Artykuł metodologiczny

Analiza komunikacji neuronalnej jelitowo-mózgowej w czasie rzeczywistym: dynamika wapnia w całej korze mózgowej w odpowiedzi na stymulację glukozy w jelitach

DOI:

10.3791/65902

⸱

29 grudnia 2023

 , 
1Department of Biology, Faculty of Science, Ochanomizu University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja jelitowo-mózgowa, ułatwiana przez nerw błędny, jest kluczowa dla komunikacji między układem hormonalnym przewodu pokarmowego a mózgiem. Jednak to, czy dożołądkowe wstrzyknięcie glukozy może zmienić aktywność kory mózgowej, nadal nie jest zrozumiałe. W tym miejscu oferujemy kompleksowy protokół obserwacji zmian w aktywności kory mózgowej po wstrzyknięciu glukozy do dwunastnicy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Komunikacja między przewodem pokarmowym a mózgiem po wchłonięciu składników odżywczych odgrywa istotną rolę w preferencjach żywieniowych, metabolizmie i zachowaniach żywieniowych. Szczególnie w odniesieniu do określonych składników odżywczych, wiele badań wykazało, że asymilacja glukozy w komórkach nabłonka jelitowego inicjuje aktywację wielu cząsteczek sygnałowych. Hormony, takie jak glukagonopodobny peptyd-1, są znane jako kwintesencja mediatorów sygnałowych. Ponieważ hormony wpływają głównie na mózg poprzez szlaki krążenia, powoli modulują aktywność mózgu.

Jednak ostatnie badania wykazały dwie szybkie ścieżki jelitowo-mózgowe, które są wspierane przez autonomiczny układ nerwowy. Jeden działa poprzez rdzeniowo-aferentną ścieżkę nerwową, podczas gdy nerw błędny pośredniczy w drugim. W związku z tym reakcje mózgu po asymilacji glukozy w przewodzie pokarmowym są skomplikowane. Co więcej, ponieważ stymulacja jelitowa w końcu indukuje różnorodne czynności korowe, w tym reakcje czuciowe, nocyceptywne, nagrody i motoryczne, konieczne jest zastosowanie metodologii, które ułatwiają wizualizację zlokalizowanych obwodów mózgowych i czynności pankorowych, aby w pełni zrozumieć transmisję neuronalną jelitowo-mózgową. Niektóre badania wykazały gwałtowne zmiany stężenia jonów wapnia (Ca2+) w podwzgórzu i brzusznej okolicy nakrywki niezależnie od siebie różnymi szlakami po stymulacji jelitowej. Nie wiadomo jednak, czy zachodzą zmiany w aktywności kory mózgowej.

Aby obserwować aktywność kory mózgowej po wstrzyknięciu glukozy do żołądka, opracowaliśmy technikę obrazowania do wizualizacji w czasie rzeczywistym dynamiki Ca2+ w korze mózgowej przez całkowicie nienaruszoną czaszkę, używając transgenicznych myszy wyrażających genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół techniki zaprojektowanej do monitorowania obrazowania Ca2+ kory przezczaszkowej wywołanej stymulacją jelitową po wstrzyknięciu glukozy do żołądka za pomocą wszczepionego cewnika. Wstępne dane sugerują, że podanie roztworu glukozy do jelita aktywuje korę czołową, która nie reaguje na podawanie wody.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przede wszystkim, wyczuwanie glukozy w jelitach odbywa się za pośrednictwem receptorów słodkiego smaku (Tas1r2, Tas1r3) i kotransportera sodowo-glukozowego 1 (SGLT-1) znajdujących się w komórkach enteroendokrynnych w świetle jelita1,2,3,4,5,6. Odczuwanie glukozy w mózgu to proces, który zwykle trwa od kilku minut do godzin po jej wchłonięciu z jelit, a występowanie to opiera się głównie na zwiększonym poziomie cukru we krwi w osoczu i uwalnianiu hormonów7,8,9,10,11 (np. glukagonopodobny peptyd-1 [GLP-1], peptyd YY (PYY) i polipeptyd insulinotropowy zależny od glukozy [GIP]). Docierają do łukowatego jądra podwzgórza (ARC), gdzie wiążą neurony pro-opiomelanokortyny (POMC) i neurony białkowe związane z agouti (AgRP) poprzez przepływ krwi i nerw błędny (nerw przywspółczulny)12,13,14. Zmiana aktywności tych neuronów prowadzi do kontroli metabolizmu i zachowań żywieniowych15,16.

Najnowsza literatura coraz częściej podkreśla znaczenie sygnalizacji nerwowej jelitowo-mózgowej po wchłonięciu glukozy. Ten złożony szlak można ogólnie podzielić na dwa podstawowe mechanizmy. Pierwsza z nich polega na aktywacji rdzeniowych aferentów, co ostatecznie wpływa na aktywność neuronalną AgRP w ARC. Drugi mechanizm polega na stymulacji nerwu błędnego poprzez połączenia z komórkami nabłonka. Biorąc pod uwagę wieloaspektowe sposoby, w jakie komórki nabłonka jelitowego mogą aktywować nerw błędny13, jego rola jest uważana za wszechstronną.

Znaczna część aktywności nerwu błędnego jelitowego i rdzeniowego nerwu doprowadzającego jest związana z zachowaniami żywieniowymi17,18,19. Jednak pojawiające się dowody sugerują, że niektóre włókna nerwu błędnego, wystające do "komórek nerwowych", są zaangażowane w preferencję glukozy. Komórki neuropodów, podzbiór komórek enteroendokrynnych, wyrażają SGLT-1 po swojej stronie świetlnej i przekazują bodźce czuciowe do nerwu błędnego za pośrednictwem synaps glutaminergiczne2,20,21,22. Aktywacja nerwu błędnego wyzwala neurony dopaminergiczne w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) w ciągu kilku sekund19. Warto zauważyć, że hamowanie aktywacji nerwu błędnego, szczególnie w dwunastnicy, za pomocą antagonisty glutaminianu zmniejsza preferencję sacharozy u myszy1. Podkreśla to kluczową rolę aktywacji komórek neuropodów w modulowaniu zachowań związanych z wyborem jedzenia po spożyciu glukozy2.

Pomimo tych postępów, dokładne zrozumienie mechanizmów szybkiego wykrywania glukozy w jelitach i ich wpływu na aktywność kory mózgowej pozostaje złożoną zagadką. Chociaż aktywacja mózgu kontrolowana przez neurony AgRP nie obejmuje kory mózgowej23, wiadomo, że neurony dopaminergiczne w VTA projektują korę mózgową. Nie wiadomo jednak, czy szybka aktywacja neuronów dopaminergicznych VTA po wykryciu glukozy naprawdę aktywuje korę mózgową. Aby wyjaśnić ten mechanizm, zbadaliśmy potencjał dożołądkowego podawania glukozy w celu szybkiego wpływu na korową dynamikę Ca2 + u transgenicznych myszy wykazujących ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia.

Ten artykuł przedstawia tanią i mniej inwazyjną metodę kompleksowego zrozumienia zmian w aktywności kory mózgowej po dożołądkowym podaniu glukozy za pomocą obrazowania Ca2+ szerokości kory mózgowej u myszy Ostatnio popularność zyskała technika obrazowania Ca2+ przez nienaruszoną czaszkę, wykorzystująca transgeniczne myszy wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia24. Warto zauważyć, że transgeniczna linia myszy BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 (znana również jako mysz G7NG817) zastosowana w tym badaniu wyraża czujnik Ca2 +, G-CaMP7, w neuronach i astrocytach25. Ze względu na wysoką gęstość ekspresji w korze mózgowej, ta transgeniczna linia myszy jest szczególnie odpowiednia do obrazowania Ca2+ w korze przezczaszkowej przy użyciu standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Ochanomizu w Japonii (protokoły badań na zwierzętach 22017). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach Uniwersytetu Ochanomizu, które są zgodne z Podstawowymi wytycznymi dotyczącymi prawidłowego prowadzenia eksperymentów na zwierzętach i powiązanych działań w akademickich instytucjach badawczych (Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, Japonia). Podjęto starania w celu zminimalizowania liczby wykorzystywanych zwierząt. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE.

1. Przygotowanie myszy transgenicznych

  1. Aby przeprowadzić ten eksperyment, użyj dorosłej męskiej i żeńskiej linii myszy transgenicznych BAC GLT-1-G-CaMP7 #817, a mianowicie G7NG817 myszy24,25 (starsze niż 8 tygodni). Szczep tła G7NG817 myszy25 to C57BL/6J.
  2. Trzymaj myszy w cyklu 12 godzin / 12 godzin światła / ciemności i hoduj je w grupach do pięciu myszy.

2. Tworzenie cewnika

  1. Użyj nożyczek, aby wyregulować silikonową rurkę (średnica wewnętrzna 0,5 mm, średnica zewnętrzna 1,0 mm) do precyzyjnej długości 7 cm (Rysunek 1A-a).
    UWAGA: Przed zabiegami wysterylizowano nożyczki i rurkę silikonową.
  2. Przyklej maleńkie plastikowe koraliki (średnica wewnętrzna 3 mm, średnica zewnętrzna 5 mm) do dopasowanej rurki, upewniając się, że znajdują się 3 mm od jej końca (Rysunek 1A-b). Przymocuj koraliki bezpiecznie za pomocą kleju cyjanoakrylowego (dopuszczalne są warianty medyczne lub standardowe).
  3. Odciąć wierzchołek igły o wadze 23 G, a następnie odciąć go o 1,5 cm od końcówki igły (Rysunek 1A-c).
  4. Wprowadzić przeciętą igłę 23 G z kroku 2.3 do końca rurki silikonowej, naprzeciwko miejsca, w którym przytwierdzono koraliki (Rysunek 1A-d).

3. Tworzenie wtryskiwacza

  1. Użyj sterylnych szczypiec, aby wyciąć 1 cm od końcówki igły (Rysunek 1B-a).
    UWAGA: Upewnij się, że otwór na odciętym końcu zachowuje swoją integralność i nie ulega deformacji, ponieważ jakiekolwiek zniekształcenia mogą utrudnić przepływ roztworu do wstrzykiwań.
  2. Połączyć dostosowaną igłę do wstrzykiwań 23 G z kroku 3.1.1 ze strzykawką o pojemności 2,5 ml (Rysunek 1B-b).
  3. Podziel rurkę silikonową na segmenty na wymaganą długość (w tym eksperymencie rurka silikonowa o długości 15 cm) i owiń ją osłoną na igle iniekcyjnej 23 G (Rysunek 1B-c).
    UWAGA: Objętość dozowanego roztworu będzie się zmieniać w zależności od długości rurki. Na przykład w przypadku probówki o średnicy 15 cm po eksperymencie pozostanie około 50 μl roztworu.
  4. Odciąć igłę do wstrzykiwań 23 G w odległości 1,5 cm od końcówki igły.
  5. Połącz podzieloną część z kroku 3.4 za pomocą cewnika silikonowego utworzonego w kroku 3.3 (Rysunek 1B-d).
    UWAGA: Upewnij się, że otwory utworzone w krokach 3.1 i 3.4 pozostają niezniekształcone po nacięciu. Jeśli konieczna jest korekta, użyj szczypiec, aby przywrócić jego okrągłą konfigurację.

4. Lokalizacja żołądkowa

  1. Podaj znieczulenie myszy poprzez inhalację 3,0% izofluranu w określonej komorze. Zastosuj maść okulistyczną, aby zapobiec wysuszeniu oczu.
  2. Delikatnie przenieś znieczuloną mysz z komory inhalacyjnej na stół chirurgiczny po sprawdzeniu stanu znieczulenia myszy. Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania zabiegu.
  3. Połóż mysz na wznak, ustawiając jej pysk bliżej aparatu do inhalacji i moduluj stężenie izofluranu od 3,0% do 2,0%.
    UWAGA: Odłącz dolny segment maski izofluranowej od jej górnego odpowiednika i zakotwicz oddzieloną maskę (górny segment) na stole operacyjnym za pomocą taśmy klejącej.
  4. Uzupełnij jamę ustną myszy, kończyny przednie i tylne na stół chirurgiczny za pomocą taśmy klejącej.
    UWAGA: Mocując mysz do stołu, można zapobiec błędom chirurgicznym spowodowanym ruchem, nawet jeśli mysz jest znieczulona.
  5. Usuń włosy myszy z lewej górnej części brzucha (150% obszaru wokół pola operacyjnego) za pomocą kremu do depilacji. Nałóż miejscowo miejscowy środek przeciwbólowy na miejsce operacji i odczekaj 5 minut przed kontynuacją.
  6. Nałóż żel znieczulający miejscowo na skórę brzucha i odczekaj od 5 do 10 minut. Następnie zdezynfekuj obszar operacyjny 3 razy naprzemiennie jodoforem i 70% etanolem. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą szczypania palca u nogi i przykryj zwierzę sterylnymi obłożeniami chirurgicznymi. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 1,5 cm (Ryc. 1C-b), położone 1 cm na prawo od mediany brzucha i 5 mm poniżej wyrostka mieczykowatego (Rysunek 1C-c). Następnie wykonaj 1,5 cm nacięcie w ścianie brzucha w tym samym miejscu, w którym nastąpiło początkowe nacięcie skóry.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby uniknąć uszkodzenia wątroby.
  7. Delikatnie przestaw lewy płat wątroby na boki za pomocą kleszczy z końcami, odsłaniając brzuch pod spodem.

5. Wprowadzenie cewnika

  1. Podnieś żołądek i ostrożnie wydobądź go przez nacięcie.
    UWAGA: Należy zachować najwyższą ostrożność w celu zachowania integralności sąsiednich narządów, zwłaszcza wątroby, i powstrzymać się od wywierania nadmiernej siły na żołądek.
  2. Użyj nożyczek, aby stworzyć maleńką perforację (o średnicy około 1,5 mm) w antrum odźwiernika.
  3. Wprowadzić koniec cewnika do perforacji, upewniając się, że koralik jest w bezpośrednim kontakcie z antrum odźwiernika.
    UWAGA: Przed włożeniem cewnik dezynfekuje się 0,1 do 0,5% roztworem glukonianu chlorheksydyny.
  4. Przyklej kulkę cewnika do żołądka za pomocą kleju cyjanoakrylowego klasy medycznej.
    UWAGA: Upewnij się, że żołądek nie jest przyczepiony do otaczających narządów.
  5. Sprawdź mocne przymocowanie cewnika do żołądka, a następnie delikatnie przestaw żołądek na jego wrodzone miejsce poniżej lewego płata wątroby.
  6. Zszyj ścianę jamy brzusznej, pozwalając cewnikowi wysunąć się na zewnątrz, za pomocą szwu z polidioksanonu (PDS). Następnie zamknij nacięcie skóry w sposób analogiczny do zamknięcia brzucha.
  7. Delikatnie umieść mysz w odkażonej klatce.
    UWAGA: Myszy pooperacyjne powinny być trzymane w pojedynczych pomieszczeniach. Zastosuj miejscowo miejscowy środek przeciwbólowy na zamknięcie rany i postępuj zgodnie z planami przeciwbólowymi zgodnie z zaleceniami lokalnych wytycznych instytucjonalnych.
  8. Minimalny okres odzyskiwania wynoszący 48 godzin w środowisku standardowym.
    UWAGA: Jeden koniec cewnika wprowadzonego do żołądka myszy jest zamknięty igłą 23G z uszczelnioną końcówką, aby zapobiec przedostawaniu się ciał obcych i uniknąć gryzienia. Ponieważ cewnik wystający z brzucha jest krótki, zapobiega to przeciąganiu go przez mysz przez pościel, co mogłoby spowodować jego otwarcie lub zaplątanie.

6. Przygotowanie do przezczaszkowego obrazowania Ca2+ in vivo

  1. Podać znieczulenie myszy za pomocą izofluranu (indukcja po 2%; leczenie podtrzymujące od 0,8% do 1,0%).
  2. Przymocuj mysz do platformy stereotaktycznej za pomocą pomocniczych pasków nausznych, aby złagodzić skutki pulsacji i oddychania. Następnie umieść mysz pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym.
  3. Zastosuj szerokopasmowy zestaw filtrów niebieskiej fluorescencji (o wzbudzeniu przy 460-490 nm i emisji przy 520 nm) w połączeniu z rtęciowym źródłem światła.
  4. Uchwyć obrazy za pomocą aparatu i przetwórz je za pomocą wyznaczonego oprogramowania do obrazowania.
  5. Ostrożnie usuń włosy ze skóry głowy za pomocą golarki elektrycznej lub kremu do depilacji.
    UWAGA: Jeśli używasz maszynki do golenia, upewnij się, że jest ona dokładnie zdezynfekowana i uważaj, aby nie przeciąć skóry.
  6. Zdezynfekuj powierzchnię skóry głowy za pomocą bawełnianego wacika lub podobnego narzędzia roztworem glukonianu chlorheksydyny rozcieńczonego do 0,1-0,5%. Następnie zdezynfekuj alkoholem i powtórz to naprzemiennie 3 razy.
  7. Nałóż żel do znieczulenia miejscowego i odczekaj 5-10 minut.
  8. Przygotuj się do nałożenia dentystycznego cementu akrylowego.
    1. Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby przeciąć skórę głowy. Albo całkowicie usuń skórę głowy, albo wykonaj proste cięcie od tyłu głowy do czoła.
    2. Użyj klipsów, aby odsłonić czaszkę, przedłużając nadmiar skóry.
    3. Użyj bawełnianego wacika, aby usunąć tkankę łączną okostnej.
    4. Cement akrylowy należy nałożyć natychmiast po usunięciu okostnej. Działaj szybko, aby zapobiec zmętnieniu powierzchni czaszki z powodu parowania z odsłoniętej kości.
    5. Odczekaj około 5 minut, aż cement wyschnie.

7. Przezczaszkowe obrazowanie Ca2+ z dodwunastniczym podawaniem glukozy

  1. Zrównoważyć zarówno roztwór doświadczalny, jak i sól fizjologiczną do temperatury otoczenia. Poddaj myszy ograniczeniom dietetycznym przez określony czas (np. 2 godziny).
  2. Usuń resztki zawartości w cewniku po stronie myszy za pomocą ~0,03 ml soli fizjologicznej przed rozpoczęciem wstrzykiwania.
  3. Odessać roztwór doświadczalny (na przykład 10% roztwór glukozy przygotowany w 300 μl wody, uzupełniony dodatkowymi 300 μl wody) do strzykawki, a następnie podłączyć go do cewnika. Ustalić optymalną dawkę roztworu dostosowaną do konkretnego celu doświadczalnego.
    UWAGA: Podczas tej fazy należy zachować ostrożność, aby zapobiec nadmiernemu obciążeniu cewnika, które może zagrozić wewnętrznej anatomii myszy. Staraj się manipulować rurką po stronie myszy z najwyższą delikatnością. Dodatkowo należy upewnić się, że strzykawka pozostaje wolna od aspiracji roztworu powietrza, ponieważ uwięzione powietrze i pęcherzyki mogą wywołać wzdęcia żołądkowo-jelitowe.
  4. Oceń stan fizjologiczny myszy i aktywuj funkcję nagrywania w oprogramowaniu do obrazowania, klikając przycisk procesu nagrywania w aplikacji.
  5. Rejestruj obrazy w rozdzielczości 512 x 512 pikseli, 16-bitowej głębi i częstotliwości odświeżania 10 Hz.
    UWAGA: Parametry nagrywania można dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych.
  6. Uzyskaj spontaniczne dane (np. obejmujące 50 s), a następnie stopniowo wlewaj roztwór eksperymentalny z szybkością dostosowaną do eksperymentu (tutaj 0,035 ml / s).
    UWAGA: Pod koniec eksperymentu mysz zostanie natychmiast poddana eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy w znieczuleniu izofluranowym.

8. Przetwarzanie i analiza danych obrazu

  1. Umieść dane obrazu w koszu o wymiarach 64 x 64 piksele.
  2. Określ ręcznie rysowane obszary zainteresowania (ROI) za pomocą ImageJ. Zapoznaj się z atlasem mózgu myszy, aby wyznaczyć ROI jako obszar czołowy (M2), obszar somatosensoryczny, w tym beczkę (Somato), obszar potyliczny (wizualny) i obszar zaśledziony (RSC).
  3. Użyj funkcji MATLAB ReadImageJROI, aby wyodrębnić współrzędne odpowiadające ROI. Uzyskaj dostęp do funkcji MATLAB za pośrednictwem podanego linku: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi
  4. Oblicz średnią szybkość zmiany intensywności fluorescencji w ramach ROI za pomocą MATLAB.
    1. Określ szybkość zmiany intensywności fluorescencji (ΔF/F) za pomocą równania (1):
      figure-protocol-1 (1)
      Gdzie Ft oznacza wartość intensywności fluorescencji w określonym czasie, a średnia wartość intensywności od początku rejestracji do 50 s po wstrzyknięciu jest oznaczana jako F0.
  5. Należy uwzględnić opóźnienie w dotarciu roztworu do wstrzykiwań do narządu. Jako punkt odniesienia należy przyjąć średnią wartość intensywności obejmującą trzy sekundy po wstrzyknięciu. Przebiegi docelowe przekraczające wartość natężenia linii bazowej + 1 SD do analizy, jeśli wystąpią 3 s lub później po wstrzyknięciu.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przezczaszkowa kora szeroka Ca2+ obrazowanie za pomocą znieczulonej izofluranem G7NG817 mysz
Cewnik stworzyliśmy zgodnie z procedurą zilustrowaną na Rysunek 1. Po dokładnym określeniu pozycji żołądka, przymocowaliśmy cewnik do tego miejsca (Rysunek 1). Po zapewnieniu wystarczającego czasu rekonwalescencji po wprowadzeniu cewnika (około 48 godzin), zmierzyliśmy spontaniczną aktywność neuronalną w łagodnym znieczuleniu izofluranem (0,8-1,0%), aby ustalić wyjściowe zmiany intensywności fluorescencji dla kolejnych obserwacji stymulacji jelit. W rezultacie potwierdziliśmy losowe wzorce oscylacji Ca2+, które obejmowały całą korę mózgową (Rysunek 2A). Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne przykłady spontanicznej aktywności mózgu, z wcześniej założonymi cewnikami. Określiliśmy czas pierwszego obserwowalnego przejściowego piku Ca2+ w regionie M2 po wstrzyknięciu jako 0,0 s. Reprezentacja pseudokolorowa wyświetlała szczyt tego stanu przejściowego Ca2+ jako wartość maksymalną, z wartością średnią plus jedno odchylenie standardowe (1 SD) jako wartość minimalną. Było jasne, że lewa i prawa półkula wykazywały synchroniczną aktywność we wszystkich regionach.

Następnie ustaliliśmy ROI, aby scharakteryzować fale w każdym obszarze funkcjonalnym. Jak pokazano na Rysunek 2B, przedstawiliśmy czasowe zmiany intensywności fluorescencji dla każdego ROI (Rysunek 2B). Te obserwowane powierzchniowe oscylacje Ca2+ podążały za wzorcem tłumienia impulsów, na przemian z okresami niskiej aktywności i zmianami fluorescencji o wysokiej amplitudzie. Ten wzorzec aktywności jest zgodny z wcześniejszymi odkryciami, które jednocześnie mierzyły EEG powierzchni kory mózgowej i dynamikę Ca2+26.

Pomimo globalnych lub regionalnych fluktuacji powierzchni Ca2+ między stanami tłumienia i wybuchu, konkretny region korowy inicjujący wyrzut wapnia może się różnić. Jak wcześniej informowaliśmy, gdy sygnał stymuluje lokalny obszar kory mózgowej, oczekuje się, że obszar ten aktywuje się, co w konsekwencji napędza globalną zmianę stanu kory mózgowej27,28.

Zmiany w dynamice kory Ca2+ po dożołądkowym wstrzyknięciu glukozy
Następnie, aby wyjaśnić, w jaki sposób podawanie glukozy lub wody wpływa na aktywność kory mózgowej, monitorowaliśmy dynamikę Ca2+ w całej korze podczas i po wstrzyknięciu. W rezultacie stwierdziliśmy zmiany w korowej dynamice Ca2 + po wstrzyknięciu glukozy do żołądka. W przeciwieństwie do spontanicznej aktywności zilustrowanej w różnych regionach aktywacji kory mózgowej, zaobserwowaliśmy natychmiastową aktywację w obszarze przedczołowym lub wtórnej korze ruchowej (M2) po bezpośrednim wstrzyknięciu glukozy do jelita przez cewnik, efekt niewywołany przez wstrzyknięcie wody do żołądka (Figura 3A-C). Co więcej, zaobserwowaliśmy, że te przejściowe, wyraźne zdarzenia Ca2 + miały tendencję do występowania w sposób ciągły przez około 10 s po wstrzyknięciu glukozy do żołądka. Takie uporczywe zjawiska nie były widoczne, gdy podawano wodę (Ryc. 3D-F).

Zdarzenia Ca2+ w każdym ROI zostały scharakteryzowane poprzez obliczenie współczynnika zmian intensywności fluorescencji, używając kory słuchowej (Odniesienie) jako punktu odniesienia, przy pierwszym piku występującym w ciągu 4-8 s po zakończeniu podawania glukozy. W rezultacie zaobserwowano istotną zmianę po wstrzyknięciu glukozy po porównaniu odpowiedzi w regionie M2 przy użyciu kory słuchowej jako punktu odniesienia przed i po wstrzyknięciu.

Natomiast nie zaobserwowano takiej zmiany, gdy wstrzyknięto wodę (Rysunek 3G, woda N = 7: przed wstrzyknięciem, 2,38 ± 2,53 vs. 2,05 ± 1,84, p > 0,05; glukoza N = 7: przed wstrzyknięciem, 2,48 ± 0,97 vs. 3,76 ± 2,76, p < 0,01, test rangi ze znakiem Wilcoxona). Następnie, definiując poziomy aktywacji w każdym obszarze kory mózgowej za pomocą stosunku wartości po wstrzyknięciu do wartości przed wstrzyknięciem, istotną różnicę zaobserwowano tylko w regionie M2 (Rysunek 3H, M2: 0,92 ± 0,89 vs. 1,30 ± 0,32, p = 0,006; Somato: 0,95 ± 0,076 vs. 1,04 ± 0,13, p = 0,27; Wizualny: 0,92 ± 0,3 vs. 1,00 ± 0,06, p = 0,89; RSC: 0,97 ± 0,27 vs. 1,10 ± 0,27, p = 0,60, test t).

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd metody. (A) Tworzenie cewnika: (a) Przeciąć rurkę silikonową. (b) Przymocuj plastikowy koralik do rurki silikonowej za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. (c) Odciąć igłę 23 G w odległości 1,5 cm od końcówki. (d) Przymocuj odcięty koniec igły do silikonowej rurki. (B) Zespół wtryskiwacza: (a) Przyciąć igłę do wstrzykiwań o masie 23 G o 1 cm. (b) Podłączyć przyciętą igłę do wstrzykiwań do strzykawki o pojemności 2,5 ml. c) Osłonić odcięty fragment igły iniekcyjnej silikonową rurką. (d) Odciąć igłę 23 G w odległości 1,5 cm od końcówki. (e) Przymocuj odcięty koniec igły do silikonowej rurki. (C) Zabieg chirurgiczny: (a) Zdepiluj obszar operacyjny. (b) Naciąć skórę i ścianę brzucha na długość około 1,5 cm. (c) Utworzyć małą perforację (o średnicy około 1,5 mm) w antrum odźwiernika za pomocą nożyczek i wprowadzić cewnik (rurkę silikonową). Przymocuj cewnik do antrum odźwiernika za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. (d) Zszyj ścianę brzucha i skórę za pomocą jedwabnego materiału do szycia 5/0 i igły. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Spontaniczne oscylacje Ca2+ w korze mózgowej u myszy G7NG817 z dołączonym cewnikiem. (A) Reprezentatywny przykład oscylacji Ca2+ o szerokości kory mózgowej wyświetlany w odstępach 0,2 s. Zmiany intensywności fluorescencji są reprezentowane przez pseudokolorową nakładkę. Okno czasowe otoczone przerywaną linią w B pokazuje pierwszy pojawiający się stan przejściowy Ca2+, z jego szczytem ustawionym na czas 0. Reprezentacja pseudokoloru używa wartości szczytowej tego stanu przejściowego Ca2+ jako wartości maksymalnej i średniej +1 SD jako wartości minimalnej. (B) Szeregi czasowe zmian intensywności fluorescencji dla każdego zwrotu z inwestycji w przykładzie. Kolory linii odpowiadają różnym obszarom kory mózgowej: czerwony reprezentuje M2; magenta reprezentuje obszar somatosensoryczny (Somato); niebieski reprezentuje obszar wizualny (Wizualny); a zielony reprezentuje obszar retro splenial. Pasek w kolorze łososiowym pokazuje czas wstrzyknięcia. (C) Pojedynczy pik w obrębie przerywanego konturu jest wyodrębniony i wyświetlany w powiększeniu. Skróty: SD = odchylenie standardowe; ROI = obszar zainteresowania; RSC = retro obszar śledziony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Odpowiedź kory mózgowej Ca2+ podczas/po wstrzyknięciu glukozy lub wody. (A) Reprezentatywny przykład podania glukozy wyświetlany w odstępach 0,2 s. Zmiany intensywności fluorescencji są reprezentowane przez pseudokolorową nakładkę. Okno czasowe otoczone linią przerywaną w B pokazuje pierwszy pojawiający się stan przejściowy Ca2+ po wstrzyknięciu, z jego szczytem ustawionym na czas 0. Reprezentacja pseudokoloru opiera się na piku pierwszego stanu nieustalonego Ca2+ po wstrzyknięciu jako wartości maksymalnej i średniej +1 SD jako wartości minimalnej. (B) Zmiany intensywności fluorescencji w szeregach czasowych dla każdego zwrotu z inwestycji w przykładzie. Kolory linii odpowiadają różnym obszarom kory mózgowej: czerwony reprezentuje M2, magenta reprezentuje obszar somatosensoryczny (Somato), niebieski reprezentuje obszar wzrokowy (wizualny), a zielony reprezentuje obszar śledziony retro. (C) Pojedynczy pik w obrębie przerywanego konturu jest wyodrębniony i wyświetlany w powiększeniu. Analiza docelowej fali wapniowej to najwcześniejsza fala, która pojawiła się w ciągu 4-8 s po wstrzyknięciu. (D) Reprezentatywny przykład wstrzyknięcia wody jako dane kontrolne stężenia glukozy. (E) Szeregi czasowe zmieniają intensywność fluorescencji dla każdego zwrotu z inwestycji w przykładzie. Kolory linii są takie jak w B. (F) Pojedynczy pik w obrębie przerywanego konturu jest wyodrębniony i wyświetlany w powiększonym widoku. Analiza docelowej fali wapniowej to najwcześniejsza fala, która pojawiła się w ciągu 4-8 s po wstrzyknięciu. (G) Porównanie spontanicznej aktywności M2 (przed) i odpowiedzi po wstrzyknięciu (wstrzyknięciu). Średnia intensywność fluorescencji zmienia się w ciągu 50 s przed wstrzyknięciem, a szczytowa odpowiedź w obszarze M2 między 4 s a 8 s po wstrzyknięciu, została obliczona, używając kory słuchowej jako odniesienia. (H) Porównanie poziomów aktywacji w każdym obszarze kory mózgowej po podaniu wody lub glukozy. Stosunek wartości po wstrzyknięciu do wartości przed wstrzyknięciem, określony w G, obliczono dla każdego regionu. N.S. oznacza nieistotne (p > 0,05). ** <0.01. Słupki błędów są definiowane jako błąd standardowy średniej. Skróty: SD = odchylenie standardowe; ROI = obszar zainteresowania; RSC = retro obszar śledziony. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym artykule przedstawiono, jak podłączyć cewnik do jelita i obserwować sygnały Ca2 + o szerokości kory przezczaszkowej u myszy transgenicznych, które wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik Ca2 + . W tym eksperymencie nie uzyskaliśmy danych obrazowych, które wykorzystują wtórną długość fali źródła światła. Dzieje się tak, ponieważ myszy transgeniczne, które zatrudniliśmy w tym badaniu, wykazują bardzo wysoki wskaźnik zmiany intensywności fluorescencji (~kilkadziesiąt procent) w odpowiedzi na bodźce czuciowe ze względu na właściwości zastosowanego białka wskaźnikowego Ca2 + (G-CaMP7). W związku z tym myśleliśmy, że zanieczyszczenie hemodynamiką jest znikome. Co więcej, reakcje neuronalne, na których się skupiliśmy, pojawiły się szybko w ciągu kilku sekund, więc uznaliśmy, że nie ma potrzeby uwzględniania następnie wygenerowanego miejscowego przekrwienia czynnościowego. Ta metoda implantacji cewnika jest w stanie połączyć się z innymi genetycznie zmodyfikowanymi myszami, aby obserwować aktywność neuronalną w innych regionach mózgu i w różnych skalach czasowych. Jeśli jednak wykorzystuje się inne genetycznie zmodyfikowane myszy, należy przeprowadzić eksperyment kontrolny opisany powyżej.

Ta metoda mocowania cewnika do jelita jest odpowiednia do wstrzykiwania pojedynczej dawki przy niskich kosztach i jest łatwa i mniej inwazyjna niż metoda zaproponowana wcześniej29. Tradycyjnie chłonną bawełnę nakłada się na narząd trawienny i zszywa. Jednak szycie może pogorszyć powrót do zdrowia po operacji u myszy. Dlatego przyjęliśmy metodę dołączania. Powodem, dla którego wybraliśmy plastikowe koraliki, jest to, że lepiej przylegają do silikonu za pomocą używanego przez nas kleju cyjanoakrylowego.

Tradycyjnie postuluje się, że mózg postrzega glukozę na podstawie eskalacji poziomu glukozy we krwi w osoczu i towarzyszącego jej uwalniania hormonów. W związku z tym mózg potrzebuje od kilku minut do kilku godzin, aby wykryć glukozę po jej wchłonięciu z jelita4. Niektóre badania sugerują, że wyczuwanie jelit kontroluje preferencje smakowe myszy oprócz doustnego odbioru słodkiego smaku 1,3,17,22. Jako ilustracyjny przykład, naukowcy dostarczyli dowodów na to, że aromatyzowany roztwór nieodżywczy w parze z glukozą w żołądku (IG) i niemetabolizowany niemetabolizowany nieodżywczy roztwór nieodżywczy IG w parze z α-metylo-d-glukopiranozydem (MDG) mogą wywoływać preferencje dla każdego aromatyzowanego roztworu nieodżywczego w porównaniu z grupą IG sparowaną z wodą. Ponieważ dootrzewnowe wstrzyknięcie glukozy nie stymulowało przyjmowania roztworu nieodżywczego30, przewidywano, że wyczuwanie składników odżywczych w jelitach będzie odgrywać kluczową rolę w wyborach żywieniowych myszy 1,19,22.

Niedawne badania ujawniły obecność elektrycznie pobudliwej komórki w jelitach, określanej jako "komórka neuropodów", która wykorzystuje receptory molekularne do wykrywania i przekazywania bodźców czuciowych do nerwu błędnego za pośrednictwem synapsy glutaminergicznej. Podczas gdy poprzednie badania koncentrowały się głównie na roli GLP-1 w kontrolowaniu odżywiania się myszy, ostatnie badania wykazały, że aktywacja nerwu błędnego przez komórki nerwowe moduluje apetyt myszy. Nerw błędny następnie aktywuje jądro traktowe samodzielne, co prowadzi do późniejszej aktywacji neuronów dopaminergicznych19. Nie wiadomo jednak, czy aktywacja neuronów dopaminergicznych aktywuje również korę mózgową. Aby sklasyfikować reakcje mózgowe po dożołądkowym wlewie glukozy, udoskonaliliśmy technikę mocowania cewnika do celów obrazowania. Podczas stosowania tej technologii należy zachować ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniom narządów, ze szczególnym uwzględnieniem wątroby, która jest podatna na urazy podczas manipulacji wymaganej w celu ustalenia lokalizacji żołądka.

Nasze odkrycia wskazują, że dożołądkowe wstrzyknięcie glukozy aktywuje korę przedczołową w ciągu kilku sekund. Jednak dożołądkowe podawanie glukozy inicjuje jednocześnie wiele szlaków sygnałowych, takich jak drogi hormonalne, nerw błędny i rdzeń doprowadzający. Sygnały te są przetwarzane w pniu mózgu w różnych skalach czasowych. Dlatego przyszłe badania powinny zbadać, w jaki sposób te skomplikowane sygnały są przetwarzane i integrowane w mózgu.

Co więcej, transgeniczna linia myszy BAC GLT-1-G-CaMP7, którą zastosowaliśmy w niniejszym badaniu, wykazuje ekspresję czujnika Ca2 + , G-CaMP7, zarówno w neuronach, jak i astrocytach. Zasadniczo przedczołowe uniesienie Ca2 + uzyskane przez obrazowanie Ca2 + o szerokości kory przezczaszkowej pochodzi z neuronów i / lub astrocytów. Ponieważ jednak astrocyty wyrażają receptory dopaminy, jeśli zaangażowana jest sygnalizacja dopaminowa, sugeruje to potencjalną aktywację astrocytarnej sygnalizacji IP3 / Ca2 + . Ponieważ astrocytowa sygnalizacja IP3 / Ca2 + reguluje plastyczność synaptyczną, może również odgrywać ważną rolę w zmianach preferencji sacharozy i zmianach w zachowaniu żywieniowym po otrzymaniu glukozy. W związku z tym obrazowanie w rozdzielczości komórkowej przy użyciu mikroskopii dwufotonowej byłoby wymagane do określenia, czy odpowiedź obserwowana w korze przedczołowej po podaniu glukozy pochodziła z neuronów czy astrocytów w przyszłych badaniach. Inna skuteczna metoda polega na obserwacji specyficznej dla komórki ekspresji wskaźnika Ca2 + u myszy przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) za pomocą fotometrii światłowodowej. Ponadto konieczne jest sprawdzenie, za pomocą technik elektrofizjologicznych, czy bodziec glukozowy do jelita rzeczywiście stymulował nerw błędny. Jeśli komórki nerwowe przekazują sygnały do nerwu błędnego poprzez otrzymywanie glukozy, spodziewamy się braku odpowiedzi ze strony nerwu błędnego po podaniu inhibitora SGLT-1. Wreszcie, walidacja przy użyciu różnych antagonistów receptora dopaminy byłaby konieczna, aby potwierdzić, czy projekcje nerwu błędnego do jądra tractus solitarii (NTS) aktywowały neurony dopaminergiczne, zwiększając sygnały Ca2 + kory przedczołowej. Ogólnie rzecz biorąc, system ten umożliwia kompleksowe badanie efektów szybkiej transmisji neuronalnej z jelit do mózgu. Przedstawiono w nim bardzo obiecującą metodologię, która może potencjalnie wyjaśnić mechanizmy, takie jak to, w jaki sposób stres zmienia preferencje dotyczące sacharozy w odniesieniu do interakcji jelitowo-mózgowych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Ochanomizu, granty KAKENHI (18K14859, 20K15895), program JST FOREST, grant numer JPMJFR204G, Fundację Badawczą Opto-Science and Technology, Kao Research Council for the Study of Healthcare Science, Japońskie Stowarzyszenie Innowacji Chemicznych oraz fundację nauk przyrodniczych TERUMO. Autor dziękuje dr Takashi Tsuboi, Kazuki Harada i Akiyo Natsubori za nadzór nad eksperymentami. Autor dziękuje również członkom laboratorium za wsparcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Strzykawka 2,5 ml TERUMO IgłaTERUMOss-02Sz
23 GTERUMO4987350390691
Znieczulenie (roztwór do inhalacji ISOFLURANE)viatris871119
wacikbawełniany lokalna firma
Klej cyjanoakrylowy (AronArufa A)TOAGOSEI7990700Q1022
dentystyczny cement akrylowy C& B Słońce Medyczne 221AABZX00115000
Krem do depilacjiKracielokalnej firmy
Cyfrowy aparat CMOS Fotonika Hamamatsu ORCA-Spark
Pałąk na uchoNARISHIGEEB-5N
Zestaw filtrów (U-MWB2)EwidentnyU-MWB2 
Cienkie nożyczkiFine Dcience Tools14040-10
G7NG817 myszyRIKEN BRCRBRC09650
Oprogramowanie do obrazowaniaHamamatsu Photonics Oprogramowanie
Isoflurane vapolizershinanoseisakusyoSN-487-0T
Źródło światła (U-HGLGPS)EwidentnaU-HGLGPS
(MVX10)Ewidentne
plastikowe koraliki (średnica wewnętrzna 3 mm, średnica zewnętrzna 5 mm)lokalna firma
Szczypcelokalna firma
Szew polidioksanonowy, monodioxAlfresa PharmaHR1305MV45-KF2RTen wchłanialny, monofilamentowy szew PDS służy do zamykania nacięcia chirurgicznego
Kleszcze okrągłezakończone FST;11617-12
sól fizjologicznaFabryka Farmaceutyczna Otsuka35061311
Rurka silikonowa (średnica wewnętrzna 0,5 mm, średnica zewnętrzna 1,0 mm)JAKO JEDEN  CORPORATIO33151413lokalna firma
mała igła chirurgicznaNatsume Seisakusho Co., Ltd.
Stolik stereotaktycznyNARISHIGEMA-6N
Xylocaine Jelly 2%Sandoz K.K.614429303Galaretka ta jest stosowana jako miejscowy środek przeciwbólowy w celu złagodzenia bólu chirurgicznego
iniekcyjna HC Image mikroskopia AC03DNT

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  2. Reimann, F. Molecular mechanisms underlying nutrient detection by incretin-secreting cells. International Dairy Journal. 20 (4), 236-242 (2010).
  3. Kreuch, D., et al. Gut mechanisms linking intestinal sweet sensing to glycemic control. Frontiers in Endocrinology. 9, 741(2018).
  4. Gorboulev, V., et al. Na(+)-D-glucose cotransporter SGLT1 is pivotal for intestinal glucose absorption and glucose-dependent incretin secretion. Diabetes. 61 (1), 187-196 (2012).
  5. Harada, N., Inagaki, N. Role of sodium-glucose transporters in glucose uptake of the intestine and kidney. Journal of Diabetes Investigation. 3 (4), 352-353 (2012).
  6. Kaelberer, M. M., Rupprecht, L. E., Liu, W. W., Weng, P., Bohórquez, D. V. Neuropod cells: The emerging biology of gut-brain sensory transduction. Annual Review of Neuroscience. 43, 337-353 (2020).
  7. Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
  8. Larsen, P. J., Tang-Christensen, M., Jessop, D. S. Central administration of glucagon-like peptide-1 activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat. Endocrinology. 138 (10), 4445-4455 (1997).
  9. Alhadeff, A. L., Rupprecht, L. E., Hayes, M. R. GLP-1 neurons in the nucleus of the solitary tract project directly to the ventral tegmental area and nucleus accumbens to control for food intake. Endocrinology. 153 (2), 647-658 (2012).
  10. Raybould, H. E. Gut chemosensing: interactions between gut endocrine cells and visceral afferents. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 41-46 (2010).
  11. Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant. Physiology & Behavior. 76 (3), 403-413 (2002).
  12. Secher, A., et al. The arcuate nucleus mediates GLP-1 receptor agonist liraglutide-dependent weight loss. The Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4473-4488 (2014).
  13. Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
  14. Borgmann, D., et al. Gut-brain communication by distinct sensory neurons differently controls feeding and glucose metabolism. Cell Metabolism. 33 (7), 1466-1482.e7 (2021).
  15. Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
  16. Aponte, Y., Atasoy, D., Sternson, S. M. AGRP neurons are sufficient to orchestrate feeding behavior rapidly and without training. Nature Neuroscience. 14 (3), 351-355 (2011).
  17. Zhang, L., Han, W., Lin, C., Li, F., de Araujo, I. E. Sugar metabolism regulates flavor preferences and portal glucose sensing. Frontiers in Integrative Neuroscience. 12, 57(2018).
  18. Goldstein,, et al. Hypothalamic detection of macronutrients via multiple gut-brain pathways. Cell Metabolism. 33 (3), 676-687.e5 (2021).
  19. Fernandes, A. B., et al. Postingestive modulation of food seeking depends on vagus-mediated dopamine neuron activity. Neuron. 106 (5), 778-788.e6 (2020).
  20. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. 361 (6408), Science. New York, N.Y. eaat5236(2018).
  21. Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 782-786 (2015).
  22. Tan, H. -E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
  23. Wang, D., et al. Whole-brain mapping of the direct inputs and axonal projections of POMC and AgRP neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 40(2015).
  24. Yamada, S., Wang, Y., Monai, H. Transcranial cortex-wide Ca2+ imaging for the functional mapping of cortical dynamics. Frontiers in Neuroscience. 17, 1119793(2023).
  25. Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7 (1), 11100(2016).
  26. Ferron, J. -F., Kroeger, D., Chever, O., Amzica, F. Cortical Inhibition during Burst Suppression Induced with Isoflurane Anesthesia. The Journal of Neuroscience. 29 (31), 9850-9860 (2009).
  27. Ming, Q., et al. Isoflurane-induced burst suppression is a thalamus-modulated, focal-Onset rhythm with persistent local asynchrony and variable propagation patterns in rats. Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 599781(2021).
  28. Schwalm, M., et al. Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex. Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).
  29. Ueno, A., et al. Mouse intragastric infusion (iG) model. Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).
  30. Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study. Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Komunikacja jelito m zgobrazowanie ca ego korynerw b dnymyszy transgenicznecewnik wewn trz o dkowymikroskopia fluorescencyjnaaktywno neuronalnawt rna kora motoryczna

Powiązane artykuły