Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

1.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65899

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University, 2Laboratory of Multi-Dimensional Imaging, International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 3Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, 4Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Streszczenie

Mózg ssaków przechodzi dynamiczne zmiany rozwojowe zarówno na poziomie komórkowym, jak i obwodowym w okresie prenatalnym i postnatalnym. Po odkryciu licznych genów przyczyniających się do tych zmian rozwojowych, obecnie wiadomo, że aktywność neuronalna również w znacznym stopniu moduluje te procesy. W rozwijającej się korze mózgowej neurony wykazują zsynchronizowane wzorce aktywności, które są wyspecjalizowane w każdym podstawowym obszarze czuciowym. Wzorce te znacznie różnią się od tych obserwowanych w dojrzałej korze mózgowej, podkreślając ich rolę w regulacji procesów rozwojowych specyficznych dla danego obszaru. Niedobory aktywności neuronalnej podczas rozwoju mogą prowadzić do różnych chorób mózgu. Odkrycia te podkreślają potrzebę zbadania mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw wzorców aktywności w rozwoju neuronów. Niniejszy artykuł podsumowuje szereg protokołów do wizualizacji pierwotnych obszarów czuciowych i aktywności neuronalnej u nowonarodzonych myszy, do obrazowania aktywności poszczególnych neuronów w podpolach kory mózgowej za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo oraz do analizy korelacji aktywności związanych z podpolem. Pokazujemy reprezentatywne wyniki patchworkowej aktywności synchronicznej w obrębie poszczególnych beczek w korze somatosensorycznej. Omawiamy również różne potencjalne zastosowania i niektóre ograniczenia tego protokołu.

Wprowadzenie

Kora mózgowa zawiera kilka obszarów czuciowych o różnych funkcjach. Obszary otrzymują dane wejściowe pochodzące z odpowiadających im narządów zmysłów, w większości przenoszone przez rdzeń kręgowy lub pień mózgu i przekazywane przez thalamus1,2. Warto zauważyć, że neurony w każdym podstawowym obszarze czuciowym wykazują wyjątkowo zsynchronizowaną aktywność we wczesnych stadiach rozwoju, które również pochodzą z narządów zmysłów lub niższych ośrodków nerwowych, ale zasadniczo różnią się od aktywności obserwowanej w dojrzałej korze mózgowej3.

U noworodków gryzoni, na przykład, główny obszar widzenia (V1) wykazuje aktywność falową, która zaczyna się w siatkówce (fala siatkówkowa) i rozchodzi się przez całą ścieżkę wzrokową, zachowując przy tym retinotopię4. Pierwszorzędowy obszar słuchowy (A1) wykazuje aktywność synchroniczną zorganizowaną w podregiony w kształcie pasma, które odpowiadają pasmom izoczęstotliwości w dojrzałym mózgu. Aktywność emanuje z wewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka5,6. Kora beczkowata w pierwotnym obszarze somatosensorycznym (S1) wykazuje wzorc aktywności podobny do patchworku, w którym neurony warstwy 4 w poszczególnych beczkach, a mianowicie neurony reagujące na poszczególne wąsy, są synchronicznie aktywowane7. Chociaż sugeruje się, że pochodzi ze zwoju nerwu trójdzielnego, źródło aktywności pozostaje nieznane7. W związku z tym wzorce aktywności noworodków są wyspecjalizowane zarówno w obrębie każdego podstawowego obszaru sensorycznego, jak i w obrębie podobszarów wewnątrzpowierzchniowych. Jednoczesna wizualizacja aktywności neuronalnej i struktury pierwotnych obszarów czuciowych może ułatwić badanie wkładu tych wzorców aktywności w rozwój systemów sensorycznych.

W tym artykule podsumowaliśmy szereg protokołów: (1) wizualizacji indywidualnych aktywności neuronalnych za pomocą rzadkiego znakowania GCaMP i głównych obszarów czuciowych za pomocą myszy TCA-RFP, które wyrażają czerwone białko fluorescencyjne w aksonach wzgórzowo-korowych7, (2) do obrazowania aktywności na poziomie pojedynczej komórki u noworodków myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivooraz (3) w celu przeanalizowania korelacji aktywności w korze beczkowej S1. Reprezentatywne wyniki pokazują zsynchronizowaną aktywność przypominającą patchwork, w obrębie pojedynczych beczek myszy z rodziny (P)6 w dniu pourodzeniowym. Pomimo pewnych ograniczeń, technika ta może być stosowana do obrazowania przewlekłego, obrazowania szerokokątnego w wielu obszarach czuciowych i różnych eksperymentów manipulacyjnych. Wieloaspektowa analiza aktywności neuronalnej podczas rozwoju wzbogaci nasze zrozumienie mechanizmów tworzenia obwodów mózgowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach Uniwersytetu Kumamoto oraz Narodowego Instytutu Genetyki, a protokoły zostały zatwierdzone przez odpowiednie komisje ds. eksperymentów na zwierzętach.

1. Elektroporacja in utero (IUE)

  1. Krzyżuj samce myszy TCA-RFP na tle szczepu ICR z samicami myszy ICR typu dzikiego. Następnego dnia wcześnie rano sprawdź obecność czopa pochwowego w celu potwierdzenia kopulacji. Po 2 tygodniach obejrzyj brzuch samic, aby sprawdzić wystąpienie ciąży.
  2. Przygotować roztwór plazmidu o stężeniu 5 ng/µL TRE-nCre, 1 µg/µL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE oraz 0,02% błękitu trypanu w ddH2O2Sposób rzadkiego znakowania neuronów za pomocą GCaMP z wykorzystaniem systemu Supernova8.
  3. Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający 0,5 mg/ml karprofenu i 0,01 mg/ml buprenorfiny. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej.
  4. W 14. dniu embrionalnym (E14) przeprowadź IUE zgodnie z poniższym opisem. Metody IUE są w zasadzie identyczne z tymi opisanymi w poprzednich raportach.9,10,11.
    1. Przetrzyj blat laboratoryjny 70% etanolu lub roztworem glutaraldehydu. Sterylizuj wszystkie instrumenty chirurgiczne w autoklawie. Noś maskę i fartuch laboratoryjny, aby zmniejszyć ryzyko zakażenia myszy.
    2. Przygotować szklane mikropipety za pomocą wyciągacza do mikropipet. Pobrać roztwór mieszaniny plazmidów do szklanej mikropipety, używając rurki aspiracyjnej.
    3. Wprowadź w stan znieczulenia ciężarne myszy w 14. dniu ciąży (E14), stosując izofluran (2,0% w powietrzu). Utrzymuj znieczulenie myszy podczas procedury za pomocą izofluranu (1,2% w powietrzu). Uciśnij palec u stopy, aby upewnić się, że znieczulenie jest wystarczająco głębokie. Zastosuj maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.
    4. Zdezynfekuj obszar brzucha co najmniej trzy razy, stosując naprzemiennie środek do szorowania na bazie jodu oraz 70% etanol. Nałóż jałowy obłożnik, aby osłonić pole operacyjne. Wykonaj cięcie w linii środkowej i wyprowadź macicę na obłożnik.
    5. Należy powtarzać zakraplanie ciepłej soli fizjologicznej na macicę, aby zapobiec jej wysychaniu lub ochłodzeniu aż do momentu zamknięcia brzucha (Krok 1.4.8).
    6. Za pomocą mikropipety i rurki aspiracyjnej należy pojedynczo wstrzyknąć roztwór plazmidu do jednej strony komory bocznej mózgu embrionów.
    7. Używając elektrody pęsetowej, należy uchwycić głowy embrionów i za pomocą elektroporatora podać pięć prostokątnych impulsów elektrycznych (40 V, 50 ms) w odstępach 1 s.
    8. Wprowadź macicę z powrotem do jamy brzusznej. Wprowadź do jamy około 3 ml ciepłego roztworu soli fizjologicznej. Zaszyj błonę otrzewną oraz skórę brzucha. Podaj roztwór przeciwbólowy w 10 μL/g masa (karprofen w stężeniu 5 μg/g masę ciała i buprenorfinę w dawkach 0.1 μg/g (masy) podskórnie w karku.
  5. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej na podkładce grzewczej (37 °Cdo czasu wybudzenia z narkozy. Położyć mysz na brzuchu, aby zapobiec zachłyśnięciu gardła językiem i śliną. Trzymać mysz oddzielnie od pozostałych osobników i monitorować ją do momentu powrotu do normalnej motoryki. Następnie umieścić mysz z powrotem w klatce.
  6. Po urodzeniu należy przeprowadzić genotypowanie w celu sprawdzenia obecności allelu RFP i uśmiercić szczęta pozbawione tego allelu. Krok ten jest zalecany, zwłaszcza jeśli obrazowanie odbywa się w drugim tygodniu po urodzeniu, kiedy sygnał TCA-RFP jest słaby i trudny do zweryfikowania w punkcie 2.2.7.

2. Operacja okna czaszkowego

  1. Przed dniem operacji przygotować bufor kory zawierający 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 oraz 2 mM MgSO4 w ddH2O (pH dostrojone do 7,4 za pomocą 1 M NaOH)12. Bufor wysterylizować za pomocą filtra próżniowego.
    UWAGA: Bufor można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy. Wymagana objętość to 5-10 mL na szczenię.
  2. Kolejne kroki wykonać w dniach P3-12. Należy również zapoznać się z wcześniejszymi raportami opisującymi tę procedurę13,14.
    1. Wymieszać 50 mg agarozy z 5 mL buforu kory i całkowicie rozpuścić agarozę poprzez podgrzewanie. Przenieść część roztworu do probówki 1,5 mL i utrzymać w temperaturze 42 °C.
    2. Przenieść część buforu kory do probówki stożkowej 50 mL i przechowywać w temperaturze pokojowej. Przenieść część soli fizjologicznej do pojemnika (np. zakrętki probówki stożkowej 50 mL) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający 0,01 mg/mL buprenorfiny. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    4. Wszystkie instrumenty chirurgiczne wysterylizować w autoklawie. Mikroskop stereoskopowy z fluorescencją zdezynfekować 70% etanolem.
    5. Użyć waporyzatora izofluranu, aby wprowadzić szczenię w stan znieczulenia izofluranem (2,0% w powietrzu). Monitorować szczenię i wyjąć je, gdy oddech lekko spowolni.
      UWAGA: Jeśli znieczulenie jest przedłużone, oddech szczenięcia może ustać na kilka sekund. Nawet jeśli oddech zostanie przywrócony, przedłużone znieczulenie może zmniejszyć przepływ krwi w mózgu szczenięcia i spowodować nieodwracalne uszkodzenie mózgu.
    6. Zdezynfekować głowę szczenięcia co najmniej trzy razy, stosując naprzemiennie środek myjący na bazie jodu oraz 70% etanol. Umieścić szczenię na macie grzewczej (35 °C) pod mikroskopem stereoskopowym z fluorescencją. Cały czas utrzymywać znieczulenie szczenięcia izofluranem (1,5%-2,5% w powietrzu).
    7. Wybrać szczenięta wykazujące ekspresję TCA-RFP i GCaMP, obserwując fluorescencję przez czaszkę. Eutanazować szczenięta, które nie wykazują ekspresji obu białek.
    8. Ostrożnie usunąć skórę głowy nad półkulami mózgu tak szeroko, jak to możliwe, aby nie spowodować krwawienia. Przetrzeć czaszkę sterylnym tamponem nasączonym solą fizjologiczną w celu usunięcia tkanki łącznej.
    9. Po wyschnięciu czaszki przykleić naciętą powierzchnię skóry głowy do czaszki za pomocą kleju tkankowego.
    10. Przenieść szczenię na matę grzewczą 37 °C w celu wybudzenia z narkozy. Odczekać co najmniej 15 min, aby klej stężał.
      UWAGA: Można zrobić przerwę do 1 h przed przejściem do następnego kroku. W tym czasie w podobny sposób przygotować pozostałe szczenięta, jeśli jest to konieczne.
    11. Znieczulić szczenię izofluranem. Umieścić znieczulone szczenię (1,5%-2,5% izofluranu w powietrzu) na macie grzewczej (37 °C) pod mikroskopem stereoskopowym z fluorescencją.
      UWAGA: Jeśli znieczulenie przedłuży się ponad czas trwania punktu końcowego (60 min), eutanazować szczenię poprzez dekapitację podczas znieczulenia izofluranem.
    12. Zaznaczyć miejsce ekspresji GCaMP na czaszce sterylnym markerem permanentnym. Nanieść bufor kory na to miejsce.
    13. Wsunąć róg żyletki w czaszkę. Powoli naciskać ostrze, aby zeskrobać czaszkę i wykonać otwór. Odłamać pękniętą część czaszki pęsetą i usunąć ją.
    14. Sprawdzić, czy otwór czaszkowy został poprawnie wykonany, obserwując naczynia krwionośne w otworze. W przypadku wystąpienia krwawienia szybko wypłukać otwór buforem kory za pomocą mikropipety. Powtarzać płukanie do całkowitego ustąpienia krwawienia.
    15. Nanieść kroplę buforu kory do otworu czaszkowego i umieścić nad otworem sterylną okrywkę szklaną o średnicy 3 mm. Usunąć nadmiar buforu za pomocą tkaniny włókninowej. Odczekać do wyschnięcia obszaru wokół szkła.
    16. Nanieść ciepły roztwór agarozy wokół krawędzi szkła za pomocą mikropipety. Ponieważ nadmiar agarozy może osłabić sygnały fluorescencyjne, usunąć nadmiar roztworu spod szkła, delikatnie naciskając szkło od góry.
    17. Usunąć pęsetą agarozę znajdującą się na szkle lub w oddali od krawędzi szkła. Pozostawić agarozę wyłącznie wokół zewnętrznego obwodu szkła.
    18. Odczekać do stężenia agarozy. Jeśli w wyniku kurczenia się agarozy powstanie przestrzeń pod szkłem, dodać roztwór agarozy z boku, aby pokryć całą krawędź szkła. Usunąć wszelkie ciecze z powierzchni czaszki tkaniną włókninową.
    19. Wymieszać proszek i ciecz żywicy akrylowej w gumowym pojemniku. Odessać mieszaninę mikropipetą i nalać ją tak, aby pokryć żywicą agarozę otaczającą krawędź szkła.
      UWAGA: Ponieważ żywica tężeje wkrótce po zmieszaniu proszku i cieczy, należy je mieszać wielokrotnie przed aplikacją. Ilości potrzebne przy każdym mieszaniu to ~500 µL cieczy i ~0,15 g proszku.
    20. Przymocować tytanowy pręt za pomocą żywicy na przeciwległej półkuli. Utrzymać kąt pręta równolegle do okrywki szklanej. Pokryć całą powierzchnię czaszki żywicą.
    21. Podać podskórnie u nasady szyi roztwór przeciwbólowy w dawce 10 μL/g masy ciała (buprenorfina 0,1 μg/g masy ciała). Przenieść szczenię na matę grzewczą 37 °C w celu wybudzenia z narkozy. Odczekać >60 min na stężenie żywicy przed obrazowaniem.
      UWAGA: Przed obrazowaniem zrobić przerwę od 1 do 5 h. W tym czasie w podobny sposób przeprowadzić operację u pozostałych szczeniąt.

3. Dwufotonowe obrazowanie wapnia

  1. Przymocuj goniometr dwuosiowy z płytką tytanową do płyty stolika z pozycjonowaniem XY znajdującego się pod mikroskopem. Zainstaluj podkładkę grzewczą (35 °C) na stoliku mikroskopu.
  2. Uruchom oprogramowanie do skanowania z następującymi ustawieniami: Piksele, 512 x 512; Skanowanie dwukierunkowe, WŁ.; Uśrednianie, brak; obszar obrazowania, 600 x 600 µm z obiektyw 20xSkonfiguruj ustawienia tak, aby szybkość skanowania jest szybszy niż 1 Hz.
  3. Umieść szczenię na podgrzewaczu i przymocuj tytanowy pręt mocujący do głowy do tytanowej płytki za pomocą śrub. Utrzymuj szczenię w znieczuleniu, stosując port rurkowy do podawania izofluranu (1,5–2,0% w powietrzu).
  4. Koryguj poziomo kąt okna za pomocą goniometru. Włącz podświetlenie i obserwuj powierzchnię mózgu przy użyciu obiektywu 5x, a następnie wybierz obszar obrazowania poprzez pozycjonowanie w osiach XY.
  5. Zakroplić oko kroplami do oczu na oknie czaszkowym. Przełączyć obiektyw na soczewkę imersyjną w wodzie 20x. Obserwować powierzchnię kory, aby potwierdzić widoczność przepływu krwi na powierzchni mózgu.
  6. Wyłącz podświetlenie tła i przeskanuj powierzchnię mózgu w trybie jednofotonowym. Zwiększ moc lasera, aby uzyskać widoczną zieloną autofluorescencję szkła i powierzchni mózgu.
  7. Obniż stężenie izofluranu do 1,0%–1,5%. Przykryj mikroskop, aby uniknąć przecieków światła. Przełącz oprogramowanie do skanowania w tryb dwufotonowy.
  8. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie detektora odpowiednio do skanowania sygnałów GCaMP i RFP. Znajdź głębokość, na której widoczne są sygnały TCA-RFP. Upewnij się, że głębokość ta jest warstwa 4, ~300 µm niższy niż powierzchnia mózgu w P6. Wybierz obszar obrazowania, w którym widocznych jest wiele neuronów wykazujących ekspresję GCaMP.
  9. Rozpocznij obrazowanie timelapse sygnałów GCaMP i RFP. Jeśli jednoczesne skanowanie dwukanałowe jest niewykonalne, wykonaj obrazy GCaMP i TCA-RFP przed obrazowaniem.
  10. Przerwij podawanie izofluranu, aby osłabić znieczulenie, i obserwuj spontaniczną aktywność przez około 20 min. Monitoruj ruchy szczenięcia podczas obrazowania za pomocą kamery na podczerwień. Bezzwłocznie wznów znieczulenie izofluranem (2% w powietrzu), jeśli zostanie zaobserwowana jakakolwiek reakcja świadcząca o stresie.
  11. Po ustaniu ruchów szczenięcia powtórz obrazowanie opisane w kroku 3.9. W razie potrzeby zmień obszar obrazowania.
  12. Uśmierć szczenię poprzez podanie przedawkowanej dawki izofluranu. Utwal mózg poprzez perfuzję przezsercową solą fizjologiczną i 4% PFA, a następnie przeprowadź postutrwalanie w 4% PFA przez noc w celu przygotowania przekrojów stycznych i wykonania immunohistochemii. W przeciwnym razie uśmierć szczenię poprzez podanie przedawkowanej dawki środka znieczulającego, a następnie wykonaj dekapitację.
  13. Jeśli samica nie ma innych młodych, należy poddać ją eutanazji poprzez podanie przedawkowanej dawki środka znieczulającego, a następnie zastosować zwichnięcie stawów obręczy szyjnej.

4. Analiza

  1. Uruchom program MATLAB i wykonaj narzędzie EZcalcium15, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI) „Initial GUI”.
  2. Skompensuj dryfty klatek obrazu wynikające z ruchów myszy lub innych przyczyn.
    1. W Initial GUI kliknij Motion Correction, aby otworzyć Motion Correction GUI. Kliknij „Add Files...”, aby wczytać plik TIF z danymi obrazowymi.
    2. Ustaw parametry w następujący sposób: Non-rigid Motion Correction, blank; Upsampling Factor, 50; Max Shift, 15; Initial Batch Size, 200; Bin Width, 200. Kliknij „Run Motion Correction”, aby wykonać korekcję. Dane obrazowe po korekcji ruchu zostaną zapisane automatycznie.
      UWAGA: Parametry powinny być dostosowane do właściwości danych obrazowych. Jeśli dryfty niektórych klatek nie zostały skompensowane z powodu nieliniowych zniekształceń klatek lub ruchu kory w kierunku głębokości, otwórz oryginalne dane obrazowe bez korekcji w programie ImageJ Fiji, usuń klatki i powtórz krok 4.2.
  3. Wykryj neurony i wyznacz obszary zainteresowania (ROI).
    1. W Initial GUI kliknij Automated ROI Detection, aby otworzyć ROI Detection GUI. Kliknij Add Files..., aby wczytać skorygowane pod kątem ruchu dane obrazowe.
    2. Ustaw parametry w następujący sposób: Initialization, Greedy; Search Method, Ellipse; Deconvolution, Constrained FOOPSI-SPGL1; Autoregression, Decay; Estimated # of ROIs, 60 (zaleca się wartość ponad dwukrotnie większą niż liczba wykrytych wizualnie); Estimated ROI Width, 17 (~20 µm); Merge Threshold, 0.95; Fudge Factor, 0.95; Spatial Downsampling, 1; Temp. Downsampling, 1; Temp. Iterations, 5.
      UWAGA: Parametry powinny być dostosowane do właściwości danych obrazowych.
    3. Kliknij Run ROI Detection, aby wykonać detekcję. Dane ROI zostaną zapisane automatycznie.
    4. W Initial GUI kliknij ROI Refinement, aby otworzyć ROI Refinement GUI. Kliknij Load Data, aby wczytać dane ROI. Wybierz ROI, które wykazywały niską częstotliwość aktywności (<1 Hz), znajdowały się pod czaszką lub zawierały neuryty innych neuronów. Kliknij Exclude ROI, aby wykluczyć te ROI z analizy.
    5. W polu Data Export Format wybierz XLSX i kliknij Export Data, aby uzyskać plik Excel z surowymi wartościami dF/F. Wartość dF/F obliczana jest zgodnie z równaniem (1), gdzie F to średnia intensywność pikseli w każdej klatce, F0 to bazowa intensywność sygnału, a Fb to fluorescencja tła.
      Równanie stosunku intensywności fluorescencji, \(dF/F=((F-F0)/(F0-Fb))\), dla analizy mikroskopowej.     (1)
  4. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona dla dF/F pomiędzy obszarami ROI i stwórz macierz współczynników korelacji. Używaj danych dF/F wyłącznie po osłabieniu działania anestezji i rozpoczęciu występowania aktywności spontanicznej (~10 minut po zaprzestaniu podawania izofluranu).
  5. Wyznacz krawędzie beczułek (barrels) na obrazie TCA-RFP przy użyciu programu Fiji. Przypisz ROI do odpowiednich beczułek lub przegród (septa). Porównaj korelacje parzyste w obrębie tej samej beczułki oraz pomiędzy różnymi beczułkami.
  6. Wygeneruj od 1 000 do 10 000 zestawów danych zastępczych (surrogate data) poprzez losowe przetasowanie odpowiedniości między ROI a śladami Ca2+. Oblicz średni współczynnik korelacji w obrębie poszczególnych beczułek dla każdego zestawu danych zastępczych i oceń istotność statystyczną korelacji w rzeczywistych danych.
    UWAGA: Jeśli jeden z 10 000 zestawów zastępczych posiada wartość wyższą niż wartość rzeczywista, istotność statystyczna wynosi 0,0001. Analizy opisane w krokach 4.5 i 4.6 mogą być prowadzone dla danych zbiorczych z wielu zwierząt, zgodnie z metodami opisanymi w innych publikacjach7,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rycina 1 przedstawia reprezentatywne wyniki aktywności neuronów warstwy 4 w korze beczkowatej szczenięcia w dniu P6, wizualizowane przy użyciu niniejszego protokołu. Obrazy dwufotonowe kanału zielonego (GCaMP) i kanału czerwonego (TCA-RFP) zostały uśrednione czasowo i przedstawione na Rycini 1A. Ponieważ fluorescencja TCA-RFP była znacznie słabsza niż fluorescencja GCaMP, sygnał GCaMP przenikał do kanału czerwonego (Rycina 1A1

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę, że spontaniczne czynności wyłaniają się z narządu zmysłu lub dolnego układu nerwowego i przemieszczają się do pierwotnego obszaru czuciowego przez ścieżkę równoważną ścieżce dojrzałego układu nerwowego3, kluczowe znaczenie ma zdefiniowanie pierwotnego obszaru czuciowego i lokalizacji obrazowanych neuronów w tym obszarze. W tym protokole zajęliśmy się tym wymogiem, wykorzystując transgeniczne myszy, które wizualizują aksony wzgórzowo-korowe i system Supernova, który rzadko wyraża ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty na Rzecz Transformacyjnych Obszarów Badawczych (B) (22H05092, 22H05094) oraz Granty na Badania Naukowe 20K06876, AMED pod numerem grantu 21wm0525015, Fundację Naukową Takeda, Fundację Naito, Fundację Kato Memorial Bioscience, Fundację Kowa Life Science, NIG-JOINT (24A2021) (do H.M.); oraz Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty na Rzecz Badań Naukowych Granty 19K06887 i 22K06446, Kodama Memorial Fund for Medical Research, Uehara Memorial Foundation, Kato Memorial Bioscience Foundation oraz Takeda Science Foundation (dla N.N-T.). Dziękujemy dr Takuji Iwasato za myszy TCA-RFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20&krotna soczewka obiektywowa (zanurzenie w wodzie)
250 ml Filtr próżniowy/system butelek do przechowywaniaCorning431096
4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu (4% PFA)Nacalai09154-85
Żywica akrylowa (UNIFAST II)GCN/A
AgarozaSigmaA9793
Zespół rurki aspiratoraDrummond2-040-000
CaCl2• 2H2ONacalai06731-05
ElektroporatorBEXGEB14
Krople do oczu (Scopisol)Senju PharmaceuticalN/A
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaM165FC
GlucoseNacalai16806-25
Poduszka grzewczaMuromachi KikaiFHC-HPS
HEPESGibco15630-080
IsofluranePfizerN/A
KClNacalai28514-75
MgSO4• 7H2OWako131-00405
Ściągacz do mikropipetNarishigePC-100
Laser wielofotonowySpectra-PhysicsMai Tai eHP DeepSee
Mikroskop wielofotonowyZeissLSM 7MP
NaClNacalai31320-05
Włóknina (Kimwipe)Kimberly ClarkS-200
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Nacalai27575-31
Plazmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPREAddgenepK175
Plazmid: TRE-nCreAddgenepK031
Precyzyjnie kalibrowane mikropipetyDrummond2-000-050
ŻyletkaFeatherFA-10
Rimadyl (50 mg/ml karprofen)ZoetisJPN/A
Okrągłe szkło nakrywkowe, średnica 3 mm MatsunamiCS01078
SalineOtsuka035175315
Pentobarbital soduNacalai26427-72
Stolik do obrazowania żywego szczeniaka (dwa jednoosiowe stoliki translacyjne do pozycjonowania XY, goniometr dwuosiowy, płyta podstawy, regulowany słupek do pozycjonowania z)Mysz ThorLabsLT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFPN/AN/ AMizuno i wsp., 2018a
Klej tkankowy (Vetbond)3M1469SB
Pręt tytanowyEndo Scientific InstrumentN/AWykonane na zamówienie (Mizuno i wsp., 2018b)
Tytanowa płytkaNie dotyczyWykonane na zamówienie (Mizuno i wsp., 2018b)
Pęseta Trypan niebieskiSigmaT8154
z elektrodą platynową, średnica 5 mmBEXCUY650P5
Mysz ICR typu dzikiegoNihon SLCSlc:ICR
mocująca pręt

Bibliografia

  1. Rao, M. S., Mizuno, H. Elucidating mechanisms of neuronal circuit formation in layer 4 of the somatosensory cortex via intravital imaging. Neuroscience Research. 167, 47-53 (2021).
  2. Iwasato, T., Erzurumlu, R. S. Development of tactile sensory circuits in the CNS. Current Opinion in Neurobiology. 53, 66-75 (2018).
  3. Martini, F. J., Guillamón-Vivancos, T., Moreno-Juan, V., Valdeolmillos, M., López-Bendito, G. Spontaneous activity in developing thalamic and cortical sensory networks. Neuron. 109 (16), 2519-2534 (2021).
  4. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  5. Tritsch, N. X., Yi, E., Gale, J. E., Glowatzki, E., Bergles, D. E. The origin of spontaneous activity in the developing auditory system. Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).
  6. Babola, T. A., et al. Homeostatic control of spontaneous activity in the developing auditory system. Neuron. 99 (3), 511-524.e5 (2018).
  7. Mizuno, H., et al. Patchwork-type spontaneous activity in neonatal barrel cortex layer 4 transmitted via thalamocortical projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  8. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  11. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Mizuno, H., Nakazawa, S., Iwasato, T. In vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. 140, e58340(2018).
  14. Egashira, T., et al. In vivo two-photon calcium imaging of cortical neurons in neonatal mice. STAR Protocols. 4 (2), 102245(2023).
  15. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  16. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  17. Antón-Bolaños, N., et al. Prenatal activity from thalamic neurons governs the emergence of functional cortical maps in mice. Science. 364 (6444), 987-990 (2019).
  18. Guillamón-Vivancos, T., et al. Input-dependent segregation of visual and somatosensory circuits in the mouse superior colliculus. Science. 377 (6608), 845-850 (2022).
  19. Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  20. Chen, J. L., Voigt, F. F., Javadzadeh, M., Krueppel, R., Helmchen, F. Long-range population dynamics of anatomically defined neocortical networks. eLife. 5, e14679(2016).
  21. Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  22. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. The Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  23. Murakami, T., Matsui, T., Uemura, M., Ohki, K. Modular strategy for development of the hierarchical visual network in mice. Nature. 608 (7923), 578-585 (2022).
  24. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of Calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  25. Shemesh, O. A., et al. Precision calcium imaging of dense neural populations via a cell-body-targeted calcium indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
  26. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, e38173(2019).
  27. Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv. , (2017).
  28. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2014).
  29. Marques-Smith, A., et al. A Transient translaminar GABAergic interneuron circuit connects thalamocortical recipient layers in neonatal somatosensory cortex. Neuron. 89 (3), 536-549 (2016).
  30. Tuncdemir, S. N., et al. Early somatostatin interneuron connectivity mediates the maturation of deep layer cortical circuits. Neuron. 89 (3), 521-535 (2016).
  31. Nakazawa, S., Yoshimura, Y., Takagi, M., Mizuno, H., Iwasato, T. Developmental phase transitions in spatial organization of spontaneous activity in postnatal barrel cortex layer 4. The Journal of Neuroscience. 40 (40), 7637-7650 (2020).
  32. Yu, Y. -C., et al. Preferential electrical coupling regulates neocortical lineage-dependent microcircuit assembly. Nature. 486 (7401), 113-117 (2012).
  33. Siegel, F., Heimel, J. A., Peters, J., Lohmann, C. Peripheral and central inputs shape network dynamics in the developing visual cortex in vivo. Current Biology. 22 (3), 253-258 (2012).
  34. Nakagawa, N., Hosoya, T. Slow dynamics in microcolumnar gap junction network of developing neocortical pyramidal neurons. Neuroscience. 406, 554-554 (2019).
  35. Valiullina, F., et al. Developmental changes in electrophysiological properties and a transition from electrical to chemical coupling between excitatory layer 4 neurons in the rat barrel cortex. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1(2016).
  36. Avitan, L., et al. Spontaneous and evoked activity patterns diverge over development. Elife. 10, e61942(2021).
  37. Mölter, J., Avitan, L., Goodhill, G. J. Detecting neural assemblies in calcium imaging data. BMC Biology. 16 (1), 143(2018).
  38. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kora mózgu noworodka myszymikroskopia dwufotonowaobrazowanie pojedynczych neuronówaktywność kory sensorycznejobrazowanie GCaMPkora beczkowaoperacja okna czaszkowegokorekcja ruchudetekcja ROIanaliza sygnału wapniowego
Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.