych u dorosłych danio pręgowanego w zrozumienie neurotoksykologicznych skutków zanieczyszczeń środowiska i leków, a także dostarczają informacji na temat mechanizmów molekularnych, które mogą zmieniać funkcje neuronów.

Wprowadzenie

Danio rerio (Danio rerio) jest popularnym modelowym gatunkiem kręgowców do badań ekotoksykologicznych, odkrywania leków i bezpieczeństwa. Niski koszt, dobrze znane narzędzia genetyki molekularnej i zachowanie kluczowych procesów fizjologicznych związanych z morfogenezą i utrzymaniem układu nerwowego sprawiają, że danio pręgowany jest idealnym modelem zwierzęcym do badań neurobiologicznych, w tym toksykologii neurobehawioralnej1,2. Do niedawna głównym punktem końcowym oceny neurotoksyczności substancji chemicznej była obecność skutków neuropatologicznych. Ostatnio jednak behawioralne punkty końcowe zostały włączone do protokołów badań przesiewowych neurotoksykologicznych, a te funkcjonalne wyniki są obecnie powszechnie wykorzystywane do identyfikacji i określania potencjalnej neurotoksyczności substancji chemicznych3,4. Co więcej, behawioralne punkty końcowe są bardzo istotne z ekologicznego punktu widzenia, ponieważ nawet bardzo łagodna zmiana zachowania ryb może zagrozić przetrwaniu zwierzęcia w warunkach naturalnych5.

Jednym z najczęściej używanych testów behawioralnych w badaniach nad dorosłymi danio pręgowanymi jest nowy test zbiornika (NTT), który mierzy zachowanie podobne do lęku6,7. W tym teście ryby są narażone na nowość (ryby są umieszczane w nieznanym zbiorniku), łagodny bodziec awersyjny i obserwuje się ich reakcje behawioralne. NTT służy głównie do oceny podstawowej aktywności lokomotorycznej, geotaksji, zamarzania i nieregularnych ruchów ryb. Erratic8 charakteryzuje się nagłymi zmianami kierunku (zygzakiem) i powtarzającymi się epizodami przyspieszeń (rzutki). Jest to reakcja alarmowa i zwykle obserwuje się ją przed lub po epizodach zamrożenia. Zachowanie podczas zamrażania odpowiada całkowitemu ustaniu ruchów ryby (z wyjątkiem ruchów operkularnych i gałek ocznych) na dnie zbiornika, w odróżnieniu od bezruchu spowodowanego sedacją, która powoduje hiplokocję, akinezję i tonięcie8. Zamrożenie jest zwykle związane z wysokim stanem stresu i niepokoju, a także jest częścią zachowania uległego. Złożone zachowania są doskonałymi wskaźnikami stanu lęku zwierząt. Wykazano, że NTT jest wrażliwy na manipulacje farmakologiczne i genetyczne9, co czyni go cennym narzędziem do badania neuronalnych podstaw lęku i powiązanych zaburzeń.

Danio pręgowany jest gatunkiem wysoce społecznym, więc możemy mierzyć szeroki zakres zachowań społecznych. Test płycizny (ST) i test preferencji społecznych (SPT) są najczęściej używanymi testami do oceny zachowań społecznych10. ST mierzy tendencję ryb do grupowania się w grupy11 poprzez ilościowe określenie ich zachowań przestrzennych i wzorców ruchowych. ST jest przydatny do badania dynamiki grupy, przywództwa, społecznego uczenia się i zrozumienia zachowań społecznych wielu gatunków ryb12. SPT u dorosłego danio pręgowanego został zaadaptowany z preferencji Crawleya do testu nowości społecznej dla myszy13 i szybko stał się popularnym testem behawioralnym do badania interakcji społecznych u tego gatunku modelowego14. Te dwa testy zostały również przystosowane do stosowania w testach przesiewowych leków i okazały się obiecujące w identyfikacji nowych związków, które modulują zachowania społeczne15,16.

Ogólnie rzecz biorąc, testy behawioralne u dorosłych ryb danio pręgowanego są potężnymi narzędziami, które mogą dostarczyć cennych informacji na temat mechanizmów zachowania lub neurofenotypów związków aktywnych i nadużywanych leków17. Protokół ten szczegółowo opisuje, jak zaimplementować te narzędzia behawioralne7 z podstawowymi zasobami materiałowymi i jak zastosować je w testach toksyczności w celu scharakteryzowania wpływu szerokiej gamy związków neuroaktywnych. Ponadto zobaczymy, że te same testy można zastosować do oceny neurobehawioralnych skutków ostrej ekspozycji na związek neuroaktywny (metamfetaminę), ale także do scharakteryzowania tych skutków po przewlekłym narażeniu na stężenia pestycydu (glifosatu) w środowisku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ścisłe przestrzeganie standardów etycznych gwarantuje dobrostan i właściwe traktowanie rybek danio pręgowanych wykorzystywanych w eksperymentach. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ustanowionymi przez Instytucjonalne Komitety ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (CID-CSIC). Protokoły i wyniki przedstawione poniżej zostały opracowane na podstawie licencji przyznanej przez władze lokalne (numer umowy 11336).

1. Zakwaterowanie zwierząt do testów behawioralnych

  1. Wszystkie testy (przedstawione na Rysunku 1) należy przeprowadzić w odizolowanym pomieszczeniu behawioralnym w temperaturze 27-28 °C w godzinach od 10:00 do 17:00.
  2. Przed rozpoczęciem eksperymentów należy kilkakrotnie opłukać zarówno ryby kontrolne, jak i eksponowane, w czystej wodzie dla ryb [woda oczyszczona metodą odwróconej osmozy zawierająca 90 mg/L soli do systemów akwariowych, 0.58 mM CaSO4·2H2O oraz 0.59 mM NaHCO3], aby uniknąć potencjalnego zanieczyszczenia zbiornika eksperymentalnego.
  3. Należy aklimatyzować zwierzęta w pomieszczeniu behawioralnym na 1 h przed rozpoczęciem eksperymentów.
  4. Należy upewnić się, że zwierzęta (stosunek samców do samic ≈50:50) nie brały wcześniej udziału w eksperymentach, a wszystkie testy behawioralne należy przeprowadzić metodą ślepej próby, tak aby obserwatorzy nie wiedzieli, do której grupy eksperymentalnej należą osobniki.
  5. Aby uzyskać wiarygodne wyniki w testach behawioralnych, należy zastosować całkowitą liczbę 18 osobników na warunek (n = 18), najlepiej uzyskanych w ramach dwóch lub więcej niezależnych eksperymentów. Na przykład, w testach indywidualnych należy analizować zachowanie 9 zwierząt na warunek w każdej powtórce. W testach grupowych należy analizować zachowanie ławicy od 6 do 9 zwierząt na warunek w każdej powtórce.
  6. Wszystkie testy należy przeprowadzić zgodnie z podejściem bateryjnym (propozycje planowania przedstawiono na Rysunku 2). Metoda ta, bardziej odpowiednia pod względem etycznym, pozwala na zmniejszenie liczby zwierząt potrzebnych do badania, zgodnie z zasadą 3R dotyczącą redukcji7.
  7. Większość testów behawioralnych jest powiązana z analizami biologicznymi, dlatego przed pobraniem i analizą próbek (OMICs lub związki chemiczne) należy uśmiercić zwierzęta zgodnie z wytycznymi dotyczącymi eutanazji18. Jeśli punktem końcowym nie jest pobranie próbek, grupę kontrolną należy ponownie ustabilizować po zakończeniu eksperymentu. Zwierzęta kontrolne można ponownie wykorzystać do hodowli lub celów eksperymentalnych po kilku dniach.

figure-protocol-1
Rycina 1: Układy eksperymentalne. Trzy konfiguracje kwadratowego zbiornika służące do badania szerokiego zakresu zachowań u dorosłych zebrafish. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Harmonogram eksperymentalny. Dwie propozycje planowania rejestracji testów behawioralnych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Konfiguracje eksperymentalne zbiornika

  1. Zachowanie lękowe: Nowy Test Zbiornika (Novel Tank Test, NTT)
    1. Dostosuj układ doświadczalny (liczbę zbiorników, kamer i komputerów), aby rejestrować maksymalną liczbę ryb jednocześnie. Indywidualne testy behawioralne są czasochłonne, dlatego zoptymalizuj czas, materiały i przestrzeń.
    2. Przygotuj zbiorniki doświadczalne do NTT: Zbiornik kwadratowy (długość 20 cm, szerokość 20 cm, wysokość 25 cm) z panelami akrylowymi na ścianach bocznych i dnie, aby uniknąć odbić i zakłóceń między osobnikami.
    3. Napełnij zbiorniki doświadczalne 7 L (wysokość słupa wody: 20 cm) dobrze natlenowanej wody dla ryb o temperaturze 28 °C.
    4. Dostosuj położenie zbiornika przed kamerą, aby uniknąć zniekształcenia obrazu.
    5. Sprawdź ustawienie oświetlenia. Podświetlenie LED (10000 lux) zapewnia jednorodne oświetlenie wszystkich części zbiornika, co umożliwia nagrywanie wideo w dobrych warunkach.
    6. Włącz kamery i dostosuj je zgodnie z sekcją 3.
    7. Wprowadź osobniki pojedynczo na dno zbiorników doświadczalnych przed rozpoczęciem nagrywania, robiąc to jak najszybciej.
      UWAGA: Ważne jest, aby rozpocząć nagrywanie w momencie, gdy zwierzę znajduje się na dnie zbiornika.
    8. Uważaj, aby nie płoszyć zwierząt podczas nagrywania. Użyj zasłony lub panelu, aby ograniczyć interakcje wizualne nie tylko między zbiornikami, ale także między stanowiskiem a otoczeniem.
    9. Po zakończeniu nagrywania (standardowy czas nagrywania wynosi 6 min) przenieś zwierzęta, które przeszły już test, do innego zbiornika, aby nie mieszać ich z osobnikami naiwnymi.
    10. Powtórz procedurę ze wszystkimi dostępnymi osobnikami. Zaleca się, aby całkowita liczba osobników na warunkiem wynosiła 18, co pozwoli uzyskać istotne wyniki w próbach indywidualnych (z dwóch lub więcej niezależnych powtórzeń).
    11. Randomizuj grupę doświadczalną przypisaną do każdego zbiornika pomiędzy próbami, aby uniknąć potencjalnego efektu zbiornika (jeśli nagrywasz kilka warunków jednocześnie).
  2. Zachowanie grupowe: Test Ławicowania (Shoaling Test, ST)
    1. Konfiguracja doświadczalna ST jest taka sama jak w przypadku NTT (można bezpośrednio wykorzystać te same zbiorniki).
    2. Postępuj zgodnie z krokami 2.1.1-2.1.6., aby przygotować ST.
    3. Wprowadź ławicę (od 6 do 9 osobników jednocześnie) na dno zbiorników doświadczalnych przed rozpoczęciem nagrywania, robiąc to jak najszybciej.
      UWAGA: Ważne jest, aby rozpocząć nagrywanie w momencie, gdy zwierzę znajduje się na dnie zbiornika.
    4. Postępuj zgodnie z krokami 2.1.8-2.1.11., aby przeprowadzić ST.
    5. Powtórz procedurę ze wszystkimi dostępnymi osobnikami. Aby uzyskać istotne wyniki w tym teście, wykonaj co najmniej dwa niezależne powtórzenia z taką samą wielkością ławicy w każdym powtórzeniu.
    6. Zachowaj stałą wielkość ławicy dla wszystkich grup doświadczalnych i powtórzeń w ramach jednego eksperymentu.
  3. Indywidualne zachowanie społeczne: Test Preferencji Społecznych (Social Preference Test, SPT) 
    1. Dostosuj układ doświadczalny, aby zoptymalizować przestrzeń eksperymentalną i czas nagrywania.
    2. Przygotuj zbiorniki doświadczalne do SPT: Zbiornik kwadratowy (długość 20 cm, szerokość 20 cm, wysokość 25 cm) przezroczysty (szklany lub plastikowy), aby zapewnić widoczność boczną. Pojedyncza ryba ogniskowa może swobodnie wchodzić w interakcje z konspecyficzną strefą wirtualną – ławicą ryb umieszczoną w jednostronnym zewnętrznym zbiorniku mieszkalnym, lub z niespecyficzną strefą wirtualną – jednostronnym zewnętrznym pustym zbiornikiem mieszkalnym.
    3. Napełnij zbiorniki doświadczalne 5 L (wysokość słupa wody: 15 cm, taka sama jak wysokość słupa wody w zewnętrznych zbiornikach mieszkalnych) czystej wody dla ryb o temperaturze 28 °C.
    4. Dostosuj położenie zbiornika przed kamerą, aby uniknąć zniekształcenia obrazu.
    5. Upewnij się, że system jest równomiernie oświetlony.
    6. Wprowadzaj osobniki pojedynczo na dno zbiorników doświadczalnych, a następnie niezwłocznie rozpocznij nagrywanie, gdy zwierzę znajduje się na dole w centrum.
    7. Unikaj interakcji wizualnych między obserwatorami a zwierzętami podczas nagrywania.
    8. Po zakończeniu 6 min nagrywania przenieś obecne zwierzęta do innego zbiornika, aby nie mieszać ich z osobnikami naiwnymi.
    9. Powtórz procedurę ze wszystkimi dostępnymi osobnikami. Zapewnij całkowitą liczbę 18 osobników na warunek, aby uzyskać istotne wyniki w próbach indywidualnych (z dwóch lub więcej niezależnych powtórzeń).

3. Nagrywanie wideo do testów behawioralnych

  1. Otwórz menedżera kamer, aby sprawdzić dostępność kamery GigE na każdym komputerze.
  2. Uruchom oprogramowanie do sterowania kamerą GigE (np. uEye Cockpit, opisany tutaj). Otwórz opcję Camera, wybierz tryb Monochrome i dostosuj rozmiar obrazu (1:2).
  3. Otwórz Camera Properties
    1. W sekcji Camera ustaw Pixel Clock na Maximum, Frame Rate na 30 frames per second (fps) i dostosuj Exposure (regulacja Auto lub Manual, jeśli obraz jest zbyt ciemny).
    2. W sekcji Image ustaw Gain na 0 (Auto) oraz Black Levels (regulacja Auto lub Manual w celu uzyskania dobrego kontrastu).
    3. W sekcji Size dostosuj rozmiar okna do obszaru, który ma zostać zarejestrowany (Width: Width-Left, Height: Height-Top). Krok ten pozwala zmniejszyć rozmiar obrazu, a tym samym końcowy rozmiar pliku wideo.
    4. Zamknij Camera Properties.
  4. Utwórz główny folder dla sesji eksperymentalnej, aby zapisać ustawienia kamer i pliki wideo.
  5. Aby zapisać ustawienia kamery, wybierz File > Save Parameters > To File i wskaż niedawno utworzony folder eksperymentalny.
    UWAGA: Plik z ustawieniami kamery można w ten sposób ponownie załadować w aplikacji, aby w dowolnym momencie kontynuować pracę z tymi samymi parametrami obrazu (np. gdy kamera zostanie nagle wyłączona lub w celu ponownego użycia tych samych ustawień, co skraca czas konfiguracji i ujednolica warunki eksperymentalne). Jeśli w pewnym momencie kamera zawiesi się pomiędzy nagraniami, zatrzymaj nagrywanie, wyjdź i wyłącz kamerę. Włącz ją ponownie, załaduj parametry kamery, przechodząc do File > Load Parameters > To File, i wznowij nagrywanie. Sprawdź, czy bieżące wideo zostało w całości zarejestrowane, aby odrzucić lub powtórzyć próbę z rybą (przed powtórzeniem daj zwierzętom czas na ponowną aklimatyzację).
  6. Powtórz tę procedurę konfiguracji kamery (kroki 3.1-3.5) dla wszystkich kamer.
  7. Gdy wszystkie kamery zostaną poprawnie skonfigurowane, otwórz Record Video Sequence.
  8. Wybierz Create, aby zapisać plik jako nowe wideo, wybierz niedawno utworzony folder eksperymentalny i wprowadź w nazwie pliku wideo informacje o obiekcie, rodzaju eksperymentu oraz datę.
  9. Wybierz Max. Frames. W polu klatek wpisz 10800. Standardowe wideo trwa 6 min (Video 1) przy 30 fps w formacie AVI; zatem 6 min x 60 s x 30 fps = łącznie 10800 klatek.
  10. Wybierz Calc. Frame Rate lub wskaż liczbę klatek ręcznie (prędkość nagrywania: 30 fps).
  11. Powtórz procedurę tworzenia pliku wideo na wszystkich komputerach.
  12. Wprowadź obiekty, po jednym, na dno każdego z tanków eksperymentalnych. Wszystkie próby zostaną przeprowadzone jednocześnie.
  13. Szybko rozpocznij nagrywanie, klikając Record i poczekaj na uzyskanie maksymalnej liczby żądanych klatek (krok 3.10).
  14. Po zarejestrowaniu filmów pojawi się okno czatu z komunikatem Maximal number of frames achieved!. Wybierz Accept.
  15. Wybierz Close, aby zakończyć nagrywanie i zamknąć plik wideo.
  16. Usuń ryby, które zostały właśnie zaobserwowane. Zachowaj ostrożność, aby oddzielić je od ryb naiwnych.
  17. Wybierz bezpośrednio Create i powtórz proces, aby kontynuować nagrywanie filmów.
  18. Po zakończeniu wszystkich nagrań wybierz Exit.
  19. Aby wyłączyć kamery, wybierz Close Camera i wyjdź z programu (Exit).

4. Analiza zarejestrowanych filmów

  1. Uruchom oprogramowanie analityczne (patrz Tabela materiałów).
  2. Aby opracować nowy szablon, kliknij Nowość z szablonu > Zastosowano zdefiniowany szablon > Z pliku wideonastępnie należy wybrać film, aby rozpocząć konfigurację szablonu. Należy starać się wybrać reprezentatywny film z eksperymentu, przedstawiający obiekt o dobrej mobilności i wysokiej jakości nagrania.
  3. W Parametryskonfiguruj parametry w następujących oknach (od 1 do 4/7). Wybierz model Ryby > Dorosłe danio przebranie, arena Kwadrat otwartego pola > One Arena, liczba Liczba osobników na arenę (do testu ST wymagany jest pakiet do śledzenia wielu obiektów [umożliwiający śledzenie różnych osobników w jednej arenie]), typ Detekcja metodą punktu środkowego i na koniec dostosuj liczbę klatek na sekundę do 30 kl./sW kolejnych oknach (od 5 do 7/7) nie zmieniać parametrów; konfiguracja domyślna jest prawidłowa.
  4. Nazwij eksperyment jako szablon i umieść go w tym samym folderze, co pozostałe zapisane materiały wideo. Szablon zostanie utworzony jako folder eksperymentu z kilkoma podfolderami zawierającymi wszystkie informacje dotyczące konfiguracji.
  5. Pod Ustawienia eksperymentusprawdź zdefiniowaną konfigurację (plik wideo, arena, liczba obiektów, liczba klatek na sekundę). W tym miejscu można zmodyfikować jednostki systemowe.
  6. Pod Ustawienia arenykliknij prawym przyciskiem myszy na środku ekranu i wybierz Chwyć. Z pliku na wyświetlaczu. Wybrać obraz wideo dobrej jakości i Akceptuj aby zarejestrować ten obraz dla ustawień tła. Po pierwsze, Kalibrować obrazu, tworząc skalibrowaną linijkę. Jako skalę należy przyjąć szerokość zbiornika (19 cm). Następnie należy narysować arenę. Należy zadbać o to, aby kwadrat był na tyle mały, by uniknąć odbić zwierzęcia, gdy to zbliży się do powierzchni, oraz ewentualnych błędów w działaniu oprogramowania do analizy ruchu ryb spowodowanych czarnymi obszarami zbiornika. Na koniec należy wyznaczyć strefy kształtowe za pomocą Klatka funkcja
    1. Dla NTT i ST, dzielić przód zbiornika na dwie równe wirtualne strefy: górną i dolną (patrz Rysunek 1). Narysuj dwa równe poziome prostokąty. Prostokąty powinny zajmować po połowie areny każdy. Nazwij Góra i Dół odpowiednio dla strefy górnej i dolnej. Należy zadbać o to, aby pola miały taką samą szerokość (9–10 cm) i długość (8–9 cm), nie wykraczały poza granice areny (pomarańczowy kwadrat) i nie nakładały się na siebie, upewniając się, że każda strefa strzałki wskazuje dokładnie przypisane jej obszary.
    2. W przypadku testu preferencji społecznych (SPT) należy koncepcyjnie podzielić arenę eksperymentalną na trzy strefy o tej samej wielkości: pustą, środkową i z osobnikiem tego samego gatunku (patrz Rycina 1). Narysuj trzy równe pionowe pola. Pole zorientowane w stronę zbiornika z ławicą nazwij jako Kresobrzmienne, z pudełkiem skierowanym w stronę pustego zbiornika jako Pusty, a środkowy jako CentrumNależy zadbać o to, aby pola miały tę samą szerokość (6 cm) i długość (18-19 cm), nie wykraczały poza granice areny oraz nie nakładały się na siebie.
  7. Pod Ustawienia detekcji, zweryfikuj, który film ma zostać opracowany w ramach Plik wideoNastępnie sprawdź jakość detekcji (ryby zaznaczone na żółto, czerwony punkt centralny). Kliknij w Automatyczne wykrywanie aby dostosować detekcję, należy ponownie ustawić ostrość obrazu zwierzęcia (wybrać obraz, na którym zwierzę płynie bokiem na białym tle, obrysować obraz obejmując całe ciało, a następnie zatwierdzić detekcję za pomocą Tak). Otwórz Zaawansowany w celu poprawy detekcji poprzez wybór Dynamiczna subtrakcja, ciemniejszy obiekt, ustawienia tła, uczenie tła, rozmiar obiektu, redukcja szumówitp.
  8. Pod Ustawienia próbwprowadź jedną próbę i usuń pozostałe (kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz usuń)
  9. Pod Ustawienia danychutwórz Wyniki okna dialogowe. Parametryzuj wyniki w zależności od czasu i strefy. Na przykład utwórz jedno okno Wyniki dla wyjścia danych w minutach, a drugie dla wyjścia danych w czasie całkowitym (6 min). Zaproś do wyjścia danych dla każdej strefy (zrób to, jeśli wymagana jest odległość w każdej strefie). Powiąż poszczególne okna Wyniki z Start okno z strzałki.
  10. Pod Analiza ustawień, wybierz Parametry do analizy oraz rodzaj Statystyka dla każdego parametru. Parametry te zostaną obliczone automatycznie na podstawie danych uzyskanych z procesu śledzenia.
    1. W przypadku NTT i SPT należy wybrać opcje zdefiniowane poniżej:
      1. Wybierz Dystans pokonany (wybierz Suma) w celu uzyskania dystansu pokonanego w arenie (cm) oraz dystansu pokonanego w poszczególnych strefach (cm).
      2. Wybierz W strefach (wybierz Strefy, Częstotliwość, Skumulowanai Opóźnienie do pierwszego) aby uzyskać czas spędzony w strefach (s) oraz opóźnienie do pierwszego wejścia do stref (s).
      3. Wybierz Przejście strefowe (wybierz Próg0 cm, Dodaj strefę 1 > Strefa 2; Strefa 2 > Strefa 1, w jakichkolwiek strefach, Częstotliwość) w celu uzyskania liczby wejść w strefach.
      4. Wybierz Stan mobilności (wpisz High mobile powyżej 70%, Immobile poniżej 3%, minimum 150 klatek oraz zaznacz frequency, cumulative i latency to first), aby uzyskać czas trwania nadruchliwości (s) oraz czas trwania zamrożenia (s).
        UWAGA: Szczegółowe informacje na temat przybliżania zachowania zamierania z wykorzystaniem zautomatyzowanej analizy oraz liczby i czasu trwania (s) epizodów zamierania znajdują się w sekcji Dyskusja.
      5. Wybierz Przyspieszenie i Kąt skrętu (wybrać częstotliwość i wartość skumulowaną), aby ocenić występowanie złożonych zachowań, takich jak gwałtowne ruchy (darting) i ruchy chaotyczne (szybkie przyspieszenia).
    2. W przypadku ST, poza powyższymi parametrami eksploracyjnymi, należy wybrać opcję Odległość między badanymi (wybrać wszystkie osobniki, średnią, maksimum, minimum), aby uzyskać średnią odległość między rybami (cm), średnią odległość do najbliższego sąsiada (cm) oraz średnią odległość do najdalszego sąsiada.
  11. Szablon jest gotowy do użycia. Zapisz ostatnie modyfikacje i Zamknij szablon bez pobierania żadnych danych z filmu (należy zachować plik szablonu; jest on lekki, łatwy w zarządzaniu i kopiowaniu). W przypadku posiadania kilku licencji oprogramowania należy analizować filmy z tego samego szablonu skopiowanego na każdy komputer.
  12. Aby skopiować i użyć szablonu, dostępne są dwie opcje:
    1. Otwórz plik szablonu w oprogramowaniu do analizy behawioralnej, przejdź do Plik > Zapisz jako aby utworzyć nowy, identyczny plik.
    2. W interfejsie powitalnym należy wybrać Nowości z szablonu > Zastosowano niestandardowy szablon > Z pliku wideo (wybierz szablon. plik EthXV). Nazwij nowy eksperyment i wybierz jego lokalizację. Kopiowanie informacji z pliku szablonu może potrwać kilka minut.
  13. Przejdź do Ustawienia areny aby ponownie dostosować szablon, jeśli wideo zostało nagrane inną kamerą (należy postępować zgodnie z krokami 4.6 i 4.7).
  14. Przejdź do Ustawienia detekcji lub Akwizycja aby sprawdzić, który film został wybrany i w razie potrzeby zmienić plik wideo.
  15. Pod Akwizycjawybierz DDS > Gotowy do rozpoczęciaPrzetwarzanie wideo przez oprogramowanie może potrwać kilka minut.
  16. Po zakończeniu akwizycji przejdź do Edytor ścieżekWybierz przyspieszenie x16, aby szybciej odtworzyć przetworzone nagranie wideo i sprawdzić, czy śledzenie jest prawidłowe.
    UWAGA: Czasami mogą wystąpić "straty" w śledzeniu (ze względu na refleksy lub błędy samego oprogramowania). Jeśli jest ich niewiele, można je edytować ręcznie w tej sekcji; w przeciwnym razie zaleca się ponowne przetworzenie całego eksperymentu, poprawiając definicję obszaru analizy oraz detekcję.
  17. Pod Statystykakliknij w Oblicz > Eksport danychEksport danych znajduje się bezpośrednio w folderze eksperymentu.
  18. Pod Wizualizacja śladów lub Mapy ciepła, wygeneruj i wyeksportuj (kliknij prawym przyciskiem myszy, eksportuj obraz, wybierz folder Eksportuj pliki eksperymentu, aby zapisać te dane wraz z raportem w arkuszu kalkulacyjnym) obrazów śledzących zwierzę.
  19. Przejdź do Plik To jest fragment tekstu, który wymaga tłumaczenia. Proszę o dostarczenie treści źródłowej w języku angielskim, abym mógł przygotować profesjonalne tłumaczenie naukowe na język polski zgodnie z wytycznymi. zamknij aktywny eksperyment i powtórz tę procedurę dla kolejnego filmu.

5. Analiza statystyczna

  1. Przeprowadź analizę normalności rozkładu danych w każdej grupie (test Shapiro-Wilka).
  2. Oceń homogeniczność wariancji za pomocą testu Levene'a.
  3. W przypadku braku podstaw do odrzucenia kryteriów normalności i homogeniczności wariancji, zastosuj jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA), a następnie testy wielokrotnych porównań Dunnetta i Tukeya w celu zbadania różnic między grupami.
  4. W przypadku odrzucenia kryteriów normalności i homogeniczności wariancji, zastosuj test Kruskala-Wallisa, a następnie porównania parowe z zastosowaniem korekty Bonferroniego w celu zbadania różnic między grupami.
  5. Przedstaw dane graficznie przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tej sekcji przyjrzymy się niektórym możliwym zastosowaniom tych narzędzi behawioralnych w neurotoksykologii ryb. Poniższe wyniki odpowiadają charakterystyce efektów ostrych lub efektów po jednorazowym przyjęciu dużej dawki (binge effects) metamfetaminy (METH), narkotyku rekreacyjnego, oraz efektów podprzewlekłych glifosatu, jednego z głównych herbicydów występujących w ekosystemach wodnych.

Charakterystyka modelu neurotoksyczności wywołanej epizodem nadużywania metamfetaminy u dorosł...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Charakterystyczne zachowania lękowe obserwowane w NTT zostały pozytywnie skorelowane z poziomami serotoniny analizowanymi w mózgach21. Na przykład, po ekspozycji na para-chlorofenyloalaninę (PCPA), inhibitor biosyntezy 5-HT, ryby wykazywały dodatnią geotaksję, a także obniżony poziom 5-HTw mózgu 22, wyniki bardzo podobne do tych uzyskanych po użyciu metamfetaminy. W związku z tym, spadek poziomu serotoniny w mózgu i wykazanie pozytywnej geotaksji u danio pręgowanego narażon...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez "Agencia Estatal de Investigación" z hiszpańskiego Ministerstwa Nauki i Innowacji (projekt PID2020-113371RB-C21), IDAEA-CSIC, Severo Ochoa Centre of Excellence (CEX2018-000794-S). Juliette Bedrossiantz otrzymała stypendium doktoranckie (PRE2018-083513) współfinansowane przez rząd hiszpański i Europejski Fundusz Społeczny (EFS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Akwarium Kształt kostkiBlau Akwarystyczny7782025Sześcienny Panoramiczny 10  ( 10 L, 20 cm x 20 cm x 25 cm, 5 mm)
Oprogramowanie EthovisionNoldusEthovision XTwersja 12.0 lub nowsza
Kamera GigESystemy rozwoju obrazowaniaUI-5240CP-NIR-GL
GraphPad Prism 9.02Oprogramowanie GraphPad IncGraphPad Prism 9.02  Dla systemu Windows
IDS Menedżer kamerSystemy rozwoju
Podświetlenie LEDQuirumedGP-G2
SPSS SoftwareIBMIBM SPSS v26
uEye Cockpit software Imaging Development Systemsw wersji 4.90
obrazowania

Bibliografia

  1. Raldúa, D., Piña, B. In vivo zebrafish assays for analyzing drug toxicity. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 10 (5), 685-697 (2014).
  2. Faria, M., Prats, E., Bellot, M., Gomez-Canela, C., Raldúa, D. Pharmacological modulation of serotonin levels in zebrafish larvae: Lessons for identifying environmental neurotoxicants targeting the serotonergic system. Toxics. 9 (6), 118(2021).
  3. Faria, M., et al. Zebrafish models for human acute organophosphorus poisoning. Scientific Reports. 5, 15591(2015).
  4. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253(2021).
  5. Faria, M., et al. Screening anti-predator behaviour in fish larvae exposed to environmental pollutants. Science of the Total Environment. 714, 136759(2020).
  6. Faria, M., et al. Acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 8 (1), 7918(2018).
  7. Kalueff, A. V., Stewart, A. M. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. Neuromethods. , Springer Prtocols, Humana Totowa, NJ. (2012).
  8. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  9. Egan, R. J., et al. Understanding behavioral and physiological phenotypes of stress and anxiety in zebrafish. Behavioural Brain Research. 205, 38-44 (2009).
  10. Noldus. Social behavior in Zebrafish. , https://www.noldus.com/applications/social-behavior-zebrafish (2012).
  11. Green, J., et al. Automated high-throughput neurophenotyping of zebrafish social behavior. Journal of Neuroscience Methods. 210 (2), 266-271 (2012).
  12. Miller, N., Gerlai, R. Quantification of shoaling behaviour in zebrafish (Danio rerio). Behavioural Brain Research. 184 (2), 157-166 (2007).
  13. Landin, J., et al. Oxytocin receptors regulate social preference in zebrafish. Scientific Reports. 10 (1), 5435(2020).
  14. Ogi, A., et al. Social preference tests in zebrafish: A systematic review. Frontiers in Veterinary Science. 7, 590057(2021).
  15. Bedrossiantz, J., et al. A zebrafish model of neurotoxicity by binge-like methamphetamine exposure. Frontiers in Pharmacology. 12, 770319(2021).
  16. Hamilton, T. J., Krook, J., Szaszkiewicz, J., Burggren, W. Shoaling, boldness, anxiety-like behavior and locomotion in zebrafish (Danio rerio) are altered by acute benzo[a]pyrene exposure. Science of the Total Environment. 774, 145702(2021).
  17. Kane, A. S., Salierno, J. D., Brewer, S. K. Chapter 32. Fish models in behavioral toxicology: Automated Techniques, Updates, and Perspectives Methods in Aquatic Toxicology. Volume2, Lewis Publishers, Boca Raton, FL. (2005).
  18. Leary, S. L., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , www.avma.org/sites/default/files/2020-02/Guidelines-on-Euthanasia-2020.pdf (2020).
  19. Grieco, F., Krips, O. Help (PDF version) EthoVision ® XT. , www.noldus.com (2017).
  20. Faria, M., et al. Glyphosate targets fish monoaminergic systems leading to oxidative stress and anxiety. Environment International. 146, 106253(2021).
  21. Maximino, C., Costa, B., Lima, M. A review of monoaminergic neuropsychopharmacology in zebrafish, 6 years later: Towards paradoxes and their solution. Current Psychopharmacology. 5 (2), 96-138 (2016).
  22. Maximino, C., et al. Role of serotonin in zebrafish (Danio rerio) anxiety: Relationship with serotonin levels and effect of buspirone, WAY 100635, SB 224289, fluoxetine and para-chlorophenylalanine (pCPA) in two behavioral models. Neuropharmacology. 71, 83-97 (2013).
  23. Faria, M., et al. Therapeutic potential of N-acetylcysteine in acrylamide acute neurotoxicity in adult zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 16467(2019).
  24. Homer, B. D., Solomon, T. M., Moeller, R. W., Mascia, A., DeRaleau, L., Halkitis, P. N. Methamphetamine abuse and impairment of social functioning: A review of the underlying neurophysiological causes and behavioral implications. Psychological Bulletin. 134 (2), 301-310 (2008).
  25. Linker, A., et al. Assessing the maximum predictive validity for neuropharmacological anxiety screening assays using zebrafish. Neuromethods. 51, 181-190 (2011).
  26. Hartung, T. From alternative methods to a new toxicology. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 77 (3), 338-349 (2011).
  27. Cachat, J. M., et al. Video-Aided Analysis of Zebrafish Locomotion and Anxiety-Related Behavioral Responses. Zebrafish Neurobehavioral Protocols. Neuromethods. Kalueff, A., Cachat, J. 51, Humana Press. (2011).
  28. Rosemberg, D. B., et al. Differences in spatio-temporal behavior of zebrafish in the open tank paradigm after a short-period confinement into dark and bright environments. PLoS ONE. 6 (5), e19397(2011).
  29. Blaser, R., Gerlai, R. Behavioral phenotyping in Zebrafish: Comparison of three behavioral quantification methods. Behavioral Research Methods. 38 (3), 456-469 (2006).
  30. Cachat, J., et al. Three-dimensional neurophenotyping of adult zebrafish behavior. PLoS ONE. 6 (3), e17597(2011).
  31. Cachat, J. M., et al. Deconstructing adult zebrafish behavior with swim trace visualizations. Neuromethods. 51, 191-201 (2011).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Dorosłe danio pręgowanetesty behawioralnetest nowej akwariumtest ławicowaniatest preferencji społecznychekspozycja na metamfetaminęekspozycja na glifosatśledzenie wideozachowania lękowe
Ocena neurotoksyczności u dorosłych Danio rerio przy użyciu baterii testów behawioralnych w jednym zbiorniku
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.