Artykuł metodologiczny

Zdalna aktywacja neuronów w połączeniu z automatycznym pobieraniem próbek krwi w celu indukcji i pomiaru krążącego hormonu luteinizującego u myszy

DOI:

10.3791/65875

⸱

25 sierpnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular and Integrative Physiology, University of Michigan, Ann Arbor, 2Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live, University of Michigan, Ann Arbor

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pulsatywność hormonu luteinizującego (LH) jest cechą charakterystyczną funkcji rozrodczych. Opisujemy protokół zdalnej aktywacji określonych populacji neuronów związany z seryjnym automatycznym pobieraniem krwi. Technika ta pozwala na czasową modulację hormonalną, multipleksowanie i minimalizowanie efektów manipulacji na poziomie LH u przytomnych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych zwierząt.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poziomy krążącego hormonu luteinizującego (LH) są podstawowym wskaźnikiem funkcjonowania podwzgórzowo-przysadkowej kontroli rozrodu. Rola licznych danych wejściowych i populacji neuronów w modulacji uwalniania LH jest nadal nieznana. Pomiar zmian poziomu LH u myszy jest często wyzwaniem, ponieważ są one łatwo zakłócane przez stres środowiskowy. Obecne techniki pomiaru uwalniania LH i pulsatility wymagają długotrwałego treningu myszy w zakresie przystosowania się do stresu manipulacyjnego, pewnej powściągliwości, obecności badacza i pracy na poszczególnych zwierzętach, co zmniejsza ich przydatność dla wielu pytań badawczych.

Ten artykuł przedstawia technikę zdalnej aktywacji określonych populacji neuronów za pomocą technologii Designer Receptor Exclusive Activated by Designer Drugs (DREADDs) w połączeniu z automatycznym sekwencyjnym pobieraniem próbek krwi u świadomych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych myszy. Najpierw opisujemy protokół chirurgii stereotaktycznej w celu dostarczenia wektorów wirusa związanego z adenowirusem (AAV) eksprymujących DREADD do określonych populacji neuronów. Następnie opisujemy protokół kaniulacji tętnicy szyjnej i żyły szyjnej oraz pooperacyjnego podłączenia do automatycznego systemu pobierania krwi CULEX. Na koniec opisujemy protokół dożylnego wstrzykiwania N-tlenku klozapiny w celu zdalnej aktywacji neuronów i automatycznego pobierania krwi. Technika ta pozwala na zaprogramowane automatyczne pobieranie próbek co 5 minut lub dłużej przez określony czas, w połączeniu z dożylnym wstrzyknięciem substancji w żądanym punkcie czasowym lub czasie trwania. Ogólnie rzecz biorąc, stwierdziliśmy, że technika ta jest skutecznym podejściem do badań nad kontrolą neuroendokrynną.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oś podwzgórze-przysadka-gonady (HPG) jest centralnie regulowana przez pulsacyjne uwalnianie hormonu uwalniającego gonadotropiny (GnRH) do układu wrotnego przysadki. W przysadce mózgowej GnRH kontroluje pulsacyjne uwalnianie gonadotropin, hormonu luteinizującego (LH) i hormonu folikulotropowego (FSH) do układu krążenia. Uwolnienie pulsacyjne LH służy jako znak rozpoznawczy dla funkcjonowania centralnej osi HPG1,2,3,4. Na przykład wyświetla wpływ zmian genetycznych lub zmian czynników hormonalnych lub środowiskowych na neuronalną część osi5,6,7. Do niedawna pomiar wzorca pulsacyjnego LH był ograniczony do dużych ssaków8 i rats9, biorąc pod uwagę wysoką częstotliwość pobierania próbek i duże objętości krwi niezbędne do identyfikacji pulsów.

Wykrywanie impulsów LH u myszy jest pożądane, ponieważ gatunek ten ma dostępne szerokie modele genetyczne i może być łatwo manipulowany za pomocą technologii inżynierii genomowej do dalszego badania określonych genów i populacji komórek. W ciągu ostatniej dekady duży postęp w analizie stężeń LH u myszy przy użyciu testu immunoenzymatycznego LH (ELISA) pozwolił na wykrycie LH w niewielkiej ilości krwi10. Rozwój techniki częstego pobierania próbek krwi na końcówce ogona umożliwił niezbędne częste pobieranie próbek w celu wykrycia częstotliwości i amplitudy impulsów LH u myszy10,11. Jednak pobieranie próbek krwi z końcówki ogona jest ograniczone do jego stosowania u przytomnych, obudzonych zwierząt; Wymaga to długiego okresu szkolenia, aby myszy przystosowały się do obchodzenia się z nim i obecności wyznaczonego badacza podczas pobierania próbek. Jego sukces jest bardzo podatny na stresory środowiskowe i może nie być odpowiedni do stosowania w szczepach myszy wykazujących wysoki poziom lęku. Kaniulacja wewnątrzprzedsionkowa była również stosowana do częstego pobierania próbek krwi u swobodnie poruszających się świadomych myszy12. Jednak taka konfiguracja nadal wymaga wielokrotnego ręcznego pobierania krwi i ogranicza przestrzeń poruszania się zwierząt, podczas gdy kaniulacja przedsionków może prowadzić do dynamicznych zmian w funkcji serca. Dlatego pożądane jest ustalenie metody pobierania krwi w warunkach bezstresowych u przytomnych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych myszy, bez konieczności wcześniejszego szkolenia lub obchodzenia się z nimi lub obecności człowieka.

Automatyczne pobieranie próbek krwi lub dializatu było już wcześniej używane do pomiaru różnych poziomów hormonów (np. melatonina13,14) i ich pulsacyjnego wydzielania (np. hormonu wzrostu)15 u niepohamowanych gryzoni. Przedstawiamy w niniejszym dokumencie protokół automatycznego, długoterminowego, częstego pobierania próbek krwi u przytomnych i nieskrępowanych zwierząt, w połączeniu z szybką zdalną aktywacją określonych populacji neuronów przy użyciu technologii chemogenetycznych: receptorów projektowanych aktywowanych wyłącznie przez (DREADDs). Opiszemy stereotaktyczne dostarczanie wektora wirusa związanego z adenowirusem (AAV) i zdalną aktywację przez automatyczne dożylne (IV) dostarczanie N-tlenku klozapiny (CNO)16,17. Protokół ten pozwala na sekwencyjne wykrywanie poziomów podstawowych i indukowanych zmian pulsacji LH u wielu zwierząt w tym samym czasie. Zarówno pobieranie krwi, jak i podawanie związku dożylnie odbywa się w sposób kontrolowany czasowo za pomocą programu komputerowego, eliminując fizyczną obecność badacza lub wymóg wcześniejszego szkolenia myszy. Metoda ta pozwala przezwyciężyć główne ograniczenia związane z ręcznym pobieraniem krwi. Pozwala na pobieranie próbek krwi w warunkach bezstresowych i jednoczesne podawanie związków dożylnych w połączeniu ze zdalną kontrolą aktywności neuronalnej. Przedstawiamy reprezentatywne wyniki stosowania automatycznego pobierania krwi samodzielnie lub w połączeniu ze zdalną aktywacją neuronów oraz omawiamy jego zalety, ograniczenia i dodatkowe zastosowania.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach są wykonywane zgodnie z Przewodnikiem Narodowej Rady ds. Badań Naukowych dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych18 oraz przepisami federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Do demonstracji tego protokołu wykorzystano dorosłe samice myszy (w wieku 3-6 miesięcy), w tym cztery samice C57BL / 6J i cztery Kiss1-Cre; Samice ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP). Myszy trzymano w cyklu 12:12 światło: ciemność, kontrolowano temperaturę 22 °C i karmiono ad libitum na diecie o niskiej zawartości fitoestrogenów. Procedury i protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Michigan (IACUC, Animal Protocols: PRO00010420 and PRO00010138).

1. Stereotaktyczne dostarczanie AAV do określonej populacji komórek

  1. Przygotowanie do zabiegu
    1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia. Przygotuj wiele pakietów narzędzi chirurgicznych, aby upewnić się, że każde opakowanie jest używane u nie więcej niż pięciu zwierząt. Przygotuj sterylne rękawiczki, co najmniej jedną parę dla każdego zwierzęcia.
    2. Do długich cienkich mikropipet, które wstrzykują powoli i stabilnie i nie zapychają się, należy wyciągnąć szklane mikropipety do wstrzykiwań przy użyciu następujących ustawień (patrz Tabela materiałów): Ciecz 1: 915, Ciecz 2: 630, Ciągnięcie: 630. Zoptymalizuj te ustawienia dla każdego ściągacza.
    3. Wykonuj operacje w wyznaczonej przestrzeni operacyjnej. Dezynfekuj powierzchnie chirurgiczne 70% etanolem.
    4. Używaj sterylnych obłożeń, aby utrzymać sterylność pola operacyjnego. Załóż czysty fartuch laboratoryjny lub jednorazowy fartuch i maskę.
    5. Przygotuj system znieczulenia wziewnego. Otwórz dopływ tlenu i reguluj natężenie przepływu do 0,8 l/min.
  2. chirurgia
    1. Umieść mysz w pudełku anestezjologicznym i otwórz izofluran do 2,5%. Zmniejszyć przepływ izofluranu do 2% po początkowej indukcji; Utrzymuj płynność przez cały czas trwania zabiegu. Aby uzyskać informacje na temat alternatywnych metod znieczulenia, zapoznaj się z protokołem dla zwierząt i wytycznymi lokalnej komisji etycznej.
    2. Wstrzykiwać zapobiegawczy lek przeciwbólowy (karprofen 5 mg/kg s.c.) zgodnie z zaleceniami komitetu ds. stosowania u zwierząt i lokalnymi przepisami.
    3. Ogol głowę myszy za pomocą maszynki do strzyżenia.
    4. Zainstaluj zwierzę na stole stereotaktycznym, umieść nauszniki i upewnij się, że głowa jest prawidłowo zamocowana i stabilna. Przymocuj usta myszy do ustnika, upewniając się, że język jest umieszczony z boku na zewnątrz ust, aby uniknąć uduszenia.
    5. Przed rozpoczęciem operacji sprawdź, czy zwierzę jest głęboko znieczulone za pomocą uszczypnięcia palca u nogi i monitoruj oddech i kolor myszy przez cały zabieg.
    6. Umieść podporę podnoszenia pod myszą, aby utrzymać ciało i głowę wypoziomowane w pozycji poziomej. Utrzymuj zwierzę w cieple za pomocą ciepłej podkładki pokrytej papierem. Nałóż maść na oczy na oba oczy, aby uniknąć wysuszenia.
    7. Utrzymuj obszar operacyjny tak czysty, jak to tylko możliwe. Nosić sterylne rękawice. Zdezynfekuj głowę myszy jodem i alkoholem przed otwarciem skóry. Skalpelem przeciąć skórę na głowie wzdłuż linii środkowej, mniej więcej od tyłu oczu aż do szwu lambda. Trzymaj czaszkę odsłoniętą i wyczyść ją bawełnianym wacikiem osadzonym w sterylnym 0,9% NaCl.
    8. Znajdź żyłę rostralną nosa (RRV) i zaznacz ją sterylnym ołówkiem. Do końca procedury użyj stereoskopu.
      UWAGA: Lepsze wyniki uzyskujemy, używając RRV jako odniesienia przednio-tylnego, ale standardem jest używanie bregma jako odniesienia.
    9. Używając sterylnej igły jako odniesienia, upewnij się, że orientacja mózgu jest prawidłowa przed przystąpieniem do pomiarów stereotaktycznych. Upewnij się również, że wysokość powierzchni czaszki przy RRV i lambda, a także nachylenie boczne są takie same (± 0,02 mm).
      UWAGA: Nachylenie boczne staje się bardziej istotne do wstrzyknięcia do bardziej bocznych struktur mózgu.
    10. Załadować sterylną szklaną pipetę roztworem wirusa, który ma zostać wstrzyknięty. Przynieś go do odniesienia RRV w celu uzyskania odniesienia 0 przednio-tylnego (AP). Przesuń wzdłuż szwu strzałkowego do wybranej współrzędnej AP. Zaznacz tę pozycję sterylnym ołówkiem, podnieś igłę i przystąp do kraniotomii.
    11. Ostrożnie wywierć małe kółko wokół zaznaczonej pozycji, aby uniknąć złamania górnej zatoki strzałkowej. Ustaw wiertło w pozycji nachylonej, a nie prostopadłej, aby zmniejszyć nacisk podczas wiercenia. Usuń kawałek czaszki za pomocą małych kleszczy.
    12. Po odsłonięciu układu krwionośnego użyj środka zatoki strzałkowej górnej, aby użyć go jako odniesienia przyśrodkowo-bocznego (ML) (punkt 0); jest to bardziej precyzyjne niż użycie szwu strzałkowego. Przejdź do wybranej pozycji ML. Opuścić pipetę, aby dotknąć opony twardej jako odniesienia grzbietowo-brzusznego (DV) (punkt 0). Lekko przełamać oponę twardą i opuścić pipetę do wybranej pozycji DV.
    13. Wstrzyknąć żądaną ilość AAV (50-200 nL) i pozostawić kaniulę na miejscu na 3 minuty, aby umożliwić odpowiednią dyspersję cieczy. Ostrożnie wyjmij pipetę z mózgu.
    14. Zdejmij mysz z nauszników. Zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych lub dowolnej wybranej metody. Umieść zwierzę w osobnej ogrzewanej klatce w celu rekonwalescencji. Monitoruj odzyskiwanie, reaktywność i aktywność po wybudzeniu myszy. Po całkowitym odzyskaniu praw przenieś mysz z powrotem do pierwotnej klatki.
  3. Poczekaj co najmniej 3-4 tygodnie na ekspresję wirusa przed przystąpieniem do drugiej części zabiegu.

2. Kaniulacja żyły szyjnej i tętnicy szyjnej

  1. Przygotowanie do zabiegu
    1. Wykonuj operacje w wyznaczonej przestrzeni operacyjnej. Przed rozpoczęciem zabiegów należy zdezynfekować powierzchnie chirurgiczne 70% etanolem. Przygotuj wiele pakietów narzędzi chirurgicznych, aby upewnić się, że każde opakowanie jest używane u nie więcej niż pięciu zwierząt.
    2. Autoklaw wszystkich narzędzi chirurgicznych. Następnie umyj je sterylną wodą lub solą fizjologiczną i zdezynfekuj narzędzia sterylizatorem z gorącymi kulkami przez co najmniej 15 sekund (zgodnie z instrukcjami producenta) między zabiegami.
    3. Używaj sterylnych obłożeń, aby utrzymać sterylność pola operacyjnego. Załóż czysty fartuch laboratoryjny lub jednorazowy fartuch i maskę.
    4. Przygotuj mikrocewniki do kaniulacji w tętnicy szyjnej i żyle szyjnej. Zbuduj cewnik tętniczy, łącząc mały segment rurki mikrorenatanowej (rozciągniętej od 0,025 cala średnicy zewnętrznej [OD] x 0,012 cala średnicy wewnętrznej [ID]) z rurką silastyczną, (0,025 cala średnicy zewnętrznej x 0,012 cala ID). Cewnik żylny należy konstruować wyłącznie za pomocą rurki silastycznej (0.025 cala średnicy zewnętrznej x 0.012 cala średnicy). Namocz wszystkie cewniki w 70% etanolu na noc przed zabiegiem.
    5. Ścięte końcówki obu cewników należy ukosować pod kątem 45° do wstępnie oszacowanej długości na podstawie masy ciała i długości zwierzęcia.
  2. Zabiegi chirurgiczne
    1. Znieczulenie zwierząt poniżej 2% izofluranu za pomocą stołowego systemu izofluranu o niskim przepływie, aby precyzyjnie kontrolować etap i płaszczyznę znieczulenia podczas operacji.
    2. Wstrzyknąć zapobiegawczą dawkę leku przeciwbólowego (karprofen 5 mg/kg s.c.) i nałożyć maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu i urazom rogówki.
    3. Ogol brzuszną i tylną część szyi i oczyść skórę trzema peelingami jodowymi na przemian z 70% etanolem. Wyciąć pionowe nacięcie skóry (12 mm) między łopatkami i przykryć je gazą chirurgiczną do późniejszego wykorzystania. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej z głową skierowaną w stronę chirurga.
    4. Użyj stereoskopowej lunety do większości procedur opisanych poniżej.
    5. Wykonaj małe pionowe nacięcie (~10 mm) po prawej stronie szyi, powyżej obojczyka, aby odsłonić prawą tętnicę szyjną i żyłę szyjną. Przeciąć skórę nożyczkami i wykonać wypreparowanie w celu oddzielenia tkanek podskórnych za pomocą nieząbkowanych mikrokleszczyków z cienkimi końcówkami, odsłaniając prawą żyłę szyjną zewnętrzną i prawą tętnicę szyjną wspólną.
    6. Zawiąż dystalny koniec żyły szyjnej, aby zatrzymać przepływ krwi i wytnij mały otwór w zapadniętej żyle za pomocą mikrokleszczy i nożyczek. Wprowadzić cewnik żylny skośnie w dół i proksymalnie za pomocą pary mikrokleszczyków, aby przesunąć go przez żyłę główną górną, aby osiągnąć poziom prawego przedsionka. Długość po włożeniu wynosi ~10-12 mm dla 30 g chudej myszy. Zawiąż cewnik, aby przymocować go do naczynia za pomocą jedwabnych szwów 7-0.
      UWAGA: Gdy cewnik znajduje się we właściwym miejscu, krew można łatwo pobrać; W przeciwnym razie cewnik może zostać niewłaściwie umieszczony w bocznej żyle piersiowej i musi zostać ponownie włożony.
    7. Ostrożnie wypreparuj tkanki łączne, aby odsłonić prawą wspólną tętnicę szyjną znajdującą się w obszarze trójkąta otoczonym mięśniem mostkowo-gnykowym, mięśniem mostkowo-sutkowym i mięśniem dwubrzuścowym. W razie potrzeby użyj zwijacza drutu, aby oddzielić te mięśnie. Zawiąż tętnicę na poziomie rozwidlenia tętnic szyjnych wewnętrznych i zewnętrznych za pomocą szwów jedwabnych 7-0. Zamień dwie rozwiązane pętle szwów proksymalnie.
    8. Tymczasowo zatrzymaj przepływ krwi, pociągając za wymienioną pętlę do szwów i wytnij lub przebij mały otwór w ścianie naczynia za pomocą mikronożyczek lub igły 27 G. Wprowadzić cewnik tętniczy skośnie w dół i proksymalnie na szacowaną długość, docierając do łuku aorty, ale bez dotykania zastawki aortalnej. Długość po włożeniu wynosi ~9-10 mm dla 30 g chudej myszy. Zawiąż cewnik, aby przymocować go do naczynia za pomocą dwóch zastąpionych szwów.
    9. Tuneluj wszystkie cewniki podskórnie i zewnętrzizuj je z tyłu szyi przez wstępnie nacięte nacięcie i połącz je z portami żylnymi lub tętniczymi łącznika rurki pokrytego silikonem wykonanego z rurki igłowej 25 G: zmodyfikowana klasa MASA19 przy użyciu dwóch rurek igłowych 25 G i dwóch 4,0 cm rurki PE-20, w osłonie 2,0 cm rurki silastycznej ID o średnicy 0,062 cala przymocowanej małym metalowym pierścieniem wykonanym z drutu. Całkowita objętość światła każdego cewnika wraz ze złączem wynosi 6-8 μl (Rysunek 1A).
    10. Zamknij nacięcie brzuszne i przymocuj łącznik podskórnie po zamknięciu tylnej skóry za pomocą szwów. Napełnij oba cewniki heparynizowaną solą fizjologiczną (200 U/ml) i szczelnie zatkaj je na końcu drutami chirurgicznymi ze stali nierdzewnej.
    11. Myszy wracają do zdrowia po znieczuleniu izofluranem w ciągu kilku minut i w pełni wracają do zdrowia po operacji w ciągu 5 dni. Umieść zwierzęta w komorze do automatycznego pobierania krwi 24 godziny po operacji i podłącz je do systemu, łącząc hak mocujący systemu z metalowym pierścieniem przymocowanym do łącznika rurki wszczepionego z tyłu szyi. Podłączyć cewniki tętnicze i żylne odpowiednio do linii iniekcyjnej i pobierania próbek, 24 godziny przed rozpoczęciem pobierania próbek (Rysunek 1B) . Całkowita długość przewodu do pobierania próbek wynosi 55 cm długości lub 40 μl objętości strumienia świetlnego.
      UWAGA: Szczegółowo opisano konfiguracje linii do wstrzykiwań i pobierania próbek, programowanie metody pobierania oraz mechanizmy równoważenia klatkowego automatycznego systemu pobierania próbek krwi20,21. System utrzymuje cewnik w pozycji otwartej, automatycznie dostarczając 10 μl heparynizowanej soli fizjologicznej co 20 minut.
    12. Ustaw czas i częstotliwość pobierania próbek przed wstrzyknięciem, wstrzyknięciem i po wstrzyknięciu za pomocą programu komputerowego systemu. Zobacz krok 3.1 poniżej, aby zapoznać się z bieżącymi ustawieniami.
    13. System umożliwia zwierzęciu swobodne poruszanie się bez plątania linii pobierania próbek i/lub infuzji poprzez wykrywanie ruchu myszy podczas obracania komory inwentarskiej w kierunku przeciwnym do ruchu myszy21 (Rysunek 1).
    14. Ponownie napełnić przewód infuzyjny lub iniekcyjny związkiem i ponownie podłączyć do cewnika żylnego co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem infuzji lub wstrzyknięcia.
      UWAGA: Mogą wystąpić powikłania po operacji, a zwierzęta muszą być ściśle monitorowane w celu powrotu do zdrowia i w dniach po operacji. Zapoznaj się z protokołem dla zwierząt, aby uzyskać informacje o prawidłowym monitorowaniu, wymaganiach dotyczących terminacji i procedurach.

3. Automatyczne pobieranie krwi i wstrzyknięcie dożylne

  1. Automatyczne pobieranie krwi
    1. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy użyć objętości próbki wynoszącej 20,0 μl i ustawić odstęp (tj. 7,0 min) między każdym próbkowaniem, aby częstotliwość pobierania próbek wynosiła co 10,0 minut na próbkę. Maksymalna szybkość próbkowania to próbkowanie w sposób ciągły z prędkością 3,0 min/próbkę; minimalna możliwa objętość próbki wynosi 5,0 μl. Taka sama ilość soli fizjologicznej jest automatycznie oddawana przez system w celu zastąpienia pobranej krwi i utrzymania równowagi płynów ustrojowych.
    2. Ustaw całkowity czas pobierania próbek na 30 (t = -30 - 0) minut przed i 30 (t = 0 - 30) minut po dożylnym wstrzyknięciu CNO (0,5 mg/kg, Rysunek 2).
    3. Każda pobrana próbka krwi (20,0 μl) jest automatycznie rozcieńczana w 50 μl soli fizjologicznej (zawierającej heparynę w stężeniu 10 μl/ml) i przechowywana indywidualnie w mikroprobówce utrzymywanej przez system w chłodzonej karuzeli na próbki.
  2. Automatyczne wstrzyknięcie dożylne
    1. Odłącz przewód żylny od cewnika żylnego w celu napełnienia CNO (indywidualnie obliczana dawka objętościowa ~50-60 μL przy 0,5 mg/kg) co najmniej 2 godziny przed rozpoczęciem pobierania krwi.
    2. Ręcznie pobrać roztwór (nieco większy niż obliczona objętość) z linii wstecz za pomocą strzykawki do wstrzykiwań, pozostawiając niewielki pęcherzyk powietrza między roztworem a istniejącą w linii solą fizjologiczną.
    3. Ponownie podłączyć przewód iniekcyjny do cewnika żylnego i ustawić szybkość wstrzykiwania na 500 μl/min, a czas rozpoczęcia wstrzykiwania na 2 minuty po t = 0 zakończeniu pobierania próbek. Całkowity czas wstrzyknięcia dla każdego zwierzęcia wynosi 5-6 s.
      UWAGA: W razie potrzeby związek można również dostarczyć za pomocą ręcznego wstrzyknięcia dootrzewnowego (IP), ale będzie to wymagało niepokojenia zwierzęcia w trakcie lub przed protokołem pobierania krwi. Tę alternatywę również pokazujemy w wynikach.

4. Perfuzja zwierzęca i pobieranie mózgu (OPCJONALNIE)

UWAGA: Ta procedura powinna być stosowana tylko wtedy, gdy mózg jest zobowiązany do analizy miejsca aktywacji neuronów lub dalszych reakcji mózgu.

  1. Odłącz mysz od systemu pobierania krwi po zakończeniu protokołu pobrania. Dwie godziny po wstrzyknięciu dożylnym należy przystąpić do perfuzji zwierzęcia 10% neutralną buforowaną formaliną (NBF), stosując preferowaną metodę lub zgodnie z opisem w innym miejscu22.
  2. Wypreparuj mózg i zakonserwuj go w 20% sacharozie w 10%-NBF przez 3 godziny, aby kontynuować utrwalanie.
  3. Po 3 godzinach przenieść utrwalony mózg do 20% sacharozy w PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu, gdy będzie gotowy do sekcji.
    UWAGA: Unikaj nadmiernej fiksacji, ponieważ spowoduje to zamaskowanie antygenów cFOS. W 20% roztworze sacharozy mózg powinien opaść na dno pojemnika.
  4. Wykonaj sekcje za pomocą mikrotomu do zamrażania lub kriostatu i użyj preferowanej metody, aby przyjrzeć się aktywacji neuronów (np. pokazano immunohistochemię cFOS).
    UWAGA: Przeciwciała użyte do obecnych wyników są opisane w Tabeli Materiałów.

5. Przetwarzanie i analiza próbek

  1. Natychmiast po zakończeniu eksperymentu należy pobrać próbki krwi z próbnika automatycznego i umieścić je na lodzie.
  2. Wirować próbki z prędkością 14 000 × g przez 30 s.
  3. Zbierz osocze. Przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy.
  4. Oznacz próbki krwi za pomocą testu LH ELISA zgodnie z wcześniejszym opisem10,23.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neurony wyrażające kisspeptynę (gen Kiss1) znajdujące się w łukowatym jądrze podwzgórza są silnym stymulatorem GnRH, a tym samym uwalniania LH z przysadki mózgowej24,25. W tej demonstracji protokołu użyliśmy wydzielania LH indukowanego kisspeptyną, aby zilustrować działanie techniki automatycznego pobierania krwi. Rysunek 2 pokazuje reprezentatywne wzorce LH u dorosłych samic Kiss1-eYFP, które wcześniej otrzymały jednostronny stereotaktyczny zastrzyk AAV-hM3Dq-mCherry w jądro łukowate (AP: -4,95, ML: -0,35, DV: -5,7). ChR2-eYFP został użyty jako fluorescencyjny reporter dla komórek Kiss1. Miesiąc po operacji stereotaktycznej myszy przeszły operację tętnicy szyjnej i kaniulacji żyły szyjnej i zostały podłączone do automatycznego samplera krwi 4 dni po operacji. Pobieranie krwi w celu określenia podstawowych poziomów LH rozpoczęto następnego dnia przy 10-minutowej częstotliwości pobierania próbek (7 minut przerwy między próbkami i 3 minuty/pobieranie próbek), a następnie zautomatyzowane dożylne wstrzyknięcie CNO i kontynuowano pobieranie krwi co 10 minut przez 30 minut. Poziomy LH u diestrousa są na ogół niskie (Rysunek 2A), ale zwykle obserwuje się różnice ze względu na jego pulsacyjne uwalnianie (Rysunek 2B). Po wstrzyknięciu CNO (i aktywacji neuronów kisspeptyny) wzrost LH był gwałtowny (w ciągu 10 minut). Poziom wzrostu i czas trwania szczytu zależy od wielu czynników, w tym miejsca wstrzyknięcia, liczby aktywowanych neuronów lub docelowej populacji.

Rysunek 3 pokazuje miejsce wstrzyknięcia w mózgu w łukowatym jądrze samicy myszy reprezentowanej w Rysunek 2A. Neurony Kiss1-eYFP są oznaczone na zielono, podczas gdy immunoreaktywność mCherry pokazuje miejsce wstrzyknięcia i aktywacji AAV po CNO. Aktywowane neurony wykryto za pomocą immunoreaktywności cFOS, oznaczonej DAB. Większość neuronów mCherry kolokalizowała się z Kiss1-eYFP, a wiele z nich wykazywało immunoreaktywność cFOS, co pokazuje, że aktywacja wirusa i neuronów była specyficzna dla docelowej populacji.

Reprezentatywny pulsacyjny wzór uwalniania LH u myszy typu dzikiego (C57BL/6J), po którym następuje odpowiedź na wstrzyknięcie IP kisspeptyny-10, jest pokazany w Rysunek 4. Mysz przeszła kaniulację tętnicy szyjnej i została podłączona do systemu automatycznego pobierania krwi 4 dni po operacji. Następnego ranka sprawdzono cykle rujowe i wykonano pobranie krwi oraz wstrzyknięcie kisspeptyny-10 w dniu diestrous day26. Próbki krwi pobierano co 7 minut przez 2 godziny (odstęp 4 minut, plus 3 minuty/pobieranie próbek przez 120 minut przed wstrzyknięciem) w celu określenia poziomów wyjściowych i pulsacji LH, a następnie wstrzyknięto IP kisspeptyny-10 (65 μg / kg) i kontynuowano pobieranie krwi co 7 minut przez dodatkowe 30 minut. Zaobserwowano wyraźne impulsy LH typowe dla samicy w diestrous, wykazujące niski podstawowy poziom LH, częstotliwość impulsów ~2 impulsy/h i amplitudę impulsu ~1 ng/mL27. Natychmiastowy i silny wzrost LH wykryto w odpowiedzi na podanie kisspeptyny28. Wzorce wydzielania LH i zmiany po stymulacji są zgodne z innymi badaniami wykorzystującymi ręczne pobieranie krwi10,27,29,30. Wyniki te pokazują, że metoda automatycznego pobierania próbek krwi wychwytuje typowe i stymulowane wydzielanie LH w warunkach bezstresowych.

figure-results-1
Rysunek 1: Szczegóły systemu złączy i połączeń myszy z rurkami systemu infuzji i pobierania próbek. (A) Łącznik rurkowy pokryty silikonem (MASA) zbudowany z dwóch rurek igłowych 25G i dwóch wężyków PE-20, owinięty w rurkę silastyczną przymocowaną małym metalowym pierścieniem. (B) Mysz podłączona do rurki infuzyjnej i do pobierania próbek w klatce do pobierania próbek, odpoczywający w swoim gnieździe podczas pobierania próbek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki dla impulsów LH u samic myszy Kiss1-Cre, którym wstrzyknięto AAV-hM3Dq do jądra łukowatego i zdalnie aktywowano CNO. Podstawowe poziomy LH mierzono co 10 minut przez pół godziny. W czasie 0 po pobraniu krwi samica otrzymała dożylne wstrzyknięcie N-tlenku klozapiny (0,5 mg/kg), a krew była nadal pobierana z tętnicy szyjnej co 10 minut przez dodatkowe pół godziny. (A) Pokazuje samicę z niskim podstawowym poziomem LH. (B) Pokazuje kobietę wykazującą wstępne wstrzyknięcie impulsu LH. Skróty: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = wirus związany z adenowirusem; CNO = N-tlenek klozapiny; LH = hormon luteinizujący. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Aktywacja mózgu w łukowatym jądrze Kiss1-Cre; Samica Chr2-eYFP (Kiss1-eYFP) reprezentowana w Rysunek 2A. ChR2-eYFP był używany tylko jako gen reporterowy do znakowania neuronów kiss1. (A) Obraz fluorescencyjny o małym powiększeniu pokazujący miejsce wstrzyknięcia AAV w jądrze łukowatym. Zielony: immunoreaktywność eYFP, Magenta: immunoreaktywność mCherry. (B) Obraz w jasnym polu o małym powiększeniu obszaru odpowiadającego Rycina 3A, pokazująca immunoreaktywność cFOS () w miejscu wstrzyknięcia AAV w jądrze łukowatym. (C) Połączenie fluorescencji w dużym powiększeniu i obrazu w jasnym polu, pokazujące bliższe przyjrzenie się neuronom w Rysunek 3A,B. Neurony Kiss1-eYFP koeksprymujące AAV-mCherry, które zostały aktywowane, to te z białą cytoplazmą i czarnym jądrem (strzałki). Podziałka = 50 μm (A,B), 20 μm (C). Skróty: Kiss1 = Kisspeptin; AAV = wirus związany z adenowirusem; eYFP = wzmocnione białko fluorescencji żółtej. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Podstawowa pulsatywność LH u samicy dzikiego typu mierzona co 7 minut przez 2 godziny. Samica otrzymała następnie dootrzewnowe wstrzyknięcie kisspeptyny-10 (65 μg/kg) o godzinie 0, a próbki krwi były pobierane w sposób ciągły co 7 minut przez pół godziny. Skrót: LH = hormon luteinizujący. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z tego protokołu, byliśmy w stanie wykazać podstawową pulsywność LH i wydzielanie LH po stymulacji populacji neuronów. Ogromną zaletą systemu jest bezstresowe środowisko, w którym odbywa się pobieranie próbek, bez obecności człowieka lub obsługi podczas pobierania krwi. Ponadto nie było wymagane wcześniejsze pracochłonne szkolenie zwierząt i przystosowanie się do obecności człowieka lub obchodzenia się z nim podczas eksperymentu. Poprzednie eksperymenty z wykorzystaniem ręcznego pobierania krwi wymagały dużej ilości czasu i wysiłku, aby zminimalizować czynniki stresogenne 7,31,32. Jednak samo obcięcie ogona jest stresorem33. Wdrożenie niestresującego środowiska i paradygmatu treningu we wspólnych obiektach dla zwierząt, w których przerwy są nieprzewidywalne, może również być ograniczeniem. W niektórych laboratoriach zwierzęta często muszą być transportowane do alternatywnych sal zabiegowych w celu pobrania krwi. Ograniczenia te mogą sprawić, że metoda ręczna nie będzie odpowiednia do wykrywania subtelnych zmian w poziomach LH, dlatego w takich sytuacjach pomocne może być podejście bezobsługowe. Automatyczne pobieranie próbek odbywa się w cichym pomieszczeniu, w którym myszy są umieszczane z kilkudniowym wyprzedzeniem, aby zaaklimatyzować się w nowym środowisku. Nasze wcześniejsze doświadczenia z tym protokołem zapewniły precyzyjne wykrywanie wzorców wydzielania kortykosteronu i pulsacyjnego hormonu wzrostu u myszy, nie wykazując podwyższonego poziomu kortykosteronu podczas automatycznego pobierania próbek15. W obecnych eksperymentach wszystkie zwierzęta były dobrze przystosowane do systemu pobierania próbek, wykazując budowanie gniazda w komorze pobierania próbek po ~24 godzinach i jasny kolor włosów, co wskazuje na brak stresu i ogólny dobry stan zdrowia (ryc. 1).

Główną trudnością prowadzącą do negatywnych wyników jest prawdopodobnie niewłaściwe ukierunkowanie AAV na wymaganą populację neuronów. Precyzja w iniekcjach stereotaktycznych jest niezbędna, a szkolenie powinno być wykonane z wyprzedzeniem, aby zweryfikować współrzędne i objętości iniekcji. Trening można wykonać, wstrzykując niewielką ilość 0,5-1% Evans Blue w żądane miejsce podczas operacji bez rekonwalescencji, a następnie pobierając wycinek świeżo wypreparowanego mózgu za pomocą macierzy mózgowej myszy (np. Ted Pella) w celu sprawdzenia miejsca i wielkości wstrzyknięcia za pomocą stereoskopu.

Ważne jest również, aby wziąć pod uwagę, że krew i osocze pobrane z automatycznego systemu pobierania próbek krwi będą rozcieńczane w soli fizjologicznej soliowanej heparyną (np. 20 μl krwi w 50 μl soli fizjologicznej w naszych wynikach)20, a współczynnik rozcieńczenia może wymagać dostosowania do czułości wybranej metody analitycznej. Zbadaliśmy poziomy LH w pełnej krwi rozcieńczonej w BSA-PBS (zgodnie z zaleceniami dla ultraczułego LH ELISA)10 lub soli fizjologicznej i nie znaleźliśmy różnic w wartościach LH. Tween nie może być używany w rozcieńczalniku, ponieważ będzie on krążył w układzie krwionośnym w celu ekstrakcji próbek poprzez zastąpienie płynów próbki20. Z naszego doświadczenia wynika, że rozcieńczenia poniżej 1:10 dawały dobre wyniki LH, ale nieco zaniżały poziomy LH w porównaniu do 1:3,5. Oznacza to, że rozcieńczenie może być dalej dostosowywane w celu zmniejszenia ilości pobieranej krwi, jeśli jest to konieczne.

Alternatywą dla automatycznego podawania związków jest wykonywanie ręcznych wstrzyknięć przez cewnik żylny. W takim przypadku badacz jest przez krótki czas obecny w pomieszczeniu w celu wykonania zastrzyku. Nie ma jednak bezpośredniego kontaktu ze zwierzętami ani ich pomieszczeniami i otoczeniem, a w przeciwieństwie do iniekcji dootrzewnowych lub podskórnych, cała procedura jest często niezauważona przez zwierzę. Zaletą ręcznego wstrzykiwania jest to, że rozcieńczanie związku nie musi być wcześniej ustawiane, co może mieć kluczowe znaczenie w przypadku związków, które są zbyt drogie, aby stosować je w większych ilościach lub są wrażliwe na degradację w czasie; Ponieważ objętość operacyjna jest mniejsza niż w przypadku podawania automatycznego, gdzie linia infuzyjna i cewnik muszą być wstępnie napełnione większą ilością roztworu złożonego.

Automatyczne pobieranie próbek krwi daje wyjątkową możliwość badania zmian LH na przykład podczas snu. Regularnie obserwowaliśmy zwierzęta śpiące w swoich gniazdach w czasie pobierania próbek. Możliwe jest powiązanie tego próbkowania z zapisami EEG w celu wygenerowania bardziej szczegółowej analizy związku między aktywnością neuronalną a wzorcem LH34. Jak pokazano tutaj, możliwości wykorzystania automatycznego pobierania próbek krwi jest wiele: od podstawowego pobierania LH po badanie odpowiedzi LH na związki endogenne lub egzogenne lub po aktywację lub supresję populacji neuronów. Manipulacje neuronalne mogą być realizowane ostro za pomocą chemogenetyki lub optogenetyki lub na stałe przy użyciu transgenicznych modeli myszy i narzędzi do wyciszania apoptozy lub neuronów. Automatyczne pobieranie próbek krwi pozwala również na pomiar innych hormonów o wysoce pulsacyjnych wzorcach wydzielniczych (np. hormonu wzrostu15). U samic myszy, jeśli wymagana jest określona faza cyklu rujowego, wymazy z pochwy można ostrożnie pobrać na kilka godzin przed rozpoczęciem protokołu26 bez przerywania linii infuzji i pobierania próbek. Zwierzęta mogą być podłączone do systemu pobierania próbek na 7-10 dni, przy czym ryzyko zakrzepnięcia linii tętniczej wzrasta z czasem.

Technika ta jest jednak ograniczona do stosowania u zwierząt trzymanych samotnie, a zatem może nie być odpowiednia do badania interakcji społecznych. Jest również inwazyjny i wymaga technicznie wymagającej operacji, więc może nie być możliwe do wdrożenia z młodymi zwierzętami lub niektórymi modelami chorób. Wreszcie, ponieważ koszt zakupu systemu może być zbyt wysoki dla pojedynczego laboratorium badawczego, wskazane byłoby skonfigurowanie go w laboratorium podstawowym, które świadczy usługi w ramach wspomnianego protokołu eksperymentalnego.

Podsumowując, protokół ten pokazuje, jak przeprowadzić stereotaktyczne dostarczanie AAV w połączeniu z automatycznym pobieraniem próbek krwi. Precyzyjna kontrola przestrzenna i czasowa osiągnięta za pomocą tej techniki, wraz z jej elastycznością zastosowania do różnych modeli, protokołów pomiarowych i hormonów, sprawia, że jest to potężna metoda badania regulacji hormonalnej u gryzoni. Co najważniejsze, metoda zapewnia bezstresowe środowisko poprzez wyeliminowanie obecności człowieka i obchodzenia się z nim podczas iniekcji i/lub pobierania próbek oraz wcześniejszego szkolenia zwierząt. Te zalety, wraz z możliwością multipleksowania, sprawiają, że metoda ta jest unikalnym narzędziem do badania neuronalnej kontroli zmian hormonalnych u świadomych, swobodnie poruszających się i niezakłóconych myszy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Dr. Danielowi Haisendederowi za pomoc w testowaniu różnych metod rozcieńczania krwi. Testy hormonalne w surowicy przeprowadzono w Centrum Badań nad Rozrodczością i Analizą Ligandów Uniwersytetu Wirginii, wspieranym przez Eunice Kennedy Shriver NICHD Grant R24 HD102061. Michigan Mouse Metabolic Phenotyping Center-Live jest wspierany przez NIH Center Grant U2C DK135066. JF i NQ są wspierane przez granty DK020572 (MDRC) i DK089503 (MNORC). CFE i CSM są wspierane przez grant NICHD R21 HD109485 i R01 HD096324.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
AAV8-hSyn-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Niekoniecznie ten wirus, ale to był ten, którego użyto do uzyskania reprezentatywnych wyników
Dezynfekcjaalkoholem
Znieczulenie Skrzynka indukcyjnaVetequip
Maszyna do indukcji znieczuleniaKent Sprzęt naukowySomnoSuite
dla myszyKent Sprzęt naukowySOMNO-0801
Aplikator Autoclip 9 mmClay Adams427630
Zmywacz Autoclip 9 mmClay Adams427637
Autoclips 9 mmClay Adams427631
Kontroler BASi CulexCulexSN: 2151, 2152, 2156, 21584 stacje
BASi Plaster miodu Zbieracz frakcji Plaster miodu Plaster mioduSN: 2105, 2106, 2107, 21084 stacje
BASi Ratrun Rotation ControlRATURN 2SN: 5680, 5681, 5682, 56834 stacje
myszy C57BL/6JJAX # 000664
CarprofenZoetisRimadyl
Maszynki do strzyżeniaBraun
Tlenek N-klozapinyENZOBLM-NS105-0005
Aplikatory
CULEX Zautomatyzowany system pobierania próbek in vivoBASiDS000627z wymiennymi zestawami przewodów CX-4000S Zakrzywione
kleszcze ząbkowaneWiertarka FST11151-10
Dremel61100
Moduł sterujący EmpisEMPIS CMSN: 174
Programowalny systeminfuzyjny EmpisEMPISSN: 2125 , 2126, 2127, 2128z CX-7010S 4 zestawy infuzyjne BAS-2; 4 stacje
Envigo 2016 dietanisko-fitoestrogenowa 
Maść do oczuDechraPuralube Maść weterynaryjnaWazelina Maść oftalmiczna
Pipety szklaneWorld Precision InstrumentsMIB100-6
HemostatsRoboz Surgical     RS-7101
JodineBetadine Peeling
IsofluraneVetOneFlurisoAnesthetic
Isoflurane Vaporizer lub SomnoSuite Low-Flow Anesthesia SystemSurgivet lub Kent Scientific CorpSS-01Aparat anestezjologiczny
Kiss1-Cre; Myszy ChR2-eYFP (Kiss1-eYFP) JAX # 023436 i #024109
Kisspeptin-10Phoenix Pharmaceuticals048-56
Rurki z mikro-renatanem Braintree ScientificMRE025Cewnikowanie chirurgiczne
MikronożyczkiRoboz Surgical   RS-5606
Uchwyt igłyRoboz Surgical     RS-7842
Wtryskiwacz PicoliterWarnerInstruments PLI-100A
Ściągacz do pipetSutter Instruments P30
Ocieplacz na gryzonie X2Stoelting53850
SkalpelFST10003-12
NożyczkiRoboz Surgical   RS-6808
Rurki silikonoweRurki laboratoryjne LiveoNO.508-0010,012 cala ID x 0,025 cala OD
Stół stereotaktycznyRWDE06208
Sterylny 0,9% sól fizjologicznaBaxter2F7124
Sterylne obłożenia ręcznikoweDynarex4410
Ostrza chirurgiczneSKLAR06-3011
Stereoskop chirurgicznyZeissf-160
PęsetaRoboz Surgical  Pęseta RS-4960
Roboz Surgical   RS-4972
Pęsetachirurgiczna Roboz   RS-5058
przeciwciała
Anti-cFos MilliporeABE457: N-koniec cFos; Organizm gospodarza: Królik; Zastosowane rozcieńczenie: 1:5 000; RRID: AB_2631318 
Anty-GFPAves LabsGFP-1010Cel antygenu: rekombinowany GFP null; Organizm gospodarza: Kurczak; Zastosowane rozcieńczenie: 1:10 000; RRID: AB_2307313 
Sprzężony z biotyną SP AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgGJackson ImmunoResearch Labs711-065-152Cel antygenu: IgG królika (H + L); Organizm żywiciela: Osioł; Zastosowane rozcieńczenie: 1:1,000; RRID: AB_2340593 
Osioł anty-Rat IgG, AlexaFluor 594Thermo Fisher ScientificA-21209Cel antygenowy: Rat IgG (H+L); Organizm żywiciela: Osioł; Zastosowane rozcieńczenie: 1:500; RRID: AB_2535795 
Kozie przeciwciała anty-kurze IgY, Alexa Fluor 488Thermo Fisher ScientificA-11039Cel antygenowy: Kurczak, IgY (H+L); Organizm gospodarza: Koza; Zastosowane rozcieńczenie: 1:500; RRID: AB_2534096
mCherry monoklonalny (16D7)Thermo Fisher ScientificM11217Cel antygenu: mCherry tag; Organizm gospodarza: Szczur; Zastosowane rozcieńczenie: 1:5 000; RRID: AB_2536611 
Maski anestezjologiczne przeciwbólowego z bawełnianą końcówkąchirurgiczny Cel antygenu

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kokoris, G. J., Lam, N. Y., Ferin, M., Silverman, A. J., Gibson, M. J. Transplanted gonadotropin-releasing hormone neurons promote pulsatile luteinizing hormone secretion in congenitally hypogonadal (hpg) male mice. Neuroendocrinology. 48 (1), 45-52 (1988).
  2. Coquelin, A., Desjardins, C. Luteinizing hormone and testosterone in young and old male mice. American Journal of Physiology - Endocrinology and Metabolism. 243 (3), E257-E263 (1982).
  3. Carmel, P. W., Araki, S., Ferin, M. Pituitary stalk portal blood collection in rhesus monkeys: Evidence for pulsatile release of gonadotropin-releasing hormone (GnRH). Endocrinology. 99 (1), 243-248 (1976).
  4. Schuiling, G., Gnodde, H. Site of origin of the pulsatile secretion of luteinizing hormone in long-term ovariectomized rats. Journal of Endocrinology. 70 (1), 97-104 (1976).
  5. Hackwell, E. C. R., Ladyman, S. R., Brown, R. S. E., Grattan, D. R. Mechanisms of lactation-induced infertility in female mice. Endocrinology. 164 (5), 1-12 (2023).
  6. Bahougne, T., Kretz, M., Angelopoulou, E., Jeandidier, N., Simonneaux, V. Impact of circadian disruption on female mice reproductive function. Endocrinology. 161 (4), (2020).
  7. Kreisman, M. J., McCosh, R. B., Tian, K., Song, C. I., Breen, K. M. Estradiol Enables Chronic Corticosterone to Inhibit Pulsatile Luteinizing Hormone Secretion and Suppress Kiss1 Neuronal Activation in Female Mice. Neuroendocrinology. 110 (6), 501-516 (2020).
  8. Moenter, S. M., Evans, N. P. Gonadotropin-releasing hormone GnRH measurements in pituitary portal blood. Journal of Neuroendocrinology. 34 (5), 13065(2022).
  9. Maeda, K. I., et al. The LHRH pulse generator: A mediobasal hypothalamic location. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 19 (3), 427-437 (1995).
  10. Steyn, F. J., et al. Development of a methodology for and assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion in juvenile and adult male mice. Endocrinology. 154 (12), 4939-4945 (2013).
  11. Steyn, F. J., et al. Development of a method for the determination of pulsatile growth hormone secretion in mice. Endocrinology. 152 (8), 3165-3171 (2011).
  12. Minabe, S., Uenoyama, Y., Tsukamura, H., Maeda, K. Analysis of pulsatile and surge-like luteinizing hormone secretion with frequent blood sampling in female mice. Journal of Reproduction and Development. 57 (5), 660-664 (2011).
  13. Perreau-Lenz, S., Kalsbeek, A., Pévet, P., Buijs, R. M. Glutamatergic clock output stimulates melatonin synthesis at night. European Journal of Neuroscience. 19 (2), 318-324 (2004).
  14. Herwig, A., Pévet, P., Bothorel, B., Steinlechner, S., Saboureau, M. Trans-pineal microdialysis in the Djungarian hamster (Phodopus sungorus): A tool to study seasonal changes of circadian clock activities. Journal of Pineal Research. 40 (2), 177-183 (2006).
  15. Adams, J. M., Otero-Corchon, V., Hammond, G. L., Veldhuis, J. D., Qi, N., Low, M. J. Somatostatin is essential for the sexual dimorphism of GH secretion, corticosteroid-binding globulin production, and corticosterone levels in mice. Endocrinology. 156 (3), 1052-1065 (2015).
  16. Alexander, G. M., et al. Remote control of neuronal activity in transgenic mice expressing evolved G protein-coupled receptors. Neuron. 63 (1), 27-39 (2009).
  17. Krashes, M. J., et al. reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  18. National Research Council. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Eighth edition. National Research Council. , The National Academies Press. Washington, DC. (2011).
  19. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments. (57), e3188(2011).
  20. Peters, S., et al. Culex ABS Part I: Introduction to automated blood sampling. Current Separations. 18 (4), 139-145 (2000).
  21. Bohs, C., Cregor, M., Gunaratna, G., Kissinger, C. Culex Automated blood sampler part II Managing freely-moving animals and monitoring their activity. Current Separations. 18 (4), 147-151 (2000).
  22. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).
  23. Kreisman, M. J., Mccosh, R. B., Breen, K. M. A Modified ultra-sensitive ELISA for measurement of LH in mice. Endocrinology. 163 (9), (2022).
  24. Pielecka-Fortuna, J., Chu, Z., Moenter, S. M. Kisspeptin acts directly and indirectly to increase gonadotropin-releasing hormone neuron activity and its effects are modulated by estradiol. Endocrinology. 149 (4), 1979-1986 (2008).
  25. Kumar, D., et al. Specialized subpopulations of kisspeptin neurons communicate with GnRH neurons in female mice. Endocrinology. 156 (1), 32-38 (2015).
  26. Caligioni, C. S. Assessing reproductive status/stages in mice. Current Protocols in Neuroscience. , 1-8 (2009).
  27. Czieselsky, K., et al. Pulse and surge profiles of luteinizing hormone secretion in the mouse. Endocrinology. 157 (12), 4794-4802 (2016).
  28. Wang, L., et al. Genetic dissection of the different roles of hypothalamic kisspeptin neurons in regulating female reproduction. eLife. 8, 43999(2019).
  29. McCosh, R. B., Kreisman, M. J., Breen, K. M. Frequent tail-tip blood sampling in mice for the assessment of pulsatile luteinizing hormone secretion. Journal of Visualized Experiments. (137), e57894(2018).
  30. Vanacker, C., Defazio, R. A., Sykes, C. M., Moenter, S. M. A role for glial fibrillary acidic protein (Gfap)-expressing cells in the regulation of gonadotropin-releasing hormone (GnRH) but not arcuate kisspeptin neuron output in male mice. eLife. 10, e68205(2021).
  31. Dulka, E. A., Defazio, R. A., Moenter, S. M. Chemogenetic suppression of GnRH neurons during pubertal development can alter adult GnRH neuron firing rate and reproductive parameters in female mice. eNeuro. 7 (3), 0223(2020).
  32. Talbi, R., et al. Characterization of the Action of Tachykinin Signaling on Pulsatile LH Secretion in Male Mice. Endocrinology. 162 (8), 1-9 (2021).
  33. Tuli, J., Smith, J., Morton, D. Corticosterone, adrenal and spleen weight in mice after tail bleeding, and its effect on nearby animals. Laboratory Animals. 29 (1), 90-95 (1995).
  34. Lucien, J. N., Ortega, M. T., Shaw, N. D. Sleep and puberty. Current Opinion in Endocrine and Metabolic Research. 17, 1-7 (2021).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Technologia DREADDchirurgia stereotaktycznawirusy towarzysz ce adenowirusomkaniulacja t tnicy szyjnejkaniulacja y y szyjnejwstrzykiwanie N tlenku klozapinykontrola neuroendokrynna

Powiązane artykuły