Artykuł metodologiczny

Wizualizacja in vivo spontanicznej aktywności w korze czuciowej noworodków myszy w rozdzielczości pojedynczego neuronu

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65899

⸱

21 listopada 2023

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Kagoshima University, 2Laboratory of Multi-Dimensional Imaging, International Research Center for Medical Sciences (IRCMS), Kumamoto University, 3Graduate School of Medical Sciences, Kumamoto University, 4Cedars-Sinai Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Podstawowe obszary czuciowe w korze nowej wykazują unikalne spontaniczne działania podczas rozwoju. W tym artykule opisano, jak wizualizować aktywność poszczególnych neuronów i podstawowych obszarów czuciowych w celu analizy synchronicznych działań specyficznych dla danego obszaru u noworodków myszy in vivo.

Streszczenie

Mózg ssaków przechodzi dynamiczne zmiany rozwojowe zarówno na poziomie komórkowym, jak i obwodowym w okresie prenatalnym i postnatalnym. Po odkryciu licznych genów przyczyniających się do tych zmian rozwojowych, obecnie wiadomo, że aktywność neuronalna również w znacznym stopniu moduluje te procesy. W rozwijającej się korze mózgowej neurony wykazują zsynchronizowane wzorce aktywności, które są wyspecjalizowane w każdym podstawowym obszarze czuciowym. Wzorce te znacznie różnią się od tych obserwowanych w dojrzałej korze mózgowej, podkreślając ich rolę w regulacji procesów rozwojowych specyficznych dla danego obszaru. Niedobory aktywności neuronalnej podczas rozwoju mogą prowadzić do różnych chorób mózgu. Odkrycia te podkreślają potrzebę zbadania mechanizmów regulacyjnych leżących u podstaw wzorców aktywności w rozwoju neuronów. Niniejszy artykuł podsumowuje szereg protokołów do wizualizacji pierwotnych obszarów czuciowych i aktywności neuronalnej u nowonarodzonych myszy, do obrazowania aktywności poszczególnych neuronów w podpolach kory mózgowej za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivo oraz do analizy korelacji aktywności związanych z podpolem. Pokazujemy reprezentatywne wyniki patchworkowej aktywności synchronicznej w obrębie poszczególnych beczek w korze somatosensorycznej. Omawiamy również różne potencjalne zastosowania i niektóre ograniczenia tego protokołu.

Wprowadzenie

Kora mózgowa zawiera kilka obszarów czuciowych o różnych funkcjach. Obszary otrzymują dane wejściowe pochodzące z odpowiadających im narządów zmysłów, w większości przenoszone przez rdzeń kręgowy lub pień mózgu i przekazywane przez thalamus1,2. Warto zauważyć, że neurony w każdym podstawowym obszarze czuciowym wykazują wyjątkowo zsynchronizowaną aktywność we wczesnych stadiach rozwoju, które również pochodzą z narządów zmysłów lub niższych ośrodków nerwowych, ale zasadniczo różnią się od aktywności obserwowanej w dojrzałej korze mózgowej3.

U noworodków gryzoni, na przykład, główny obszar widzenia (V1) wykazuje aktywność falową, która zaczyna się w siatkówce (fala siatkówkowa) i rozchodzi się przez całą ścieżkę wzrokową, zachowując przy tym retinotopię4. Pierwszorzędowy obszar słuchowy (A1) wykazuje aktywność synchroniczną zorganizowaną w podregiony w kształcie pasma, które odpowiadają pasmom izoczęstotliwości w dojrzałym mózgu. Aktywność emanuje z wewnętrznych komórek rzęsatych ślimaka5,6. Kora beczkowata w pierwotnym obszarze somatosensorycznym (S1) wykazuje wzorc aktywności podobny do patchworku, w którym neurony warstwy 4 w poszczególnych beczkach, a mianowicie neurony reagujące na poszczególne wąsy, są synchronicznie aktywowane7. Chociaż sugeruje się, że pochodzi ze zwoju nerwu trójdzielnego, źródło aktywności pozostaje nieznane7. W związku z tym wzorce aktywności noworodków są wyspecjalizowane zarówno w obrębie każdego podstawowego obszaru sensorycznego, jak i w obrębie podobszarów wewnątrzpowierzchniowych. Jednoczesna wizualizacja aktywności neuronalnej i struktury pierwotnych obszarów czuciowych może ułatwić badanie wkładu tych wzorców aktywności w rozwój systemów sensorycznych.

W tym artykule podsumowaliśmy szereg protokołów: (1) wizualizacji indywidualnych aktywności neuronalnych za pomocą rzadkiego znakowania GCaMP i głównych obszarów czuciowych za pomocą myszy TCA-RFP, które wyrażają czerwone białko fluorescencyjne w aksonach wzgórzowo-korowych7, (2) do obrazowania aktywności na poziomie pojedynczej komórki u noworodków myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej in vivooraz (3) w celu przeanalizowania korelacji aktywności w korze beczkowej S1. Reprezentatywne wyniki pokazują zsynchronizowaną aktywność przypominającą patchwork, w obrębie pojedynczych beczek myszy z rodziny (P)6 w dniu pourodzeniowym. Pomimo pewnych ograniczeń, technika ta może być stosowana do obrazowania przewlekłego, obrazowania szerokokątnego w wielu obszarach czuciowych i różnych eksperymentów manipulacyjnych. Wieloaspektowa analiza aktywności neuronalnej podczas rozwoju wzbogaci nasze zrozumienie mechanizmów tworzenia obwodów mózgowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dla eksperymentów na zwierzętach Uniwersytetu Kumamoto i Narodowego Instytutu Genetyki oraz zatwierdzone przez komitety ds. eksperymentów na zwierzętach.

1. Elektroporacja in utero (IUE)

  1. Połącz samce myszy TCA-RFP o pochodzeniu ICR z samicami myszy ICR typu dzikiego. Obserwuj czop dopochwowy, aby sprawdzić, czy nie doszło do krycia wczesnym rankiem następnego dnia. Obserwuj brzuch, aby sprawdzić, czy nie ma ciąży 2 tygodnie później.
  2. Przygotować roztwór plazmidowy zawierający 5 ng/μL TRE-nCre, 1 μg/μL CAG-loxP-stop-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPRE i 0,02% błękitu trypanowego w ddH2O do rzadkiego znakowania neuronów przez GCaMP za pomocą systemu Supernova 8.
  3. Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający 0,5 mg/ml karprofenu i 0,01 mg/ml buprenorfiny. Chroń go przed światłem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
  4. W dniu embrionalnym (E)14 wykonaj IUE w następujący sposób. Metody IUE są zasadniczo takie same jak w poprzednich raportach9,10,11.
    1. Przetrzyj stół laboratoryjny 70% roztworem etanolu lub aldehydu glutarowego. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne przez autoklawowanie. Noś maskę i fartuch laboratoryjny, aby zmniejszyć ryzyko infekcji myszy.
    2. Przygotować szklane mikropipety za pomocą ściągacza do mikropipet. Pobrać roztwór mieszaniny plazmidów do szklanej mikropipety za pomocą rurki aspiratora.
    3. Wywołać znieczulenie ciężarnych myszy w grupie E14 za pomocą izofluranu (2,0% w powietrzu). Utrzymuj myszy w znieczuleniu podczas zabiegu izofluranem (1,2% w powietrzu). Ściśnij palec u nogi, aby upewnić się, że znieczulenie jest wystarczająco głębokie. Stosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
    4. Zdezynfekuj okolice brzucha co najmniej trzy razy naprzemiennie peelingiem na bazie jodu i 70% etanolu. Umieść sterylną serwetę, aby przykryć obszar operacyjny. Wykonaj nacięcie w linii środkowej i odsłoń macicę na zasłonę.
    5. Powtórz wlewanie ciepłej soli fizjologicznej na macicę, aby zapobiec jej wysuszeniu lub ochłodzeniu aż do zamknięcia brzucha (krok 1.4.8).
    6. Wstrzyknąć roztwór plazmidu po jednej stronie bocznej komory zarodków jeden po drugim za pomocą mikropipety i rurki aspiratora.
    7. Za pomocą elektrody kleszczowej uszczypnij główki zarodków i dostarcz kwadratowe impulsy elektryczne (40 V, 50 ms) pięć razy w odstępach 1 s za pomocą elektroporatora.
    8. Wróć macicę do jamy brzusznej. Nałóż ~3 ml ciepłej soli fizjologicznej do jamy ubytkowej. Zszyj błonę otrzewnej i skórę brzucha. Roztwór przeciwbólowy należy podawać w stężeniu 10 μl/g (karprofen w stężeniu 5 μg/g masy i buprenorfina w stężeniu 0,1 μg/g masy) pod skórę z tyłu szyi.
  5. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej (37 °C), aby wyleczyć się ze znieczulenia. Połóż mysz na brzuchu, aby język i ślina nie zadusiły gardła. Trzymaj mysz z dala od innych myszy i monitoruj ją, aż odzyska normalne ruchy. Umieść mysz z powrotem w klatce.
  6. Po urodzeniu wykonaj genotypowanie, aby sprawdzić allel RFP i poddać eutanazji szczenięta bez allelu. Ten krok jest zalecany, zwłaszcza jeśli obrazowanie jest wykonywane w drugim tygodniu po porodzie, kiedy sygnał TCA-RFP jest słaby i trudny do sprawdzenia w kroku 2.2.7.

2. Chirurgia okna czaszkowego

  1. Przygotuj bufor korowy zawierający 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM glukozy, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl2 i 2 mMMgSO4 w ddH2O (pH dostosowane do 7,4 z 1 M NaOH) 12 przed dniem operacji. Wyjałowić bufor za pomocą filtra próżniowego.
    UWAGA: Bufor może być przechowywany w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy. Wymagana objętość to 5-10 ml na szczeniak.
  2. Wykonaj następujące czynności w P3-12. Zobacz również poprzednie raporty, które opisywały tę procedurę13,14.
    1. Wymieszaj 50 mg agarozy z 5 ml buforu kory i całkowicie rozpuść agarozę przez ogrzewanie. Pobrać część roztworu do probówki o pojemności 1,5 ml i utrzymywać w temperaturze 42 °C.
    2. Weź trochę buforu kory mózgowej do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i utrzymuj go w temperaturze pokojowej. Weź trochę soli fizjologicznej do pojemnika (np. nakrętki stożkowej probówki o pojemności 50 ml) i przechowuj ją w temperaturze pokojowej.
    3. Przygotować roztwór przeciwbólowy zawierający 0,01 mg/ml buprenorfiny. Chroń go przed światłem i przechowuj w temperaturze pokojowej.
    4. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Zdezynfekuj fluorescencyjny mikroskop stereoskopowy 70% etanolem.
    5. Użyj parownika izofuranowego, aby wywołać znieczulenie u szczeniaka za pomocą izofluranu (2,0% w powietrzu). Zwróć uwagę na szczeniaka i wyjmij go, gdy jego oddech nieco zwolni.
      UWAGA: Jeśli znieczulenie przedłuży się, oddech szczeniaka może ustać na kilka sekund. Nawet jeśli oddychanie szczeniaka zostanie wznowione, przedłużone znieczulenie może zmniejszyć przepływ krwi w mózgu i spowodować nieodwracalne uszkodzenie mózgu.
    6. Zdezynfekuj głowę szczeniaka co najmniej trzy razy naprzemiennie szorowaniem na bazie jodu i 70% etanolem. Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej (35 °C) pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Zawsze utrzymuj szczenię w znieczuleniu izofluranem (1,5%-2,5% w powietrzu).
    7. Wybierz szczenięta wykazujące ekspresję TCA-RFP i GCaMP, obserwując fluorescencję przez czaszkę. Poddaj eutanazji szczenięta, które nie wyrażają obu.
    8. Usuń skórę głowy powyżej półkul mózgowych tak szeroko, jak to możliwe, ostrożnie, aby nie spowodować krwawienia. Przetrzyj czaszkę sterylnym wacikiem nasączonym solą fizjologiczną, aby usunąć tkankę łączną.
    9. Po wyschnięciu czaszki przyklej naciętą powierzchnię skóry głowy do czaszki za pomocą kleju tkankowego.
    10. Przenieś szczeniaka na poduszkę grzewczą o temperaturze 37 °C, aby wyzdrowiał ze znieczulenia. Odczekaj co najmniej 15 minut, aby klej stwardniał.
      UWAGA: Zatrzymaj się na maksymalnie 1 godzinę przed przejściem do następnego kroku. W tym czasie przygotuj inne szczenięta w podobny sposób, jeśli zajdzie taka potrzeba.
    11. Znieczulić szczenię izofluranem. Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej (37 °C) pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym w znieczuleniu (1.5%-2.5% izofluranu w powietrzu).
      UWAGA: Jeśli znieczulenie trwa dłużej niż czas do punktu końcowego (60 min), należy poddać szczenię eutanazji przez dekapitację podczas znieczulenia izofluranem.
    12. Zaznaczyć miejsce odciągania GCaMP na czaszce sterylnym markerem permanentnym. Zastosuj bufor kory mózgowej do lokalizacji.
    13. Włóż róg żyletki do czaszki. Powoli popchnij ostrze, aby zgolić czaszkę i zrobić dziurę. Uszczypnij pękniętą czaszkę pęsetą i usuń ją.
    14. Sprawdź, czy otwór w czaszce został pomyślnie wykonany, obserwując naczynia krwionośne w otworze. Jeśli wystąpi krwawienie, szybko przepłucz otwór buforem kory mózgowej za pomocą mikropipety. Powtarzaj płukanie, aż krwawienie całkowicie ustaje.
    15. Nałóż kroplę buforu kory mózgowej na otwór czaszki i umieść w sterylnym okrągłym szkle nakrywkowym o średnicy 3 mm nad otworem. Nadmiar bufora zetrzeć włókniną. Poczekaj, aż obszar wokół szkła wyschnie.
    16. Nałóż ciepły roztwór agarozy wokół krawędzi szkła za pomocą mikropipety. Ponieważ zbyt duża ilość agarozy może zmniejszyć sygnały fluorescencyjne, usuń nadmiar roztworu pod szkłem, delikatnie popychając szkło od góry.
    17. Usuń agarozę ze szkła lub odsuniętą od krawędzi szkła za pomocą pęsety. Pozostaw agarozę tylko na zewnętrznym obwodzie szkła.
    18. Poczekaj, aż agaroza zastygnie. Jeśli skurcz agarozy tworzy przestrzeń pod szkłem, dodaj roztwór agarozy z boku, aby pokryć całą krawędź szkła. Usuń płyn z powierzchni czaszki za pomocą włókniny.
    19. Wymieszaj żywicę akrylową w proszku i płynie w gumowym pojemniku. Odessać mieszaninę za pomocą mikropipety i wlać ją, aby pokryć żywicą agarozę otaczającą krawędź szkła.
      UWAGA: Ponieważ żywica krzepnie wkrótce po zmieszaniu proszku i płynu, należy je wielokrotnie mieszać przed nałożeniem. Ilości potrzebne w każdym mieszaniu to ~500 μL dla płynu i ~0,15 g dla proszku.
    20. Zamocuj tytanowy pręt z żywicą na przeciwległej półkuli. Utrzymuj kąt pręta równolegle do szkła nakrywkowego. Przymocuj całą powierzchnię czaszki żywicą.
    21. Roztwór przeciwbólowy należy podawać w stężeniu 10 μl/g (buprenorfina w stężeniu 0,1 μg/g masy) pod skórę z tyłu szyi. Przywróć szczeniaka do poduszki grzewczej o temperaturze 37 °C w celu odzyskania znieczulenia. Poczekaj >60 minut do zestalenia żywicy przed obrazowaniem.
      UWAGA: Zrób przerwę na 1-5 godzin przed obrazowaniem. W tym czasie wykonuj operację na innych szczeniętach w podobny sposób.

3. Dwufotonowe obrazowanie wapnia

  1. Przymocuj dwuosiowy goniometr z tytanową płytką do płytki stolika z pozycjonowaniem XY pod mikroskopem. Ustaw poduszkę grzewczą (35 °C) na scenie.
  2. Włącz oprogramowanie do skanowania, spełniając następujące warunki: Piksele, 512 x 512; Dwukierunkowy, WŁ.; Uśrednianie, brak; obszar obrazowania, 600 x 600 μm z obiektywem 20x. Ustaw ustawienia tak, aby szybkość skanowania była większa niż 1 Hz.
  3. Umieść szczeniaka na poduszce grzewczej i przymocuj tytanową listwę montowaną na głowie do tytanowej płytki za pomocą. Utrzymuj szczenię w stanie znieczulenia, umieszczając port rurki na izofluran (1,5-2,0% w powietrzu).
  4. Wyreguluj kąt okna w poziomie za pomocą goniometru. Włącz podświetlenie i obserwuj powierzchnię mózgu za pomocą soczewki obiektywu 5x, a następnie wybierz obszar obrazowania według pozycjonowania XY.
  5. Umieść krople do oczu na oknie czaszki. Zmień obiektyw na soczewkę zanurzającą w wodzie 20x. Obserwuj powierzchnię kory mózgowej, aby potwierdzić, że przepływ krwi jest widoczny na powierzchni mózgu.
  6. Wyłącz podświetlenie i zeskanuj powierzchnię mózgu w trybie jednofotonowym. Zwiększ moc lasera, aby zielona autofluorescencja szkła i powierzchni mózgu była widoczna.
  7. Obniż stężenie izofluranu do 1,0%-1,5%. Zakryj mikroskop, aby uniknąć wycieków światła. Przełącz oprogramowanie skanujące w tryb dwufotonowy.
  8. Dostosuj moc lasera i wzmocnienie detektora odpowiednie do skanowania sygnałów GCaMP i RFP. Znajdź głębokość, na której widoczne są sygnały TCA-RFP. Upewnij się, że głębokość jest warstwą 4, ~300 μm niższą niż powierzchnia mózgu w P6. Wybierz obszar obrazowania, w którym widocznych jest wiele neuronów wykazujących ekspresję GCaMP.
  9. Rozpocznij obrazowanie poklatkowe sygnałów GCaMP i RFP. Jeśli jednoczesne skanowanie dwukanałowe nie ma zastosowania, przechwyć obrazy GCaMP i TCA-RFP przed obrazowaniem.
  10. Odstaw izofluran, aby osłabić znieczulenie i obserwuj spontaniczne aktywności przez ~20 min. Monitoruj ruchy szczeniaka podczas obrazowania za pomocą kamery na podczerwień. Natychmiast wznowić znieczulenie izofluranem (2% w powietrzu), jeśli zaobserwuje się jakąkolwiek reakcję wskazującą na niepokój.
  11. Gdy szczenię przestanie się poruszać, powtórz obrazowanie od kroku 3.9. W razie potrzeby zmień obszar obrazowania.
  12. Poddaj szczenię eutanazji za pomocą przedawkowania izofluranu. Napraw mózg przez przezsercową perfuzję soli fizjologicznej i 4% PFA, a następnie po utrwaleniu w 4% PFA przez noc w celu przygotowania stycznych plasterków i przeprowadzenia immunohistochemii. W przeciwnym razie poddaj szczeniaka eutanazji za pomocą przedawkowania środka znieczulającego, a następnie ścięcia głowy.
  13. Jeśli matka nie ma innych młodych, poddaj myszą matkę eutanazji za pomocą przedawkowania środka znieczulającego, a następnie zwichnięcia szyjki macicy.

4. Analiza

  1. Uruchom MATLAB i uruchom EZcalcium toolbox15, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika (GUI) 'Initial GUI'.
  2. Kompensacja przesunięć ramki obrazu spowodowanych ruchami myszy lub innymi przyczynami.
    1. Kliknij opcję Korekcja ruchu w początkowym graficznym interfejsie użytkownika, aby otworzyć graficzny interfejs korekcji ruchu. Kliknij "Dodaj pliki...', aby załadować plik TIF z danymi obrazowania.
    2. Ustaw ustawienia w następujący sposób: Niesztywna korekcja ruchu, puste; Współczynnik zwiększania próbkowania, 50; Maksymalna zmiana, 15; początkowa wielkość partii, 200; Szerokość pojemnika, 200. Kliknij "Uruchom korekcję ruchu", aby wykonać korektę. Dane obrazowania z korekcją ruchu zostaną zapisane automatycznie.
      UWAGA: Ustawienia należy dostosować do właściwości danych obrazowania. Jeśli dryfty niektórych klatek nie są kompensowane z powodu nieliniowych zniekształceń klatki lub ruchu kory w kierunku głębokości, otwórz oryginalne dane obrazowania bez korekcji w ImageJ Fiji i usuń klatki, a następnie uruchom ponownie krok 4.2.
  3. Wykrywaj neurony i rysuj obszary zainteresowania (ROI).
    1. Kliknij opcję Automatyczne wykrywanie ROI w początkowym graficznym interfejsie użytkownika, aby otworzyć graficzny interfejs użytkownika wykrywania ROI. Kliknij przycisk Add Files... (Dodaj pliki), aby załadować dane obrazowania z korekcją ruchu.
    2. Ustaw ustawienia w następujący sposób: Inicjalizacja, Zachłanny; metoda wyszukiwania, elipsa; Dekonwolucja, ograniczona FOOPSI-SPGL1; Autoregresja, rozpad; Szacowany # zwrot z inwestycji, 60 (zalecana jest ponad dwukrotnie większa liczba wykrytych wizualnie); Szacowana szerokość ROI, 17 (~20 μm); Próg scalania, 0,95; współczynnik krówki, 0,95; Przestrzenne zmniejszanie próby, 1; Temp. Próbkowanie w dół, 1; Temp. Iteracje, 5.
      UWAGA: Ustawienia należy dostosować do właściwości danych obrazowania.
    3. Kliknij przycisk Uruchom wykrywanie ROI, aby uruchomić wykrywanie. Dane ROI zostaną zapisane automatycznie.
    4. Kliknij opcję Uściślanie ROI w początkowym graficznym interfejsie użytkownika, aby otworzyć GUI uściślania ROI. Kliknij przycisk Załaduj dane, aby załadować dane ROI. Wybierz ROI, które miały niską częstotliwość aktywności (<1 Hz), znajdowały się pod czaszką lub zawierały neuryty innych neuronów. Kliknij opcję Wyklucz zwrot z inwestycji, aby wykluczyć zwrot z inwestycji.
    5. Wybierz format eksportu danych do XLSX i kliknij Eksportuj dane, aby uzyskać plik Excel z nieprzetworzonymi wartościami dF/F. dF/F wykorzystuje równanie (1), gdzie F to średnia intensywność pikseli w każdej klatce, F0 to natężenie sygnału bazowego, a Fb to fluorescencja tła.
      figure-protocol-1 (1)
  4. Oblicz współczynnik korelacji Pearsona dF/F między ROI i utwórz macierz współczynników korelacji. DF/F należy stosować tylko po osłabieniu znieczulenia i rozpoczęciu spontanicznej aktywności (~10 minut po odstawieniu izofluranu).
  5. Zdefiniuj krawędzie beczki na podstawie obrazu TCA-RFP za pomocą Fidżi. Kategoryzuj zwroty z inwestycji do odpowiednich beczek lub przegród. Porównaj korelację parami w obrębie tej samej beczki i korelację między różnymi beczkami.
  6. Wygeneruj od 1 000 do 10 000 danych zastępczych, losowo tasując korespondencję między śladami ROI i Ca2+. Oblicz średni współczynnik korelacji w obrębie poszczególnych baryłek w każdym przypadku danych zastępczych i oceń istotność statystyczną korelacji w danych rzeczywistych.
    UWAGA: Jeśli jeden z 10 000 surogatów ma wartość wyższą niż wartość rzeczywista, istotność statystyczna wynosi 0,0001. Analizy opisane w krokach 4.5 i 4.6 można przeprowadzić dla zbiorczych danych pochodzących od wielu zwierząt, tak jak to zostało wykonane w innym miejscu7,16.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Rysunek 1 pokazuje reprezentatywne wyniki aktywności neuronów warstwy 4 w korze lufowej szczeniaka P6 zwizualizowane przy użyciu obecnego protokołu. Dwufotonowe obrazy kanału zielonego (GCaMP) i kanału czerwonego (TCA-RFP) zostały czasowo uśrednione i pokazane w Rysunek 1A. Ponieważ fluorescencja TCA-RFP była znacznie słabsza niż fluorescencja GCaMP, sygnał GCaMP przeciekał do kanału czerwonego (Rysunek 1A1,A2). Czternaście ROI zostało...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Biorąc pod uwagę, że spontaniczne czynności wyłaniają się z narządu zmysłu lub dolnego układu nerwowego i przemieszczają się do pierwotnego obszaru czuciowego przez ścieżkę równoważną ścieżce dojrzałego układu nerwowego3, kluczowe znaczenie ma zdefiniowanie pierwotnego obszaru czuciowego i lokalizacji obrazowanych neuronów w tym obszarze. W tym protokole zajęliśmy się tym wymogiem, wykorzystując transgeniczne myszy, które wizualizują aksony wzgórzowo-korowe i system Supernova, który rzadko wyraża ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konkurencyjnych interesów finansowych, które mogliby zadeklarować.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty na Rzecz Transformacyjnych Obszarów Badawczych (B) (22H05092, 22H05094) oraz Granty na Badania Naukowe 20K06876, AMED pod numerem grantu 21wm0525015, Fundację Naukową Takeda, Fundację Naito, Fundację Kato Memorial Bioscience, Fundację Kowa Life Science, NIG-JOINT (24A2021) (do H.M.); oraz Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki Granty na Rzecz Badań Naukowych Granty 19K06887 i 22K06446, Kodama Memorial Fund for Medical Research, Uehara Memorial Foundation, Kato Memorial Bioscience Foundation oraz Takeda Science Foundation (dla N.N-T.). Dziękujemy dr Takuji Iwasato za myszy TCA-RFP.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
20&krotna soczewka obiektywowa (zanurzenie w wodzie)
250 ml Filtr próżniowy/system butelek do przechowywaniaCorning431096
4% roztwór buforowy fosforanu paraformaldehydu (4% PFA)Nacalai09154-85
Żywica akrylowa (UNIFAST II)GCN/A
AgarozaSigmaA9793
Zespół rurki aspiratoraDrummond2-040-000
CaCl2• 2H2ONacalai06731-05
ElektroporatorBEXGEB14
Krople do oczu (Scopisol)Senju PharmaceuticalN/A
Fluorescencyjny mikroskop stereoskopowyLeicaM165FC
GlucoseNacalai16806-25
Poduszka grzewczaMuromachi KikaiFHC-HPS
HEPESGibco15630-080
IsofluranePfizerN/A
KClNacalai28514-75
MgSO4• 7H2OWako131-00405
Ściągacz do mikropipetNarishigePC-100
Laser wielofotonowySpectra-PhysicsMai Tai eHP DeepSee
Mikroskop wielofotonowyZeissLSM 7MP
NaClNacalai31320-05
Włóknina (Kimwipe)Kimberly ClarkS-200
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Nacalai27575-31
Plazmid: CAG-loxP-STOP-loxP-GCaMP6s-ires-tTA-WPREAddgenepK175
Plazmid: TRE-nCreAddgenepK031
Precyzyjnie kalibrowane mikropipetyDrummond2-000-050
ŻyletkaFeatherFA-10
Rimadyl (50 mg/ml karprofen)ZoetisJPN/A
Okrągłe szkło nakrywkowe, średnica 3 mm MatsunamiCS01078
SalineOtsuka035175315
Pentobarbital soduNacalai26427-72
Stolik do obrazowania żywego szczeniaka (dwa jednoosiowe stoliki translacyjne do pozycjonowania XY, goniometr dwuosiowy, płyta podstawy, regulowany słupek do pozycjonowania z)Mysz ThorLabsLT1/M, GN2/M, BM2060/M, MLP01/M
TCA-RFPN/AN/ AMizuno i wsp., 2018a
Klej tkankowy (Vetbond)3M1469SB
Pręt tytanowyEndo Scientific InstrumentN/AWykonane na zamówienie (Mizuno i wsp., 2018b)
Tytanowa płytkaNie dotyczyWykonane na zamówienie (Mizuno i wsp., 2018b)
Pęseta Trypan niebieskiSigmaT8154
z elektrodą platynową, średnica 5 mmBEXCUY650P5
Mysz ICR typu dzikiegoNihon SLCSlc:ICR
mocująca pręt

Bibliografia

  1. Rao, M. S., Mizuno, H. Elucidating mechanisms of neuronal circuit formation in layer 4 of the somatosensory cortex via intravital imaging. Neuroscience Research. 167, 47-53 (2021).
  2. Iwasato, T., Erzurumlu, R. S. Development of tactile sensory circuits in the CNS. Current Opinion in Neurobiology. 53, 66-75 (2018).
  3. Martini, F. J., Guillamón-Vivancos, T., Moreno-Juan, V., Valdeolmillos, M., López-Bendito, G. Spontaneous activity in developing thalamic and cortical sensory networks. Neuron. 109 (16), 2519-2534 (2021).
  4. Ackman, J. B., Burbridge, T. J., Crair, M. C. Retinal waves coordinate patterned activity throughout the developing visual system. Nature. 490 (7419), 219-225 (2012).
  5. Tritsch, N. X., Yi, E., Gale, J. E., Glowatzki, E., Bergles, D. E. The origin of spontaneous activity in the developing auditory system. Nature. 450 (7166), 50-55 (2007).
  6. Babola, T. A., et al. Homeostatic control of spontaneous activity in the developing auditory system. Neuron. 99 (3), 511-524.e5 (2018).
  7. Mizuno, H., et al. Patchwork-type spontaneous activity in neonatal barrel cortex layer 4 transmitted via thalamocortical projections. Cell Reports. 22 (1), 123-135 (2018).
  8. Mizuno, H., et al. NMDAR-regulated dynamics of layer 4 neuronal dendrites during thalamocortical reorganization in neonates. Neuron. 82 (2), 365-379 (2014).
  9. Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
  10. Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8. Science. 294 (5544), 1071-1074 (2001).
  11. Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental Biology. 240 (1), 237-246 (2001).
  12. Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  13. Mizuno, H., Nakazawa, S., Iwasato, T. In vivo two-photon imaging of cortical neurons in neonatal mice. Journal of Visualized Experiments. 140, e58340(2018).
  14. Egashira, T., et al. In vivo two-photon calcium imaging of cortical neurons in neonatal mice. STAR Protocols. 4 (2), 102245(2023).
  15. Cantu, D. A., et al. EZcalcium: Open-source toolbox for analysis of calcium imaging data. Frontiers in Neural Circuits. 14, 25(2020).
  16. Maruoka, H., et al. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358 (6363), 610-615 (2017).
  17. Antón-Bolaños, N., et al. Prenatal activity from thalamic neurons governs the emergence of functional cortical maps in mice. Science. 364 (6444), 987-990 (2019).
  18. Guillamón-Vivancos, T., et al. Input-dependent segregation of visual and somatosensory circuits in the mouse superior colliculus. Science. 377 (6608), 845-850 (2022).
  19. Cardin, J. A., Crair, M. C., Higley, M. J. Mesoscopic imaging: Shining a wide light on large-scale neural dynamics. Neuron. 108 (1), 33-43 (2020).
  20. Chen, J. L., Voigt, F. F., Javadzadeh, M., Krueppel, R., Helmchen, F. Long-range population dynamics of anatomically defined neocortical networks. eLife. 5, e14679(2016).
  21. Ota, K., et al. cell-resolution, contiguous-wide two-photon imaging to reveal functional network architectures across multi-modal cortical areas. Neuron. 109 (11), 1810-1824 (2021).
  22. Zariwala, H. A., et al. A Cre-dependent GCaMP3 reporter mouse for neuronal imaging in vivo. The Journal of Neuroscience. 32 (9), 3131-3141 (2012).
  23. Murakami, T., Matsui, T., Uemura, M., Ohki, K. Modular strategy for development of the hierarchical visual network in mice. Nature. 608 (7923), 578-585 (2022).
  24. Pnevmatikakis, E. A., et al. Simultaneous denoising, deconvolution, and demixing of Calcium imaging data. Neuron. 89 (2), 285-299 (2016).
  25. Shemesh, O. A., et al. Precision calcium imaging of dense neural populations via a cell-body-targeted calcium indicator. Neuron. 107 (3), 470-486 (2020).
  26. Giovannucci, A., et al. CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis. Elife. 8, e38173(2019).
  27. Pachitariu, M., et al. Suite2p: beyond 10,000 neurons with standard two-photon microscopy. BioRxiv. , (2017).
  28. Sitdikova, G., et al. Isoflurane suppresses early cortical activity. Annals of Clinical and Translational Neurology. 1 (1), 15-26 (2014).
  29. Marques-Smith, A., et al. A Transient translaminar GABAergic interneuron circuit connects thalamocortical recipient layers in neonatal somatosensory cortex. Neuron. 89 (3), 536-549 (2016).
  30. Tuncdemir, S. N., et al. Early somatostatin interneuron connectivity mediates the maturation of deep layer cortical circuits. Neuron. 89 (3), 521-535 (2016).
  31. Nakazawa, S., Yoshimura, Y., Takagi, M., Mizuno, H., Iwasato, T. Developmental phase transitions in spatial organization of spontaneous activity in postnatal barrel cortex layer 4. The Journal of Neuroscience. 40 (40), 7637-7650 (2020).
  32. Yu, Y. -C., et al. Preferential electrical coupling regulates neocortical lineage-dependent microcircuit assembly. Nature. 486 (7401), 113-117 (2012).
  33. Siegel, F., Heimel, J. A., Peters, J., Lohmann, C. Peripheral and central inputs shape network dynamics in the developing visual cortex in vivo. Current Biology. 22 (3), 253-258 (2012).
  34. Nakagawa, N., Hosoya, T. Slow dynamics in microcolumnar gap junction network of developing neocortical pyramidal neurons. Neuroscience. 406, 554-554 (2019).
  35. Valiullina, F., et al. Developmental changes in electrophysiological properties and a transition from electrical to chemical coupling between excitatory layer 4 neurons in the rat barrel cortex. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1(2016).
  36. Avitan, L., et al. Spontaneous and evoked activity patterns diverge over development. Elife. 10, e61942(2021).
  37. Mölter, J., Avitan, L., Goodhill, G. J. Detecting neural assemblies in calcium imaging data. BMC Biology. 16 (1), 143(2018).
  38. Nakazawa, S., Mizuno, H., Iwasato, T. Differential dynamics of cortical neuron dendritic trees revealed by long-term in vivo imaging in neonates. Nature Communications. 9 (1), 3106(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Kora m zgu noworodka myszymikroskopia dwufotonowaobrazowanie pojedynczych neuron waktywno kory sensorycznejobrazowanie GCaMPkora beczkowaoperacja okna czaszkowegokorekcja ruchudetekcja ROIanaliza sygna u wapniowego

Powiązane artykuły