Obecny protokół opisuje technikę chirurgiczną polegającą na wszczepianiu elektrod do nerwu błędnego w jamie brzusznej u szczurów, wraz z metodami przewlekłego testowania elektrofizjologii i stymulacji za pomocą wszczepionego urządzenia.
Artykuł metodologiczny
Chirurgia implantacji w celu stymulacji nerwu błędnego jamy brzusznej i rejestrowanie badań na obudzonych szczurach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Stymulacja nerwu błędnego w jamie brzusznej (VNS) może być zastosowana do gałęzi podprzeponowej nerwu błędnego u szczurów. Ze względu na swoje anatomiczne położenie nie ma żadnych skutków ubocznych ze strony układu oddechowego i serca, które są powszechnie kojarzone z VNS szyjki macicy. Brak efektów off-target ze strony układu oddechowego i sercowego oznacza, że intensywność stymulacji nie musi być obniżana w celu zmniejszenia skutków ubocznych często występujących podczas VNS szyjki macicy. Niewiele ostatnich badań wykazuje przeciwzapalne działanie VNS w jamie brzusznej w szczurzych modelach nieswoistego zapalenia jelit, reumatoidalnego zapalenia stawów i obniżenia glikemii w szczurzym modelu cukrzycy typu 2. Szczur jest doskonałym modelem do zbadania potencjału tej technologii ze względu na dobrze ugruntowaną anatomię nerwu błędnego, duży rozmiar nerwu, który umożliwia łatwą obsługę, oraz dostępność wielu modeli chorób. Tutaj opisujemy metody czyszczenia i sterylizacji matrycy elektrod VNS w jamie brzusznej oraz protokół chirurgiczny u szczurów. Opisano również technologię wymaganą do potwierdzenia stymulacji ponadprogowej poprzez rejestrację wywołanych złożonych potencjałów czynnościowych. VNS w jamie brzusznej ma potencjał, aby zaoferować selektywne, skuteczne leczenie różnych schorzeń, w tym chorób zapalnych, i oczekuje się, że zastosowanie będzie się rozszerzać podobnie jak VNS szyjki macicy.
Wprowadzenie
Stymulacja nerwu błędnego (VNS) dostarczana w miejscu szyjki macicy jest zatwierdzona przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (FDA) do leczenia padaczki opornej na leczenie, depresji opornej na leczenie i rehabilitacji po udarze niedokrwiennym1, oraz zatwierdzona przez Komisję Europejską do leczenia niewydolności serca w Europie2. Nieinwazyjny VNS szyjki macicy jest zatwierdzony przez FDA do leczenia migreny i bólu głowy1. Oczekuje się, że jego zastosowanie będzie się rozszerzać, a ostatnie badania kliniczne wykazały skuteczność VNS w innych wskazaniach, takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna3, reumatoidalne zapalenie stawów4,5 oraz upośledzona tolerancja glukozy i cukrzyca typu 26,7. Chociaż obiecujące, VNS szyjki macicy może powodować bradykardię i bezdech z powodu niezamierzonej aktywacji włókien nerwowych, które unerwiają płuca i serce8,9,10. Działania niepożądane, takie jak kaszel, ból, zmiany głosu, ból głowy i wzrost wskaźnika bezdechu i spłycenia oddechu są często zgłaszane u pacjentów otrzymujących VNS11,12. Zmniejszenie siły stymulacji jest powszechną strategią zmniejszania tych skutków ubocznych, jednak zmniejszony ładunek może ograniczyć skuteczność terapii VNS poprzez brak aktywacji włókien terapeutycznych11. Na poparcie tej hipotezy stwierdzono, że odsetek pacjentów otrzymujących stymulację o wysokiej intensywności w leczeniu padaczki był wyższy niż u pacjentów otrzymujących stymulację o niskiej intensywności13.
Brzuszny VNS jest nakładany na nerw błędny podprzeponowy, powyżej gałęzi wątroby i celiakii14 (Rysunek 1). Nasze poprzednie badanie wykazało, że u szczurów VNS w jamie brzusznej nie powoduje skutków ubocznych związanych z VNS10. Wcześniejsze badania wykazały również przeciwzapalne działanie VNS w brzusznym modelu w szczurzym modelu nieswoistego zapalenia jelit i reumatoidalnego zapalenia stawów10,15, a także obniżenie glikemii w szczurzym modelu cukrzycy typu 216. Niedawno technologia VNS w jamie brzusznej została przetłumaczona na potrzeby pierwszego badania klinicznego z udziałem ludzi w leczeniu nieswoistego zapalenia jelit (NCT05469607).
Zestaw elektrod do nerwów obwodowych używany do stymulacji nerwu błędnego w jamie brzusznej (WO201909502017) został specjalnie opracowany do stosowania u szczurów i składa się z dwóch do trzech par elektrod platynowych umieszczonych w odległości 4,7 mm od siebie, wspieranych przez mankiet z elastomeru silikonowego klasy medycznej, zakładkę do szycia do zakotwiczenia matrycy w przełyku, przewód doprowadzający i przezskórne złącze do zamontowania w okolicy lędźwiowej (Rysunek 2). Przewód ołowiany jest tunelowany pod skórą po lewej stronie zwierzęcia. Konstrukcja z wieloma parami elektrod pozwala na elektryczną stymulację nerwu, a także rejestrację elektrycznie wywołanych złożonych potencjałów czynnościowych (ECAP), co potwierdza prawidłowe umieszczenie implantu na nerwie i intensywność stymulacji ponadprogowej. VNS brzuszny jest dobrze tolerowany przez wiele miesięcy u swobodnie poruszających się szczurów10,15,16. Pozwala to na ocenę jego skuteczności na modelach chorobowych.
Ten manuskrypt opisuje metody sterylizacji matrycy elektrod, chirurgii implantacji nerwu błędnego w jamie brzusznej oraz przewlekłej stymulacji i rejestracji ECAP u obudzonych szczurów w celu zbadania skuteczności VNS w jamie brzusznej w różnych modelach chorobowych. Metody te zostały pierwotnie opracowane do badania skuteczności VNS w brzusznym modelu nieswoistego zapalenia jelit na szczurach10 i zostały również z powodzeniem zastosowane w szczurzym modelu reumatoidalnego zapalenia stawów15 i cukrzycy16.
Protokół
Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Szpitala St. Vincent (Melbourne) i były zgodne z Australijskim Kodeksem Opieki i Wykorzystywania Zwierząt do Celów Naukowych (National Health and Medical Research Council of Australia) oraz Ustawą o Zapobieganiu Okrucieństwu wobec Zwierząt (1986). W sumie do tego badania wykorzystano 24 samice szczurów Dark Agouti (w wieku 8-9 tygodni). Grupy eksperymentalne składały się z: normalnej kohorty (n = 8), która nie otrzymała zastrzyku kolagenu ani implantu VNS; niestymulowana chorobowo kohorta (n = 8), która otrzymała implant i wstrzyknięcie kolagenu (nie przeprowadzono badań elektrofizjologicznych); oraz kohorta z chorobą stymulowaną (n = 8), która otrzymała implant, zastrzyk z kolagenu, badania elektrofizjologiczne i terapię VNS. Operacja implantacji nastąpiła 5 dni przed wstrzyknięciem kolagenu, a przyzwyczajenie do terapii VNS rozpoczęło się 4 dni po wstrzyknięciu kolagenu i trwało przez 7 dni. Terapię VNS stosowano od 11 do 17 dnia (włącznie) po wstrzyknięciu kolagenu15. Dla kohorty z chorobą stymulowaną badania elektrofizjologiczne wykonano bezpośrednio po zabiegu implantacji w znieczuleniu, w dniu wstrzyknięcia kolagenu, 10 dni po wstrzyknięciu kolagenu oraz w dniu zakończenia (17 dni po wstrzyknięciu kolagenu).
1. Sonikacja i sterylizacja matrycy elektrod
- Ustaw myjkę ultradźwiękową na częstotliwość 80 kHz i napełnij zbiornik ultradźwiękowy wodą z kranu. Zanurz matrycę elektrod w roztworze czyszczącym w czystym plastikowym pojemniku i umieść ją w zbiorniku ultradźwiękowym.
UWAGA: Roztwór czyszczący i czas sonikacji, który należy zastosować dla każdego etapu, podsumowano w Tabeli 1. Do każdego kroku używaj czystego pojemnika. - Umieść soniczny układ elektrod w worku sterylizacyjnym za pomocą czystych kleszczy poddanych sonikacji 0,5% płynnym roztworem czyszczącym w wodzie destylowanej i wypłukanych w wodzie destylowanej. Autoklawuj układ elektrod przez 45 minut w maksymalnej temperaturze 130 °C i pozostaw do wyschnięcia na czystej ławce.
2. Implantacja matrycy elektrod na nerwie błędnym w jamie brzusznej
UWAGA: W tym badaniu użyliśmy samic ciemnych szczurów agouti (w wieku 8-9 tygodni)15. Z powodzeniem zastosowaliśmy również ten protokół do chronicznego implantacji dorosłych samców szczurów Sprague-Dawley (w wieku 10-14 tygodni)10,16. Operacja jest przeprowadzana w warunkach aseptycznych, a wszystkie narzędzia, układ elektrod i materiały eksploatacyjne, takie jak gaza i bawełniane końcówki, są sterylizowane w autoklawie.
- Znieczulić szczura w komorze indukcyjnej przy użyciu 3% izofluranu i 1 l/min tlenu. Gdy nie ma odruchu pedałowania do szczypania palców, przenieś szczura na matę grzewczą z termostatem na stole operacyjnym i umieść maskę izofluranową na nosie.
- Monitoruj częstość oddechów i temperaturę w odbycie przez cały czas trwania operacji i dostosuj poziom izofluranu w zakresie od 1,5% do 2,5%, aby utrzymać częstość oddechów w zakresie od 40 do 62 oddechów na minutę. W razie potrzeby dostosuj ustawienie maty grzewczej, aby utrzymać zakres temperatury w odbycie w zakresie 35,9 - 37,5 °C.
- Przed rozpoczęciem operacji należy podać premedykację przeciwbólową podskórnie za pomocą strzykawek 1 ml z igłami 25 G (karprofen 5 mg/kg i buprenorfina 0,03 mg/kg podskórnie).
- Ogol się obficie wokół miejsca nacięcia, w tym obszar wzdłuż brzusznej linii środkowej od wyrostka ksylifoidalnego do końca klatki piersiowej, lędźwiową część pleców wzdłuż grzbietowej linii środkowej oraz lewą stronę ciała między kończyną przednią a tylną, aby umożliwić podskórne tunelowanie układu.
- Oczyść miejsca operowane okrężnymi ruchami trzy razy naprzemiennie z betadyną i alkoholem, a następnie umieść serwetę chirurgiczną na zwierzęciu. Bupiwakainę (1-2 mg/kg mc.) podawać podskórnie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 25G w miejsce nacięcia grzbietowego i brzusznego.
- Umieść zwierzę w pozycji leżącej brzusznej i wykonaj nacięcie o długości 2 cm na grzbiecie, w którym cokół przezskórny zostanie zakotwiczony za pomocą ostrza skalpela.
- Obróć szczura do pozycji leżącej grzbietowej i wykonaj 3 cm nacięcie na skórze wzdłuż linii środkowej tuż poniżej wyrostka ksylfoidalnego za pomocą ostrza skalpela. Przytrzymaj skórę w pobliżu miejsca nacięcia i za pomocą nożyczek preparacyjnych tępo wypreparuj warstwę skóry z warstwy mięśniowej wokół nacięcia.
- Aby umożliwić podskórne tunelowanie matrycy od cokołu do miejsca implantacji, należy umieścić zwierzę na prawym boku, wprowadzić hemostat z nacięcia brzusznego i sekcję w kierunku miejsca nacięcia grzbietowego. Odetnij krawędź nasadki igły i włóż zestaw elektrod, aby chronić go podczas transportu (Rysunek 1B). Używając rąk (nosić sterylne rękawice), tuneluj matrycę elektrod pod skórą w kierunku nacięcia brzusznego.
- Aby uzyskać dostęp do przełyku i nerwu błędnego, ponownie ułóż zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej. Wykonaj 3-centymetrowe nacięcie na warstwie mięśniowej wzdłuż linii środkowej poniżej wyrostka ksylifoidalnego, wystarczająco duże, aby odsłonić całą długość wątroby. Unikaj uszkodzenia wątroby na tym etapie.
- Wykonaj mniejsze nacięcie (mniej niż 1 cm) na warstwie mięśniowej bocznie (po lewej stronie zwierzęcia) do głównego nacięcia brzusznego. Przeprowadź tunel w matrycy elektrod przez to małe nacięcie za pomocą nasadki igły użytej w kroku 2.8, aby wprowadzić matrycę do jamy brzusznej.
UWAGA: Ten krok zmniejsza napięcie wywierane na główne miejsce nacięcia i zmniejsza ryzyko pęknięcia szwów. - Cofnij warstwy skóry i mięśni, aby utrzymać otwartą jamę brzuszną. Upewnij się, że chusteczki są wilgotne, używając bawełnianych końcówek i gazy nasączonej sterylną solą fizjologiczną do obchodzenia się z tkanką.
- Delikatnie cofnij wątrobę, przecinając otaczającą ją tkankę łączną za pomocą nożyczek Vannas i umieszczając retraktor na małym kawałku gazy nasączonej solą fizjologiczną w celu ochrony. Delikatnie cofnij żołądek, aby umożliwić wyprostowanie przełyku i leżącego nad nim nerwu błędnego, umieszczając zwijacz między przełykiem a żołądkiem.
UWAGA: Zwijacze są wykonane przez zaokrąglenie spiczastego końca haczyków na ryby. - Po odsłonięciu brzusznej powierzchni przełyku zidentyfikuj nerw błędny brzuszny i jego podgałęzie, w tym nerw wątrobowy, nerw trzewny i dwie gałęzie żołądka (Rysunek 1D).
- Przeciąć tkankę łączną łączącą nerw błędny jamy brzusznej z przełykiem za pomocą cienkich kleszczy i nożyczek Vannas i wyciąć długość nerwu tuż nad gałęziami wątroby i celiakii w kierunku przepony. Upewnij się, że nie rozerwiesz, nie rozciągasz ani nie szczypiesz nerwu. Umieść układ elektrod obok nerwu, aby potwierdzić, że wystarczająco dużo nerwu jest oddzielone od tkanki łącznej, aby zmieścić się w układzie.
- Po oczyszczeniu tkanki łącznej wokół nerwu, przełóż jedwabne szwy (7-0) po stronie elektrody mankietu matrycowego pod nerwem. Otwórz mankiet matrycy i ostrożnie umieść nerw w kanale matrycy.
- Upewnij się, że cała długość nerwu znajduje się wewnątrz kanału matrycy. Zwiąż szwy wokół mankietu, aby bezpiecznie zamknąć mankiet, aby upewnić się, że nerw nie wyślizgnie się z kanału. Przyciąć szwy.
- Używając jedwabnego szwu 7-0, zszyj zakładkę matrycy na przełyku, aby zabezpieczyć matrycę na miejscu i zapobiec jej skręceniu. Unikaj uszkadzania innych gałęzi nerwu błędnego lub wprowadzania igły zbyt głęboko w mięśnie gładkie przełyku.
- Delikatnie wyjmij retraktory i upewnij się, że cała gaza została usunięta z jamy brzusznej. Podaj 1-2 ml ciepłego sterylnego roztworu soli fizjologicznej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml do jamy brzusznej i ustaw wątrobę we właściwej pozycji.
- Zamknij warstwę mięśniową jedwabnym szwem 3-0 przy użyciu prostej techniki szwu biegowego, tworząc bezpieczne kwadratowe węzły z co najmniej 3 rzutami na obu końcach. Odstępy szwy ściśle do siebie (około 3 mm od siebie), aby zapobiec powikłaniom, takim jak przepuklina/wysunięcie wyrostka ksyloidalnego.
- Użyj szwu, aby zamknąć nacięcie otrzewnej wraz z nacięciem warstwy mięśniowej, aby zmniejszyć ryzyko zrostu tkanki.
- Za pomocą wchłanialnego materiału do szycia (Vicryl 4-0) zamknij nacięcie skóry. Użyj techniki szycia zakopanego, takiej jak szew pionowy materaca do zakopania lub szew skórny do zakopania, aby zapobiec usunięciu szwu przez zwierzę.
- Obróć zwierzę do pozycji leżącej brzusznej i za pomocą nożyczek przedłuż nacięcie grzbietowe do 4-5 cm i tępo wypreparuj warstwę mięśnia i skóry dalej, aby podstawa łącznika przezskórnego mogła leżeć płasko na warstwie mięśniowej.
- Używając jedwabnego szwu 3-0, wykonaj od 6 do 8 prostych przerywanych szwów wokół podstawy łącznika, aby przymocować go do warstwy mięśniowej pod spodem. Zamknij nacięcie skóry jedwabnym szwem 3-0, stosując technikę poziomego szwu materaca, zapewniając bezpieczne kwadratowe węzły przy co najmniej 3 rzutach.
UWAGA: Na tym etapie preferowane są plecione szwy jedwabne ze względu na ich łatwość obsługi i zdolność do tworzenia bezpieczniejszych węzłów w porównaniu ze szwami monofilamentowymi. - Po zakończeniu zabiegu należy podać roztwór Hartmanna podskórnie (1 ml/100 g/h). Wyłącz izofluran i pozwól zwierzęciu dojść do siebie na macie grzewczej podczas pracy z tlenem (1,5 l/min). Gdy szczur jest przytomny i w pełni mobilny, wróć do jego domowej klatki, umieszczonej na poduszce grzewczej, aż do całkowitego wyzdrowienia po znieczuleniu.
- Należy uważnie obserwować powrót zwierzęcia do zdrowia po wyleczeniu izofluranu i upewnić się, że zwierzę ma dostęp do jedzenia i picia. W ciągu następnych dwóch dni należy podać podskórnie analgezję pooperacyjną (karprofen 5 mg/kg mc., codziennie) w celu złagodzenia bólu. Monitoruj zwierzę co najmniej 2 razy dziennie i sprawdź, czy nie ma śladów wypróżniania, jakości sierści, poziomu aktywności i obecności obrzęku lub wydzieliny z ran chirurgicznych.
- Rekordową wagę zwierzęcia, aw rzadkim przypadku zwierzę traci 10% lub więcej, rozpocznij intensywne leczenie. Intensywne leczenie obejmuje podskórne podawanie płynów (roztwór Hartmanna, 2 x 10 ml) każdego dnia, dostarczanie dodatkowego pokarmu, takiego jak świeże warzywa i suplement diety w żelu, oraz umieszczenie połowy klatki na poduszce grzewczej z termostatem dla dodatkowego ciepła. Zwiększ częstotliwość monitorowania do czasu, aż zwierzę wyzdrowieje. W razie potrzeby należy kontynuować podawanie leku przeciwbólowego (karprofen 5 mg/kg mc., SQ, codziennie) w oparciu o skalę grymasu.
3. Badania elektrofizjologiczne
UWAGA: Rejestrowanie wywołanych złożonych potencjałów czynnościowych (ECAP) potwierdza prawidłowe umieszczenie matrycy elektrod na nerwie błędnym. Dodatkowo, rejestracja ECAP za pomocą opisanego powyżej układu elektrod dostarcza prawdopodobnego potwierdzenia aktywacji elektrycznej włókien C błędnych i suprathreshold VNS10,15.
- Zmierz wspólną impedancję uziemienia elektrod, aby ocenić ich integralność i wykryć wszelkie przerwy lub zwarcia przewodów przed zarejestrowaniem ECAP. Działające elektrody nerwu błędnego brzusznego in vivo powinny mieć wartości impedancji w zakresie 4 - 20 kΩ.
- Badane zwierzęta w znieczuleniu, tj. bezpośrednio po operacji, lub przytomne i swobodnie poruszające się. Wykonaj testy czuwania co najmniej 2-3 dni po zabiegu, aby umożliwić zagojenie się i ustabilizowanie ran chirurgicznych skóry. Zgromadź sprzęt wymagany do testów impedancji i elektrofizjologicznych, który obejmuje wykonany na zamówienie stymulator, urządzenie do akwizycji danych, izolowany wzmacniacz różnicowy oraz oprogramowanie do akwizycji i analizy danych, jak wymieniono w tabeli materiałów.
- W razie potrzeby owiń zwierzę ręcznikiem, podłącz do tylnego złącza przezskórnego, a drugi koniec podłącz do stymulatora. Aby przetestować wspólną impedancję uziemienia elektrod, należy zastosować dwufazowe impulsy prądu (100 μs na fazę i prąd 107 μA) między interesującą elektrodą a wszystkimi innymi elektrodami w układzie.
- Zmierz napięcie szczytowe na końcu pierwszej fazy przebiegu napięcia (całkowita wartość V) i oblicz impedancję całkowitą (wartość całkowita Z) za pomocą prawa Ohma (Z = napięcie/prąd).
- Podłączyć parę elektrod do stymulatora i parę elektrod do urządzenia rejestrującego i zastosować stymulację bipolarną w celu wygenerowania ECAP przy użyciu elektrody referencyjnej implantu VNS umieszczonej pod skórą jako odniesienia dla różnicowego zapisu ECAP. Wykonaj dwa zestawy nagrań uśrednionych z łącznej liczby 50 powtórzeń za pomocą oprogramowania do akwizycji i analizy danych.
- Użyj następujących ustawień dla pomiarów.
Prądy: od 0 do 2 mA w krokach co 0,1 mA;
Szerokość impulsu: 25 - 200 μs;
Przerwa międzyfazowa: 8 - 50 μs;
Szybkość stymulacji: 10 - 30 impulsów/s;
Częstotliwość próbkowania: 100 kHz;
Filtr: górnoprzepustowy 200 Hz, dolnoprzepustowy 2000 Hz, wzmocnienie napięcia 1 x 102. - Korzystając z oprogramowania do analizy danych, przeanalizuj odpowiedź ECAP, mierząc napięcie międzyszczytowe przebiegów w oknie analizy (4 - 10 ms po bodźcu, wskazywane przez cieniowanie w Rysunek 3A,B). Próg ECAP definiuje się jako minimalne natężenie prądu bodźca wytwarzające amplitudę odpowiedzi wynoszącą co najmniej 0,1 μVszczyt-szczyt w obu zestawach średnich zapisów elektrofizjologicznych. Poprawna odpowiedź zostanie powtórzona dla co najmniej dwóch bieżących poziomów powyżej progu i nie będzie obecna dla co najmniej dwóch bieżących poziomów poniżej progu10,15.
4. Przewlekłe VNS w jamie brzusznej u obudzonych szczurów
UWAGA: VNS brzuszny może być stosowany u obudzonych zwierząt, gdy rana chirurgiczna wokół łącznika przezskórnego zagoi się i ustabilizuje. Aby zmniejszyć reakcję na stres i umożliwić lepsze gromadzenie danych, zwierzęta są przyzwyczajone do środowiska obsługi i stymulacji przez testerów, jedną godzinę dziennie przez siedem dni przed zabiegiem implantacji i rozpoczęciem terapii VNS.
- Zmierz impedancję każdej elektrody zgodnie z opisem w kroku 3.4 przed zastosowaniem jakiegokolwiek VNS. Upewnij się, że impedancja elektrod stymulujących jest poniżej 20 kΩ.
- Podłącz do tylnego złącza przezskórnego, a drugi koniec podłącz do stymulatora zaprogramowanego do stosowania odpowiedniej stymulacji (np. 27 Hz, 1,6 mA, szerokość impulsu 200 μs z przerwą międzyfazową 50 μs, 30 s ON, 2,5 min off15) i włącz stymulator.
UWAGA: Chociaż często obserwuje się, że zwierzęta zasypiają podczas stymulacji, jeśli są odpowiednio przyzwyczajone, w miarę możliwości używaj z ochronnym materiałem zewnętrznym, takim jak stalowe cewki, aby zapobiec jego żuciu. - Obserwuj zwierzę na początku każdej sesji terapeutycznej VNS, aby upewnić się, że nie wystąpią żadne działania niepożądane, takie jak nadmierna pielęgnacja lub nagły wzrost/spadek poziomu aktywności zsynchronizowany z czasem stymulacji.
- Monitoruj co 30 minut, aby sprawdzić, czy nie jest skręcony lub odłączony. Aby stosować VNS przewlekle (np. 3 godziny dziennie przez 7 dni15), powtórz kroki 4.1-4.3 na początku każdej sesji.
UWAGA: Użycie komutatora może zmniejszyć ryzyko skręcenia i może wymagać rzadszego monitorowania.
Wyniki
Rejestracja wywołanych złożonych potencjałów czynnościowych (ECAPs, Rysunek 3A,B) bezpośrednio po operacji jest techniką, którą można wykorzystać w celu potwierdzenia prawidłowego umieszczenia nerwu w kanale matrycy oraz sprawdzenia, czy stymulacja skutecznie aktywuje nerw błędny.
Na Ryc. 3 u samic szczurów dark agouti (w wieku 8-9 tygodni) wszczepiono macierz elektrod VNS. U szczurów wybranych losowo do stymulacji terapeutycznej rejestrowano ECAP bezpośrednio po operacji (dzień 0, Ryc. 3A) oraz po zakończeniu sesji terapii VNS (dzień 23, Ryc. 3B). Obecność ECAP (Ryc. 3B) wskazywała, że natężenie stymulacji znajdowało się powyżej progu neuronalnego i że nerw został skutecznie aktywowany. Zwierzęta z grupy leczonej VNS wykluczano, jeśli nie zarejestrowano ECAP, ponieważ nie było gwarancji, że stymulacja została skutecznie dostarczona15. Latencja odpowiedzi neuronalnej (Ryc. 3A,B, wskazana zieloną strzałką) może służyć do oceny, która klasa włókien została aktywowana.
W poprzednich badaniach zaobserwowaliśmy, że większość odpowiedzi neuronalnych występuje zazwyczaj między 4 ms a 10 ms10,15. Biorąc pod uwagę, że odległość między parami stymulującymi a rejestrującymi wynosi 4,7 mm, przybliżona prędkość przewodzenia w tym oknie odpowiedzi wynosi 0,47 - 1,2 m/s, co jest zgodne z prędkością przewodzenia włókien C18.
Obserwuje się wzrost progu neuronalnego między dniem 0 (377 µA, Rycyna 3A) a dniem 23 (1335 µA, Rycyna 3B), co następuje w czasie prawdopodobnie z powodu niewielkiej, łagodnej włóknicy tworzącej się wokół styku tkanka-elektroda10,15.
Rysunek 3C przedstawia układ testowy oraz rozmieszczenie tylnego złącza, które pozostało stabilne przez cały 3-tygodniowy okres testowy15.
Rysunek 1: Miejsca szyjnej i brzusznej stymulacji nerwu błędnego (VNS). (A) Szyjna VNS jest stosowana powyżej odgałęzień do serca i dróg oddechowych, a brzuszna VNS poniżej tych odgałęzień. (B) Macierz elektrod jest wkładana do nasadki igły (z usuniętym rantem), aby chronić ją podczas tunelowania pod skórą. (C) Brzuszna macierz VNS u szczura zostaje zaimplantowana i zabezpieczona szwami (D) powyżej odgałęzień trzewnych i wątrobowych poniżej przepony. Skróty: VN = nerw błędny, b. = odgałęzienie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Macierz VNS u szczura. (A) Macierz VNS u szczura składa się z złącza przezskórnego i macierzy elektrod połączonych przewodem prowadzącym. (B) zakładkę znajdującą się w pobliżu macierzy elektrod można przyszyć do przełyku, aby pomóc w stabilizacji pozycji macierzy. Standardowa macierz do brzusznego nerwu błędnego szczura posiada dwie pary elektrod (E1 i E2 oraz E3 i E4). Obie pary elektrod mogą być wykorzystywane do stymulacji lub rejestracji. Złącze przezskórne jest zamontowane w regionie lędźwiowym zwierzęcia, a przewód prowadzący jest przeprowadzony podskórnie po lewej stronie zwierzęcia. Elektroda referencyjna wzdłuż przewodu prowadzącego jest umieszczana pod skórą po lewej stronie zwierzęcia po implantacji macierzy elektrod. Macierz elektrod jest implantowana na nerwie błędnym wzdłuż przełyku powyżej żołądka i tuż poniżej przepony. (C) Nadmiarowa długość przewodu prowadzącego po lewej stronie zwierzęcia pod skórą zapewnia odciążenie mechaniczne. Skróty: E = elektroda. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rycina 3: Typowe zapisy elektrofizjologiczne zarejestrowane z brzusznego nerwu błędnego podczas przewlekłej implantacji oraz szczur otrzymujący terapię VNS. (A) Każdy zapis elektrofizjologiczny stanowi średnią z 25 powtórzeń. Zielone obszary zacienione wskazują typową latencję odpowiedzi włókien C w brzusznym nerwie błędnym szczura, między 4 ms a 10 ms (przy użyciu macierzy elektrod z odległością 4,7 mm między parami elektrod stymulujących i rejestrujących, mierzoną od środka do środka). ECAPs są oznaczone zielonymi grotami strzałek. (B) Szczur otrzymujący terapię VNS poprzez złącze przezskórne na grzbiecie w klatce domowej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
| Roztwór czyszczący | Czas sonikacji |
| 1. 0,5% roztwór pyronegu w wodzie ultrapure | 15 min |
| 2. Woda ultrazczysta | 5 min |
| 3. Woda ultrazczysta | 5 min |
| 4. 96% etanol | 10 min |
| 5. Woda ultrapure | 5 min |
| 6. Woda ultrazczysta | 5 min |
Tabela 1: Etapy sonikacji. Tabela zawiera szczegółowe informacje na temat przeprowadzonej tutaj sonikacji.
Dyskusja
Ta metoda chirurgii implantacji VNS w jamie brzusznej i przewlekłej stymulacji nerwu błędnego oraz rejestracji ECAP była z powodzeniem stosowana i dobrze tolerowana przez 5 tygodni u szczurów po implantacji 10,15,16. Retrakcja żołądka, wątroby i jelit w celu uzyskania dobrego widoku przełyku i nerwu błędnego jest jednym z kluczowych etapów operacji. Po wycofaniu tych narządów nerw błędny staje się dostępny. Retrakcja żołądka grozi upośledzeniem oddychania, w takim przypadku zwijacz jest poluzowany. Dodatkowo, podczas przecinania tkanki łącznej otaczającej przełyk w celu uzyskania dostępu do nerwu błędnego, należy zachować ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia przepony, co może prowadzić do zakłócenia ciśnienia w klatce piersiowej, ciężkiego zahamowania oddychania i śmierci zwierzęcia podczas operacji. Zaleca się, aby tkanka łączna otaczająca przełyk została oczyszczona na tyle, aby zmieścić matrycę elektrod powyżej gałęzi wątroby i celiakii.
Możliwe powikłania pooperacyjne obejmują zrosty tkanek wokół przełyku, przepuklinę i pooperacyjną niedrożność jelit. Przyleganie tkanek można zminimalizować poprzez obfite stosowanie sterylnej soli fizjologicznej w jamie brzusznej podczas operacji i przed zamknięciem jamy brzusznej. Szew zamykający warstwę otrzewnej wraz z warstwą mięśniową powinien również pomóc w ochronie narządów wewnętrznych i zmniejszeniu zrostu tkanek. Ponieważ wątroba łatwo ulega posiniaczeniu, a manipulacja jelitem może powodować pooperacyjną niedrożność jelit, ważne jest minimalne i delikatne obchodzenie się z tymi narządami. Wreszcie, szczególnie u cięższych zwierząt, bardzo ważne jest, aby szwy do szwów biegowych były umieszczane blisko siebie lub zamiast tego podczas zamykania jamy brzusznej stosuje się szwy przerywane, aby zapobiec wysunięciu się przepukliny i wyrostka ksylidowego.
W ramach standardowej opieki pooperacyjnej zwierzęta powinny być regularnie badane po operacji pod kątem objawów wypróżniania, zmiany masy ciała, sierści, poziomu aktywności oraz obecności obrzęku lub wydzieliny z ran chirurgicznych. W rzadkich przypadkach może wystąpić nadmierna wydzielina, zaczerwienienie i obrzęk wokół ran pooperacyjnych, co sugeruje infekcję. W takich przypadkach podaje się antybiotyki, takie jak Baytril (0,2 mg/ml w wodzie pitnej przez 3-5 dni) do momentu ustąpienia infekcji. Podczas gdy normalne szczury na ogół dobrze wracają do zdrowia po operacji, szczury z pogorszonymi warunkami zdrowotnymi (tj. modelami choroby) mogą potrzebować więcej czasu, zanim testy i stymulacja będą mogły rozpocząć się po operacji. Właściwa opieka pooperacyjna (podsumowana w kroku 2.26) dla takich zwierząt ma zasadnicze znaczenie dla dobrostanu zwierząt.
Jednym z ograniczeń tego protokołu jest to, że chociaż konstrukcja układu elektrod VNS szczura doskonale nadaje się do rejestrowania wolniejszej odpowiedzi światłowodu C, odstępy między parami elektrod (4,7 mm) mogą nie być odpowiednie do uchwycenia aktywności niektórych szybszych typów włókien. Chociaż całkowita długość matrycy jest ograniczona dostępną długością nerwu błędnego podprzeponowego powyżej gałęzi wątroby i celiakii, te matryce VNS można zakupić z dodatkowymi parami elektrod. Takie tablice mogą być wykorzystane do zbadania zastosowania stymulacji blokującej, która może manipulować kierunkiem VNS16,19, rozszerzając możliwe zastosowanie tego modelu.
Rejestrujące ECAP mogą być wykorzystane do oceny rozmieszczenia matrycy wokół nerwu, jakości interfejsu elektrod i zdolności urządzenia do aktywacji włókien błędnych. Nerw błędny jest nerwem autonomicznym, składającym się w 97%-99% z włókien C18,20, a pozostałe 1%-3% włókien to włókna mielinizowane (funkcja nieznana), co potwierdzono w badaniach transmisyjnej mikroskopii elektronowej20. Odpowiedzi na rycinie 3 są prawdopodobnie spowodowane elektrycznie wywołaną aktywnością nerwu błędnego, a nie aktywnością miogenną, ponieważ pasują do kształtu i formy złożonego potencjału czynnościowego dla nerwu obwodowego21,22. Ponadto typowa prędkość przewodzenia ECAP nerwu błędnego brzusznego szczura wynosi 0,47 - 1,2 m/s, co jest zgodne z prędkością przewodzenia włókien C18. We wstępnych badaniach pilotażowych nad opracowaniem urządzenia nagrania zostały zweryfikowane w znieczulonych badaniach na szczurach poprzez przecięcie nerwu błędnego między elektrodą stymulującą a rejestrującą, co spowodowało eliminację wszelkich wywołanych reakcji (dane nie pokazane). Układ elektrod został zaprojektowany w taki sposób, że nerw błędny znajduje się w kanale platynowo-silikonowym, skutecznie izolując go elektrycznie od otaczających struktur strukturalnych (np. przełyku). Stymulacja i rejestracja są również wykonywane przy użyciu konfiguracji bipolarnych z wykorzystaniem sąsiednich elektrod, co dodatkowo minimalizuje możliwości rozprzestrzeniania się stymulacji i zanieczyszczenia zapisu. Konsekwentnie zgłaszaliśmy podobne przebiegi po elektrycznej stymulacji nerwu błędnego w jamie brzusznej w preparatach znieczulonych i obudzonych 10,15,16,19,23, w tym w badaniach, w których fizjologiczne efekty stymulacji potwierdziły aktywację nerwu błędnego 10,15,16. Chociaż nie można wykluczyć zanieczyszczenia zapisu aktywnością miogenną, odpowiedzi miogenne można zwykle odróżnić od odpowiedzi neuronalnej ze względu na ich szybki i duży profil amplitudywzrostu 24 w przeciwieństwie do stopniowanych, mniejszych profili wzrostu obserwowanych w naszych badaniach10,15 i na rysunku 3A,B: Dzień 0: obecny poziom opóźnienia 377 μA: 7,24 ms > aktualnym poziomie 1750 μA: 6,74 ms.
Chociaż wykazano, że aktywacja podprzeponowego nerwu błędnego, który składa się prawie wyłącznie z włókien C20,25, jest skuteczna w leczeniu przedklinicznych modeli nieswoistego zapalenia jelit10, reumatoidalnego zapalenia stawów15 i cukrzycy16, optymalne parametry VNS w jamie brzusznej w celu maksymalizacji jego efektu terapeutycznego nie zostały w pełni zbadane14. Dalsze badania na ten temat przyniosłyby ogromne korzyści, ponieważ zastosowanie VNS w jamie brzusznej w leczeniu nieswoistych zapaleń jelit jest obecnie badane w pierwszym badaniu klinicznym z udziałem ludzi. Ponieważ uważa się, że działanie przeciwzapalne VNS w jamie brzusznej jest ogólnoustrojowe26, istnieje duże prawdopodobieństwo, że terapia ta jest również skuteczna w przypadku innych stanów zapalnych, takich jak toczeń rumieniowatyukładowy 27 i przewlekła choroba nerek28.
Nasze badania na szczurach pokazują, że VNS w jamie brzusznej ma wyjątkową przewagę nad VNS w szyjce macicy, ponieważ nie powoduje skutków sercowych lub oddechowych poza celem10. Stymulacja o wyższej intensywności może być stosowana przez dłuższy czas bez uszczerbku dla oddychania lub tętna zwierzęcia. W połączeniu z możliwością monitorowania wywołanej odpowiedzi neuronalnej potwierdzającej ponadprogową intensywność stymulacji, metoda ta stanowi doskonały model do badania skuteczności VNS w jamie brzusznej w leczeniu różnych chorób. Ponieważ zastosowanie VNS nadal się rozwija, oczekuje się, że zastosowanie tej metody VNS również się rozszerzy.
Oświadczenia
Badanie to zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.
Podziękowania
Opracowanie implantu VNS dla szczurów zostało sfinansowane przez Agencję Zaawansowanych Projektów Badawczych w Obronności (DARPA) BTO, pod auspicjami Dr. Douga Webera i Dr. Erica Van Giesona przez Centrum Systemów Kosmicznych i Morskich (Kontrakt nr N66001-15-2-4060). Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez Fundusz Inkubacji Instytutu Bioniki. Instytut Bioniki docenia wsparcie, jakie otrzymuje od rządu stanu Wiktoria w ramach Programu Operacyjnego Wsparcia Infrastrukturalnego. Chcielibyśmy podziękować Panu Owenowi Burnsowi za projekt mechaniczny, prof. Johnowi B. Furnessowi za ekspertyzę anatomiczną, prof. Robertowi K. Shepherdowi za interfejs peryferyjny, neuromodulację i doświadczenie w nagrywaniu, Pani Philippie Kammerer i Pani Amy Morley za hodowlę i testy zwierząt, Pani Fenelli Muntz i dr Peta Grigsby za ich porady dotyczące pooperacyjnej opieki nad zwierzętami oraz Pani Jenny Zhou i zespołowi produkującemu elektrody z NeoBionica za produkcję matryc VNS.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,9% sól fizjologiczna | Briemarpak | SC3050 | |
| Baytril Bayer | |||
| Betadine | Sanofi-Aventis Healthcare | ||
| Buprelieve (Buprenorfina) | Jurox | ||
| Urządzenie do akwizycji danych | National Instruments | USB-6210 | |
| DietGel Boost (suplement diety w żelu) | ClearH2O | ||
| Pęseta Dumont, styl 5 | ProSciTech | T05-822 | |
| Pęseta Dumont, typ N7, samozamykająca | ProSciTech | EMS72864-D | |
| Roztwór Elmasonic P | Elmy | ||
| Hartmann | Baxter | AHB2323 | |
| Hemostat | ProSciTech | TS1322-140 | |
| HPMC/PAA Nawilżający żel pod oczy | Alcon | ||
| Igor Pro-8 oprogramowanie | Wavemetrics, Inc | ||
| Isoflo (Isoflurane) | Zoetis | ||
| Izolowany wzmacniacz różnicowy | World Precision Instruments | ISO-80 | |
| Płynny pironeg | Diversey | HH12291 | roztwór czyszczący |
| Marcaine (Bupiwakaina) | Osika | ||
| Serweta z tworzywa sztucznego | Multigate | 22-203 | |
| Implant nerwu błędnego szczura | Neo-Bionica | ||
| Rimadyl (Carprofen) | Zoetis | ||
| Szew jedwabny 3-0 | Ethicon | ||
| Szew jedwabny 7-0 | Autoklaw Ethicon | ||
| SteriClave | Cominox | 24S | |
| Sterylny jednorazowy fartuch chirurgiczny | Zebravet | DSG-S | |
| Suicide Haczyki niklowe | Jarvis Walker | ||
| Ultraczysta woda | Merck Millipre | Milli-Q Direct | |
| Podkłady | Nożyczki Zebravet | UP10SM | |
| Vannas | ProSciTech | EMS72933-01 | |
| Vicryl szew 4-0 | Ethicon |
Bibliografia
- Fang, Y. T., et al. Neuroimmunomodulation of vagus nerve stimulation and the therapeutic implications. Front Aging Neurosci. 15, 1173987(2023).
- Fudim, M., et al. Device therapy in chronic heart failure: JACC state-of-the-art review. J Am Coll Cardiol. 78 (9), 931-956 (2021).
- Sinniger, V., et al. A 12-month pilot study outcomes of vagus nerve stimulation in Crohn's disease. Neurogastroenterol Motil. 32 (10), 13911(2020).
- Koopman, F. A., et al. Vagus nerve stimulation in patients with rheumatoid arthritis: 24 month safety and efficacy. Arthritis Rheumatol. 70, (2018).
- Genovese, M. C., et al. Safety and efficacy of neurostimulation with a miniaturised vagus nerve stimulation device in patients with multidrug-refractory rheumatoid arthritis: a two-stage multicentre, randomised pilot study. Lancet Rheumatol. 2 (9), e527-e538 (2020).
- Lu, J. Y., et al. A randomized trial on the effect of transcutaneous electrical nerve stimulator on glycemic control in patients with type 2 diabetes. Sci Rep. 13 (1), 2662(2023).
- Huang, F., et al. Effect of transcutaneous auricular vagus nerve stimulation on impaired glucose tolerance: a pilot randomized study. BMC Complement Altern Med. 14, 203(2014).
- Chang, R. B., Strochlic, D. E., Williams, E. K., Umans, B. D., Liberles, S. D. Vagal sensory neuron subtypes that differentially control breathing. Cell. 161 (3), 622-633 (2015).
- McAllen, R. M., Shafton, A. D., Bratton, B. O., Trevaks, D., Furness, J. B. Calibration of thresholds for functional engagement of vagal A, B and C fiber groups in vivo. Bioelectron Med (Lond). 1 (1), 21-27 (2018).
- Payne, S. C., et al. Anti-inflammatory effects of abdominal vagus nerve stimulation on experimental intestinal inflammation). Front Neurosci. 13, 418(2019).
- Ben-Menachem, E., Revesz, D., Simon, B. J., Silberstein, S. Surgically implanted and non-invasive vagus nerve stimulation: a review of efficacy, safety and tolerability. Eur J Neurol. 22 (9), 1260-1268 (2015).
- Parhizgar, F., Nugent, K., Raj, R. Obstructive sleep apnea and respiratory complications associated with vagus nerve stimulators. J Clin Sleep Med. 7 (4), 401-407 (2011).
- Mao, H., Chen, Y., Ge, Q., Ye, L., Cheng, H. S. hort- and long-term response of vagus nerve stimulation therapy in drug-resistant epilepsy: A systematic review and meta-analysis. Neuromodulation. 25 (3), 327-342 (2022).
- Payne, S. C., Furness, J. B., Stebbing, M. J. Bioelectric neuromodulation for gastrointestinal disorders: effectiveness and mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (2), 89-105 (2019).
- Payne, S. C., Romas, E., Hyakumura, T., Muntz, F., Fallon, J. B. Abdominal vagus nerve stimulation alleviates collagen-induced arthritis in rats. Front Neurosci. 16, 1012133(2022).
- Payne, S. C., et al. Blood glucose modulation and safety of efferent vagus nerve stimulation in a type 2 diabetic rat model. Physiol Rep. 10 (8), 15257(2022).
- Shepherd, R. K., Fallon, J. B., Payne, S. C., Burns, O., Furness, J. B. Peripheral nerve electrode array. US patent. , US-2020230400-A1 (2019).
- Castoro, M. A., et al. Excitation properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Exp Neurol. 227 (1), 62-68 (2011).
- Payne, S. C., et al. Differential effects of vagus nerve stimulation strategies on glycemia and pancreatic secretions. Physiol Rep. 8 (11), 14479(2020).
- Prechtl, J. C., Powley, T. L. The fiber composition of the abdominal vagus of the rat. Anat Embryol (Berl). 181 (2), 101-115 (1990).
- Gasser, H. S., Erlanger, J. The role played by the sizes of the constituent fibers of a nerve trunk in determining the form of its action potential wave. Am J Physiol-Legacy Content. 80 (3), 522-547 (1927).
- Parker, J. L., Shariati, N. H., Karantonis, D. M. Electrically evoked compound action potential recording in peripheral nerves. Bioelectron Med. 1 (1), 71-83 (2018).
- Villalobos, J., et al. Stimulation parameters for directional vagus nerve stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 16(2023).
- Verma, N., et al. Characterization and applications of evoked responses during epidural electrical stimulation. Bioelectron Med. 9 (1), 5(2023).
- Hoffman, H. H., Schnitzlein, H. N. The numbers of nerve fibers in the vagus nerve of man. Anat Rec. 139, 429-435 (1961).
- Bassi, G. S., et al. Anatomical and clinical implications of vagal modulation of the spleen. Neurosci Biobehav Rev. 112, 363-373 (2020).
- Courties, A., Berenbaum, F., Sellam, J. Vagus nerve stimulation in musculoskeletal diseases. Joint Bone Spine. 88 (3), 105149(2021).
- Hilderman, M., Bruchfeld, A. The cholinergic anti-inflammatory pathway in chronic kidney disease-review and vagus nerve stimulation clinical pilot study. Nephrol Dial Transplant. 35 (11), 1840-1852 (2020).
Przedruki i uprawnienia
