Tutaj opisana jest metoda karmienia Drosophila melanogaster lekami i ekstraktami roślinnymi oraz oceny ich wpływu na przewód pokarmowy poprzez analizę złogów kałowych muszek. Muchy leczone lekami mogą być wykorzystane jako model do dalszych badań.
Artykuł metodologiczny
Ocena wpływu leków przeciwbiegunkowych i ekstraktów roślinnych na Drosophila melanogaster
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Aby badać fizjologię przewodu pokarmowego człowieka, naukowcy zajmujący się biomedycyną wykorzystali organizmy modelowe. Chociaż wielu badaczy używało myszy jako modelu do badania funkcji jelit, tylko kilka doniesień skupiło się na Drosophila melanogaster (D. melanogaster). W porównaniu z myszami, muszki owocowe mają wiele zalet, takich jak krótki cykl życia, opłacalna i prosta konserwacja oraz brak problemów etycznych. Co więcej, fizjologia przewodu pokarmowego, anatomia i szlaki sygnałowe ssaków są wysoce konserwatywne u D. melanogaster. Ekstrakty roślinne są tradycyjnie stosowane w leczeniu biegunki i zaparć. Na przykład Psidium guajava (P. guajava) jest jednym z najbardziej znanych środków przeciwbiegunkowych w tropikach. Jednak żadne badania nie oceniały wpływu leków przeciwbiegunkowych i przeczyszczających oraz ekstraktów roślinnych na D. melanogaster i nie wiadomo, czy podobne efekty (np. mniejsze, bardziej skoncentrowane i mniej obfite złogi kału w przypadku leków przeciwbiegunkowych) mogą wystąpić u muszek owocowych w porównaniu ze ssakami. W tym badaniu wykazano działanie przeciwbiegunkowe wywołane przez P. guajava w szczepie D. melanogaster, który ma fenotyp biegunkowy. Pobieranie próbek kału wytwarzanych przez muchy jest monitorowane przy użyciu pokarmu uzupełnionego barwnikiem. Protokół ten przedstawia metodę stosowaną do przygotowywania żywności z lekami, oceny złogów kałowych much karmionych tymi preparatami spożywczymi oraz interpretacji uzyskanych danych.
Wprowadzenie
Przewód pokarmowy (GI), zwany również przewodem trawiennym, jest odpowiedzialny za trawienie i wchłanianie składników odżywczych oraz wydalanie niestrawionych produktów1. Przewód pokarmowy jest podatny na szereg zaburzeń, które mogą powodować dyskomfort, ból i zakłócenia w codziennym życiu. Zaburzenia żołądkowo-jelitowe obejmują ból brzucha i dyskomfort, wzdęcia, zgagę, niestrawność lub niestrawność, nudności, wymioty, biegunkę i zaparcia2. Biegunka jest najczęstszym objawem choroby przewodu pokarmowego3 i jest definiowana jako choroba, w której w ciągu 24 godzin występują co najmniej trzy luźne i wodniste stolce4. Biegunka jest wywoływana przez szeroką gamę patogenów, w tym bakterie, wirusy, pasożyty, grzyby, a także może być wywoływana przez leki5,6. Na całym świecie biegunka nadal jest drugą najczęstszą przyczyną śmiertelności wśród dzieci poniżej 5 roku życia7. Chociaż biegunka może ustąpić sama, może również wskazywać na poważniejszy stan podstawowy, jeśli trwa dłużej niż kilka dni.
Aby zbadać przewód pokarmowy, badacze korzystają z modeli zwierzęcych, takich jak myszy, szczury i świnie8,9. Jednak wykorzystanie tych zwierząt może być kosztowne i czasochłonne, ponieważ wymaga specjalistycznego wyposażenia i względów etycznych. Ostatnie badania wykazały, że D. melanogaster może być używany jako model do badania przewodu pokarmowego i badania niektórych mechanizmów, takich jak utrzymanie homeostazy regeneracyjnej, rozwój starzenia się immunologicznego, utrata funkcji bariery nabłonkowej i spadek homeostazy metabolicznej10,11. D. melanogaster, znany jako muszka owocowa, ma wysoki stopień homologii genetycznej z ludźmi; Uważa się, że około 75% genów chorób u ludzi ma funkcjonalny homolog w Fly12. Mają również prosty układ trawienny składający się z jelita przedniego, jelita środkowego i jelita tylnego13. D. melanogaster jest łatwy do hodowli w laboratorium i może być genetycznie modyfikowany na różne sposoby14. Dlatego wykorzystanie D. melanogaster do badań in vivo jest potężnym narzędziem, które pozwala naukowcom badać złożone procesy biologiczne w kontrolowanych warunkach.
Według Światowej Organizacji Zdrowia (WHO), około 80% osób mieszkających w krajach rozwijających się korzysta z tradycyjnej medycyny w celu zaspokajania swoich podstawowych potrzeb zdrowotnych15. Wysokie wykorzystanie roślin leczniczych można wytłumaczyć faktem, że są one łatwo dostępne, niedrogie i mają niewiele skutków ubocznych16. Główne części roślin używane w ziołolecznictwie to liście, kora, korzenie, nasiona17, podczas gdy główne metody przygotowania to napar, wywar i maceracja18. Te ziołowe środki zawierają substancje fitochemiczne, takie jak alkaloidy, terpenoidy, flawonoidy, sterydy, garbniki i węglowodany19, które mają działanie terapeutyczne na organizm ludzki. Ludzie używają różnych roślin leczniczych do leczenia zaburzeń żołądkowo-jelitowych, takich jak biegunka, ból brzucha i czerwonka20. Na przykład Psidium guajava jest jedną z najczęściej stosowanych roślin w leczeniu biegunki na świecie. Różne testy farmakologiczne i kliniczne wykazały już jego bezpieczeństwo, co czyni go dobrym kandydatem na lek przeciwbiegunkowy do badań21,22. Jednak głównymi ograniczeniami leków ziołowych jest brak oceny skuteczności i bezpieczeństwa, a także brak konkretnych i kompletnych informacji na temat składu stosowanych ekstraktów roślinnych23. W celu walidacji skuteczności i bezpieczeństwa leków ziołowych wymagane jest systematyczne podejście obejmujące walidację doświadczalną i kliniczną, a podejście to powinno być poparte wystarczającą ilością danych z badań in vivo i in vitro.
Aby ocenić skuteczność tradycyjnych środków leczniczych w leczeniu biegunki, w ostatnich dziesięcioleciach dominowało wykorzystanie myszy i szczurów24,25. Ze względu na główne zalety wymienione wcześniej, tj. łatwość użycia, przystępność cenową, powtarzalność, zachowane funkcje absorpcyjne i trawienne między muchami a ssakami, proponujemy wykorzystanie D. melanogaster jako modelu do oceny aktywności przeciwbiegunkowej roślin. Fenotyp biegunki u D. melanogaster może charakteryzować się kilkoma cechami, w tym zwiększoną obfitością złogów kałowych, większymi rozmiarami osadów, jaśniejszym zabarwieniem (mniej skoncentrowanym) i wyższym materiałem kałowym26. Fenotyp ten można określić ilościowo za pomocą różnych parametrów: liczby złogów kału, całkowitej powierzchni osadów, średniej jasności i całkowitej zintegrowanej gęstości optycznej (IOD). Całkowity IOD definiuje się jako całkowitą zawartość barwnika w złożu, co oznacza całkowity wydalany materiał kałowy27. Wcześniej opracowano test do analizy depozytów kałowych D. melanogaster27,28. W tym teście ostateczny czytnik obornika (T.U.R.D.) został wykorzystany jako narzędzie do analizy kału, które pozwala sprawdzić liczbę, wielkość i lekkość złogów kałowych, a tym samym monitorować fizjologię jelit muszek owocowych. Jednak metoda ta nigdy nie została zastosowana do oceny fenotypu biegunki u muszek. Gen peptydu transportu jonów (ITP) jest ważnym endokrynologicznym regulatorem pragnienia i wydalania oraz łączy homeostazę wody z żerowaniem w D. melanogaster. W niedawnym badaniu wykazano, że szybkość transportu pokarmu w przewodzie pokarmowym i częstotliwość wypróżnień były zmniejszone przez nadmierną ekspresję ITP i zwiększone przez knockdown ITP. Ten ostatni fenotyp został opisany jako biegunkowy przez autorów tego badania29.
W tym protokole, zmodyfikowana wersja testu depozytów kałowych jest wykorzystywana do oceny wpływu środka przeciwbiegunkowego (np. ekstraktu z liści guawy) na przewód pokarmowy D. melanogaster przy użyciu szczepu ITPi jako modelu biegunkowego. Ogólnym celem tej metody jest: 1) zapewnienie łatwej i wiarygodnej metody oceny działania przeciwbiegunkowego leków i ekstraktów roślinnych oraz 2) umożliwienie odkrycia związków bioaktywnych odpowiedzialnych za działanie przeciwbiegunkowe w ekstraktach roślinnych poprzez zastosowanie podejścia opartego na bioaktywności.
Protokół
1. Przygotowanie ekstraktu roślinnego
- Zebrać liście Psidium guajava L.30 z dorosłego drzewa i przetworzyć je w następujący sposób: suszyć liście w suszarce w temperaturze 40 °C przez 6 dni, następnie suszyć na powietrzu przez 6 dni, ponownie suszyć w suszarce w temperaturze 40 °C przez 4 dni, a na koniec przygotować proszek z liści, mieląc wysuszone liście w młynku do mielenia lub młynku do kawy.
- Macerować 100 g wysuszonego proszku w 1 L 96% etanolu przez 24 h, przy ciągłym mieszaniu za pomocą wytrząsarki. Poddać pozostałości roślinne temu samemu procesowi jeszcze raz, a otrzymane filtraty odparować do suchości za pomocą rotacyjnego odparowacza próżniowego pod obniżonym ciśnieniem (175 mbar) w temperaturze 40 °C.
- Rozpuścić ekstrakt roślinny w etanolu, aby uzyskać pożądane stężenie. Ustalić optymalne stężenie (stosując opisany tutaj protokół) poprzez przetestowanie serii stężeń.
- W przypadku ekstraktów roślinnych przetestować zakres stężeń: 100 µg/mL, 1 mg/mL, 10 mg/mL, 100 mg/mL i wybrać te, które nie wpływają na przeżywalność much. W przypadku czystych związków przetestować następujący zakres stężeń: 0,05, 0,5, 5 i 50 mM12.
2. Przygotowanie pożywki
- Odmierz 100 mL wody destylowanej i wlej do zlewki zawierającej 4 g cukru oraz 0,8 g agaru (patrz Tabela materiałów). Podgrzewaj do 100 °C (podczas mieszania) i utrzymuj tę temperaturę przez 10 min.
- Obniż temperaturę do 80 °C, a następnie, mieszając, dodaj 7,4 g mąki i 2,8 g drożdży. Podgrzewaj przez co najmniej 20 min, cały czas mieszając i kontrolując temperaturę, która powinna wynosić około 80 °C.
- Dodaj roztwór moldexu i kwasu propionowego (wymieszaj dokładnie 1 mL moldexu i 0,3 g kwasu propionowego). Poczekaj, aż temperatura spadnie do około 50 °C, a następnie dodaj roztwór ekstraktu roślinnego (1 mg/mL) oraz 0,5 g proszku błękitu bromofenolowego.
UWAGA: Szczegółowe informacje na temat pozostałych stężeń podlegających badaniu znajdują się w sekcji 1.3.1. - Wlej pożywkę do szalek Petriego i przestań nalewać, gdy szalka będzie pełna (Rycina 1A). Pozostaw szalki Petriego do ostygnięcia w temperaturze pokojowej (około 3 h), następnie zamknij pokrywki i przechowuj w lodówce w temperaturze 4 °C.
UWAGA: Szalki Petriego należy przechowywać w lodówce nie dłużej niż 2 tygodnie, aby uniknąć odparowania wody.
Rycina 1: Przedstawienie przebiegu procesu eksperymentalnego dla testu osadów fekalnych. (A) Zdjęcie pokazujące szalki Petri wypełnione pożywką. Należy upewnić się, że w szalce Petri znajduje się wystarczająca ilość pożywki, aby żadne luki nie uwięziły much i nie uniemożliwiły im poruszania się. Jednocześnie nie należy przepełniać szalki Petri pożywką, aby powierzchnia mogła zostać pokryta równomiernie. (B) Zdjęcie szpatułki opisanej w protokole. (C) Zdjęcie testu osadów fekalnych opisanego w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
3. Przygotowanie much
- Przygotować butle z CO2, pistolet do CO2 z igłami, podkładkę do muszek, pędzelek oraz mikroskop. Stacja do obsługi muszek dostarcza CO2 zarówno do podkładki, jak i do pistoletu. Podkładka służy do sortowania muszek, natomiast pistolet do CO2 jest wykorzystywany do znieczulania muszek w probówkach, butelkach i szalkach Petriego.
- Ujednolicić wiek muszek, wybierając probówki zawierające pocidła (co najmniej 10), a następnie usunąć dorosłe muchy z probówki zgodnie z poniższą metodą. Po kolei odwrócić probówki do góry dnem i wsunąć igłę pomiędzy bawełniany korek a ściankę probówki. Znieczulić dorosłe muchy pistoletem do CO2, aż wszystkie zaśnie na bawełnianym korku (znieczulenie zajmuje kilka sekund, a jego działanie utrzymuje się przez kilka sekund po puszczeniu spustu pistoletu). Otworzyć probówkę nad szklaną butelką zawierającą 70% etanolu i wrzucić do niej muchy. Zamknąć probówkę bawełnianym korkiem i przechowywać w inkubatorze w temperaturze 25 °C przy wilgotności 60%. Ustawić cykl świetlny inkubatora na 12 h światła/12 h ciemności.
- Po inkubacji (maksymalnie 8 h), posortować je na dziewicze samice i samce pod mikroskopem i na podkładce, kładąc je na grzbiecie i badając narządy kopulacyjne.
- Narządy kopulacyjne samic są blade w porównaniu do narządów samców, które mają czerwonawy kolor. Samce można również rozpoznać po obecności ciemnych szczecinek, zwanych grzebieniami płciowymi, na pierwszej parze nóg. Rozdzielić muchy do dwóch nowych probówek (jednej dla samców i jednej dla samic) i inkubować przez 6-8 dni w temperaturze 25 °C.
UWAGA: W temperaturze 25 °C samice pozostają dziewicze przez około 8 h po wykluciu.
- Narządy kopulacyjne samic są blade w porównaniu do narządów samców, które mają czerwonawy kolor. Samce można również rozpoznać po obecności ciemnych szczecinek, zwanych grzebieniami płciowymi, na pierwszej parze nóg. Rozdzielić muchy do dwóch nowych probówek (jednej dla samców i jednej dla samic) i inkubować przez 6-8 dni w temperaturze 25 °C.
4. Test osadów kałowych
- Oznacz szalki Petri odpowiednim szczepem, płcią i lekiem, aby uniknąć pomylenia szalek. Ułóż szalki Petri jedna na drugiej.
- Pobierz szalki Petri zawierające zabarwioną pożywkę i odwróć je na papierze filtracyjnym, aby wchłonął nadmiar cieczy. Za pomocą szpatułki (Rysunek 1B) podziel pożywkę na 12 równych części, a następnie użyj szpatułki, aby przełożyć jeden plasterek do pustej szalki Petri.
UWAGA: W zależności od liczby powtórzeń, liczbę wycinanych plasterków można zwiększyć do 20 na szalkę Petri. Każdy plasterek powinien mieć taką samą wielkość. - Znieczul muchy CO2, aż wszystkie zasną na watowanym czopie. Przenieś sześć zdrowych much do każdej szalki Petri (Rysunek 1C), natychmiast zamknij pokrywkę, a następnie umieść je w inkubatorze (25°C, 60% wilgotności, 12 h światła/ 12 h ciemności).
- Aby upewnić się, że muchy nie uciekną z szalki Petri podczas eksperymentu, zabezpiecz górną i dolną pokrywę szalki taśmą. Dla każdej grupy badawczej przygotuj co najmniej sześć powtórnych szalek Petri.
- Po 24 h hodowli much znieczul je za pomocą CO2, przenieś do pojemnika z 70% etanolem i usuń pozostałości pożywki.
- Zachowaj szalki Petri i przejdź do kroku 5.
5. Ilościowe oznaczenie szalek Petriego
- Utwórz folder na komputerze i zmień jego nazwę, podając nazwę szczepu użytego w eksperymencie, płeć much oraz rodzaj zastosowanych leków. Wewnątrz tego folderu utwórz podfoldery o nazwach Original, Cut i Analysis.
- Zeskanuj szalki Petriego, używając skanera o wysokiej rozdzielczości z optyczną rozdzielczością 6400 pikseli na cal (ppi). Przykrywki górne i dolne każdej szalki Petriego skanuj osobno, umieszczając je pojedynczo na środku pola skanowania.
- Otwórz aplikację zainstalowaną na komputerze. Na ekranie komputera pojawi się okno powitalne z wszystkimi ustawieniami ogólnymi (Rysunek 2A).
UWAGA: Nie należy zmieniać ustawień zaawansowanych. Ten krok jest właściwy tylko dla użytkowników korzystających z tego samego skanera, który został zaproponowany w Tabela materiałówW przypadku korzystania z innego oprogramowania należy zapoznać się z wytycznymi.- Nazwij szalkę Petriego w aplikacji, podając numer sekwencyjny, górną lub dolną pokrywę, płeć oraz rodzaj zastosowanej pożywki. Wybierz podfolder original set z kroku 5.1.
- Podgląd szalki Petriego. Kliknij w Podgląd na dole okna należy odczekać kilka sekund, aż skaner wykona wstępne skanowanie, po czym na ekranie komputera pojawi się okno. Przesuń wyświetlany na ekranie kwadrat tak, aby objął szalkę Petriego.
- Kliknij w Skanowanie w prawym dolnym rogu okna na ekranie komputera skan jest automatycznie zapisywany jako obraz w wybranym folderze.
- Przytnij obraz za pomocą aplikacji (np. otwartoźródłowej aplikacji Fiji) w taki sposób, aby artefakty i pozostałości żywności nie zostały uznane za osady.
UWAGA: Poniższe kroki są prawidłowe wyłącznie dla użytkowników aplikacji Fiji. W przypadku korzystania z innego oprogramowania należy zapoznać się z wytycznymi.- Uruchom aplikację Fiji i odczekaj kilka sekund, aż na ekranie pojawi się pasek narzędzi.
- Przeciągnij obraz do przycięcia na pasek narzędzi. Wybierz trzecią ikonę. Zaznaczenia wielokątne na pasku narzędzi przytnij niepotrzebną część zdjęcia (kolorowy wykres kołowy), klikając na ekranie, aby zaznaczyć obszar wokół wykresu kołowego (Rycina 2B-1,2).
UWAGA: Podczas wyznaczania obszaru przycinania na obrazie niezbędne jest, aby wybrane klatki były połączone ze sobą w sposób ciągły. - Kliknij w Edytuj w lewym górnym rogu paska, a następnie na Wypełnij/Wyczyść na zewnątrz (Rysunek 2B-3).
- Aby zapisać zdjęcie, kliknij w Plik w górnym lewym rogu paska, a następnie na Zapisz jakoi na koniec na TiffWybierz podfolder Odetnij ustawione w kroku 5.1.
UWAGA: Podczas zapisywania przyciętego obrazu należy upewnić się, że nie zostały użyte znaki specjalne (np. !, &, $, #, _,-,…) lub w nazwie pliku znajduje się zbyt wiele znaków.
Rysunek 2: Kluczowe etapy procesu analizy danych z testu osadów fekalnych. (A) Zrzut ekranu przedstawiający informacje o ustawieniach aplikacji do skanowania. (B) Obrazy przycięte za pomocą aplikacji Fiji. Należy upewnić się, że artefakty i resztki pokarmu nie zostaną uznane za osady. (C) Zrzut ekranu przedstawiający wygląd aplikacji Excel_merge-v4 po jej otwarciu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.
6. Identyfikacja odkładów kałowych przy użyciu otwartoźródłowego oprogramowania Ultimate Reader of Dung
UWAGA: Wprowadzenie i instrukcje użytkowania oprogramowania ultimate reader of dung znajdują się w Pliku Uzupełniającym 1.
- Najpierw otwórz oprogramowanie T.U.R.D. (Supplementary Figure 1). Utwórz nowy eksperyment i nadaj nazwę dokumentowi, a następnie zapisz go w podfolderze Analysis ustanowionym w kroku 5.1.
- Kliknij Plates , a następnie Add plate. Wybierz szalkę Petri do przetworzenia. Pojawi się nowe okno z nazwami wybranych szalek i nowymi parametrami. Ustaw wielkość bloku (block size), przesunięcie (offset), minimalny rozmiar (min size) oraz maksymalny rozmiar (max size) (Supplementary Figure 2).
- Aby zweryfikować, czy wykryte odchody są prawidłowe, kliknij Plates, następnie Inspect Selected Plates, potem Graphics i View annotated images (Supplementary Figure 3). Powiększ obraz i sprawdź zliczenia. Jeśli znajduje się tam tylko kilka osadów, które nie powinny być uwzględnione w analizie, odznacz odchody do wykluczenia (Supplementary Figure 4).
- W przypadku każdego nowego obrazu do przetworzenia powtórz czynności od kroku 6.3.
- Po przeanalizowaniu szalek za pomocą oprogramowania T.U.R.D. zmień liczbę much, klikając No. Flies (Supplementary Figure 5).
- Zmień nazwę grupy, klikając Plates > Edit groups > Add, a następnie w kolumnie Group wybierz nazwę grupy.
- Wyeksportuj dane z różnych powtórzeń osobno, klikając Analyze > Descriptive Statistics > Select Group (Supplementary Figure 6). Przechowuj wszystkie pliki arkuszy kalkulacyjnych (.csv) w tym samym folderze.
- Aby zebrać wszystkie pliki (uzyskane w kroku 6.7) w jednym arkuszu, otwórz aplikację Excel_merge-v4 (Supplementary Coding File 1), poczekaj, aż pojawi się komunikat Select the path of the folder (with .csv files):, a następnie wklej adres powyższego folderu. Na przykład ścieżka może brzmieć C:\Experiment\Fecal deposit test\, a następnie naciśnij dwukrotnie klawisz Enter na klawiaturze (Figure 2C). Po tym czasie w tym samym folderze zostanie utworzony nowy plik arkusza kalkulacyjnego. Nowy plik zawiera wszystkie wyeksportowane pliki w osobnych arkuszach.
- W poprzednim pliku arkusza dodaj kolejny arkusz, aby zebrać średnią każdego parametru dla wszystkich powtórzeń (do przetworzenia danych użyj funkcji VLOOKUP). Przykład podano w Supplementary Table 1.
- Przeanalizuj wartość p.
Wyniki
Przedstawione tutaj badanie wykazuje, że pomiar biegunki u D. melanogaster można przeprowadzić za pomocą testu złogów fekalnych. Istotne różnice między fenotypami (biegunkowym lub niebiegunkowym) można określić poprzez analizę różnych parametrów, w tym liczby złogów fekalnych, całkowitej powierzchni złogów, średniej powierzchni złogów, średniej jasności oraz całkowitej zintegrowanej gęstości optycznej (IOD), która jest miarą całkowitej ilości barwnika obecnego w złogu i reprezentuje całkowitą zawartość wydalonego materiału fekalnego27.
Wyciszenie genu ITP u muszek może wywołać fenotyp biegunkowy, charakteryzujący się zwiększoną częstotliwością defekacji, co czyni je odpowiednim modelem do badania biegunki29. W ramach niniejszego eksperymentu wykorzystano linię ITPi (w1118; daughterless-GeneSwitch, UAS-ITPi /(CyO)), którą hodowano na standardowej pożywce. Ekstrakt z liści Psidium guajava wybrano jako interwencję przeciwbiegunkową, biorąc pod uwagę powszechne wykorzystanie tej rośliny w regionach tropikalnych do leczenia biegunki. Krofelemer, środek przeciwbiegunkowy, został zatwierdzony przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) w celu zapewnienia łagodzenia objawów biegunki nieinfekcyjnej u dorosłych pacjentów z HIV/AIDS poddawanych terapii antyretrowirusowej31. Krofelemer jest ekstraktem z lateksu kory pnia Croton lechleri Müll.Arg.32. Loperamid jest syntetycznym lekiem stosowanym na całym świecie w leczeniu biegunki33. Zarówno krofelemer, jak i loperamid zostały wykorzystane jako potencjalne kontrole pozytywne.
Postawiono hipotezę, że podawanie muszkom ekstraktu z P. guajava, crofelemeru oraz loperamidu zredukuje fenotyp biegunkowy w porównaniu z grupą karmioną zwykłą pożywką. Aby zweryfikować tę hipotezę, przeprowadzono pomiar złogów fekalnych u D. melanogaster, porównując kilka parametrów między muszkami karmionymi zwykłą pożywką a tymi, którym podawano ekstrakt z P. guajava (1 g/100 mL), crofelemer (1 g/100 mL) oraz loperamid (10 mM). Do przygotowania eksperymentu wykorzystano 6-7-dniowe dziewicze samice lub samce. Każda szalka Petri zawierała sześć muszek i wykonano sześć powtórzeń. Muszki hodowano przez 24 h, a następnie przeanalizowano każdą grupę. Do porównania istotnych różnic między grupami testowymi zastosowano test t studenta. Wyniki wykazują, że liczba złogów fekalnych (Rysunek 3A), całkowita powierzchnia złogów (Rysunek 3B) oraz całkowite IOD (Rysunek 3C) wykazały istotnie wyższe wartości w grupie z zwykłą pożywką w porównaniu z grupą z ekstraktem z P. guajava (1 g/100 mL), zarówno u dziewiczych samic, jak i samców. Niestety, loperamid nie wykazał żadnego efektu u obu płci (choć wcześniej wykazano, że działa on jako środek rozkurczowy u D. melanogaster)34, natomiast crofelemer wywarł wpływ wyłącznie na samice.
Rycina 3: Analiza szczepu ITPi. Szczep ITPi analizowano w czterech warunkach: przy żywieniu standardową pożywką, pożywką uzupełnioną o 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava, 1 g/100 mL Crofelemeru oraz 10 mM Loperamidu. Dane przedstawiono jako średnia ± SD dla każdego warunku u samic i samców (dla sześciu powtórzeń z dwóch stron szalki Petriego). Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta porównującego dwie grupy. Wartości p przedstawiono następująco: *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001, ****: p < 0,0001. (A) Porównano liczbę odkładów kałowych szczepu ITPi u much karmionych pożywką uzupełnioną o 1 g/100 mL Crofelemeru, 10 mM Loperamidu, 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava oraz u much karmionych standardową pożywką. Dodatkowo przeanalizowano różnicę w liczbie odkładów kałowych między dziewiczymi samicami a samcami. W obu grupach liczba odkładów kałowych była istotnie wyższa u much karmionych standardową pożywką niż u tych karmionych 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava. (B) Porównano całkowitą powierzchnię odkładów kałowych szczepu ITPi u much karmionych standardową pożywką oraz u much karmionych pożywką uzupełnioną o 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava, 1 g/100 mL Crofelemeru i 10 mM Loperamidu. U samców i samic całkowita powierzchnia odkładów kałowych była istotnie wyższa u much karmionych standardową pożywką niż u tych karmionych 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava. (C) Przeanalizowano różnicę w całkowitej gęstości optycznej zintegrowanej (IOD) szczepu ITPi między muchami karmionymi standardową pożywką a muchami karmionymi pożywką uzupełnioną o 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava, 1 g/100 mL Crofelemeru i 10 mM Loperamidu. U samców i samic całkowita IOD była istotnie wyższa u much karmionych standardową pożywką niż u tych karmionych 1 g/100 mL ekstraktu z P. guajava. Skróty: F = samica; M = samiec; Crofe = Crofelemer; Lope = Loperamid; Nor food = pożywka standardowa; P. gua ext = ekstrakt z Psidium guajava. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Aby wykazać, że zmniejszone wydalanie zaobserwowane w grupie otrzymującej ekstrakt z P. guajava wynika z hamującego działania ekstraktu, a nie ze zmniejszonego spożycia pokarmu, zastosowano metodę bezpośredniej oceny i śledzenia spożycia pokarmu stałego (DIETS)35. Wyniki wykazały brak istotnych różnic w spożyciu pokarmu pomiędzy grupami otrzymującymi lek a grupami kontrolnymi, z wyjątkiem loperamidu u samców, który spowodował mniejsze spożycie pokarmu przez muchy niż w warunkach normalnych (Rycina 4).
Rysunek 4: Test żerowania. Test żerowania służył do pomiaru spożycia pokarmu stałego przez muchy. Muchy karmiono czterema różnymi pożywkami: ekstraktem z P. guajava (1 g/100 mL), Crofelemerem (1 g/100 mL), Loperamidem (10 mM) oraz standardową pożywką. Każda grupa składała się z 20 much w pięciu powtórzeniach. Dane przedstawiono jako średnia ± SD dla każdego stanu u samic i samców. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu t Studenta dla porównania dwóch grup. Wartości p przedstawiono w następujący sposób: *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001, ****: p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Osady fekalne oraz wyniki testu żywieniowego wykazały, że ekstrakt z P. guajava jest niezawodną rośliną leczniczą w terapii biegunki u muszek owocówek.
Rycina uzupełniająca 1: Okno otwarcia T.U.R.D. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający 2: Okno programu T.UR.D. z ustawieniami do dostosowania. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający 3: Okno T.U.R.D. z adnotacjami na obrazie. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rysunek uzupełniający 4: Okno T.U.R.D. prezentujące każdy wykryty punkt z wcześniej przetworzonego obrazu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca 5: Okno T.U.R.D. prezentujące każdy przetworzony obraz. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Rycina uzupełniająca 6: Okno programu T.U.R.D. przedstawiające proces eksportu danych dla każdej grupy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Plik uzupełniający 1: Krótki przewodnik po oprogramowaniu T.U.R.D. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Tabela uzupełniająca 1: Przykład końcowych arkuszy kalkulacyjnych gotowych do analizy. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.
Uzupełniający plik z kodem 1: Aplikacja do łączenia arkuszy kalkulacyjnych. Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.
Dyskusja
D. melanogaster został powszechnie zaakceptowany jako model dla różnych procesów biologicznych ze względu na podobieństwo genów między D. melanogaster a ludźmi36. Wykorzystanie D. melanogaster jako modelu do badania przewodu pokarmowego jest powszechne, a zastosowanie T.U.R.D. zostało wykorzystane do oszacowania liczby, obszaru i ilości złogów kałowych. Jednak metoda wykrywania fenotypowego nie została wykorzystana do oceny biegunki u muszek owocowych. Dlatego protokół ten wprowadza nową metodę do przybliżonej oceny obecności biegunki poprzez wykrywanie złogów kału.
Złogi kału są podstawowym wskaźnikiem funkcjonowania i zdrowia przewodu pokarmowego37. W tym kontekście zaproponowano metodę hodowli D. melanogaster na pożywce zawierającej lek w celu zbadania różnych parametrów złogów kałowych. Monitorując liczbę złogów, można określić częstotliwość wypróżniania i ocenić, czy lek ma jakikolwiek wpływ na pasaż jelitowy. Całkowitą powierzchnię złogów można zmierzyć w celu oceny stężenia i rozcieńczenia kału, co jest ważnym czynnikiem określającym ogólny stan zdrowia przewodu pokarmowego. Ponadto całkowita zintegrowana gęstość optyczna (IOD) może być wykorzystana do wykrycia całkowitej ilości materiału kałowego obecnego w osadach. Protokół ten zapewnia skuteczną metodę badania przesiewowego i oceny leków, a także ekstraktów roślinnych, które wpływają na przewód pokarmowy. Gdy D. melanogaster jest używany jako organizm modelowy, możliwa jest ocena skuteczności potencjalnych leków, co może pomóc w przyspieszeniu procesu odkrywania leków. Stosując tę metodę do ekstraktów roślinnych, naukowcy mogą pomóc w walidacji ich stosowania jako środków przeciwbiegunkowych.
Istnieje kilka krytycznych kroków, które należy wziąć pod uwagę podczas korzystania z tego protokołu do badania złogów kałowych u D. melanogaster. Po pierwsze, konieczne jest obliczenie masy wymaganej do osiągnięcia pożądanego stężenia leku w pożywce. Ponadto ważne jest, aby zapewnić dobre warunki przygotowania podczas dodawania leku do podłoża, ponieważ wysokie temperatury mogą degradować lek i wpływać na jego siłę działania. Po drugie, selekcja samic much jest ważna w tym protokole. Ważne jest, aby używać dziewiczych samic much, aby uniknąć różnic w wydalaniu kału między dziewiczymi a pokrytymi samicami. Na przykład plamy wytwarzane przez dziewicze samice są bardziej okrągłe niż kryte samice, a kryte samice mają tendencję do wydalania większej ilości kału niż dziewicze samice 27,28. Dlatego zaleca się zbieranie much przed upływem 8 godzin, aby upewnić się, że wszystkie zebrane samice są dziewicami. Dodatkowo badane muchy powinny być silne i zdrowe, ponieważ ich zdrowie może wpływać na pobieranie pokarmu i wydalanie kału. Na przykład muchy o nietypowym kształcie skrzydeł mogą mieć trudności ze zdobyciem pożywienia. Wreszcie, aby z powodzeniem korzystać z T.U.R.D., kluczowe znaczenie ma rozmiar bloku (piksele) i ustawienia przesunięcia. Ze względu na różnicę w kontraście światła obrazów, może być konieczne wypróbowanie różnych ustawień, aby uzyskać najlepszą możliwą identyfikację złogów kału.
Chociaż przedstawiona metoda jest skuteczna, istnieje kilka ograniczeń. Jednym z nich jest dokładność stężenia leku w pożywce. Ponieważ podłoże jest podgrzewane podczas przygotowywania, część wody może odparować, co może wpłynąć na stężenie leku. Kolejnym ograniczeniem jest skanowanie szalek Petriego. Niektóre części szalek Petriego (tj. krawędzie) nie są skanowane, co może spowodować błędne obliczenie całkowitych złogów kału. Ponadto muchy nie wytwarzają takiej samej ilości osadów kałowych na górnej i dolnej pokrywie szalek Petriego. Ponieważ mają one tendencję do tworzenia większej ilości osadów na dolnej pokrywie, odchylenie standardowe analizy między górną a dolną pokrywą może być wysokie, co może mieć wpływ na dokładność wyników.
Korzystając z tego protokołu, naukowcy mogą badać biegunkę u D. melanogaster. Modyfikując pożywkę zawierającą lek, metoda ta może być stosowana do badań przesiewowych roślin przeciwbiegunkowych, co zapewnia nowatorskie podejście do odkrywania leków. Tradycyjna medycyna i produkty naturalne są stosowane od wieków w leczeniu różnych chorób, w tym zaburzeń żołądkowo-jelitowych. Wykorzystując ten protokół do oceny skuteczności ekstraktów roślinnych w przypadku złogów kałowych, można zidentyfikować potencjalne nowe metody leczenia zaburzeń przewodu pokarmowego i przedstawić naukowe uzasadnienie ich stosowania jako środków przeciwbiegunkowych. Takie podejście może stanowić cenny wkład w dziedzinę odkrywania leków i etnofarmakologii.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Dziękujemy dr Martinie Gálikovej za dostarczenie nam szczepów Drosophila. Jesteśmy wdzięczni zespołowi Michelle Crozatier-Borde i Marca Haenlina za przekazanie informacji zwrotnych na temat naszego badania i pomoc w ulepszaniu naszego modelu. Chcielibyśmy podziękować firmie Napo Pharmaceuticals Company za dostarczenie nam leku Crofelemer. Autorzy są również wdzięczni redaktorowi gościnnemu, dr Hugues'owi Petitjeanowi, za umożliwienie nam opublikowania tego protokołu. Badanie zostało sfinansowane przez Agence Nationale de la Recherche (ANR) w ramach projektu ANR-22-CE03-0001-01.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| chemiczny i Podłoże spożywcze | |||
| Agar | Sigma Aldrich | A7002 | Wiadro 5 kg |
| Bromofenol niebieski | Sigma Aldrich | 34725-61-6 | B5525-25G |
| Mąka kukurydziana | Nature et Cie | *910007 | Worek 25 kg |
| Crofelemer | Napo pharmaceuticals | - | - |
| Etanol 96% | - | - | - |
| Loperamid | Sigma Aldrich | L4762 | 5 gramów |
| Moldex | VWR | 1.06757.5000 | 5 kg worek |
| Kwas propionowy | Dutscher | 409553-CER | 1 litrowa butelka |
| Cukier | Pomona EpiSaveurs | 52705 | Worek 1 kg |
| Drożdże | Dutscher | 789195 | 10 kg worek |
| Materiały | |||
| Zlewka | DWK LIFE SCIENCE-250 | mL | |
| Probówka wirówkowa | Eppendorf | 30119401 | Probówki Eppendorfa Zbiornik 5,0 ml |
| CO2< / sub> | - | -- | |
| Kolba Erlena Meyera | - | 500 ml (do ekstrakcji) | |
| Bibuła filtracyjna | klasy Whatman-3 | mm chr. | |
| Cokół Flowbuddy | Genesis | - | - |
| Flugs Wąskie plastikowe fiolki | Genesis | 49-102-Flystuff | |
| Pistolet do przedmuchiwania | Genesis | - | |
| -Flystuff Ultimate Flypad | Genesis | - | - |
| Pedał nożny Flystuff | Genesis | - | - |
| Kleszcze | Dumostar | 11295-51 | - |
| Cylinder z podziałką | - | 100 ml | |
| szpatułka Inox | - | -- | |
| Mikropipeta | Eppendorf | 4924000088 | Eppendorf Referencje 2 |
| Końcówki do mikropipet | Eppendorf | 30000919 | epT.I.P.S. |
| Standardowe wąskie fiolki Drosophila | Genesis | 32-120-Pędzel | |
| - | -- | ||
| szalka Petriego | Greiner | 628162 | Rozmiar: 60 x 15 mm |
| Kolba okrągłodenna | - | 500 ml (do odparowania) | |
| Termometr | Avantor | 620-0916 | |
| Trzepaczka | - | - | - |
| Equipments | |||
| Chiller | HUBER | Minichiller-Łaźnia | |
| grzewcza | BÜ CHI | B-490-Płyta | |
| grzewcza | BIOBLOCK SCIENTIFIC-Mieszadło | magnetyczne z gorącą płytą | |
| Inkubator | |||
| Parownik obrotowy | BÜ Skaner CHI | R-200 | |
| Epson | V850 | pro-Shaker | |
| Edmund Bü hle | KS | 10-Lornetka | |
| stereoskopowa | Zeiss | Stemi 305-Pompa | |
| próżniowa | VACUUBRAND | serii PC500-Mieszalnik | |
| wirowy | Sigma Aldrich | CLS6776-1EA | Corning LSE mieszalniki wirowe |
| Waga | OHAUS Scout | SKX622 | - |
Bibliografia
- Cheng, L. K., et al. Gastrointestinal system. WIREs Sys Bio Med. 2 (1), 65-79 (2010).
- Greenwood-Van Meerveld, B., Johnson, A. C., Grundy, D. Gastrointestinal physiology and function. Handb Exp Pharmacol. 239, 1-16 (2017).
- Doyle, L. A., et al. A clinicopathologic study of 24 cases of systemic mastocytosis involving the gastrointestinal tract and assessment of mucosal mast cell density in irritable bowel syndrome and asymptomatic patients. Am J Surg Pathol. 38 (6), 832-843 (2014).
- Levine, G. A., Walson, J. L., Atlas, H. E., Lamberti, L. M., Pavlinac, P. B. Defining pediatric diarrhea in low-resource settings. J Pediatric Infect Dis Soc. 6 (3), 289-293 (2017).
- Abraham, B., Sellin, J. H. Drug-induced diarrhea. Curr Gastroenterol Rep. 9 (5), 365-372 (2007).
- Badry, A. H. H., Jameel, A. Y., Mero, W. M. S. Pathogenic microorganisms associated with arrhea in infants and children in Duhok Province, Kurdistan Region / Iraq. Sci J Uni Zakho. 2 (2), 266-275 (2014).
- Manetu, W. M., M'masi, S., Recha, C. W. Diarrhea disease among children under 5 years of age: A global systematic review. Open J Epidemiol. 11 (3), 207-221 (2021).
- Fu, J., et al. Aquatic animals promote antibiotic resistance gene dissemination in water via conjugation: Role of different regions within the zebra fish intestinal tract, and impact on fish intestinal microbiota. Mol Ecol. 26 (19), 5318-5333 (2017).
- Zhang, Q., Widmer, G., Tzipori, S. A pig model of the human gastrointestinal tract. Gut Microbes. 4 (3), 193-200 (2013).
- Cox, C. R., Gilmore, M. S. Native microbial colonization of Drosophila melanogaster and its use as a model of Enterococcus faecalis pathogenesis. Infect Immun. 75 (4), 1565-1576 (2007).
- Jasper, H. Exploring the physiology and pathology of aging in the intestine of Drosophila melanogaster. Invertebr Reprod Dev. 59, 51-58 (2015).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Miguel-Aliaga, I., Jasper, H., Lemaitre, B. Anatomy and physiology of the digestive tract of Drosophila melanogaster. Genetics. 210 (2), 357-396 (2018).
- Jennings, B. H. Drosophila- a versatile model in biology & medicine. Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).
- Kumar, V. S., Navaratnam, V. Neem (Azadirachta indica): Prehistory to contemporary medicinal uses to humankind. Asian Pac J Trop Biomed. 3 (7), 505-514 (2013).
- Shrestha, P., Adhikari, S., Lamichhane, B., Shrestha, B. G. Phytochemical screening of the medicinal plants of Nepal. J Environ Sci Tech Food Tech. 1 (6), 11-17 (2015).
- Perveen, S., Al-Taweel, A. Pharmacognosy: Medicinal Plants. IntechOpen. , (2019).
- Noumi, E., Yomi, A. Medicinal plants used for intestinal diseases in Mbalmayo Region, Central Province, Cameroon. Fitoterapia. 72 (3), 246-254 (2001).
- Njoku, V. O., Obi, C., Onyema, O. M. Phytochemical constituents of some selected medicinal plants. African J Biotechnol. 10 (66), (2011).
- Rokaya, M. B., et al. Traditional uses of medicinal plants in gastrointestinal disorders in. Nepal. J Ethnopharmacol. 158, 221-229 (2014).
- Birdi, T., Krishnan, G. G., Kataria, S., Gholkar, M., Daswani, P. A randomized open label efficacy clinical trial of oral guava leaf decoction in patients with acute infectious diarrhoea). J Ayurveda Integr Med. 11 (2), 163-172 (2020).
- van Vuuren, S. F., Nkwanyana, M. N., de Wet, H. Antimicrobial evaluation of plants used for the treatment of diarrhoea in a rural community in northern Maputaland, KwaZulu-Natal, South Africa. BMC Complement Altern Med. 15, 53(2015).
- Firenzuoli, F., Gori, L. Herbal medicine today: Clinical and research issues. Evid Based Complement Alternat Med. 4, 37-40 (2007).
- Rawat, P., Singh, P. K., Kumar, V. Evidence based traditional anti-diarrheal medicinal plants and their phytocompounds. Biomed Pharmacother. 96, 1453-1464 (2017).
- Palombo, E. A. Phytochemicals from traditional medicinal plants used in the treatment of diarrhoea: modes of action and effects on intestinal function. Phytother Res. 20 (9), 717-724 (2006).
- Koyama, T., et al. A nutrient-responsive hormonal circuit mediates an inter-tissue program regulating metabolic homeostasis in adult Drosophila. Nat Commun. 12 (1), 5178(2021).
- Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
- Cognigni, P., Bailey, A. P., Miguel-Aliaga, I. Enteric neurons and systemic signals couple nutritional and reproductive status with intestinal homeostasis. Cell Metab. 13 (1), 92-104 (2011).
- Gáliková, M., Dircksen, H., Nässel, D. R. The thirsty fly: Ion transport peptide (ITP) is a novel endocrine regulator of water homeostasis in Drosophila. PLoS Genet. 14 (8), 1007618(2018).
- Chassagne, F., Quave, C. L. Collection, extraction, and in vitro antibacterial evaluation of plants used in traditional medicine. Methods Mol Biol. 2296, 19-41 (2021).
- Patel, T. S., Crutchley, R. D., Tucker, A. M., Cottreau, J., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of chronic diarrhea in patients living with HIV/AIDS. HIVAIDS. 5, 153-162 (2013).
- Cottreau, J., Tucker, A., Crutchley, R., Garey, K. W. Crofelemer for the treatment of secretory diarrhea. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 6 (1), 17-23 (2012).
- Wu, P. E., Juurlink, D. N. Loperamide cardiac toxicity: Pathophysiology, presentation, and management. Can J Cardiol. 38 (9), 1378-1383 (2022).
- Benguettat, O., et al. The DH31/CGRP enteroendocrine peptide triggers intestinal contractions favoring the elimination of opportunistic bacteria. PLoS Pathog. 14 (9), 1007279(2018).
- Thakare, M. R., et al. Direct intake estimation and longitudinal tracking of solid-food consumption (DIETS) in Drosophila. bioRxiv. , 543033(2023).
- Miller, J., et al. Drosophila melanogaster as an emerging translational model of human nephrolithiasis. J Urol. 190 (5), 1648-1656 (2013).
- Zierer, J., et al. The fecal metabolome as a functional readout of the gut microbiome. Nat Genet. 50 (6), 790-795 (2018).
Przedruki i uprawnienia
