Artykuł metodologiczny

Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T

5.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65887

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 2Department of Microbiology & Immunology, Vagelos College of Physicians and Surgeons, Columbia University, 3Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, 4Data Science Institute, Columbia University

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych i transdukcję mysich limfocytów T, ułatwiając efektywne wytwarzanie mysich komórek CAR-T.

Streszczenie

Terapie komórkowe wykorzystujące chimeryczne receptory antygenowe (CAR)-T osiągnęły niezwykłą skuteczność u osób z nowotworami hematologicznymi i są obecnie opracowywane pod kątem leczenia różnych guzów litych. Do tej pory wstępna ocena nowych produktów komórkowych CAR-T odbywała się głównie w modelach guzów ksenoprzeszczepów z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności. Podejście to zostało wybrane w celu ułatwienia pomyślnego wszczepienia ludzkich komórek CAR-T w warunkach eksperymentalnych. Jednak syngeniczne modele myszy, w których nowotwory i komórki CAR-T pochodzą z tego samego szczepu myszy, umożliwiają ocenę nowych technologii CAR w kontekście funkcjonalnego układu odpornościowego i kompleksowego mikrośrodowiska guza (TME). Opisany tutaj protokół ma na celu usprawnienie procesu generowania mysich komórek CAR-T poprzez przedstawienie znormalizowanych metod transdukcji retrowirusowej i hodowli komórek T ex vivo. Metody opisane w niniejszym protokole mogą być stosowane do innych konstruktów CAR poza tymi wykorzystanymi w tym badaniu, aby umożliwić rutynową ocenę nowych technologii CAR w systemach kompetentnych immunologicznie.

Wprowadzenie

Adoptywne terapie limfocytami T wyrażające chimeryczne receptory antygenowe (CAR) zrewolucjonizowały dziedzinę immunoterapii nowotworów, wykorzystując moc adaptacyjnego układu odpornościowego do specyficznego celowania i eliminowania antygenowo-dodatnich komórek nowotworowych1. Chociaż skuteczność terapii komórkowych CAR-T ukierunkowanych na nowotwory złośliwe z komórek B została potwierdzona klinicznie, badania przedkliniczne przeprowadzone na modelach zwierzęcych nadal mają kluczowe znaczenie dla opracowania nowych CAR ukierunkowanych na guzy lite. Jednak do tej pory wykazano ograniczoną skuteczność kliniczną we wskazaniach do guzów litych i staje się coraz bardziej oczywiste, że poszczególne modele przedkliniczne nie przewidują dokładnie farmakodynamiki i skuteczności klinicznej żywego leku2,3. W związku z tym badacze zaczęli rozszerzać badanie przedkliniczne produktów komórkowych CAR-T o równoległe oceny w modelach ksenoprzeszczepowych i syngenetycznych odpowiednio raka ludzkiego i mysiego.

W przeciwieństwie do modeli ksenoprzeszczepów, gdzie ludzkie nowotwory i limfocyty T są wszczepiane myszom z niedoborem odporności, modele syngeniczne umożliwiają badanie odpowiedzi komórek CAR-T w kontekście funkcjonalnego układu odpornościowego. W szczególności myszy immunokompetentne z guzami syngenicznymi zapewniają system do badania interakcji między adoptywnie przeniesionymi limfocytami T a środowiskami specyficznymi dla kontekstu - w tym makrofagami związanymi z nowotworem (TAM) i regulatorowymi limfocytami T (Treg), o których wiadomo, że hamują funkcję limfocytów T w mikrośrodowisku guza (TME)4,5,6. Co więcej, modele syngeniczne oferują dodatkową platformę do oceny toksyczności na miejscu, poza guzem i interakcji komórek CAR-T z czynnikami gospodarza, które mogą prowadzić do dodatkowych toksyczności, w tym zespołu uwalniania cytokin7.

Pomimo tych zalet, liczba badań nad syngenicznymi komórkami CAR-T pozostaje ograniczona. Warto zauważyć, że modele syngeniczne wymagają autologicznej inżynierii komórek CAR-T z tego samego szczepu myszy, a tym samym stanowią dodatkowe wyzwanie ze względu na brak metodologii wydajnej transdukcji mysich limfocytów T i ekspansji ex vivo2,8. Protokół ten przedstawia metody osiągania stabilnej ekspresji CAR poprzez produkcję wektorów retrowirusowych i zoptymalizowaną transdukcję limfocytów T. Schemat całego procesu przedstawiono na rysunku 1. Zastosowanie tego podejścia pozwala na zademonstrowanie skutecznej transdukcji retrowirusowej mysich komórek CAR-T i osiągnięcie wysokiej ekspresji CAR bez konieczności koncentracji wirusa poprzez ultrawirowanie. Omówiono strategie zmiany swoistości antygenowej konstruktu CAR oprócz koekspresji dodatkowych transgenów.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (Columbia University, protokoły AC-AABQ5551 i AC-AAAZ4470) przy użyciu 6-8-tygodniowych samic myszy BALB/c lub CF57BL/6 o wadze od 20 do 25 g. Zwierzęta zostały pozyskane ze źródła komercyjnego (patrz tabela materiałów). Protokół ten opiera się na "dniach po aktywacji" mysich limfocytów T, a produkcja wirusa rozpoczyna się w dniu -2. Retrowirus może być przechowywany w temperaturze -80 °C po początkowej produkcji, a w celu wykorzystania tego protokołu w przyszłości można rozpocząć od etapu 2, izolacji i aktywacji limfocytów T w dniu 0.

1. Produkcja wektorów retrowirusowych

UWAGA: Produkty wirusa stały się wadliwe pod względem replikacji poprzez rozdzielenie genów pakujących na dwa oddzielne plazmidy (patrz Tabela Materiałów), co znacznie zmniejsza prawdopodobieństwo wystąpienia zdarzeń rekombinacji i niezamierzonej produkcji wirusa kompetentnego do replikacji.

  1. Przygotuj komórki Phoenix Eco na dzień przed transfekcją (procedura Dzień -2).
    1. Umieścić około 1 x 107 komórek na 15-centymetrowej płytce poddanej działaniu TC lub kolbie hodowlanej T150, używając 30 ml pożywki hodowlanej (pożywka Phoenix Eco, jak wyszczególniono w tabeli 1).
    2. Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C. Po 18-24 godzinach komórki powinny być w około 70% zlewające się i równomiernie rozmieszczone, aby zapewnić wysoką wydajność wirusa bez przerostu.
      UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, należy użyć komórek o niskim pasażu i przejść je dzień przed posiewem w celu produkcji wirusa. Nie pozwól, aby komórki Phoenix Eco zarosły podczas rutynowej hodowli.
  2. Przygotować mieszaninę do transfekcji zawierającą odczynniki do lipofekcji i wzmacniacza, pCL-Eco (Gag/Pol) i plazmid ekspresji pMSCV (pMSCV_PGK_mGFP28z) w pożywce o zredukowanej surowicy (patrz tabela materiałów) (procedura dnia -1).
    UWAGA: Kotransfekcja powinna być wykonywana w stosunku 1:1 pMSCV i pCL-Eco.
    1. Przygotować probówkę A: Rozcieńczyć 105 μl odczynnika do transfekcji w 3,75 ml zredukowanej pożywki surowicy na 15 cm płytkę i dokładnie wymieszać przez wirowanie lub pipetowanie w górę iw dół.
    2. Przygotuj probówkę B: Rozcieńczyć plazmid ekspresji pMSCV (21 μg) i pCL-Eco (21 μg) 90 μl odczynnika wzmacniającego w 3,75 ml zredukowanej pożywki surowicy na 15 cm płytkę. Dobrze wymieszać, pipetując w górę i w dół.
      UWAGA: W przypadku generowania wielu produktów wirusowych należy skonfigurować mieszankę wzorcową zawierającą pCL-Eco i odczynnik wzmacniający.
    3. Dodaj probówkę A do probówki B i dokładnie wymieszaj, pipetując. Inkubować przez 10-20 minut w temperaturze pokojowej, uzyskując całkowitą objętość około 7,5 ml.
    4. Ostrożnie usunąć 10 ml pożywki do hodowli komórkowych z płytki (płytek) Phoenix Eco i dodać całą objętość mieszaniny do transfekcji do pozostałych pożywek, przechylając płytkę i pipetując kroplami. Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  3. Zmień pożywkę na transfekowanych komórkach Phoenix Eco 16-20 godzin po transfekcji (procedura dnia 0).
    1. Wstępnie rozgrzaną surowicę i β-merkaptoetanol (2-ME, patrz tabela materiałów) wolne od mysich limfocytów T (zbiór wirusa mTCM, jak podano w tabeli 1) do 37 °C przy użyciu kąpieli wodnej lub perełkowej.
    2. Ostrożnie wyjmij pożywkę hodowlaną Phoenix Eco, przechylając płytkę i umieszczając końcówkę pipety w dolnym rogu, używając próżni, jeśli to możliwe. Unikaj nadmiernego wysuszania komórek.
    3. Delikatnie dodaj podgrzaną pożywkę do zbierania wirusa mTCM z boku przechylonej płytki, pipetując 30 ml na najwolniejszym ustawieniu. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Ten krok może spowodować oderwanie się komórek Phoenix Eco od płytki i zmniejszenie miana wirusa. Wstępnie podgrzane media i delikatne pipetowanie zminimalizują zakłócenia.
  4. Pobrać supernatant wirusa 48 godzin po transfekcji (procedura dnia 1).
    1. Zbierz supernatant wirusa i przefiltruj go przez filtry PVDF 0,45 μm (patrz tabela materiałów) w celu usunięcia komórek i zanieczyszczeń. Podzielić i zamrozić wirusa w temperaturze -80 °C lub przejść bezpośrednio do dnia 1 kroku 3 w przypadku stosowania nowego wirusa.
    2. Określ miano wirusa (jednostki transdukcyjne/ml) za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano wcześniej9. Ten krok jest opcjonalny.
      1. Określić miano wirusa przez transdukcję na małą skalę 1 x 105 aktywowanych mysich limfocytów T na 96-dołkowych płytkach poddanych hodowli nietkankowej (TC), wstępnie pokrytych retronektyną (patrz tabela materiałów) i obciążonych trzykrotnymi seryjnymi rozcieńczeniami supernatantu retrowirusowego w końcowej objętości 100 μl pożywki do zbioru wirusa mTCM.
        UWAGA: Zobacz kroki 2 i 3 poniżej, aby uzyskać szczegółowe instrukcje dotyczące izolacji, aktywacji i transdukcji limfocytów T.
      2. Określić ekspresję powierzchni CAR 4-5 dni po transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej.
      3. Oblicz miano wirusa zgodnie ze wzorem10: (N x F x D)/V, gdzie N to liczba transdukowanych komórek, F to częstotliwość komórek CAR-dodatnich, D to współczynnik rozcieńczenia, a V to objętość transdukcji w ml, aby uzyskać jednostki transdukcji (TU)/mL.
        UWAGA: Miano wirusa może się zmniejszyć po zamrożeniu/rozmrożeniu; Dlatego miano wirusa jest idealnie określone na zamrożonym, a następnie rozmrożonym wirusie.

2. Izolacja mysich limfocytów T

  1. Wyizoluj i aktywuj mysie limfocyty T (procedura dnia 0).
    UWAGA: Czynności te można wykonać w temperaturze pokojowej (RT) lub 4 °C i należy je wykonywać w sterylnym środowisku.
    1. Zbierz śledzionę (śledziony) z interesującego nas szczepu myszy (np. Balb/c, C57BL/6), jak wcześniej opisano11 i uzyskaj zawiesinę jednokomórkową poprzez dysocjację mechaniczną.
    2. Używając tylnej części sterylnej strzykawki, zmiażdż śledzionę (śledziony) przez sitko do komórek o pojemności 70-100 μm do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Po odstawieniu strzykawki na bok przemyć sitko 5 ml buforu do izolacji limfocytów T (sól fizjologiczna buforowana fosforanami, PBS, uzupełniona 2% płodową surowicą bydlęcą, FBS).
    4. Powtórzyć etap zacierania i ponownie umyć sitko 5 ml buforu do izolacji limfocytów T. Doprowadzić końcową objętość do 50 ml za pomocą buforu do izolacji limfocytów T.
    5. Policz żywe komórki za pomocą ręcznego hemocytometru lub automatycznego licznika komórek, rozcieńczając w stosunku 1:20, a następnie mieszając w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym.
    6. Osadzać komórki przez wirowanie przez 10 minut w temperaturze 450 x g, w temperaturze 4 °C (lub RT) i ponownie zawiesić śledziony w temperaturze 1 x 108/ml, jeśli używa się zalecanego zestawu do izolacji limfocytów T (patrz tabela materiałów).
      UWAGA: Na tym etapie śledziony można ponownie przecedzić przez sitko o średnicy 40-70 μm w celu usunięcia grudek.
  2. Wyizolować limfocyty T CD3 + metodą selekcji negatywnej zgodnie z instrukcjami producenta (patrz Tabela materiałów). Po separacji magnetycznej przenieś izolat do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wykonaj końcowe zliczenie żywych komórek.
  3. Zawiesić izolowane limfocyty T przez odwirowanie przez 10 minut w temperaturze 450 x g, w temperaturze 4 °C (lub RT) i ponownie zawiesić je w temperaturze 1 x 106/ml w pożywce aktywacyjnej mTCM (Tabela 1).
  4. Aktywuj limfocyty T poprzez dodanie mysich kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem monoklonalnym anty-CD3 / anty-CD28 (patrz tabela materiałów) w stosunku 25 μl / 1 x 106 limfocytów T i 100 U / ml IL-2.
  5. Umieścić komórki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i pozostawić je na noc.
    UWAGA: Ze względu na mały rozmiar limfocytów T, dokładniejszą liczbę żywych limfocytów T można uzyskać, rozcieńczając w stosunku 1:10-1:20 i mieszając w stosunku 1:1 z błękitem trypanowym do ręcznego liczenia za pomocą hemocytometru. Czystość można określić za pomocą cytometrii przepływowej, barwiąc komórki fluorescencyjnie sprzężonym przeciwciałem αCD3. Każda śledziona wytworzy od 7 do 10 x 106 limfocytów T, w zależności od wieku i szczepu myszy.

3. Transdukcja mysich limfocytów T

  1. Przygotuj płytki do transdukcji (procedura Dzień 0).
    1. Wstępnie pokryć niepoddane działaniu środka sterylne 24-dołkowe płytki 0,5 ml ludzkiego odczynnika wzmacniającego transdukcję fibronektyny (patrz tabela materiałów) w końcowym stężeniu 20-40 μg/ml poprzez rozcieńczenie go w sterylnym PBS i przechowywać w temperaturze 4 °C przez noc.
      UWAGA: Ten etap można również wykonać w dniu 1, pokrywając niepoddane działaniu substancji płytki 24-dołkowe odczynnikiem do transdukcji i inkubując je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  2. Wykonaj transdukcję limfocytów T (procedura dnia 1).
    1. Przygotuj wstępnie pokrytą płytkę do transdukcji. Usunąć odczynnik do transdukcji z każdego dołka wstępnie powleczonej 24-dołkowej płytki i zablokować równoważną objętością sterylnie przefiltrowanego PBS + 2% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (0,5 ml) przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    2. Przemyć raz 0,5-1 ml PBS.
  3. Dodać 0,5-1 ml czystego retrowirusa z etapu 1 lub rozcieńczonego na podstawie miana wirusa do każdej wstępnie pokrytej studzienki i wirować przez 90 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 32 °C.
  4. Dodać 1 ml aktywowanych limfocytów T do każdej studzienki załadowanej wirusem i wirować przez 10 minut w temperaturze 450 x g i temperaturze 32 °C. Komórki należy umieścić na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
  5. 24 godziny po transdukcji usunąć 1-1,5 ml pożywki do hodowli komórkowych i zastąpić ją 1-1,5 ml mTCM-complete i 10 ng/ml rekombinowanych ludzkich IL-7 i IL-15 (patrz tabela materiałów). Umieścić komórki z powrotem w inkubatorze o temperaturze 37 °C (procedura dnia 2).
    UWAGA: Podczas hodowli ex vivo do hodowli należy dodawać 10 ng/ml cytokin co 48 godzin, a limfocytów T nie należy rozcieńczać powyżej 1 x 106/ml.
  6. 48 godzin po transdukcji przenieść komórki z płytki transdukcyjnej do świeżej płytki 24- lub 6-dołkowej i zwrócić komórki do inkubatora w temperaturze 37 °C (procedura dnia 3).
    UWAGA: Żywotność limfocytów T może się poprawić poprzez przeniesienie komórek w ciągu 24 godzin do 2 dni po transdukcji, w zależności od początkowej żywotności limfocytów T i miana wirusa.
  7. Usuń krople z limfocytów T i potwierdź ekspresję CAR (procedura dnia 5-6).
    1. Dokładnie ponownie zawiesić komórki, aby oddzielić aktywowane limfocyty T od kulek pokrytych αCD3/CD28 (patrz Tabela materiałów) i umieścić zawiesinę komórek na magnesie na 30 sekund. Przenieść zawiesinę komórkową do żądanego naczynia do hodowli ex vivo i umieścić ją w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Limfocyty T mogą być hodowane w kolbach hodowlanych lub płytkach do hodowli głębinowych. Zaleca się umieszczenie co najmniej 5 x 106 limfocytów T w 30 ml pożywki mTCM-complete na studzienkę w dołku w głębokim dołku na płytkę o formacie 6-dołkowym (patrz Tabela materiałów).
    2. Określ ekspresję CAR za pomocą cytometrii przepływowej8.
      UWAGA: Ekspresję GFP-CAR oznaczono przez inkubację ze 100 ng/ml oczyszczonego GFP. Włączenie N-końcowego znacznika epitopowego ułatwi wykrywanie alternatywnych konstrukcji CAR.
  8. Przeprowadzić hodowlę ex vivo komórek CAR-T (procedura w dniu 7-10).
    1. Podczas hodowli ex vivo utrzymuj komórki, usuwając 50% pożywki hodowlanej i zastępując ją świeżym mTCM-complete + 2x 10 ng/ml IL-7 i IL-15 co 48 godzin
      UWAGA: Mysie komórki CAR-T są gotowe do użycia w dalszych zastosowaniach 7 dni po aktywacji i nie powinny być kriokonserwowane ze względu na słabą żywotność po rozmrożeniu.

Wyniki

Protokół opisany w niniejszym opracowaniu ma na celu standaryzację procesu transdukcji limfocytów T myszy w celu generowania mysich komórek CAR-T. Rysunek 1 przedstawia szczegółowy opis poszczególnych etapów. Proces rozpoczyna się od produkcji wektorów retrowirusowych via kotransfekcji komponentów wirusowych do komórek Phoenix Eco. Rysunek 2 przedstawia obraz optymalnej gęstości komórek Phoenix Eco w dniu transfekcji. Izolowane limfocyty T są następnie aktywowane 24 h po transfekcji, co stanowi „Dzień 0” niniejszego protokołu, w ramach przygotowania do transdukcji w Dniu 1. Po transdukcji komórki CAR-T są hodowane w obecności rekombinowanej ludzkiej IL-7 i IL-15, aby uzyskać odpowiedni stopień ekspansji przy jednoczesnym zachowaniu populacji komórek pamięci macierzystej.

Zastosowanie zalecanego zestawu do izolacji limfocytów T mysich (patrz Tabela materiałów) zgodnie z niniejszym protokołem pozwala na uzyskanie czystości limfocytów T <98% przed transdukcją, co potwierdzono za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 3A). Ponadto, stosując ten protokół oraz wektor retrowiralny pMSCV zmodyfikowany w celu ekspresji konstruktu CAR z promotora PGK, można osiągnąć powtarzalne poziomy ekspresji CAR wynoszące 65%-75% (Rysunek 3B,C). Wyznaczenie miana retrowirusa wykazało wartości mian do ~2 x 107 TU/mL oraz 74% ekspresji CAR przy użyciu 1/3rd zebranego supernatantu wirusowego po kotransfekcji pMSCV z pCL-Eco (Rysunek uzupełniający 1).

Ostatecznie, hodowla ex vivo z dodatkiem 10 ng/mL IL-7 i IL-15 prowadzi do około 15-krotnej ekspansji, w wyniku czego w 10. dniu po aktywacji z jednej śledziony uzyskuje się ~150 x 106 limfocytów T (Rysunek 3D). Hodowla z IL-7 i IL-15 prowadzi do uzyskania porównywalnych częstotliwości limfocytów T CD8+ i CD4+ (Rysunek 3E) oraz zachowania populacji komórek pamięci macierzystych, określonych przez ekspresję CD62L+CD44- po 10 dniach hodowli ex vivo (Rysunek 3F).

Schemat procesu transdukcji limfocytów T myszy, produkcja retrowirusów, izolacja i aktywacja limfocytów T.
Rycina 1: Przegląd protokołu. Górny panel: Schematyczny przegląd harmonogramu protokołu. Dolny panel: Instrukcje krok po kroku dotyczące produkcji wektora retrowirusowego i transdukcji limfocytów T myszy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obraz mikroskopowy hodowanych komórek, ilustrujący morfologię komórek do celów badań biologicznych.
Rycina 2: Optymalna gęstość komórek do transfekcji. Obraz z mikroskopii w świetle przechodzącym komórek Phoenix Eco o optymalnej gęstości przed transfekcją pMSCV i pCL-Eco. Obraz wykonany przy użyciu obiektywu 10x. Pasek skali = 200 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza cytometrii przepływowej; komórki CD3+, schemat wektora, ekspresja mGFP28z, wykres stosunku CD4:CD8.
Rycina 3: Produkcja mysich komórek CAR-T i hodowla ex vivo. (A) Wykres cytometrii przepływowej przedstawiający częstotliwość występowania komórek BALB/c CD3+ po izolacji mysich limfocytów T. (B) Schematyczny opis wektora retrowirusowego pMSCV użytego do ekspresji GFP-CAR w mysich limfocytach T. (C) Histogramy cytometrii przepływowej demonstrujące ekspresję CAR na powierzchni mysich limfocytów T po inkubacji z oczyszczonym sfGFP. UT, nieprzetransdukowane. (D) Krotność ekspansji komórek CAR-T w 10. dniu po aktywacji i hodowli z rekombinowaną ludzką IL-17 i IL-15. Przed transdukcją aktywowano około 8 x 106 mysich limfocytów T, a w 10. dniu po aktywacji ich liczba osiągnęła około 1,28 x 108. (E) Wykres cytometrii przepływowej przedstawiający częstotliwość występowania komórek CAR-T CD8+ i CD4+ w 10. dniu po aktywacji. (F) Wykres cytometrii przepływowej demonstrujący częstotliwość populacji pamięciowych limfocytów T CD8+ określonych na podstawie ekspresji powierzchniowej CD62L i CD44. Pamięć macierzysta (TSCM) charakteryzuje się fenotypem CD62L+CD44-, pamięć centralna (TCM) fenotypem CD62L+CD44+, a pamięć efektorowa (TEM) fenotypem CD62L-CD44+. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Skład pożywek do hodowli komórkowych. Szczegóły dotyczące składu pożywek do hodowli komórkowych wykorzystanych w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Ekspresja powierzchniowa CAR i miana retrowirusów. (A) Histogramy z cytometrii przepływowej pokazujące ekspresję powierzchniową CAR na limfocytach T myszy BALB/c po inkubacji z oczyszczonym sfGFP. Retrowirus został wygenerowany poprzez transfekcję komórek Phoenix Eco plazmidem pMSCV_PGK_mGFP28z w połączeniu z pCL-Eco i pMD2.G (I), pCL-Eco (II) lub samym plazmidem pMSCV_PGK_mGFP28z (III). Limfocyty T zostały transdukowane rozcieńczonym retrowirusem zgodnie z oznaczeniami. (B) Miana retrowirusów określone na podstawie ekspresji powierzchniowej CAR w transdukowanych limfocytach T. Jednostki transdukcyjne (TU)/mL obliczono według wzoru: (N∙F∙D)/V, gdzie N to liczba transdukowanych komórek (1 x 105), F to częstotliwość występowania komórek CAR+, D to czynnik rozcieńczenia, a V to objętość transdukcji w mL (0.2 mL). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: sekwencja wektora ekspresyjnego pMSCV. Sekwencja CAR GFP28z oraz sekwencje flankujące (kursywa) w wektorze ekspresyjnym pMSCV, z zaznaczonymi na niebiesko miejscami cięcia enzymów NotI i BamHI. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Protokół ten opisuje etapy i odczynniki niezbędne do transdukcji retrowirusowej mysich limfocytów T w celu wytworzenia komórek CAR-T do badań in vivo . Optymalizacja warunków transdukcji retrowirusowej pozwala na uzyskanie silnej ekspresji CAR bez konieczności zagęszczania wirusa poprzez ultrawirowanie lub dodatkowe odczynniki. Istnieje jednak wiele modyfikacji, które można zastosować do tej metodologii.

Chociaż protokół ten opisuje przykładową generację CAR specyficznego dla GFP, metody te można dostosować do generowania mysich komórek CAR-T ukierunkowanych na dowolny antygen zewnątrzkomórkowy będący przedmiotem zainteresowania. pMSCV_PGK wektor retrowirusowy zastosowany w tym badaniu pozwala na skuteczne uwalnianie specyficznej dla GFP sekwencji nanowirusowej poprzez trawienie enzymatyczne z NotI i BamHI i może być zastąpiony zdefiniowaną przez użytkownika domeną rozpoznawania antygenu, taką jak scFv, nanociało lub domena wiążąca ligand (plik uzupełniający 1). Aby ułatwić ocenę alternatywnej ekspresji CAR, zaleca się projektowanie CAR z N-końcowym znacznikiem epitopowym, takim jak znaczniki Myc (EQKLISEEDL) lub Flag (DYKDDDDK), które można wykryć za pomocą fluorescencyjnie sprzężonych przeciwciał12. Co więcej, obecne badanie wykazało produkcję pojedynczego transgenu; jednak włączenie peptydów samorozszczepiających (sekwencji 2A) lub wewnętrznych miejsc wejścia rybosomów (IRES) umożliwiłoby współprodukcję wielu transgenów, w tym dodatkowe technologie poprawiające funkcję komórek T in vivo 8,13,14.

Chociaż protokół ten został opracowany w celu wyeliminowania potrzeby stosowania specjalistycznego sprzętu poprzez pominięcie ultrawirowania (24 000 x g, 2 h, 4 °C), warto zauważyć, że stężenie supernatantu wirusa może osiągnąć wyższe miana wirusa i zmniejszyć objętość wirusa wymaganą do osiągnięcia wysokiej ekspresji CAR8. Protokół ten dodatkowo usprawnia produkcję wektorów retrowirusowych, osiągając powtarzalnie wysokie miana wirusa (~2 x 10,7 TU/ml) i stałą ekspresję CAR bez konieczności oznaczania miana wirusa przed użyciem. Jednak oprócz ułatwienia standaryzacji, określenie miana wirusa przed transdukcją limfocytów T może również zwiększyć żywotność limfocytów T poprzez zmniejszenie potencjalnej toksyczności spowodowanej niepotrzebnie wysokimi stężeniami wirusa10,15.

Suplementacja IL-7 i IL-15 jest zalecana w celu promowania ekspansji komórek T i zachowania populacji pamięci komórek T; jednak rekombinowana ludzka IL-2 może być stosowana jako alternatywa w celu zmniejszenia liczby niezbędnych odczynników do hodowli ex vivo 16,17,18,19. Niemniej jednak przedstawione tutaj metody generowania komórek CAR-T pozostają ograniczone przez stosunkowo słabą ekspansję mysich limfocytów T. Jednak omówione powyżej środki mające na celu poprawę żywotności limfocytów T można jeszcze bardziej wzmocnić poprzez włączenie dodatkowych suplementów i 2-ME do pożywki hodowlanej mTCM w całym procesie transdukcji20. Chociaż modyfikacje te mogą poprawić ekspansję limfocytów T od 15-krotnej do nawet20-krotnej 20, mogą skutkować niższą wydajnością transdukcji i zmniejszoną ekspresją CAR.

Ostatecznie, produkcja mysich komórek CAR-T umożliwia opracowanie modeli syngenicznych do oceny funkcji komórek CAR-T w nienaruszonym układzie odpornościowym, ułatwiając kontekstową ocenę ich siły, trwałości i bezpieczeństwa. Natomiast modele u myszy z niedoborem odporności pozwalają na ważne badania przedkliniczne produktu z ludzkich limfocytów T ukierunkowanego na ludzki antygen nowotworowy. Połączenie tych uzupełniających się systemów modelowych będzie niezbędne do zrozumienia złożoności biologii komórek CAR-T, optymalizacji nowych projektów CAR i ostatecznie przełożenia wyników przedklinicznych na skuteczne terapie kliniczne.

Oświadczenia

Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy L. Brockmannowi za krytyczną recenzję manuskryptu. Prace te były wspierane przez NIH 1R01EB030352 i UL1 TR001873.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m filtryMilliporeSigmaSLHVR33RS
strzykawka 1 ml Fisher Naukowy 14-955-450
Probówki do mikrowirówek 1,5 ml Fisher Naukowy 05-408-135
Strzykawka 10 ml BD14-823-16E
100 μ m sitkoCorning07-201-432
15 cm Naczynia do hodowli komórkowych poddane działaniu TCThermoFisher Scientific 
Probówki stożkowe 15 ml Sokół14-959-70C
40 μ m sitko Corning07-201-430
Probówki stożkowe 50 ml Sokół14-959-49A
70 μ m filtr siatkowyCorning07-201-431
Cytometr przepływowy Attune NxT ThermoFisher Naukowy 
BALB/C, 6-8 tygodni Jackson Laboratory651
B-merkaptoetanol Gibco21985023
Albumina surowicy bydlęcej GOLDBIOA-420-500
DMEM MediumGibco11965092
Sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS) firmy Dulbecco, bez wapnia i magnezu Gibco14-190-250
Magnes DynaMag-2 Magnes Invitrogen12-321-D
EasySep Stemcell Technologies18000
Zestaw do izolacji mysich komórek T EasySepStemcell Technologies19851
Bufor FACS BDBDB554657
Surowica bydlęca płodu (FBS) CorningMT35011CV
GlutaMAXGibco35-050-061
G-Rex6Wilson Wolf80240M 
Roztwór buforowy HEPES Gibco15-630-080
Ludzka rekombinowana IL-15 Miltenyi Biotec130-095-765
Ludzki rekombinant IL-2Miltenyi Biotec130-097-748
Ludzki rekombinowany IL-7Miltenyi Biotec130-095-363
Lipofektamina 3000InvitrogenL3000008
MEM Roztwór aminokwasów endogennych Gibco11140-050
Mysz Anty-CD3 BV421Biolegend100228
Mysz Anty-CD3/CD28 DynabeadsMysz Gibco11-453-D
Anty-CD4 BV605BD563151
Mysz Anty-CD44 APC Mysz Biolegend103011
Anti-CD62L PE-Cy7TonboSKU 60-0621-U025
Mysz Anti-CD8 APC-Cy7TonboSKU 25-0081-U025
Nikon Ti2 z aparatem Prime 95B Nikon
Nieobrobione płytki 24-dołkowe CytoOneCC7672-7524
Opti-MEMGibco31-985-062
pCL-EcoAddgene#12371
Roztwór penicyliny/streptomycynyGibco15-070-063
Komórki Phoenix EcoATCCCRL-3214
pMDG.2Addgene#12259
pMSCV_PGK_GFP28zNie dotyczyWyprodukowany przez R.LV.
Oczyszczony sfGFPN/AProdukowany przez R.LV.
Retronektyna ("odczynnik do transdukcji")Takara BioT100B
RPMI 1640Gibco21875
Pipeta serologiczna 10 mlFisher Scientific 13-678-11E
Pipeta serologiczna 25 mlFisher Scientific 13-678-11
Pipeta serologiczna 5 mlFisher Scientific 13-678-11D
Pirogronian soduGibco11-360-070
Płytki 24-dołkowe poddane działaniu TC Corning08-772-1
Błękit trypanowy Gibco15-250-061
130183

Bibliografia

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
  3. Hou, A. J., Chen, L. C., Chen, Y. Y. Navigating CAR-T cells through the solid-tumour microenvironment. Nat Rev Drug Discov. 20 (7), 531-550 (2021).
  4. Campesato, L. F., et al. Blockade of the ahr restricts a treg-macrophage suppressive axis induced by l-kynurenine. Nat Commun. 11 (1), 4011(2020).
  5. Kaneda, M. M., et al. Pi3kgamma is a molecular switch that controls immune suppression. Nature. 539 (7629), 437-442 (2016).
  6. Hyrenius-Wittsten, A., Roybal, K. T. Paving new roads for cars. Trends Cancer. 5 (10), 583-592 (2019).
  7. Giavridis, T., et al. CAR T cell-induced cytokine release syndrome is mediated by macrophages and abated by il-1 blockade. Nat Med. 24 (6), 731-738 (2018).
  8. Lanitis, E., et al. Optimized gene engineering of murine CAR-T cells reveals the beneficial effects of il-15 coexpression. J Exp Med. 218 (2), e20192203(2021).
  9. Lambeth, C. R., White, L. J., Johnston, R. E., De Silva, A. M. Flow cytometry-based assay for titrating dengue virus. J Clin Microbiol. 43 (7), 3267-3272 (2005).
  10. Agarwal, S., Wellhausen, N., Levine, B. L., June, C. H. Production of human crispr-engineered CAR-T cells. J Vis Exp. 169, e62299(2021).
  11. JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Sterile Tissue Harvest. , JoVE, Cambridge, MA. (2023).
  12. Giordano-Attianese, G., et al. A computationally designed chimeric antigen receptor provides a small-molecule safety switch for t-cell therapy. Nat Biotechnol. 38 (4), 426-432 (2020).
  13. Kuhn, N. F., et al. Cd40 ligand-modified chimeric antigen receptor T cells enhance antitumor function by eliciting an endogenous antitumor response. Cancer Cell. 35 (3), 473-488.e6 (2019).
  14. Jin, C., Ma, J., Ramachandran, M., Yu, D., Essand, M. CAR T cells expressing a bacterial virulence factor trigger potent bystander antitumour responses in solid cancers. Nat Biomed Eng. 6 (7), 830-841 (2022).
  15. Kurachi, M., et al. Optimized retroviral transduction of mouse T cells for in vivo assessment of gene function. Nat Protoc. 12 (9), 1980-1998 (2017).
  16. Jafarzadeh, L., Masoumi, E., Fallah-Mehrjardi, K., Mirzaei, H. R., Hadjati, J. Prolonged persistence of chimeric antigen receptor (CAR) T cell in adoptive cancer immunotherapy: Challenges and ways forward. Front Immunol. 11, 702(2020).
  17. Elkassar, N., Gress, R. E. An overview of IL-7 biology and its use in immunotherapy. J Immunotoxicol. 7 (1), 1-7 (2010).
  18. Osinalde, N., et al. Simultaneous dissection and comparison of IL-2 and IL-15 signaling pathways by global quantitative phosphoproteomics. Proteomics. 15 (2-3), 520-531 (2015).
  19. Eremenko, E., et al. An optimized protocol for the retroviral transduction of mouse CD4 T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100719(2021).
  20. Lewis, M. D., et al. A reproducible method for the expansion of mouse CD8+ T lymphocytes. J Immunol Methods. 417, 134-138 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mysie komórki CAR-Ttransdukcja retrowirusowahodowla komórek T ex vivosyngeniczne modele mysieizolacja komórek Tcytometria przepływowamodele guzów litychlimfocyty T CD3+pamięć macierzystych komórek T
Wydajne wytwarzanie mysich chimerycznych receptorów antygenowych (CAR)-T
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.