Artykuł metodologiczny

Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65901

⸱

5 kwietnia 2024

 ,  , 
1Department of Farm Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Midwestern University

W tym artykule

Podsumowanie

Enteroidy pojawiają się jako nowy model do badania fizjologii i patofizjologii tkanek, opracowywania leków i medycyny regeneracyjnej. W tym miejscu opisujemy system hodowli 2D enteroidów pochodzących z komórek pierwotnych bydła, który umożliwia kohodowlę z odpowiednimi typami komórek tkankowych. Model ten oferuje przewagę translacyjną w modelowaniu badań żołądkowo-jelitowych.

Streszczenie

Systemy hodowli komórek organoidowych mogą podsumować złożoność obserwowaną w tkankach, co czyni je użytecznymi w badaniu interakcji gospodarz-patogen, ocenie skuteczności i toksyczności leków oraz bioinżynierii tkankowej. Jednak zastosowanie tych modeli z opisanych powodów może być ograniczone ze względu na trójwymiarowy (3D) charakter tych modeli. Na przykład wykorzystanie systemów hodowli enteroidów 3D do badania chorób układu pokarmowego jest trudne ze względu na niedostępność światła jelita i wydzielanych przez niego substancji. Rzeczywiście, stymulacja organoidów 3D patogenami wymaga albo mikroiniekcji światła, mechanicznego rozerwania struktury 3D, albo wytworzenia enteroidów wierzchołkowych. Co więcej, organoidy te nie mogą być hodowane wspólnie z komórkami odpornościowymi i zrębowymi, co ogranicza dogłębną analizę mechanistyczną dynamiki patofizjologicznej. Aby obejść ten problem, zoptymalizowaliśmy dwuwymiarowy (2D) system hodowli monowarstwowej pochodzącej z enteroidów bydła z komórek pierwotnych, umożliwiając jednoczesną hodowlę z innymi istotnymi typami komórek. Krypty jelita krętego wyizolowane od zdrowego dorosłego bydła zostały wyhodowane w celu wygenerowania organoidów 3D, które zostały poddane krioprezerwacji do wykorzystania w przyszłości. Stworzono monowarstwę 2D przy użyciu ożywionych enteroidów 3D, które zostały pasażowane i rozerwane w celu uzyskania pojedynczych komórek, które zostały wysiane na wkładkach hodowli komórek transwell pokrytych ekstraktem z błony podstawnej, odsłaniając w ten sposób ich powierzchnię wierzchołkową. Polarność monowarstwy jelitowej, różnicowanie komórkowe i funkcję bariery scharakteryzowano za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej i pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego. Stymulacja powierzchni wierzchołkowej monowarstwy ujawniła oczekiwaną funkcjonalność monowarstwy, czego dowodem jest wydzielanie cytokin zarówno z przedziału wierzchołkowego, jak i podstawnego. Opisany model jednowarstwowy 2D pochodzący z enteroidów jest bardzo obiecujący w badaniu interakcji gospodarz-patogen i fizjologii jelit, opracowywaniu leków i medycynie regeneracyjnej.

Wprowadzenie

Modele zwierzęce w badaniach odgrywają kluczową rolę w pogłębianiu naszego zrozumienia patofizjologii chorób i dynamiki odpowiedzi immunologicznej gospodarza podczas infekcji oraz wspierają rozwój nowych strategii prewencyjnych i terapeutycznych1,2,3,4. Modele te wspierają odkrywanie i postęp badań na zwierzętach i mają kluczowe znaczenie dla postępu w badaniach nad zdrowiem człowieka. Przez dziesięciolecia modele gryzoni stanowiły podstawę postępów w mechanizmach odpornościowych i podstawowych badaniach biologicznych nad chorobami człowieka3,5,6,7. Podczas gdy modele gryzoni mają kluczowe znaczenie w badaniach przesiewowych i wczesnych badaniach rozwojowych, duże modele zwierzęce oferują bardziej odpowiednie porównanie w badaniach nad chorobami ludzkimi zarówno we wczesnych odkryciach, jak i późniejszych badaniach rozwojowych, w tym w testach skuteczności terapeutycznej i bezpieczeństwa1,3,4,5. Hodowla zwierząt gospodarskich oferuje wyraźne korzyści w porównaniu z modelami gryzoni, zapewniając bardziej wydajną translację do zastosowań u ludzi w przypadku niektórych chorób, w tym kryptosporydiozy, salmonellozy, gruźlicy, syncytialnego wirusa oddechowego i brucelozy1,7,8. Rzeczywiście, te i inne choroby rozwijają się spontanicznie u bydła, które ma kilka analogicznych patogenez choroby i procesów immunologicznych do ludzi, a jako populacja niekrewniacza, bydło naśladuje heterogeniczność genetyczną i środowiskową wpływającą na ludzką odpowiedź immunologiczną5,8,9,10. Korzyści płynące z modeli bydlęcych w badaniach nad chorobami zakaźnymi można zmaksymalizować, stosując najpierw zaawansowany system hodowli, a następnie wdrażając badania in vivo krok po kroku. Początkowe zastosowanie wysoce złożonego systemu hodowli bydła może znacznie zmniejszyć liczbę badań na żywych zwierzętach, jednocześnie zwiększając szanse na udane badania translacyjne i stosowane. Modele hodowlane powinny podsumowywać procesy chorobowe na poziomie narządów, aby zapewnić optymalną trafność predykcyjną, zachowując natywne mikrośrodowisko tkankowe przestrzennie i funkcjonalnie.

Odpowiedź immunologiczna błony śluzowej to wielopłaszczyznowy system składający się z wysoce wydajnej bariery utworzonej przez enterocyty przewodu pokarmowego i różne populacje komórek odpornościowych zlokalizowanych poniżej powierzchni błony śluzowej11. Ten wysoce złożony system ma kluczowe znaczenie podczas infekcji w utrzymaniu homeostazy przewodu pokarmowego i inicjowaniu obrony immunologicznej przed patogenami jelitowymi11. Komunikacja między enterocytami a leżącymi pod nimi wrodzonymi komórkami odpornościowymi inicjuje rozwój ochronnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko mikroorganizmom chorobotwórczym. W związku z tym systemy hodowli, które są porównywalne pod względem poziomu złożoności, są niezbędne do optymalnego badania interakcji patogenów gospodarz-jelito i są wysoce skuteczne w zrozumieniu fizjologii jelit oraz odkrywania i opracowywania leków12,13. Organoidy to solidny system hodowlany, który przypomina architekturą i funkcję tkanki pochodzenia14,15. Wielokomórkowość tych modeli pozwala na badanie roli różnych populacji komórek i interakcji komórkowych związanych ze zdrowiem i chorobą jelit12,14. Jednak modele organoidów pochodzenia ludzkiego w badaniach są obecnie ograniczone ze względu na trudności w uzyskaniu wystarczającej ilości i stałej jakości ludzkich komórek nabłonka jelitowego oraz ograniczoną żywotność komórek w hodowli. Unieśmiertelnione linie komórkowe mogą być wykorzystywane do konsekwentnego uzyskiwania wysokich plonów homologicznych kultur w tych modelach; Jednak transformowane komórki z natury nie mają różnorodności i złożoności funkcjonalnej nieprzekształconych komórek nabłonkowych16,17. Zalety stosowania kultur pochodzących z tkanki bydlęcej jako modelu do badania chorób i fizjologii przewodu pokarmowego obejmują łatwość, z jaką próbki tkanek mogą być konsekwentnie uzyskiwane od zdrowych dawców, lepszą żywotność komórek i większą różnorodność komórkową, którą można osiągnąć tylko w przypadku tkanki nieunieśmiertelnionej. Porównawcza transkryptomika tkanek i charakterystyka organoidów jelitowych ujawniają podobieństwa w zachowanych genach ortologicznych i potencjałach komórkowych między ludźmi a bydłem18. W związku z tym system hodowli organoidów bydlęcych może być korzystny w badaniu chorób jelit u ludzi, a wyniki można łatwo przełożyć na medycynę ludzką.

Protokół opisany tutaj szczegółowo opisuje skuteczną platformę do oceny odpowiedzi gospodarza na patogeny jelitowe lub związki oraz fizjologii jelit przy użyciu systemu hodowli komórek pierwotnych 2D pochodzących z enteroidów bydlęcych. W przeciwieństwie do organoidów 3D, systemy hodowli 2D generowane na wkładkach transwell pozwalają na podwójną hodowlę komórek jelitowych z komórkami odpornościowymi lub zrębowymi, umożliwiając badanie dynamiki na poziomie tkankowym. Dzięki zastosowaniom w badaniach biomedycznych, rozwoju farmaceutycznym i testowaniu skuteczności, ten fizjologicznie istotny model może przynieść korzyści zdrowotne i rozwojowe zarówno bydła, jak i ludzi.

Protokół

Wszystkie protokoły zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi i krajowymi wytycznymi i przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt.

1. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Podstawowe i końcowe stężenia odczynników użytych w tym badaniu są wymienione w Tabeli 1.

  1. Przygotować bufor do pobierania próbek: Wymieszać 1 l lodowato zimnego roztworu soli fizjologicznej buforowanego fosforanem (PBS) zawierającego penicylinę (100 j./ml), streptomycynę (100 μg/ml), gentamycynę (25 μg/ml) i kaspofunginę (2,5 μg/ml). Przechowywać roztwór podstawowy w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotuj odczynnik dysocjacyjny #1: Wymieszaj 18,55 ml buforu do pobierania próbek (zgodnie z opisem w kroku 1.1), 1,422 ml kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA, 0,422 M/pH 7,4), 20 μl 1 M roztworu 1,4-ditiotreitolu (DTT), 4 μl roztworu Y-27632 (5000x/50 mM). Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotuj odczynnik dysocjacyjny #2: Wymieszaj 18,57 ml buforu zbiorczego (zgodnie z opisem w kroku 1.1), 1,422 ml EDTA (0,422 M/pH 7,4), 4 μl roztworu Y-27632 (5000x/50 mM). Przechowywać roztwór w temperaturze 37 °C.
  4. Przygotuj bulion z enteroidów: Wymieszaj 9,875 ml organoidowego podłoża wzrostowego plus suplement, 100 μl penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 μg/ml), 5 μl gentamycyny (25 μg/ml) i 20 μl kaspofunginy (2,5 μg/ml). Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotować pożywkę do różnicowania enteroidów: Wymieszać 10 ml pożywki różnicującej organoidy plus suplement, 100 μl penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 μg/ml), 5 μl gentamycyny (25 μg/ml) i 20 μl kaspofunginy (2,5 μg/ml). Przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C.
  6. Przygotuj podłoże myjące: Wymieszaj 48,45 ml DMEM/F-12 1,1 podłoża (z L-glutaminą, bez HEPES), 1 ml suplementu B-27 bez witaminy A (50x zapas), 500 μl penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 μg/ml), 25 μl gentamycyny (50 mg/ml bulionu) i 25 μl kaspofunginy (5 mg/ml bulionu). Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.
  7. Przygotować bufor do powlekania: Wymieszać 25 ml kompletnej pożywki DMEM: F12 bez inhibitorów i 25 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C.

2. Izolacja krypt jelitowych z całej tkanki (Rysunek 1)

UWAGA: Enteroidy jelita cienkiego bydlęcego zostały wygenerowane z tkanki jelita krętego uzyskanej od zdrowych dorosłych wołów rasy holsztyńskiej (>2 lata) z lokalnego zakładu przetwórstwa wołowiny. Do tej serii eksperymentów wykorzystano jednego dawcę.

  1. Przygotowanie próbek tkanki jelitowej
    1. Umieść pobrane próbki tkanki jelitowej o średnicy ~ 10 cali (25 cm) w ~ 400 ml lodowatego buforu do zbierania (PBS + antybiotyki / leki przeciwgrzybicze) i na lodzie w celu transportu do laboratorium.
    2. Za pomocą nożyczek chirurgicznych (np. Nożyczek majonezowych) i kleszczy (np. kleszczy asonowych) usuń nadmiar tłuszczu i krezki z próbki tkanki jelitowej.
    3. Pokrój tkankę na dwie równe części.
    4. Otwórz tkankę wzdłużnie nożyczkami chirurgicznymi i spłucz tkankę w sterylnym PBS.
    5. Delikatnie usunąć warstwę śluzu z próbki jelita za pomocą sterylnego szklanego szkiełka mikroskopowego i spłukać tkankę świeżym PBS.
      UWAGA: Ten krok pomaga usunąć kosmki i pomaga zwiększyć czystość frakcji krypty w kolejnych krokach.
    6. Na każdy 5-calowy (13 cm) kawałek pokrój tkankę na dwie części o długości 2,5 cala (6,5 cm), a następnie pokrój każdy kawałek na 4 w przybliżeniu równe małe kawałki, aby ułatwić dysocjację tkanki.
  2. Dysocjacja tkanki jelitowej
    1. Przygotuj 20 ml objętości odczynnika dysocjacji tkanek #1 w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i umieść małe próbki tkanek w stożkowej probówce, aż przemieszczenie objętości przesunie menisk z oznaczenia 20 ml do oznaczenia 35 ml na stożkowej probówce.
    2. Powtórz powyższy krok dla pozostałych fragmentów próbki tkanki jelita cienkiego.
    3. Uszczelnij stożkowe rurki parafilmem i ręcznie potrząśnij stożkową rurką 10 razy.
      UWAGA: W całym protokole ręczne potrząsanie powinno odbywać się w sposób celowy, ale delikatny.
    4. Umieść stożkowe rurki poziomo na lodzie w pojemniku na orbitalnej platformie wibracyjnej.
    5. Potrząsaj stożkowymi rurkami na lodzie w pojemniku przez 30 minut przy 80 obrotach na minutę (rpm). Co 10 minut ręcznie potrząsaj stożkową rurką.
    6. Przygotować 20 ml wstępnie podgrzanego (37 °C) odczynnika dysocjacyjnego do tkanek #2 (sformułowanego jak powyżej, ale bez DTT) w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Zdeponuj próbki tkanek z probówek stożkowych zawierających odczynnik dysocjacyjny #1 do stożkowych probówek zawierających odczynnik dysocjacyjny #2.
    7. Uszczelnij stożkowe rurki parafilmem i ręcznie potrząśnij stożkowymi rurkami 10 razy.
    8. Umieścić stożkowe rurki we wstępnie ogrzanej (37 °C) łaźni wodnej z wytrząsaniem, przechylonej pod kątem około 60 °C i wytrząsać z prędkością 150 obr./min przez 10 minut, z ręcznym wytrząsaniem po 5 minutach i ponownie po całkowitej 10 minutach inkubacji.
  3. Izolacja fragmentów krypty
    1. Oznacz 10 sterylnych probówek stożkowych #1 - #10. Dodaj 20 ml sterylnego, lodowatego PBS do każdej oznakowanej stożkowej probówki.
    2. Przenieś kawałki tkanki ze stożkowych probówek zawierających odczynnik dysocjacyjny #2 do nowej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej lodowaty PBS #1.
    3. Ręcznie potrząśnij stożkowymi rurkami 10 razy.
    4. Uszczelnij stożkowe rurki parafilmem i umieść je poziomo na lodzie. Potrząsaj stożkowymi rurkami na wytrząsarce orbitalnej przez 10 minut przy 80 obr./min. Po 10 minutach ręcznie potrząśnij stożkową rurką #1 10 razy. Jest to uważane za pranie #1.
    5. Delikatnie przenieś próbki tkanek za pomocą kleszczy chirurgicznych do stożkowej rurki #2.
    6. Powtórz kroki 2.3.2 - 2.3.4, jest to uważane za pranie #2.
    7. Powtarzaj pranie, aż do prania #10.
    8. Supernatanty z każdego płukania zawierają krypty, które zostaną wykorzystane do wytworzenia enteroidów. Przechowywać probówki zawierające sklarowane osady w temperaturze 4 °C do momentu zakończenia wszystkich 10 płukań.
    9. Po zakończeniu 10-tego płukania i odrzuceniu części tkanki, odwirować supernatanty stożkowych probówek #6-#10 o sile 400 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C w celu osadzenia izolowanych krypt.
      UWAGA: Myjnie 6-10 zawierają najczystsze frakcje nienaruszonych krypt z ograniczoną ilością szczątków i pojedynczych komórek. W związku z tym zaleca się, aby tylko te frakcje były używane do wytwarzania enteroidów, a wcześniejsze płukania (#2-#5) były odrzucane)
    10. Wyrzuć supernatant i dodaj 4 ml świeżego, lodowatego PBS do krypt bez ponownego zawieszania (pomaga to utrzymać fragmenty w stanie nienaruszonym do czasu mikroskopii).
    11. Oceń czystość zdysocjowanych krypt dla każdej stożkowej probówki #6-#10 za pomocą mikroskopii.
      1. Dodać 50 μl PBS do płytki 384-dołkowej.
      2. Dodaj 10 μl zawiesiny krypty do PBS i użyj soczewki obiektywowej o 40-krotnym powiększeniu, aby określić czystość, integralność i liczbę krypt.
        UWAGA: Narysowanie krzyżyka na dnie studni talerza ułatwia liczenie.

3. Wytwarzanie ex vivo i pasaż enteroidów jelita krętego bydła (Rysunek 2)

UWAGA: Krypty z probówek stożkowych z najbardziej czystymi, nienaruszonymi kryptami jelitowymi będą używane do dalszych testów. W przypadku wszystkich etapów, które obejmują krypty i enteroidy, końcówki pipet, skrobaki do komórek i probówki muszą być wstępnie pokryte buforem powlekającym i należy unikać pęcherzyków, aby zapobiec utracie krypt. O ile nie zaznaczono inaczej, należy użyć końcówki pipety o pojemności 1000 μl, aby zapobiec rozpadowi fragmentów krypty.

  1. Generowanie enteroidów z fragmentów krypty
    1. Połącz najczystsze frakcje krypty (zwykle #6-#10) w jedną stożkową rurkę.
    2. Odwirować stożkową probówkę zawierającą krypty o stężeniu 400 x g przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    3. Odrzucić supernatant przez zassanie go pipetą i ponownie zawiesić osad krypty w podłożu myjącym.
    4. Odwirować jak w kroku 3.1.2. Zdekantować supernatant i dodać 2 ml pożywki płuczącej do osadu kryptowego.
    5. Policz liczbę krypt zgodnie z opisem w kroku 2.3.11.1.
    6. Odwirować jak w kroku 3.1.2 w celu osadzenia krypt, odrzucenia supernatantu i ponownego zawieszenia w lodowatej macierzy zewnątrzkomórkowej błony podstawnej o 100% zredukowanym współczynniku wzrostu (BME) w celu uzyskania stężenia około 400 krypt/100 μL.
      UWAGA: ważne jest, aby prawidłowo rozmrozić BME w temperaturze 4 °C, ponieważ zmiany temperatury zmieniają jego konsystencję. Przedwczesnemu zestaleniu się BME można zapobiec za pomocą bloku chłodzącego i wstępnie schłodzonych końcówek pipet.
      1. Użycie innego preparatu matrycy membrany podstawnej może wymagać rozcieńczenia BME podczas tworzenia kopuł. Zapoznaj się z instrukcjami producenta dotyczącymi używanego BME.
    7. Pibułuj w górę iw dół, aby dokładnie zawiesić krypty w BME.
    8. Wykonać kopuły crypt-BME, powoli pipetując 50 μl zawiesiny crypt-BME na 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej na płytce grzewczej ustawionej na 37 °C z maksymalnie 8 kopułkami/studzienkę.
      UWAGA: Płytkę 6-dołkową należy wstępnie ogrzać w inkubatorze w temperaturze 37 °C przez noc przed poszyciem kopuł.
    9. Trzymaj 6-dołkową płytkę na płycie grzewczej przez 1 minutę przed ostrożnym przeniesieniem płytki do inkubatora o temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    10. Po 2 minutach odwróć płytkę 6-dołkową tak, aby pokrywka była skierowana w dół i inkubuj przez dodatkowe 30 minut, aby umożliwić polimeryzację kopułek.
    11. Po 30 minutach ostrożnie dodać 3 ml enteroidalnej pożywki wzrostowej o temperaturze pokojowej (RT) uzupełnionej 10 μM SB202190, 0,5 μM LY2157299 i 10 μM Y-27632 do studzienek zawierających kopuły.
    12. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
    13. Usuń pożywkę i zastąp ją świeżą pożywką Enteroid Growth uzupełnioną inhibitorami co 2-3 dni.
  2. Pasażowanie enteroidów
    1. Po 7-10 dniach upewnij się, że krypty utworzyły enteroidy 3D z wieloma pączkującymi strukturami, jak w Rysunek 2E, i są gotowe do przejścia.
    2. Wyrzuć pożywkę ze studni zawierających kopuły.
    3. Na każde 4 kopuły na studzienkę dodaj 1 ml lodowatego roztworu do dysocjacji komórek nieenzymatycznych uzupełnionego 10 μM Y-27632 do każdej studzienki zawierającej kopuły.
    4. Za pomocą wstępnie powlekanego skrobaka do komórek delikatnie odłącz kopułę od płytki do hodowli tkankowej.
    5. Zebrać enteroidy do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i rozcierać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
    6. Inkubować stożkową rurkę zawierającą rozdrobnione enteroidy w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej z prędkością 80 obr./min przez 10 minut.
    7. Dodać 10 ml lodowatej pożywki myjącej z 10 μM Y -27632 do enteroidów.
    8. Odwirować probówkę stożkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    9. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 ml świeżej pożywki do płukania i przenieść do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    10. Odwirować probówkę stożkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    11. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml enteroidalnej pożywki wzrostowej w 1,5 ml probówce do mikrowirówki.
    12. Odwirować probówkę do mikrowirówek o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucić supernatant.
    13. Ponownie zawiesić osad enteroidalny w lodowato zimnym 100% BME i postępować zgodnie z krokami 3.1.6-3.1.13.
    14. Enteroidy repasujące co 7 dni. Czas ekspansji może się różnić ze względu na gęstość, żywotność i zakres pączkowania. Wiele pączkujących struktur tworzących duże struktury enteroidalne wskazuje na konieczność przejścia enteroidów.
  3. Kriokonserwacja enteroidów
    1. W celu kriokonserwacji upewnij się, że enteroidy są pasażowane nie więcej niż pięć razy w hodowli.
      UWAGA: Nie zostało to przetestowane eksperymentalnie i opiera się na obserwacji autorów, że późniejsze pasaże mają zmniejszoną żywotność i dają zmienne wyniki.
    2. Aby zebrać enteroidy, należy użyć buforu dysocjacyjnego zgodnie z opisem w krokach 3.2.2-3.2.9.
      UWAGA: Mechanicznie zdysocjować enteroidy za pomocą pipety o pojemności 5 ml.
    3. Policz liczbę fragmentów enteroidów zgodnie z opisem w kroku 2.3.11.1.
    4. Odwirować probówkę stożkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić fragmenty enteroidu w pożywkach do kriokonserwacji uzupełnionych 10 μM Y-27632 w celu uzyskania stężenia ~ 2000 fragmentów enteroidu / ml i podwielokrotności 1 ml do wstępnie znakowanych kriowialiów.
    6. Umieść kriowiale w kontrolowanym pojemniku do zamrażania i przechowuj w temperaturze -80 °C przez noc.
    7. Przenieś kriowiale do ciekłego azotu w fazie gazowej w celu długotrwałego przechowywania.
  4. Reanimacja fragmentów krypt jelitowych
    1. Umieść na noc 6-dołkową płytkę w inkubatorze.
    2. Wstępnie pokryj probówkę o pojemności 5 ml 5 ml pożywki powlekającej.
    3. Wyjmij kriowiale z magazynu ciekłego azotu.
    4. Natychmiast, po rozmrożeniu, przenieś krypty z kriowialu do wstępnie powlekanej probówki o pojemności 5 ml. Wypłucz kriowial za pomocą pożywki myjącej i dodaj do probówki o pojemności 5 ml. Unikaj bąbelków.
    5. Doprowadzić objętość do 5 ml za pomocą pożywki myjącej i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    6. Podczas wirowania należy wstępnie pokryć probówkę o pojemności 1,5 ml pożywką powlekającą.
    7. Po odwirowaniu odlać supernatant, ponownie zawiesić osad w pożywce pozostałej w probówce i przenieść do wstępnie pokrytej probówki o pojemności 1,5 ml. Umyj probówkę o pojemności 5 ml środkiem myjącym i przenieś ją do probówki o pojemności 1.5 ml. Wirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    8. Zwiększ objętość do 1,5 ml za pomocą pożywki Enteroid Growth Media.
    9. Odwirować jak powyżej (krok 3.4.7) i ostrożnie natchnąć.
    10. Weź BME od 4 °C i umieść na lodzie/bloku lodu.
    11. Ponownie zawiesić osad enteroidalny w lodowatym 100% BME i postępować zgodnie z krokami 3.1.6-3.1.12.
    12. Zmieniaj nośnik co 2-3 dni.

4. Generowanie i ocena monowarstw 2D z enteroidów 3D

UWAGA: Jak wyżej, dla wszystkich etapów, które dotyczą krypt i enteroidów, końcówki pipet, skrobaki do komórek i probówki powinny być wstępnie pokryte buforem powlekającym, a bąbelki powinny być unikane, aby zapobiec utracie krypt.

  1. Przygotowanie wkładów transwell do formowania monowarstw 2D
    1. Umieścić inserty w 24-dołkowej płytce adaptera do hodowli tkankowej i wstępnie pokryć wierzchołkową stronę 1 μm 24-dołkowych wkładek do hodowli komórkowych PET 100 μl rozcieńczenia BME w proporcji 1:15 w enteroidalnej pożywce wzrostowej. Zawsze pokrywaj dodatkową wkładkę, która będzie używana jako kontrola podczas wykonywania pomiarów integralności bariery.
    2. Umieścić powlekaną wkładkę w 24-dołkowej płytce adaptera do hodowli tkankowej w inkubatorze.
      UWAGA: Z wkładkami transwell należy użyć specjalnego adaptera lub płytki do hodowli tkankowej.
    3. Inkubować wstawki kulturowe w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 godzinę, aby umożliwić polimeryzację.
      UWAGA: Transwelle z powłoką BME mogą być uszczelniane parafolią i przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, jeśli nie zostaną natychmiast użyte.
    4. Pod koniec inkubacji odessać enteroidalną pożywkę hodowlaną 3D.
  2. Dysocjacja enteroidów 3D
    1. Wygeneruj monowarstwy enteroidów 2D z kriokonserwowanych fragmentów enteroidów, które były reanimowane, platerowane i hodowane, jak opisano powyżej w sekcji 3.1, w celu utworzenia enteroidów 3D. Przejść rozmrożone enteroidy co najmniej dwukrotnie, przy czym ostatnie pasaże są hodowane przez co najmniej 5 dni przed przetworzeniem w celu wygenerowania kultur jednowarstwowych 2D.
    2. Zbierz enteroidy, dodając lodowato zimne podłoże płuczące uzupełnione 10 μM Y-27632 do kopuł enteroidalnych (użyj około 1 ml buforu dysocjacyjnego na 4 kopuły)
    3. Odłącz kopułki za pomocą skrobaka do komórek i zbierz je do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Rozcierać 30 razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml, aby wytworzyć fragmenty enteroidu.
    5. Rozcierać 40 razy za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby jeszcze bardziej rozbić fragmenty enteroidalne.
    6. Doprowadzić objętość stożkowej probówki o pojemności 15 ml z fragmentami enteroidalnymi do 10 ml za pomocą lodowatego podłoża do mycia.
    7. Odwirować probówkę stożkową o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    8. Odessać supernatant, łącznie z warstwą BME, uważając, aby nie naruszyć osadu enteroidalnego.
      UWAGA: Warstwa BME pojawi się jako mętna, galaretowata warstwa tuż nad granulatem.
    9. Na każde 4 kopuły ponownie zawieś osad w 1 ml wstępnie podgrzanego enzymu ekspresowego TrypLE uzupełnionego 10 μM Y-27632.
    10. Dodać mieszaninę enteroidu i tryple do płytki 24-dołkowej i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 10 minut.
    11. Po 10 minutach odpipetować mieszaninę enteroidów i tryple 40 razy za pomocą pipety o pojemności 1 ml w celu dalszego rozdrobnienia enteroidów.
    12. Następnie odpipetuj fragmenty 40 razy za pomocą pipety o pojemności 200 μl, aby rozbić fragmenty na pojedyncze komórki.
    13. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml lub 5 ml z dołączoną sterylną igłą 22-G, odessać i dozować zawiesinę komórek 4 razy, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
    14. Monitoruj dysocjację komórek za pomocą mikroskopii, jak opisano w kroku 2.3.11.1, aż 80% enteroidów zostanie rozłożonych na pojedyncze komórki.
    15. Zebrać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i ugasić reakcję enzymatyczną, dodając 4 razy objętość pożywki myjącej uzupełnionej 10% FBS.
    16. Przefiltrować enteroidy przez wstępnie powlekane sitko do komórek 40 μm dwukrotnie do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    17. Granulować pojedyncze komórki, odwirowując stożkową probówkę o masie 300 x g przez 5 minut.
  3. Siew jednowarstwowy 2D na wkładach transwell.
    1. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad w małej objętości (~600 μl) organoidalnej pożywki wzrostowej uzupełnionej 20% płodową surowicą bydlęcą (FBS) w temperaturze pokojowej.
    2. Określ gęstość i żywotność komórek enteroidalnych za pomocą metody wykluczania barwnika błękitu trypanowego, hemacytometru lub automatycznego licznika komórek. Oczekuje się, że średnia rentowność wyniesie 75%.
    3. Ostrożnie usunąć nadmiar roztworu powlekającego nałożonego w kroku 1.3 z wkładki do hodowli komórkowej tuż przed wysiewem komórek.
    4. Wysiewać pojedyncze komórki w 1 x 105 komórek w objętości 200 μl na wkładkę na wierzchołkowej powierzchni wstępnie pokrytej płytki do hodowli komórkowej.
    5. Dodać 700 μl kompletnej pożywki uzupełnionej 20% FBS do podstawno-bocznej strony wkładki do hodowli komórkowej.
    6. Manewruj płytką 10 razy w kształcie liczby 8, aby komórki równomiernie rozprowadziły się po wkładce.
    7. Trzymaj płytkę na cieplejszym talerzu przez 10 minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    8. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    9. Po 48 godzinach zastąp pożywkę w przedziale wierzchołkowym i podstawnym świeżymi pożywkami Enteroid Growth Means uzupełnionymi 20% FBS i inhibitorami.
    10. Trzeciego dnia należy usunąć pożywkę z komory wierzchołkowej i podstawno-bocznej, ostrożnie umyć wkładkę 1x PBS i zastąpić ją pożywką Enteroid Differentiation uzupełnioną tylko inhibitorami.
    11. Wymieniaj nośniki w obu komorach co 2-3 dni.
  4. Ilościowy pomiar integralności bariery nabłonkowej i konfluencji monowarstw
    UWAGA: Integralność bariery można ocenić za pomocą woltoomomierza nabłonkowego do pomiaru przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER).
    1. Wyjąć płytkę do hodowli transwell z inkubatora i pozostawić ją do zrównoważenia w temperaturze pokojowej przez kilka minut w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Upewnij się, że elektrody STX2 zostały wstępnie kondycjonowane, a woltoomomierz skalibrowany na 1000 Ω zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Włóż długi drążek sondy do komory podstawno-bocznej, a krótszy koniec do komory wierzchołkowej hodowli komórek nabłonka transwell. Uważaj, aby nie uszkodzić monowarstwy ani nie uszkodzić wkładki.
    4. Po ustabilizowaniu zapisz 3 pomiary TEER na wkład transwell, w tym wkład bez komórek. Proszę uśrednić wymiary dla każdej płytki.
    5. Obliczyć skorygowaną wartość TEER, odejmując średni pomiar studzienki ślepej od średnich pomiarów studzienek doświadczalnych, a następnie mnożąc ją przez pole powierzchni wkładu w celu określenia odporności bariery nabłonkowej (TEER [Ω.cm2] = [Rcell layer - Rblank] × Powierzchnia).

Wyniki

Pierwszym krokiem w generowaniu 2D monowarstw pochodzących z enteroidów jest przygotowanie pobranego fragmentu tkanki jelitowej (Rysunek 1A) do dysocjacji tkanki. Odbywa się to poprzez usunięcie przylegającego tłuszczu i krezki z tkanki (Rysunek 1B>), a następnie rozcięcie tkanki wzdłużnie w celu odsłonięcia powierzchni światła, aby warstwa śluzu jelita mogła zostać usunięta poprzez delikatne zeskrobanie za pomocą szkiełka przedmiotowego. Pobrany fragment jelita jest następnie cięty na progresywnie mniejsze fragmenty tkanki (Rysunek 1C), aby ułatwić dysocjację. Krypty są następnie oddzielane od leżącej pod nimi tkanki podśluzowej za pomocą serii przemyć buforami chelatującymi (Rysunek 1D,E) oraz PBS. Izolowane krypty jelitowe (Rysunek 1F) są następnie osadzane w kopułkach macierzy błony podstawnej (Rysunek 2A) i hodowane przez kilka dni w celu wygenerowania 3D enteroidów. Z 10-calowego fragmentu jelita cienkiego bydlęcego można wyizolować około 900 000 krypt i wykorzystać je do tworzenia enteroidów. Już po kilku godzinach hodowli wysiane krypty zaczynają się wydłużać i przekształcać w enterosfery (Rysunek 2B). Po 2 dniach można zaobserwować wyraźnie zdefiniowane światło (Rysunek 2C), a struktury pączkujące pojawiają się już w 4. dniu hodowli (Rysunek 2D). Do 7. dnia rozwijają się dojrzałe enteroidy (Rysunek 2E). Barwienie immunofluorescencyjne 7-dniowych 3D enteroidów wykazuje obecność różnych linii komórkowych. Mikroskopia konfokalna enteroidów przedstawiona na Rysunku 3 wykazuje lokalizację barwienia jądrowego DAPI, białka E-kadheryny w złączach przylegających, barwienie Chromograniną A (Chr-A) wskazujące na obecność komórek enteroendokrynnych, Lizozymem (LYZ) wykazującym komórki Panetha oraz Cytokeratyną-18 (CK-18) reprezentującą enterocyty. Po 7-10 dniach hodowli enteroidy powinny zostać pasażowane, aby umożliwić ich dalszą ekspansję i zapobiec przeludnieniu. Ustalono, że optymalny czas pasażowania enteroidów to 7-10 dni po pierwotnej izolacji krypt, co w ostateczności zależy od stanu zdrowia i tempa wzrostu enteroidów w hodowli. Optymalna gęstość wysiewu w celu uzyskania pożądanej morfologii i żywotności enteroidów, jak pokazano na Rysunku 2E, wynosi 400 krypt na kopułkę. Enteroidy można łatwo krio konserwować, a rozmrożone fragmenty enteroidów w pełni regenerują się do użytku eksperymentalnego po dwóch pasażach po rozmrożeniu. Warto zaznaczyć, że przed krio konserwacją zaleca się przeprowadzenie co najmniej dwóch pasaży pierwotnej hodowli krypt.

Aby wytworzyć 2D monolayer pochodzący z enteroidów, 3D enteroidy są zbierane, a następnie w serii etapów mechanicznie homogenizowane w obecności roztworu dysocjującego (Ryc. 4A) do postaci pojedynczych komórek. Pojedyncze komórki można następnie wysiać na wkład transwell, który został uprzednio pokryty roztworem pożywki hodowlanej z macierzą błony podstawnej. Średnio z czterech kopułek z 3D enteroidami można wysiać cztery transwelle. Liczba przetwarzanych 3D enteroidów zależy zatem od liczby transwelli potrzebnych do eksperymentu. Wysianie pojedynczych komórek z gęstością 1 x 105 i początkowa hodowla w obecności 20% FBS (Ryc. 4B-D>) pozwala uzyskać konfluentny monolayer w czasie krótszym niż 1 tydzień. Postępującą konfluencję 2D monolayera w hodowli można monitorować w czasie za pomocą mikroskopii świetlnej (Ryc. 4E,F). Pomiary transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER) mogą potwierdzić konfluencję oraz scharakteryzować integralność bariery nabłonkowej w czasie i w odpowiedzi na stymulację eksperymentalną (Ryc. 5A). Średnio po siedmiu dniach hodowli monolayer o konfluencji bliskiej 100% będzie miał odpowiadającą mu wartość TEER na poziomie ~1500 Ω·cm2. Podłużna ocena wartości TEER 2D monolayera z enteroidów wykazuje stały wzrost wartości TEER przez siedem dni, osiągając maksymalną średnią wartość 1546 Ω·cm2, po czym następuje spadek do najniższej wartości 11,5 Ω·cm2 uzyskanej w dwunastym dniu (Ryc. 5B). Barwienie immunofluorescencyjne zróżnicowanych monolayerów wskazuje, że zgodnie z tym protokołem tworzą się nienaruszone, zorganizowane, spolaryzowane płaty nabłonka jelitowego (Ryc. 6). Mikroskopia konfokalna zabarwionego 2D monolayera wykazuje lokalizację barwienia jądrowego DAPI, E-kadheryny oraz barwienia F-aktyny (Ryc. 6A-D). Mikroskopia fluorescencyjna 2D monolayera wykazuje cechy zróżnicowanych komórek nabłonka jelitowego, gdzie barwienie na Chromograninę-A (Chr-A) wykazuje obecność komórek enteroendokrynnych, lizozym (LYZ) wskazuje na komórki Panetha, a cytokeratyna-18 (CK-18) wskazuje na linie komórkowe enterocytów (Ryc. 6E-L). Modelowanie Z-stack pokazuje oczekiwaną polaryzację hodowli 2D monolayera z charakterystycznym osadzaniem F-aktyny, która znajduje się w mikrokosmkach pokrywających aspekt apikalny zróżnicowanych enterocytów, oraz E-kadheryny, białka zlokalizowanego w złączach przylegających rozmieszczonych między komórkami nabłonka (Ryc. 6M).

Funkcjonalność monowarstwy można ocenić poprzez stymulację apikalną różnymi komponentami, w tym ligandami receptorów Toll-podobnych (TLR) lub patogenami, a następnie poprzez ilościowe oznaczenie cytokin w nadsączach kultur komórkowych pobranych z przedziałów apikalnego i bazalnego. Rzeczywiście, gdy apikalna strona monowarstwy jest stymulowana przez 24 h agonistą TLR 1/2 Pam3csk4 w 4. dniu hodowli, obserwuje się zwiększoną produkcję cytokin w obu przedziałach w porównaniu z monowarstwami niepoddanymi działaniu preparatu (Rysunek 7A,B).

Schemat przetwarzania tkanki i dysocjacji krypt: jelito kręte bydlęce, tkanka odtłuszczona, uzyskane fragmenty krypt.
Rycina 1: Izolacja krypt jelitowych bydła od zdrowych dorosłych osobników. Obrazy ilustrujące przetwarzanie tkanki: (A) całego jelita krętego dorosłego bydła, (B) odtłuszczonego jelita krętego, (C) jelita krętego pociętego na kawałki o długości 2,5 cala (6,3 cm) w PBS na lodzie, (D) sekcji tkanki jelita krętego w buforze dysocjującym nr 1 w temperaturze 4 °C, (E) w buforze dysocjującym 2 w wstrząsowej łaźni wodnej w temperaturze 37 °C oraz (F) wyizolowanych fragmentów krypt jelita krętego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rozwój organoidów 3D w ciągu 7 dni, obrazy mikroskopowe, wysiew enteroidów w kopułkach, wzrost komórkowy.
Rycina 2: Rozwój pierwotnych enteroidów jelita krętego bydła 3D w matrycy błony podstawnej. Reprezentatywne obrazy (A) kopułek enteroidów 3D utworzonych w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej oraz (B-E) rozwoju enteroidów 3D w dniach 0, 2, 4 i 7 hodowli. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Immunofluorescencyjne barwienie trójwymiarowych enteroidów jelitowych, schemat jądra, F-aktyny, CK-18, E-cad, nałożenie obrazów.
Rysunek 3: Trójwymiarowe enteroidy jelitowe wykazują barwienie linii komórek nabłonkowych. Reprezentatywne obrazy 3D enteroidów po 7 dniach hodowli wykazują obecność barwienia jąder, F-aktyny, cytokeratyny-18 (CK-18), chromograniny-A (Chr-A), ekadheryny (E-cad), lizozymu (Lyz) oraz nałożenie obrazów (Merge). Pasek skali 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Tworzenie monowarstwy 2D, obrazy mikroskopowe; progresja gęstości komórek, analiza wyników eksperymentalnych.
Rycina 4: Utworzenie dwuwymiarowej (2D) monowarstwy pochodzącej z enteroidów jelita krętego z enteroidów jelita krętego. Reprezentatywne obrazy (A) fragmentów 3D enteroidów w roztworze dysocjującym w przygotowaniu do wysiewu monowarstwy, pojedynczych komórek wysianych na wkładce transwell z gęstością wysiewu 1 x 105 obrazowanych w dniu 0 za pomocą mikroskopii (B) świetlnej, (C) kontrastowej (fazowej) oraz (D) w jasnym polu, a także rozwój monowarstwy na wkładkach transwell obrazowanych w dniu piątym za pomocą mikroskopii (E) kontrastowej (fazowej) i (F) w jasnym polu. Powiększenie 40x, pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat pomiaru TEER kultur monowarstw 2D enteroidów; wykres przedstawia TEER w ciągu 12 dni.
Rycina 5: Pomiary transepitelialnej oporności elektrycznej (TEER) monowarstwy pochodzącej z enteroidów 2D na wkładkach transwell. (A) Schemat przedstawiający sposób uzyskiwania pomiarów TEER monowarstwy 2D komórek nabłonka jelitowego (IEC) przy użyciu elektrod typu chopstick STX2 woltomierza, (B) Monitorowanie podłużne pomiarów TEER monowarstwy 2D w ciągu 12 dni hodowli komórkowej. Każdy punkt danych reprezentuje średnią wartość TEER oraz błąd standardowy średniej (SEM) uzyskany z dwóch powtórzeń technicznych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Markery monolayery 2D IEC; E-kadheryna, F-aktyna, Lyz; mikroskopia fluorescencyjna; różnicowanie komórek.
Rysunek 6:Zróżnicowane monolayery 2D pochodzące z enteroidów na wkładkach transwell przekształcają się w spolaryzowane arkusze nabłonka jelitowego. (A-M) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne monolayery 2D pochodzącej z enteroidów na wkładce transwell po 5 dniach hodowli, pokazujące (A) jądro (niebieski), (B) E-kadherynę (czerwony), (C) F-aktynę (zielony) oraz (D) nałożenie 3 obrazów (merge), (E,I) barwienie jąder, (F) chromograninę-A, (J) cytokeratynę-18, (G,K) lizozym oraz (H,L) nałożenie obrazów. (M) Modelowanie Z-stack pokazujące rozkład tych samych białek markerowych komórek nabłonka w arkuszu monolayery 2D. Obrazy uzyskano z 2 powtórzeń biologicznych. Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Poziomy IL-1α i IL-8; wykres słupkowy; strony apikalna i bazalna; porównanie grupy nieleczonej i leczonej Pam3csk4.
Rycina 7: Bydlęce pierwotne monowarstwy pochodzące z enteroidów 2D na wkładkach transwell są funkcjonalnie aktywne. Sekrecja cytokin do znadkomórkowego i podkomórkowego supernatantu hodowli (A) IL-1α oraz (B) IL-8 przez monowarstwy 2D na wkładkach transwell po 5 dniach hodowli, w grupie nieleczonej lub stymulowanej Pam3csk4 przez 24 h. Dane są reprezentatywne dla średnich poziomów cytokin i SEM z monowarstw pochodzących z zamrożonych zapasów krypt od jednego zwierzęcia i trzech niezależnych eksperymentów. Ilość cytokin oznaczono za pomocą analizy multipleksowej opartej na koralikach (Tabela materiałów) zgodnie z instrukcjami producenta, a analizy przeprowadzono przy użyciu kompaktowej jednostki multipleksowej (Tabela materiałów) oraz oprogramowania do dopasowania krzywej immunoanalizy (Tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela 1: Stężenia początkowe i końcowe odczynników. Kliknij tutaj, aby pobrać tabelę.

Dyskusja

Przedstawiony tutaj protokół opisuje fizjologicznie istotny model do badania fizjologii jelit i zaburzeń jelitowych. Kilka grup badawczych opisało wytwarzanie kultur enteroidów bydlęcych, w tym monowarstw 2D 16,19,20,21,22,23,24. Chociaż tworzenie monowarstw nie jest jawnym wyzwaniem technicznym, kilkuminutowe kroki mają kluczowe znaczenie dla konsekwentnego tworzenia udanych kultur. W związku z tym odtwarzalność monowarstw 2D przy użyciu pokrótce opisanych metod w opublikowanej literaturze może być wyzwaniem dla początkującego badacza w dziedzinie organoidów. Protokół opisany w niniejszym dokumencie został zaadaptowany z tych protokołów i tych opublikowanych dla innych gatunków, zapewniając przewodnik krok po kroku dotyczący generowania monowarstw na wkładkach transwell, który jest wysoce powtarzalny.

Przedstawiony w niniejszym dokumencie protokół może być łatwo modyfikowany w celu dopasowania do konkretnych celów projektu eksperymentalnego lub dostępności odczynników. Rzeczywiście, zgodnie z tym protokołem, udane hodowle można osiągnąć poprzez wysiewanie monowarstw o mniejszej gęstości komórek (np. 2,5 x 104) lub przy braku FBS, jak opisano w innych publikacjach24. Jednak zmiana tych parametrów może wymagać zwiększonej hodowli w celu wytworzenia zlewającej się monowarstwy. W związku z tym, jeśli inne czynniki integralnie związane z projektem badania, w tym współhodowla z komórkami odpornościowymi, dyktują określony przebieg czasowy eksperymentu, gęstość wysiewu można zmienić w razie potrzeby. Podczas gdy inne preparaty błon podstawnych można zastąpić w miejsce tego stosowanego w tym protokole do generowania enteroidów 3D i monowarstw 2D, będą one wymagały pewnej optymalizacji w celu określenia optymalnego stosunku błony podstawnej do podłoża.

Zastosowanie wkładek transwell w opisanej metodologii ma wiele zalet w porównaniu ze wzrostem jednowarstwowym na konwencjonalnych wyrobach z tworzyw sztucznych i hodowlach enteroidalnych 3D. W porównaniu ze standardowymi płytkami do hodowli tkankowych, stosowanie transwelli do hodowli jednowarstwowych sprzyja różnicowaniu i organizacji komórek w sposób, który zachowuje podobieństwo do krypt jelitowych14,25. Bariera nabłonkowa jelit jest niezbędna w zapobieganiu translokacji toksyn i mikroorganizmów do organizmu, jednocześnie ułatwiając wchłanianie składników odżywczych. W związku z tym bardzo ważne jest, aby zrozumieć, w jaki sposób integralność bariery jelitowej funkcjonuje u osób zdrowych i ulega zmianie podczas zaburzeń jelitowych lub w odpowiedzi na związki. W przeciwieństwie do 3D hodowli enteroidalnych, obiektywna ocena integralności bariery jelitowej jest możliwa przy łączeniu monowarstw na transwellach i pomiarze TEER, jak wykazano w niniejszymdokumencie 14,25. Generowanie monowarstw 2D na transwellach pozwala również na podwójną hodowlę z odpowiednimi typami komórek, takimi jak komórki odpornościowe lub zrębowe. Pozwala to na scharakteryzowanie krytycznie ważnych przesłuchów między komórkami jelitowymi a komórkami mikrośrodowiska tkankowego, czego nie można osiągnąć za pomocą kultur 3D. Odsłonięcie wierzchołkowej powierzchni monowarstwy nie tylko pozwala na eksperymentalne narażenie na patogeny i związki oraz zbieranie produktów świetlnych, ale także umożliwia badania nad innymi aspektami fizjologii i chorób jelit, w tym badanie mikrobioty jelitowej i fizjologii wchłaniania molekularnego lub transportu13. Niezależna kontrola nad wierzchołkową i podstawną powierzchnią jelita jest wyraźną zaletą w porównaniu z modelami enteroidalnymi 3D.

Dzięki kilku eksperymentom próbnym zidentyfikowaliśmy kluczowe kroki, które przyczyniły się do sukcesu protokołu. Podczas gdy próbki całych tkanek jelitowych mogą być przechowywane w lodówce przez noc i przetwarzane następnego dnia, dysocjacja tkanek i izolacja etapów fragmentu krypty muszą być wykonane szybko, aby zapobiec rozpadowi wyizolowanych frakcji krypty. Po zakończeniu mycia PBS, odwirowanie krypt w Wash Media może pomóc w zapobieganiu rozpadowi krypt, jak opisano w kroku 2.3.10. Podczas pasowania enteroidów lub zbierania ich w celu utworzenia jednej warstwy, konieczne jest oddzielenie enteroidów od kopuł BME. Media płuczące muszą być lodowate, aby pomóc w rozpuszczeniu BME. W przeciwieństwie do tego, użycie wstępnie podgrzanego TrypLE i dwukrotne przefiltrowanie zawiesiny komórek może pomóc w utworzeniu pojedynczych komórek potrzebnych do wytwarzania monowarstw. Wreszcie, ręczne manewrowanie płytką w kształcie liczby 8 może pomóc w równomiernym rozproszeniu pojedynczych komórek po wkładzie transwell.

Istotnym ograniczeniem tego protokołu jest to, że monowarstwy 2D zostały wyprodukowane z enteroidalnych stad uzyskanych od dojrzałego wołu rasy holsztyńskiej (>2 lat). Dojrzewający przewód pokarmowy u cieląt może wymagać niewielkich modyfikacji opisanego protokołu w celu uzyskania optymalnych wyników. Specyficzne dla danej rasy różnice w fizjologii jelit ras bydła opisano w piśmiennictwie26. Chociaż nie wiadomo, czy te różnice mogą wpływać na enteroidy i późniejsze wytwarzanie monowarstw, podejrzewamy, że wszelkie różnice skutkowałyby tylko niewielkimi zmianami w naszym protokole. Ponadto model kultury 2D ma pewne nieodłączne wady. W porównaniu z modelami enteroidalnymi 3D, hodowle 2D mogą nie mieć niektórych aspektów architektury tkanki jelitowej i różnorodności komórkowej, co stwarza ograniczenia i wyzwania związane z rozmnażaniem kultury 2D13. Mimo to badania pokazują, że niektóre monowarstwy mogą emulować oczekiwaną organizację krypty27, a niektóre z tych ograniczeń mogą być nawet przezwyciężone poprzez ustanowienie kultur 2D z interfejsem powietrze-ciecz. Niemniej jednak ograniczenia tego modelu powinny być w pełni rozważone w celu określenia, czy jego zastosowanie jest odpowiednie dla zadawanego pytania eksperymentalnego.

Protokół ten opisuje zoptymalizowany system hodowli, który modeluje przewód pokarmowy bydła przy użyciu enteroidów pochodzących z jelita krętego bydła w celu utworzenia monowarstw na wkładkach transwell. Dzięki szerokiemu wachlarzowi zastosowań, od badań nad chorobami zakaźnymi po odkrywanie leków i medycynę regeneracyjną, ten wysokowydajny system hodowli może doprowadzić do bezprecedensowego rozwoju strategii zapobiegawczych i terapeutycznych, które mogą być wzajemnie korzystne dla zdrowia zwierząt i ludzi.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że badanie zostało przeprowadzone przy braku jakichkolwiek powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Potwierdzamy korzystanie z Cellular and Molecular Core Facility na Uniwersytecie Środkowo-Zachodnim. Badania te były wspierane przez program badawczy Departamentu Rolnictwa Stanów Zjednoczonych, Narodowego Instytutu Żywności i Rolnictwa (Zdrowie i Produkcja Zwierząt oraz Produkty Zwierzęce: Zdrowie i Choroby Zwierząt, 1025812). Ustalenia i wnioski zawarte w tej publikacji nie zostały formalnie rozpowszechnione przez Departament Rolnictwa Stanów Zjednoczonych i nie powinny być interpretowane jako reprezentujące jakiekolwiek ustalenia lub politykę agencji.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Końcówka do pipety 0,2 ml MidSciPR-200RK-S
1 i mikro; m Wkładki do hodowli komórkowych PET 24-dołkowe Końcówka
1000 ml Igła MidSciPR-1250RK-S
22 GBecton, Dickinson and Company305156
24-dołkowe naczynie hodowlane Corning353504
40 μ Filtr siatkowy M Corning431750
50 ml Fisher scientific14-955-240
Końcówka do pipety 5 mlFisher scientific30075307
Strzykawka 5 mlBecton, Dickinson and Company309647
Probówka 5 mlEppendorf30119401
Antycytokeratyna -18 (C-04)AbcamAB668-1001
B-27 suplement bez witaminy A Gibco12-587-010
Oprogramowanie BelysaLuminex40-122Oprogramowanie do dopasowywania krzywej immunologicznej 
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)Odczynniki FisheraBP9704-100
Octan kaspofunginySelleckchemS3073
Podnośnik komórekFisher Scientific08-100-241
Chromogranina-A (E-5)Santa Cruz BiotechnologySC-271738
Szkiełka nakrywkoweFisher scientific12-540-C
KriowialeNeptun scientific3471.X
Cultrex Ultimatrix RGF BME R& D SystemsBME001-05
DAPIMilliporeSigmaD9542-5MG
Nożyczki preparacyjne VWR82027-588
Ditiothreitol (DTT) roztwórThermo ScientificFERR0861
DMEM/ F-12 1.1 medium (z L-glutaminą, bez HEPES)CytivaSH30271.01
E-kadheryna Technologia sygnalizacji komórkowej#3195
Kwas etylenodiaminotetraoctowyFisher ScientificBP2482500
FBSCorningMT35070CV
GentamycynaGibco15710064
Szklane szkiełko mikroskopowe Fisher scientific12-550-07
Koza anty-mysz Alexa Fluor 488InvitrogenA11001
Koza anty-mysz Alexa Fluor 647InvitrogenA21235
Koza anty-królik Alexa Fluor 555 InvitrogenA21428
HemacytometrBio-Rad1450015
IntestiCult organoid Podłoże różnicujące (Human)StemCell Technologies100-0214
Pożywka do wzrostu organoidów IntestiCult (Human)StemCell Technologies0-6010
Keyence BZ-X700 KeyenceBZ-X700
LY2157299 (Galunisertib)System MAGPIX SelleckchemS2230
System LuminexMagpixKompaktowy multipleksator
MikroskopKeyenceBZ-X700 
MILLIPLEX Panel magnetyczny z cytokiną bydlęcą/chemokinąMilliporeSigmaBCYT1-33KMultipleksowy test multipleksowy na bazie koralików 
Kontener Mr. Mroźny Nalgene5100-0001
Nieenzymatyczne rozwiązanie do dysocjacji komórek ATCC30-2103
NutriFreeze D10 Pożywka do kriokonserwacji Biological Industries05-713-1B
Orbitalna platforma wibrującaThermo Fisher88880021
Pam3Csk4invivogentlrl-pms Folia
uszczelniająca Parafilmdot scientific inc.
Paraformaldehyd 16% roztwórMikroskopia elektronowa Nauki15710
Falloidyna-FITC R& D Systems5782/12U
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiFisher ScientificBP399-20
Prolong Glass Anti-fadeInvitrogenP36982
Królik anty-ludzki lizozym (EC3.2.1.17)Agilent technologiesA009902-2
SB202190 (FHPI)SelleckchemS1077
Kąpiel wodna z wytrząsaniemThermo FisherMaxQ 7000
Azydek soduVWRBDH7465-2
StreptomycynaTeknovaS6525
Barwnik Trypan Blue Gibco15250-061
Enzym ekspresowy TrypLE Technologie życiowe12604013
Tween 20Fisher ScientificBP337
Woltoomomierz MilliporeSigmaMillicell ERS-2 
Y-27632 SelleckchemS1049
do pipety Corning 353104 Probówka wirówkowa #HS234526C powiedział:

Bibliografia

  1. Gerdts, V., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
  2. Reza Khorramizadeh, M., Saadat, F. Animal models for human disease. Animal Biotechnology. Chapter 8, Academic Press. 153-171 (2020).
  3. Meyerholz, D. K., Beck, A. P., Singh, B. Innovative use of animal models to advance scientific research. Cell and Tissue Research. 380 (2), 205-206 (2020).
  4. Hamernik, D. L. Farm animals are important biomedical models. Animal Frontiers. 9 (3), (2019).
  5. Ribitsch, I., et al. Large animal models in regenerative medicine and tissue engineering: To do or not to do. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 972(2020).
  6. Wagar, L. E., DiFazio, R. M., Davis, M. M. Advanced model systems and tools for basic and translational human immunology. Genome Medicine. 10 (1), 73(2018).
  7. Ziegler, A., Gonzalez, L., Blikslager, A. Large animal models: The key to translational discovery in digestive disease research. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (6), 716-724 (2016).
  8. Roth, J. A., Tuggle, C. K. Livestock models in translational medicine. ILAR Journal. 56 (1), 1-6 (2015).
  9. Schultz, R. D., Dunne, H. W., Heist, C. E. Ontogeny of the bovine immune response. Infection and Immunity. 7 (6), 981-991 (1973).
  10. Potter, A. A., et al. Large animal models for vaccine development and testing. ILAR Journal. 56 (1), 53-62 (2015).
  11. Ahluwalia, B., Magnusson, M. K., Öhman, L. Mucosal immune system of the gastrointestinal tract: maintaining balance between the good and the bad. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 52 (11), 1185-1193 (2017).
  12. Roodsant, T., et al. A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to Study host-pathogen interaction in the small intestine. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).
  13. Liu, Y., Chen, Y. G. 2D- and 3D-based intestinal stem cell cultures for personalized medicine. Cells. 7 (12), 225(2018).
  14. Duque-Correa, M. A., Maizels, R. M., Grencis, R. K., Berriman, M. Organoids - New models for host-helminth interactions. Trends in Parasitology. 36 (2), 170-181 (2020).
  15. Kar, S. K., et al. Organoids: a promising new in vitro platform in livestock and veterinary research. Veterinary Research. 52 (1), 43(2021).
  16. Hamilton, C. A., et al. Development of in vitro enteroids derived from bovine small intestinal crypts. Veterinary Research. 49 (1), 54(2018).
  17. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Veterinary Research. 52 (1), 33(2021).
  18. Lee, B. R., et al. Robust three-dimensional (3D) expansion of bovine intestinal organoids: An in vitro model as a potential alternative to an in vivo system. Animals (Basel). 11 (7), 2115(2021).
  19. Töpfer, E., et al. Bovine colon organoids: From 3D bioprinting to cryopreserved multi-well screening platforms. Toxicology in Vitro. 61, 104606(2019).
  20. Powell, R. H., Behnke, M. S. WRN conditioned media is sufficient for in vitro propagation of intestinal organoids from large farm and small companion animals. Biology Open. 6 (5), 698-705 (2017).
  21. Derricott, H., et al. Developing a 3D intestinal epithelium model for livestock species. Cell and Tissue Research. 375 (2), 409-424 (2019).
  22. Rusu, D., Loret, S., Peulen, O., Mainil, J., Dandrifosse, G. Immunochemical, biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures. BMC Cell Biology. 6, 42(2005).
  23. Dibb-Fuller, M. P., Best, A., Stagg, D. A., Cooley, W. A., Woodward, M. J. An in-vitro model for studying the interaction of Escherichia coli O157:H7 and other enteropathogens with bovine primary cell cultures. Journal of Medical Microbiology. 50 (9), 759-769 (2001).
  24. Sutton, K. M., Orr, B., Hope, J., Jensen, S. R., Vervelde, L. Establishment of bovine 3D enteroid-derived 2D monolayers. Veterinary Research. 53 (1), 15(2022).
  25. Barrila, J., et al. Modeling host-pathogen interactions in the context of the microenvironment: Three-dimensional cell culture comes of age. Infection and Immunity. 86 (11), e00282-e00318 (2018).
  26. Carvalho, P. H. V., Pinto, A. C. J., Millen, D. D., Felix, T. L. Effect of cattle breed and basal diet on digestibility, rumen bacterial communities, and eating and rumination activity. Journal of Animal Science. 98 (5), skaa114(2020).
  27. Thorne, C. A., et al. Enteroid monolayers reveal an autonomous WNT and BMP circuit controlling intestinal epithelial growth and organization. Developmental Cell. 44 (5), 624-633 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Monowarstwa enteroid w bydl cychhodowla dwuwymiarowahodowla kom rkowa organoid winterakcje gospodarz patogentransepitelialna oporno elektrycznamikroskopia immunofluorescencyjnafunkcja bariery jelitowejmarkery r nicowania kom rekzaka enie Cryptosporidiumsystem kokultury
Opracowanie dwuwymiarowego systemu hodowli jednowarstwowej bydła pochodzącego z enteroidów pierwotnych do zastosowań w translacyjnych badaniach biomedycznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.