Artykuł metodologiczny

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65899

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University, 2Laboratory of Multi-Dimensional Imaging, International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 3Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, 4Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Streszczenie

Mózg ssaków przechodzi dynamiczne zmiany rozwojowe zarówno na poziomie komórkowym, jak i obwodowym w okresie prenatalnym i postnatalnym. Po odkryciu licznych genów przyczyniających się do tych zmian rozwojowych, obecnie wiadomo, że aktywność neuronalna również w znacznym stopniu moduluje te procesy. W rozwijającej się korze mózgowej neurony wykazują zsynchronizowane wzorce aktywności, które są wyspecjalizowane w każdym podstawowym obszarze czuciowym. Wzorce te znacznie różnią się od tych obserwowanych w dojrzałej korze mózgowej, podkreślając ich rolę w regulacji procesów rozwojowych specyficznych dla danego obszaru. Niedobory aktywności neuronalnej podczas rozwoju mogą prowadzić do różnych chorób mózgu. Odkrycia te podkreślają potrzebę zbadania mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw wzorców aktywności w rozwoju neuronów. Niniejszy artykuł podsumowuje szereg protokołów do wizualizacji pierwotnych obszarów czuciowych i aktywności neuronalnej u nowonarodzonych myszy, do obrazowania aktywności poszczególnych neuronów w podpolach kory mózgowej za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo oraz do analizy korelacji aktywności związanych z podpolem. Pokazujemy reprezentatywne wyniki patchworkowej aktywności synchronicznej w obrębie poszczególnych beczek w korze somatosensorycznej. Omawiamy również różne potencjalne zastosowania i niektóre ograniczenia tego protokołu.

Wprowadzenie

Kora mózgowa zawiera kilka obszarów czuciowych o różnych funkcjach. Obszary otrzymują dane wejściowe pochodzące z odpowiadających im narządów zmysłów, w większości przenoszone przez rdzeń kręgowy lub pień mózgu i przekazywane przez thalamus1,2. Warto zauważyć, że neurony w każdym podstawowym obszarze czuciowym wykazują wyjątkowo zsynchronizowaną aktywność we wczesnych stadiach rozwoju, które również pochodzą z narządów zmysłów lub niższych ośrodków nerwowych, ale zasadniczo różnią się od aktywności obserwowanej w dojrzałej korze mózgowej3.

U noworodków gryzoni, na przykład, główny obszar widzenia (V1) wykazuje aktywność falową, która zaczyna się w siatkówce (fala siatkówkowa) i rozchodzi się przez całą ścieżkę wzrokową, zachowując przy tym retinotopię4. Pierwszorzędowy obszar słuchowy (A1) wykazuje aktywność synchroniczną zorganizowaną w podregiony w kształcie pasma, które odpowiadają pasmom izoczęstotliwości w dojrzałym mózgu. Aktywność emanuje z wewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka5,6. Kora beczkowata w pierwotnym obszarze somatosensorycznym (S1) wykazuje wzorc aktywności podobny do patchworku, w którym neurony warstwy 4 w poszczególnych beczkach, a mianowicie neurony reagujące na poszczególne wąsy, są synchronicznie aktywowane7. Chociaż sugeruje się, że pochodzi ze zwoju nerwu trójdzielnego, źródło aktywności pozostaje nieznane7. W związku z tym wzorce aktywności noworodków są wyspecjalizowane zarówno w obrębie każdego podstawowego obszaru sensorycznego, jak i w obrębie podobszarów wewnątrzpowierzchniowych. Jednoczesna wizualizacja aktywności neuronalnej i struktury pierwotnych obszarów czuciowych może ułatwić badanie wkładu tych wzorców aktywności w rozwój systemów sensorycznych.

W tym artykule podsumowaliśmy szereg protokołów: (1) wizualizacji indywidualnych aktywności neuronalnych za pomocą rzadkiego znakowania GCaMP i głównych obszarów czuciowych za pomocą myszy TCA-RFP, które wyrażają czerwone białko fluorescencyjne w aksonach wzgórzowo-korowych7, (2) do obrazowania aktywności na poziomie pojedynczej komórki u noworodków myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivooraz (3) w celu przeanalizowania korelacji aktywności w korze beczkowej S1. Reprezentatywne wyniki pokazują zsynchronizowaną aktywność przypominającą patchwork, w obrębie pojedynczych beczek myszy z rodziny (P)6 w dniu pourodzeniowym. Pomimo pewnych ograniczeń, technika ta może być stosowana do obrazowania przewlekłego, obrazowania szerokokątnego w wielu obszarach czuciowych i różnych eksperymentów manipulacyjnych. Wieloaspektowa analiza aktywności neuronalnej podczas rozwoju wzbogaci nasze zrozumienie mechanizmów tworzenia obwodów mózgowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi doświadczeń na zwierzętach Uniwersytetu Kumamoto oraz Narodowego Instytutu Genetyki i zostały zatwierdzone przez komisje ds. doświadczeń na zwierzętach.

1. Elektroporacja in utero (IUE)

  1. Krzyżuj samce myszy TCA-RFP o tle ICR z samicami myszy ICR typu dzikiego. Następnego dnia rano sprawdź obecność czopa pochwowego, aby potwierdzić kopulację. Po 2 tygodniach sprawdź brzuch pod kątem ciąży.
  2. Przygotuj roztwór plazmidów zawierający 5 ng/µL TRE-nCre, 1 µg/µL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE oraz 0,02 % błękitu trypanu w ddH2O, aby rzadko znakować neurony za pomocą GCaMP, wykorzystując system Supernova8.
  3. Przygotuj roztwór przeciwbólowy zawierający 0,5 mg/mL karprofenu i 0,01 mg/mL buprenorfiny. Chroń go przed światłem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  4. W 14. dniu embrionalnym (E14) przeprowadź IUE zgodnie z poniższymi krokami. Metody IUE są w zasadzie identyczne z poprzednimi doniesieniami9,10,1.
    1. Przetrzyj blat laboratoryjny 70% etanolem lub roztworem glutaraldehydu. Wszystkie instrumenty chirurgiczne wysterylizuj w autoklawie. Noś maseczkę i fartuch laboratoryjny, aby zmniejszyć ryzyko infekcji u myszy.
    2. Przygotuj szklane mikropipety za pomocą wyciągacza mikropipet. Pobierz mieszaninę plazmidów do szklanej mikropipety, używając rurki aspiracyjnej.
    3. Wprowadź ciężarne myszy w stan anestezji w dniu E14, stosując izofluran (2,0% w powietrzu). Utrzymuj zwierzęta w narkozie podczas zabiegu za pomocą izofluranu (1,2% w powietrzu). Ściśnij palec u nogi, aby upewnić się, że anestezja jest wystarczająco głęboka. Stosuj maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.
    4. Zdezynfekuj obszar brzucha co najmniej trzy razy, stosując naprzemiennie środek myjący na bazie jodu i 70% etanol. Rozłóż sterylną chustę, aby zakryć obszar operacyjny. Wykonaj nacięcie w linii środkowej i wyeksponuj macicę na chustę.
    5. Wielokrotnie zakraplaj ciepłą sól fizjologiczną na macicę, aby zapobiec jej wysychaniu lub wychłodzeniu aż do zamknięcia jamy brzusznej (Krok 1.4.8).
    6. Wstrzyknij roztwór plazmidów do jednej strony komory bocznej kolejno do każdego z embrionów, używając mikropipety i rurki aspiracyjnej.
    7. Użyj elektrody typu pęsetowego do uchwycenia głów embrionów i podaj pięć prostokątnych impulsów elektrycznych (40 V, 50 ms) w odstępach 1 s, korzystając z elektroporatora.
    8. Wprowadź macicę z powrotem do jamy brzusznej. Wprowadź do jamy ok. 3 mL ciepłej soli fizjologicznej. Zaszyj błonę otrzewną i skórę brzucha. Podaj podskórnie w okolicy karku roztwór przeciwbólowy w dawce 10 μL/g masy ciała (karprofen w dawce 5 μg/g i buprenorfina w dawce 0,1 μg/g).
  5. Umieść mysz w klatce rekonwalescencyjnej na macie grzewczej (37 °C), aby odzyskała przytomność po anestezji. Połóż mysz na brzuchu, aby zapobiec zadławieniu gardła językiem i śliną. Trzymaj mysz oddzielnie od innych osobników i monitoruj ją, aż odzyska zdolność do normalnego poruszania się. Następnie przenieś mysz do klatki.
  6. Po narodzinach przeprowadź genotypowanie w celu sprawdzenia obecności allelu RFP i utylizuj szczenięta pozbawione tego allelu. Krok ten jest zalecany zwłaszcza w przypadku obrazowania w drugim tygodniu postnatalnym, gdy sygnał TCA-RFP jest słaby i trudny do zweryfikowania w kroku 2.2.7.

2. Operacja okna czaszkowego

  1. Przed dniem operacji przygotować bufor kory zawierający 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 oraz 2 mM MgSO4 w ddH2O (pH skorygowane do 7,4 za pomocą 1 M NaOH)12 . Bufor wysterylizować za pomocą filtra próżniowego.
    UWAGA: Bufor można przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy. Wymagana objętość to 5-10 mL na szczenię.
  2. Poniższe kroki wykonać w dniach P3-12. Patrz również poprzednie raporty opisujące tę procedurę13,14.
    1. Wymieszać 50 mg agarozy z 5 mL buforu kory i całkowicie rozpuścić agarozę poprzez podgrzewanie. Przenieść część roztworu do probówki 1,5 mL i utrzymać go w temperaturze 42 °C.
    2. Nalać część buforu kory do probówki stożkowej 50 mL i przechowywać w temperaturze pokojowej. Nalać niewielką ilość soli fizjologicznej do pojemnika (np. do zakrętki probówki stożkowej 50 mL) i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający 0,01 mg/mL buprenorfiny. Chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze pokojowej.
    4. Wszystkie instrumenty chirurgiczne wysterylizować w autoklawie. Stereomikroskop fluorescencyjny zdezynfekować 70% etanolem.
    5. Użyć parownika izofluranu, aby wprowadzić szczenię w narkozę za pomocą izofluranu (2,0% w powietrzu). Monitorować szczenię i wyjąć je, gdy oddech lekko zwolni.
      UWAGA: Jeśli narkoza będzie przedłużona, oddech szczenięcia może ustać na kilka sekund. Nawet jeśli oddech zostanie przywrócony, przedłużona narkoza może zmniejszyć mózgowy przepływ krwi i spowodować nieodwracalne uszkodzenie mózgu.
    6. Zdezynfekować głowę szczenięcia co najmniej trzykrotnie, stosując naprzemiennie szorowanie preparatem na bazie jodu oraz 70% etanol. Umieścić szczenię na podgrzewaczu (35 °C) pod stereomikroskopem fluorescencyjnym. Przez cały czas utrzymywać szczenię w narkozie za pomocą izofluranu (1,5%-2,5% w powietrzu).
    7. Wybrać szczenięta wykazujące ekspresję TCA-RFP i GCaMP, obserwując fluorescencję przez czaszkę. Szczenięta, które nie wykazują obu sygnałów, poddać eutanazji.
    8. Ostrożnie, aby nie spowodować krwawienia, usunąć skórę głowy nad półkulami mózgu w jak najszerszym zakresie. Przetrzeć czaszkę sterylnym patyczkiem nasączonym solą fizjologiczną, aby usunąć tkankę łączną.
    9. Po wyschnięciu czaszki przytwierdzić naciętą powierzchnię skóry głowy do czaszki za pomocą kleju tkankowego.
    10. Przenieść szczenię na podgrzewacz o temperaturze 37 °C w celu wybudzenia z narkozy. Odczekać co najmniej 15 min, aż klej stwardnieje.
      UWAGA: Można zrobić przerwę do 1 h przed przejściem do następnego kroku. W tym czasie można w podobny sposób przygotować inne szczenięta.
    11. Uśpić szczenię izofluranem. Podczas narkozy (1,5%-2,5% izofluranu w powietrzu) umieścić szczenię na podgrzewaczu (37 °C) pod stereomikroskopem fluorescencyjnym.
      UWAGA: Jeśli narkoza przedłuży się powyżej czasu trwania punktu końcowego (60 min), poddać szczenię eutanazji przez dekapitację podczas znieczulenia izofluranem.
    12. Zaznaczyć miejsce ekspresji GCaMP na czaszce za pomocą sterylnego markera permanentnego. Nanieść bufor kory na to miejsce.
    13. Wsunąć róg żyletki w czaszkę. Powoli pchać ostrze, aby zeszlifować czaszkę i wykonać otwór. Odłupać pękniętą część czaszki pęsetą i usunąć ją.
    14. Sprawdzić, czy otwór czaszkowy został wykonany prawidłowo, obserwując naczynia krwionośne w otworze. W przypadku wystąpienia krwawienia szybko przepłukać otwór buforem kory za pomocą mikropipety. Powtarzać płukanie do całkowitego ustąpienia krwawienia.
    15. Nanieść kroplę buforu kory do otworu czaszkowego i umieścić nad otworem sterylną okryweczkę o średnicy 3 mm. Usunąć nadmiar buforu za pomocą tkaniny niezawodnej. Odczekać, aż obszar wokół szkła wyschnie.
    16. Za pomocą mikropipety nanieść ciepły roztwór agarozy wokół krawędzi szkła. Ponieważ nadmiar agarozy może osłabić sygnały fluorescencyjne, usunąć nadmiar roztworu spod szkła, delikatnie naciskając szkło od góry.
    17. Usunąć pęsetą agarozę znajdującą się na szkle lub oddaloną od jego krawędzi. Pozostawić agarozę tylko wokół zewnętrznego obwodu szkła.
    18. Odczekać do stwardnienia agarozy. Jeśli skurczenie się agarozy spowoduje powstanie szczeliny pod szkłem, dodać roztwór agarozy z boku, aby pokryć całą krawędź szkła. Usunąć wszelką ciecz z powierzchni czaszki za pomocą tkaniny niezawodnej.
    19. Wymieszać proszek i ciecz żywicy akrylowej w gumowym pojemniku. Pobrać mieszaninę mikropipetą i nalać ją tak, aby żywica pokryła agarozę otaczającą krawędź szkła.
      UWAGA: Ponieważ żywica twardnieje wkrótce po zmieszaniu proszku i cieczy, należy je mieszać wielokrotnie przed aplikacją. Ilości potrzebne przy każdym mieszaniu to ok. 50 µL cieczy i ok. 0,15 g proszku.
    20. Przymocować pręt tytanowy żywicą do przeciwległej półkuli. Utrzymać kąt pręta równolegle do okryweczki. Przymocować całą powierzchnię czaszki za pomocą żywicy.
    21. Podać podskórnie w karku roztwór przeciwbólowy w dawce 10 μL/g masy ciała (buprenorfina w dawce 0,1 μg/g masy ciała). Przenieść szczenię na podgrzewacz o temperaturze 37 °C w celu wybudzenia z narkozy. Odczekać >60 min do stwardnienia żywicy przed obrazowaniem.
      ​UWAGA: Odczekać 1-5 h przed obrazowaniem. W tym czasie w podobny sposób przeprowadzić operację u innych szczeniąt.

3. Dwufotonowe obrazowanie wapnia

  1. Przymocuj dwuosiowy goniometr z płytką tytanową do płytki stolika z pozycjonowaniem XY pod mikroskopem. Przygotuj podkładkę grzewczą (35 °C) na stoliku mikroskopowym.
  2. Uruchom oprogramowanie do skanowania z następującymi parametrami: Piksele, 512 x 512; Dwukierunkowe, WŁ.; Uśrednianie, brak; obszar obrazowania, 600 x 600 µm z a obiektyw 20xSkonfiguruj ustawienia w taki sposób, aby prędkość skanowania jest szybsze niż 1 Hz.
  3. Umieść szczenię na podkładce grzewczej, a następnie przytwierdź tytanowy pręt mocujący do głowy do tytanowej płytki za pomocą śrub. Utrzymaj szczenię w anestezji, stosując port rurkowy do podawania izofluranu (1,5–2,0% w powietrzu).
  4. Skoryguj poziomo kąt okna za pomocą goniometru. Włącz podświetlenie i obserwuj powierzchnię mózgu przy użyciu obiektywu 5x, a następnie wybierz obszar obrazowania poprzez pozycjonowanie w osiach XY.
  5. Nanieś krople do oczu na okno czaszkowe. Zmień obiektyw na soczewkę imersyjną w wodzie 20x. Obserwuj powierzchnię kory, aby potwierdzić widoczność przepływu krwi na powierzchni mózgu.
  6. Wyłącz podświetlenie i przeskanuj powierzchnię mózgu w trybie jednofotonowym. Zwiększ moc lasera, aby uzyskać widoczną zieloną autofluorescencję szkła i powierzchni mózgu.
  7. Obniż stężenie isofluranu do 1,0%–1,5%. Przykryj mikroskop, aby uniknąć przecieków światła. Przełącz oprogramowanie skanujące w tryb dwufotonowy.
  8. Dostosuj moc lasera oraz wzmocnienie detektora odpowiednio do skanowania sygnałów GCaMP i RFP. Wyznacz głębokość, na której widoczne są sygnały TCA-RFP. Upewnij się, że głębokość ta jest warstwa 4, ~300 µm niższy niż powierzchnia mózgu w P6. Wybierz obszar obrazowania, w którym widoczna jest duża liczba neuronów wykazujących ekspresję GCaMP.
  9. Rozpocząć obrazowanie timelapse sygnałów GCaMP i RFP. Jeśli jednoczesne skanowanie dwukanałowe jest niemożliwe, należy zarejestrować obrazy GCaMP i TCA-RFP przed rozpoczęciem obrazowania.
  10. Przerwij podawanie izofluranu, aby osłabić znieczulenie, i obserwuj spontaniczną aktywność przez około 20 min. Monitoruj ruchy szczeniaka podczas obrazowania za pomocą kamery na podczerwień. W razie zaobserwowania jakiejkolwiek reakcji wskazującej na dyskomfort niezwłocznie wznowij znieczulenie izofluranem (2% w powietrzu).
  11. Po ustaniu ruchów młodego szczura powtórzyć obrazowanie opisane w kroku 3.9. W razie potrzeby zmienić obszar obrazowania.
  12. Uśmierć szczenię poprzez przedawkowanie izofluranu. Utrwal mózg poprzez perfuzję przezsercową solą fizjologiczną i 4% PFA, a następnie przeprowadź postfiksację w 4% PFA przez noc w celu przygotowania przekrojów stycznych i wykonania immunohistochemii. W przeciwnym razie uśmierć szczenię przez przedawkowanie środka anestetycznego, a następnie przeprowadź dekapitację.
  13. Jeśli samica nie ma innych młodych, należy poddać ją eutanazji poprzez podanie przedawkowanej dawki środka znieczulającego, a następnie zastosować zwichnięcie szyi.

4. Analiza

  1. Uruchom program MATLAB i uruchom zestaw narzędzi EZcalcium15 aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI)Początkowy interfejs użytkownika'.
  2. Skoryguj przesunięcia klatki obrazu spowodowane ruchami myszy lub innymi przyczynami.
    1. Kliknij Korekcja ruchu w początkowym interfejsie graficznym użytkownika (GUI), aby otworzyć Interfejs graficzny (GUI) do korekcji ruchuKliknij „Dodaj pliki...aby wczytać plik TIF z danymi obrazowymi.
    2. Skonfiguruj ustawienia w następujący sposób: Korekcja ruchu nierigidnego, pusty; Współczynnik upsamplingu, 50; Maksymalne przesunięcie, 15; Początkowa wielkość partii, 20; Szerokość słupka, 20Kliknij 'Wykonaj korekcję ruchuw celu wykonania korekcji. Dane obrazowe po korekcie ruchu zostaną zapisane automatycznie.
      UWAGA: Ustawienia należy dostosować do właściwości danych obrazowych. Jeśli przesunięcia w niektórych klatkach nie zostały skompensowane z powodu nieliniowych zniekształceń klatek lub ruchu kory w kierunku głębokości, należy otworzyć oryginalne dane obrazowe bez korekcji w programie ImageJ Fiji, usunąć klatki, a następnie ponownie wykonać krok 4.2.
  3. Wykryj neurony i wyznacz obszary zainteresowania (ROI).
    1. Kliknij Zautomatyzowana detekcja ROI w początkowym interfejsie graficznym (GUI), aby otworzyć Interfejs graficzny do detekcji ROIKliknij Dodaj pliki... w celu załadowania danych obrazowych po korekcji ruchu.
    2. Ustaw parametry w następujący sposób: Inicjalizacja: Greedy; Metoda wyszukiwania: Ellipse; Dekonwolucja: Constrained FOOPSI-SPGL1; Autoregresja: Decay; Szacowana liczba ROI: 60 (zaleca się wartość ponad dwukrotnie większą niż liczba wykrytych wizualnie); Szacowana szerokość ROI: 17 (~20 µm); Próg łączenia (Merge Threshold), 0,95; Współczynnik korekcyjny (Fudge Factor), 0,95; Downsampling przestrzenny, 1; Downsampling czasowy, 1; Iteracje czasowe, 5.
      UWAGA: Ustawienia należy dostosować do właściwości danych obrazowych.
    3. Kliknij Uruchom wykrywanie ROI w celu przeprowadzenia detekcji. Dane ROI zostaną zapisane automatycznie.
    4. Kliknij Doprecyzowanie obszaru zainteresowania (ROI) w początkowym interfejsie graficznym użytkownika (GUI), aby otworzyć Interfejs graficzny do doprecyzowania ROIKliknij Wczytaj dane aby wczytać dane ROI. Wybierz ROI, które wykazywały niską częstotliwość aktywności (<1 Hz), znajdujące się pod czaszką lub zawierające neurity innych neuronów. Kliknij Wyklucz ROI aby wykluczyć ROI z analizy.
    5. Wybierz Format eksportu danych Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. XLSX i kliknij Eksport danych aby uzyskać plik Excel z surowymi wartościami dF/F. Wartość dF/F obliczana jest według równania (1), gdzie F to średnia intensywność pikseli w każdej klatce, F0 to bazowa intensywność sygnału, a Fb to fluorescencja tła.
      figure-protocol-1     (1)
  4. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona dla dF/F pomiędzy ROI i sporządź macierz współczynników korelacji. Wykorzystaj wartości dF/F wyłącznie z okresu po osłabieniu działania anestezji i rozpoczęciu występowania aktywności spontanicznej (~10 minut po zaprzestaniu podawania izofluranu).
  5. Wyznacz krawędzie beczułek na obrazie TCA-RFP przy użyciu programu Fiji. Przypisz wyznaczone obszary zainteresowania (ROI) do odpowiednich beczułek lub przegród. Porównaj korelację parzystą w obrębie tej samej beczułki oraz korelację między różnymi beczułkami.
  6. Wygeneruj od 1 0 do 10 00 zestawów danych zastępczych poprzez losowe przetasowanie odpowiedniości między ROI a Ca2+ ślady. Oblicz średni współczynnik korelacji w obrębie poszczególnych beczek dla każdego zbioru danych zastępczych i oceń istotność statystyczną korelacji w danych rzeczywistych.
    UWAGA: Jeśli jeden z 10 00 substytutów posiada wartość wyższą od wartości rzeczywistej, istotność statystyczna wynosi 0,01. Analizy opisane w krokach 4.5 i 4.6 można przeprowadzić dla danych zbiorczych pochodzących od wielu zwierząt, zgodnie z procedurą stosowaną w innych badaniach7,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia reprezentatywne wyniki aktywności neuronów warstwy 4 w korze beczkowej szczenięcia w dniu P6, wizualizowane przy użyciu obecnego protokołu. Obrazy dwufotonowe kanału zielonego (GCaMP) i kanału czerwonego (TCA-RFP) zostały uśrednione czasowo i przedstawione na Rysunku 1A. Ponieważ fluorescencja TCA-RFP była znacznie słabsza niż fluorescencja GCaMP, sygnał GCaMP przenikał do kanału czerwonego (Rysunek 1A1...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę, że spontaniczne czynności wyłaniają się z narządu zmysłu lub dolnego układu nerwowego i przemieszczają się do pierwotnego obszaru czuciowego przez ścieżkę równoważną ścieżce dojrzałego układu nerwowego3, kluczowe znaczenie ma zdefiniowanie pierwotnego obszaru czuciowego i lokalizacji obrazowanych neuronów w tym obszarze. W tym protokole zajęliśmy się tym wymogiem, wykorzystując transgeniczne myszy, które wizualizują aksony wzgórzowo-korowe i system Supernova, który rzadko wyraża ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty na Rzecz Transformacyjnych Obszarów Badawczych (B) (22H05092, 22H05094) oraz Granty na Badania Naukowe 20K06876, AMED pod numerem grantu 21wm0525015, Fundację Naukową Takeda, Fundację Naito, Fundację Kato Memorial Bioscience, Fundację Kowa Life Science, NIG-JOINT (24A2021) (do H.M.); oraz Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty na Rzecz Badań Naukowych Granty 19K06887 i 22K06446, Kodama Memorial Fund for Medical Research, Uehara Memorial Foundation, Kato Memorial Bioscience Foundation oraz Takeda Science Foundation (dla N.N-T.). Dziękujemy dr Takuji Iwasato za myszy TCA-RFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20&krotna soczewka obiektywowa (zanurzenie w wodzie)
250 ml Filtr próżniowy/system butelek do przechowywaniaCorning431096
4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu (4% PFA)Nacalai09154-85
Żywica akrylowa (UNIFAST II)GCN/A
AgarozaSigmaA9793
Zespół rurki aspiratoraDrummond2-040-000
CaCl2• 2H2ONacalai06731-05
ElektroporatorBEXGEB14
Krople do oczu (Scopisol)Senju PharmaceuticalN/A
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaM165FC
GlucoseNacalai16806-25
Poduszka grzewczaMuromachi KikaiFHC-HPS
HEPESGibco15630-080
IsofluranePfizerN/A
KClNacalai28514-75
MgSO4• 7H2OWako131-00405
Ściągacz do mikropipetNarishigePC-100
Laser wielofotonowySpectra-PhysicsMai Tai eHP DeepSee
Mikroskop wielofotonowyZeissLSM 7MP
NaClNacalai31320-05
Włóknina (Kimwipe)Kimberly ClarkS-200
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Nacalai27575-31
Plazmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPREAddgenepK175
Plazmid: TRE-nCreAddgenepK031
Precyzyjnie kalibrowane mikropipetyDrummond2-000-050
ŻyletkaFeatherFA-10
Rimadyl (50 mg/ml karprofen)ZoetisJPN/A
Okrągłe szkło nakrywkowe, średnica 3 mm MatsunamiCS01078
SalineOtsuka035175315
Pentobarbital soduNacalai26427-72
Stolik do obrazowania żywego szczeniaka (dwa jednoosiowe stoliki translacyjne do pozycjonowania XY, goniometr dwuosiowy, płyta podstawy, regulowany słupek do pozycjonowania z)Mysz ThorLabsLT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFPN/AN/ AMizuno i wsp., 2018a
Klej tkankowy (Vetbond)3M1469SB
Pręt tytanowyEndo Scientific InstrumentN/AWykonane na zamówienie (Mizuno i wsp., 2018b)
Tytanowa płytkaNie dotyczyWykonane na zamówienie (Mizuno i wsp., 2018b)
Pęseta Trypan niebieskiSigmaT8154
z elektrodą platynową, średnica 5 mmBEXCUY650P5
Mysz ICR typu dzikiegoNihon SLCSlc:ICR
mocująca pręt

Bibliografia

  1. Rao, M. S., Mizuno, H. Elucidating mechanisms of neuronal circuit formation in layer 4 of the somatosensory cortex via intravital imaging. Neuroscience Research. 167, 47-53 (2021).
  2. Iwasato, T., Erzurumlu, R. S. Development of tactile sensory circuits in the CNS. Current Opinion in Neurobiology. 53, 66-75 (2018).
  3. Martini, F. J., Guillamón-Vivancos, T., Moreno-Juan, V., Valdeolmillos, M., López-Bendito, G. Spontaneous activity in developing thalamic and cortical sensory networks. Neuron. 109 (16), 2519-2534 (2021).
  4. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  5. Tritsch, N. X., Yi, E., Gale, J. E., Glowatzki, E., Bergles, D. E. The origin of spontaneous activity in the developing auditory system. Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).
  6. Babola, T. A., et al. Homeostatic control of spontaneous activity in the developing auditory system. Neuron. 99 (3), 511-524.e5 (2018).
  7. Mizuno, H., et al. Patchwork-type spontaneous activity in neonatal barrel cortex layer 4 transmitted via thalamocortical projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  8. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  11. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Mizuno, H., Nakazawa, S., Iwasato, T. In vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. 140, e58340(2018).
  14. Egashira, T., et al. In vivo two-photon calcium imaging of cortical neurons in neonatal mice. STAR Protocols. 4 (2), 102245(2023).
  15. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  16. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  17. Antón-Bolaños, N., et al. Prenatal activity from thalamic neurons governs the emergence of functional cortical maps in mice. Science. 364 (6444), 987-990 (2019).
  18. Guillamón-Vivancos, T., et al. Input-dependent segregation of visual and somatosensory circuits in the mouse superior colliculus. Science. 377 (6608), 845-850 (2022).
  19. Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  20. Chen, J. L., Voigt, F. F., Javadzadeh, M., Krueppel, R., Helmchen, F. Long-range population dynamics of anatomically defined neocortical networks. eLife. 5, e14679(2016).
  21. Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  22. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. The Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  23. Murakami, T., Matsui, T., Uemura, M., Ohki, K. Modular strategy for development of the hierarchical visual network in mice. Nature. 608 (7923), 578-585 (2022).
  24. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of Calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  25. Shemesh, O. A., et al. Precision calcium imaging of dense neural populations via a cell-body-targeted calcium indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
  26. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, e38173(2019).
  27. Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv. , (2017).
  28. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2014).
  29. Marques-Smith, A., et al. A Transient translaminar GABAergic interneuron circuit connects thalamocortical recipient layers in neonatal somatosensory cortex. Neuron. 89 (3), 536-549 (2016).
  30. Tuncdemir, S. N., et al. Early somatostatin interneuron connectivity mediates the maturation of deep layer cortical circuits. Neuron. 89 (3), 521-535 (2016).
  31. Nakazawa, S., Yoshimura, Y., Takagi, M., Mizuno, H., Iwasato, T. Developmental phase transitions in spatial organization of spontaneous activity in postnatal barrel cortex layer 4. The Journal of Neuroscience. 40 (40), 7637-7650 (2020).
  32. Yu, Y. -C., et al. Preferential electrical coupling regulates neocortical lineage-dependent microcircuit assembly. Nature. 486 (7401), 113-117 (2012).
  33. Siegel, F., Heimel, J. A., Peters, J., Lohmann, C. Peripheral and central inputs shape network dynamics in the developing visual cortex in vivo. Current Biology. 22 (3), 253-258 (2012).
  34. Nakagawa, N., Hosoya, T. Slow dynamics in microcolumnar gap junction network of developing neocortical pyramidal neurons. Neuroscience. 406, 554-554 (2019).
  35. Valiullina, F., et al. Developmental changes in electrophysiological properties and a transition from electrical to chemical coupling between excitatory layer 4 neurons in the rat barrel cortex. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1(2016).
  36. Avitan, L., et al. Spontaneous and evoked activity patterns diverge over development. Elife. 10, e61942(2021).
  37. Mölter, J., Avitan, L., Goodhill, G. J. Detecting neural assemblies in calcium imaging data. BMC Biology. 16 (1), 143(2018).
  38. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kora m zgu noworodka myszymikroskopia dwufotonowaobrazowanie pojedynczych neuron waktywno kory sensorycznejobrazowanie GCaMPkora beczkowaoperacja okna czaszkowegokorekcja ruchudetekcja ROIanaliza sygna u wapniowego

Powiązane artykuły