Komunikacja jelitowo-mózgowa, ułatwiana przez nerw błędny, jest kluczowa dla komunikacji między układem hormonalnym przewodu pokarmowego a mózgiem. Jednak to, czy dożołądkowe wstrzyknięcie glukozy może zmienić aktywność kory mózgowej, nadal nie jest zrozumiałe. W tym miejscu oferujemy kompleksowy protokół obserwacji zmian w aktywności kory mózgowej po wstrzyknięciu glukozy do dwunastnicy.
Artykuł metodologiczny
Analiza komunikacji neuronalnej jelitowo-mózgowej w czasie rzeczywistym: dynamika wapnia w całej korze mózgowej w odpowiedzi na stymulację glukozy w jelitach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Komunikacja między przewodem pokarmowym a mózgiem po wchłonięciu składników odżywczych odgrywa istotną rolę w preferencjach żywieniowych, metabolizmie i zachowaniach żywieniowych. Szczególnie w odniesieniu do określonych składników odżywczych, wiele badań wykazało, że asymilacja glukozy w komórkach nabłonka jelitowego inicjuje aktywację wielu cząsteczek sygnałowych. Hormony, takie jak glukagonopodobny peptyd-1, są znane jako kwintesencja mediatorów sygnałowych. Ponieważ hormony wpływają głównie na mózg poprzez szlaki krążenia, powoli modulują aktywność mózgu.
Jednak ostatnie badania wykazały dwie szybkie ścieżki jelitowo-mózgowe, które są wspierane przez autonomiczny układ nerwowy. Jeden działa poprzez rdzeniowo-aferentną ścieżkę nerwową, podczas gdy nerw błędny pośredniczy w drugim. W związku z tym reakcje mózgu po asymilacji glukozy w przewodzie pokarmowym są skomplikowane. Co więcej, ponieważ stymulacja jelitowa w końcu indukuje różnorodne czynności korowe, w tym reakcje czuciowe, nocyceptywne, nagrody i motoryczne, konieczne jest zastosowanie metodologii, które ułatwiają wizualizację zlokalizowanych obwodów mózgowych i czynności pankorowych, aby w pełni zrozumieć transmisję neuronalną jelitowo-mózgową. Niektóre badania wykazały gwałtowne zmiany stężenia jonów wapnia (Ca2+) w podwzgórzu i brzusznej okolicy nakrywki niezależnie od siebie różnymi szlakami po stymulacji jelitowej. Nie wiadomo jednak, czy zachodzą zmiany w aktywności kory mózgowej.
Aby obserwować aktywność kory mózgowej po wstrzyknięciu glukozy do żołądka, opracowaliśmy technikę obrazowania do wizualizacji w czasie rzeczywistym dynamiki Ca2+ w korze mózgowej przez całkowicie nienaruszoną czaszkę, używając transgenicznych myszy wyrażających genetycznie kodowane wskaźniki Ca2+. W badaniu przedstawiono kompleksowy protokół techniki zaprojektowanej do monitorowania obrazowania Ca2+ kory przezczaszkowej wywołanej stymulacją jelitową po wstrzyknięciu glukozy do żołądka za pomocą wszczepionego cewnika. Wstępne dane sugerują, że podanie roztworu glukozy do jelita aktywuje korę czołową, która nie reaguje na podawanie wody.
Wprowadzenie
Przede wszystkim, wyczuwanie glukozy w jelitach odbywa się za pośrednictwem receptorów słodkiego smaku (Tas1r2, Tas1r3) i kotransportera sodowo-glukozowego 1 (SGLT-1) znajdujących się w komórkach enteroendokrynnych w świetle jelita1,2,3,4,5,6. Odczuwanie glukozy w mózgu to proces, który zwykle trwa od kilku minut do godzin po jej wchłonięciu z jelit, a występowanie to opiera się głównie na zwiększonym poziomie cukru we krwi w osoczu i uwalnianiu hormonów7,8,9,10,11 (np. glukagonopodobny peptyd-1 [GLP-1], peptyd YY (PYY) i polipeptyd insulinotropowy zależny od glukozy [GIP]). Docierają do łukowatego jądra podwzgórza (ARC), gdzie wiążą neurony pro-opiomelanokortyny (POMC) i neurony białkowe związane z agouti (AgRP) poprzez przepływ krwi i nerw błędny (nerw przywspółczulny)12,13,14. Zmiana aktywności tych neuronów prowadzi do kontroli metabolizmu i zachowań żywieniowych15,16.
Najnowsza literatura coraz częściej podkreśla znaczenie sygnalizacji nerwowej jelitowo-mózgowej po wchłonięciu glukozy. Ten złożony szlak można ogólnie podzielić na dwa podstawowe mechanizmy. Pierwsza z nich polega na aktywacji rdzeniowych aferentów, co ostatecznie wpływa na aktywność neuronalną AgRP w ARC. Drugi mechanizm polega na stymulacji nerwu błędnego poprzez połączenia z komórkami nabłonka. Biorąc pod uwagę wieloaspektowe sposoby, w jakie komórki nabłonka jelitowego mogą aktywować nerw błędny13, jego rola jest uważana za wszechstronną.
Znaczna część aktywności nerwu błędnego jelitowego i rdzeniowego nerwu doprowadzającego jest związana z zachowaniami żywieniowymi17,18,19. Jednak pojawiające się dowody sugerują, że niektóre włókna nerwu błędnego, wystające do "komórek nerwowych", są zaangażowane w preferencję glukozy. Komórki neuropodów, podzbiór komórek enteroendokrynnych, wyrażają SGLT-1 po swojej stronie świetlnej i przekazują bodźce czuciowe do nerwu błędnego za pośrednictwem synaps glutaminergiczne2,20,21,22. Aktywacja nerwu błędnego wyzwala neurony dopaminergiczne w brzusznym obszarze nakrywki (VTA) w ciągu kilku sekund19. Warto zauważyć, że hamowanie aktywacji nerwu błędnego, szczególnie w dwunastnicy, za pomocą antagonisty glutaminianu zmniejsza preferencję sacharozy u myszy1. Podkreśla to kluczową rolę aktywacji komórek neuropodów w modulowaniu zachowań związanych z wyborem jedzenia po spożyciu glukozy2.
Pomimo tych postępów, dokładne zrozumienie mechanizmów szybkiego wykrywania glukozy w jelitach i ich wpływu na aktywność kory mózgowej pozostaje złożoną zagadką. Chociaż aktywacja mózgu kontrolowana przez neurony AgRP nie obejmuje kory mózgowej23, wiadomo, że neurony dopaminergiczne w VTA projektują korę mózgową. Nie wiadomo jednak, czy szybka aktywacja neuronów dopaminergicznych VTA po wykryciu glukozy naprawdę aktywuje korę mózgową. Aby wyjaśnić ten mechanizm, zbadaliśmy potencjał dożołądkowego podawania glukozy w celu szybkiego wpływu na korową dynamikę Ca2 + u transgenicznych myszy wykazujących ekspresję genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia.
Ten artykuł przedstawia tanią i mniej inwazyjną metodę kompleksowego zrozumienia zmian w aktywności kory mózgowej po dożołądkowym podaniu glukozy za pomocą obrazowania Ca2+ szerokości kory mózgowej u myszy Ostatnio popularność zyskała technika obrazowania Ca2+ przez nienaruszoną czaszkę, wykorzystująca transgeniczne myszy wykazujące ekspresję genetycznie kodowanych wskaźników wapnia24. Warto zauważyć, że transgeniczna linia myszy BAC GLT-1-G-CaMP7 #817 (znana również jako mysz G7NG817) zastosowana w tym badaniu wyraża czujnik Ca2 +, G-CaMP7, w neuronach i astrocytach25. Ze względu na wysoką gęstość ekspresji w korze mózgowej, ta transgeniczna linia myszy jest szczególnie odpowiednia do obrazowania Ca2+ w korze przezczaszkowej przy użyciu standardowego mikroskopu epifluorescencyjnego.
Protokół
Wszystkie protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt Uniwersytetu Ochanomizu w Japonii (protokoły badań nad zwierzętami 22017). Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Uniwersytetu Ochanomizu dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach, które są zgodne z Podstawowymi Wytycznymi dotyczącymi Właściwego Prowadzenia Eksperymentów na Zwierzętach i Działań Powiązanych w Akademickich Instytucjach Badawczych (Ministerstwo Edukacji, Kultury, Sportu, Nauki i Technologii, Japonia). Podjęto wysiłki w celu zminimalizowania liczby wykorzystanych zwierząt. Badanie to zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE.
1. Przygotowanie myszy transgenicznych
- Aby przeprowadzić ten eksperyment, należy wykorzystać dorosłe samce i samice myszy transgenicznych linii BAC GLT-1-G-CaMP7 #817, a mianowicie myszy G7NG81724,25 (w wieku powyżej 8 tygodni). Szczepem tła myszy G7NG81725 jest C57BL/6J.
- Myszy należy utrzymywać w 12-godzinnym cyklu światła i ciemności (12 h /12 h) i hodować w grupach składających się z maksymalnie pięciu osobników.
2. Tworzenie cewnika
- Używając nożyczek, przytnąć rurkę silikonową (średnica wewnętrzna 0.5 mm, średnica zewnętrzna 1.0 mm) do precyzyjnej długości 7 cm (Rysunek 1A-a).
UWAGA: Przed przystąpieniem do procedur nożyczki oraz rurka silikonowa zostały wysterylizowane. - Przytwierdzić małe plastikowe kuleczki (średnica wewnętrzna 3 mm, średnica zewnętrzna 5 mm) do przyciętej rurki, upewniając się, że znajdują się one 3 mm od jej końca (Rysunek 1A-b). Mocno przykleić kuleczki za pomocą kleju cyjanoakrylowego (dopuszczalne są warianty medyczne lub standardowe).
- Odciąć wierzchołek igły 23 G, a następnie odciąć fragment o długości 1.5 cm od końcówki igły (Rysunek 1A-c).
- Wprowadzić odciętą igłę 23 G z kroku 2.3 do końca rurki silikonowej, po przeciwnej stronie niż miejsce przytwierdzenia kuleczek (Rysunek 1A-d).
3. Tworzenie iniekktora
- Za pomocą sterylnych szczypiec odciąć 1 cm od końcówki igły (Rysunek 1B-a).
UWAGA: Należy upewnić się, że otwór na odciętym końcu zachowuje swoją integralność i nie ulegnie deformacji, ponieważ wszelkie zniekształcenia mogą utrudnić przepływ roztworu wstrzykiwanego. - Połączyć przystosowaną igłę do iniekcji 23 G z kroku 3.1.1 ze strzykawką o objętości 2,5 mL (Rysunek 1B-b).
- Odciąć fragment rurki silikonowej o wymaganej długości (w tym eksperymencie rurka silikonowa o długości 15 cm) i nałożyć ją na igłę do iniekcji 23 G (Rysunek 1B-c).
UWAGA: Objętość podawanego roztworu będzie różnić się w zależności od długości rurki. Na przykład w przypadku rurki o długości 15 cm, po zakończeniu eksperymentu w środku pozostanie około 50 µL roztworu. - Odciąć igłę do iniekcji 23 G w odległości 1,5 cm od końcówki igły.
- Połączyć odcięty fragment z kroku 3.4 z silikonowym cewnikiem przygotowanym w kroku 3.3 (Rysunek 1B-d).
UWAGA: Należy upewnić się, że otwory utworzone w krokach 3.1 i 3.4 nie uległy zniekształceniu po przecięciu. W razie potrzeby należy użyć szczypiec, aby przywrócić im okrągły kształt.
4. Lokalizacja w żołądku
- Podaj myszy znieczulenie poprzez inhalację 3,0% izofluranu w odpowiedniej komorze. Nałóż maść oftalmiczną, aby zapobiec wysychaniu oczu.
- Po upewnieniu się, że mysz jest znieczulona, ostrożnie przenieś ją z komory inhalacyjnej na stół operacyjny. Zapewnij wsparcie termiczne przez cały czas trwania procedury.
- Ułóż mysz na plecach, ustawiając pysk w pobliżu aparatu do inhalacji, a następnie zmniejsz stężenie izofluranu z 3,0% do 2,0%.
UWAGA: Oddziel dolną część maski do izofluranu od części górnej i przymocuj oddzieloną maskę (segment górny) do stołu operacyjnego za pomocą taśmy klejącej. - Przymocuj jamę ustną, przednie i tylne kończyny myszy do stołu operacyjnego za pomocą taśmy klejącej.
UWAGA: Dzięki unieruchomieniu myszy na stole można zapobiec błędom chirurgicznym wynikającym z ruchu, nawet jeśli zwierzę jest pod wpływem znieczulenia. - Usuń sierść z lewej górnej części brzucha (150% obszaru wokół miejsca operacji), używając kremu do depilacji. Nałóż miejscowo środek przeciwbólowy w miejscu operacji i odczekaj 5 min przed kontynuacją.
- Nałóż żel znieczulający miejscowo na skórę brzucha i odczekaj od 5 do 10 min. Następnie zdezynfekuj obszar operacyjny 3 krotnie, stosując naprzemiennie jodofor oraz 70% etanol. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez ucisk palca u stopy i przykryj zwierzę sterylnymi chustami chirurgicznymi. Wykonaj nacięcie skóry o długości około 1,5 cm (Rycina 1C-b), zlokalizowane 1 cm na prawo od linii pośrodkowej brzucha i 5 mm poniżej wyrostka mieczowatego (Rycina 1C-c). Następnie wykonaj nacięcie ściany brzucha o długości 1,5 cm w tym samym miejscu, co początkowe nacięcie skóry.
UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby nie uszkodzić znajdującej się poniżej wątroby. - Ostrożnie odsuń lewy płat wątroby bocznie za pomocą kleszczyków tępych, odsłaniając znajdujący się pod nim żołądek.
5. Wprowadzenie cewnika
- Unieś żołądek i ostrożnie wyciągnij go przez nacięcie.
UWAGA: Zachowaj najwyższą ostrożność, aby nie uszkodzić sąsiednich organów, zwłaszcza wątroby, i unikaj wywierania nadmiernej siły na żołądek. - Za pomocą nożyczek wykonaj niewielką perforację (o średnicy około 1.5mm) w przedpylorycznym fragmencie żołądka (antrum).
- Wprowadź koniec cewnika do otworu, upewniając się, że koralik znajduje się w bezpośrednim kontakcie z antrum żołądka.
UWAGA: Przed wprowadzeniem cewnik należy zdezynfekować roztworem glukonianu chlorheksydyny o stężeniu od 0.1 do 0.5%. - Przyklej koralik cewnika do żołądka, używając medycznego kleju cyjanoakrylowego.
UWAGA: Upewnij się, że żołądek nie jest przyklejony do otaczających go organów. - Sprawdź, czy cewnik jest mocno przytwierdzony do żołądka, a następnie delikatnie umieść żołądek z powrotem w jego naturalnym położeniu pod lewym płatem wątroby.
- Zszyj ścianę brzuszną za pomocą szwu z polidoksanonu (PDS), pozostawiając cewnik wystający na zewnątrz. Następnie zamknij nacięcie skóry w sposób analogiczny do zamknięcia ściany brzusznej.
- Delikatnie umieść mysz w sterylnej klatce.
UWAGA: Myszy po operacji powinny być utrzymywane w pojedynczych klatkach. Zastosuj miejscowy środek przeciwbólowy na zamknięcie rany i postępuj zgodnie z planem analgezji zalecanym przez lokalne wytyczne instytucjonalne. - Zapewnij minimum 48 h okresu rekonwalescencji w standardowych warunkach.
UWAGA: Koniec cewnika wprowadzony do żołądka myszy zostaje zamknięty igłą 23G z uszczelnioną końcówką, aby zapobiec przedostawaniu się ciał obcych oraz uniknąć przegryzienia. Ponieważ fragment cewnika wystający z brzucha jest krótki, zapobiega to przeciąganiu go przez mysz przez ściółkę, co mogłoby doprowadzić do jego poluzowania lub zaplątania.
6. Przygotowanie do obrazowania Ca2+ przezczaszkowego in vivo
- Podaj myszy znieczulenie przy użyciu izofluranu (indukcja 2%; podtrzymanie od 0,8% do 1,0%).
- Ustabilizuj mysz na platformie stereotaktycznej, używając pomocniczych uchwytów do uszu, aby zminimalizować wpływ pulsacji i oddychania. Następnie umieść mysz pod stereomikroskopem fluorescencyjnym.
- Zastosuj szerokopasmowy zestaw filtrów fluorescencyjnych w kolorze niebieskim (z wzbudzeniem przy 460-490 nm i emisją przy 520 nm) wraz z rtęciowym źródłem światła.
- Przechwyć obrazy za pomocą kamery i przetwórz je przy użyciu odpowiedniego oprogramowania do obrazowania.
- Ostrożnie usuń włosy ze skóry głowy za pomocą golarki elektrycznej lub kremu do depilacji.
UWAGA: W przypadku użycia brzytwy należy upewnić się, że jest ona dokładnie zdezynfekowana i uważać, aby nie przeciąć skóry. - Zdezynfekuj powierzchnię skóry głowy za pomocą patyczka higienicznego lub podobnego narzędzia, używając roztworu glukonianu chlorheksydyny rozcieńczonego do 0,1-0,5%. Następnie zdezynfekuj alkoholem i powtórz te naprzemienne etapy 3 razy.
- Nałóż żel znieczulający miejscowo i odczekaj 5-10 min.
- Przygotuj się do nałożenia dentystycznego cementu akrylowego.
- Użyj sterylnego ostrza skalpela, aby rozciąć skórę głowy. Całkowicie usuń skórę głowy lub wykonaj proste cięcie od potylicy do czoła.
- Użyj klamerek, aby odsłonić czaszkę, odciągając nadmiar skóry.
- Użyj patyczka higienicznego, aby usunąć tkankę łączną okostnej.
- Natychmiast nałóż cement akrylowy po usunięciu okostnej. Działaj szybko, aby zapobiec zmętnieniu powierzchni czaszki wskutek odparowania z odsłoniętej kości.
- Odczekaj około 5 min do wyschnięcia cementu.
7. Przezczaszkowe obrazowanie Ca2+ przy podawaniu glukozy do dwunastnicy
- Dostosuj temperaturę roztworu doświadczalnego oraz soli fizjologicznej do temperatury otoczenia. Poddaj myszy restrykcji żywieniowej przez określony czas (np. 2 h).
- Przed rozpoczęciem wstrzykiwania przedmuchaj pozostałą treść z cewnika od strony myszy, używając ok. 0,03 mL soli fizjologicznej.
- Naboruj roztwór doświadczalny (na przykład 10% roztwór glukozy przygotowany w 300 µL wody z dodatkiem kolejnych 300 µL wody) do strzykawki, a następnie podłącz ją do cewnika. Określ optymalną dawkę roztworu dostosowaną do konkretnego celu eksperymentalnego.
UWAGA: Na tym etapie zachowaj ostrożność, aby uniknąć nadmiernego naprężenia cewnika, co mogłoby uszkodzić anatomię wewnętrzną myszy. Manipuluj drenem od strony myszy z najwyższą delikatnością. Ponadto upewnij się, że w strzykawce nie pozostało powietrze po nabraniu roztworu, ponieważ uwięzione powietrze i pęcherzyki mogą wywołać rozszerzenie przewodu pokarmowego. - Oceń stan fizjologiczny myszy i aktywuj funkcję rejestracji w oprogramowaniu do obrazowania, klikając przycisk recording process w aplikacji.
- Przechwytuj obrazy przy rozdzielczości 512 x 512 pixels, głębokości 16 bit oraz częstotliwości odświeżania wynoszącej 10 Hz.
UWAGA: Parametry rejestracji można dostosować do konkretnych wymagań eksperymentalnych. - Zarejestruj dane spontaniczne (np. przez 50 s), a następnie stopniowo infunduj roztwór doświadczalny z prędkością dostosowaną do eksperymentu (w tym przypadku 0,035 mL/s).
UWAGA: Po zakończeniu eksperymentu mysz zostanie niezwłocznie uśpiona poprzez zwichnięcie szyi pod narkozą izofluranową.
8. Przetwarzanie i analiza danych obrazowych
- Pogrupuj dane obrazowe w koszyki o rozmiarze 64 x 64 piksele.
- Wyznacz ręcznie obszary zainteresowania (ROI) za pomocą programu ImageJ. Korzystając z atlasu mózgu myszy, określ następujące ROI: obszar czołowy (M2), obszar somatosensoryczny obejmujący obszar beczkowy (Somato), obszar potyliczny (Visual) oraz region retrosplenialny (RSC).
- Użyj funkcji MATLAB OdczytROIwImageJ aby wyekstrahować współrzędne odpowiadające obszarom zainteresowania (ROI). Dostęp do funkcji MATLAB uzyskaj poprzez podany link: https://jp.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/32479-readimagejroi
- Oblicz średnią szybkość zmiany intensywności fluorescencji w obrębie ROI przy użyciu programu MATLAB.
- Zdefiniuj szybkość zmiany intensywności fluorescencji (ΔF/F) za pomocą równania (1):
(1)
Gdzie Ft reprezentuje wartość intensywności fluorescencji w określonym czasie, a średnia wartość intensywności od początku rejestracji do 50 s po wstrzyknięciu została oznaczona jako F0.
- Zdefiniuj szybkość zmiany intensywności fluorescencji (ΔF/F) za pomocą równania (1):
- Należy uwzględnić opóźnienie w dotarciu roztworu do wstrzyknięcia do narządu. Jako wartość bazową należy przyjąć średnią intensywność z trzech sekund po wstrzyknięciu. Do analizy należy wybrać przebiegi fal, których intensywność przekracza wartość bazową + 1 SD, pod warunkiem, że wystąpiły one 3 s lub później po wstrzyknięciu.
Wyniki
Przezczaszkowe obrazowanie szerokiego pola kory w zakresie Ca2+ u myszy G7NG817 znieczulonej izofluranem
Kaniulę wykonano zgodnie z procedurą przedstawioną na Rysunku 1. Po dokładnym zidentyfikowaniu położenia żołądka przymocowano kaniulę w tym miejscu (Rysunek 1). Po zapewnieniu odpowiedniego czasu rekonwalescencji po wprowadzeniu kaniuli (około 48 h), zmierzono spontaniczną aktywność neuronalną przy łagodnej znieczuleniu izofluranem (0,8-1,0%), aby ustalić bazowe zmiany intensywności fluorescencji dla późniejszych obserwacji stymulacji jelit. W wyniku tego potwierdzono wzorce losowych oscylacji Ca2+ obejmujące całą korę (Rysunek 2A). Rysunek 2 przedstawia reprezentatywne przykłady spontanicznej aktywności mózgu przy wcześniej wprowadzonych kaniulach. Czas wystąpienia pierwszego obserwowalnego szczytu przejściowego Ca2+ w regionie M2 po wstrzyknięciu zdefiniowano jako 0,0 s. Reprezentacja w pseudokolorach wyświetlała szczyt tego przejścia Ca2+ jako wartość maksymalną, a wartość średnią powiększoną o jedno odchylenie standardowe (1 SD) jako wartość minimalną. Wyraźnie widać było, że lewa i prawa półkula wykazywały synchroniczną aktywność we wszystkich regionach.
Następnie wyznaczyliśmy ROI w celu charakterystyki fal w obrębie każdego obszaru funkcjonalnego. Jak pokazano na Rycynie 2B, przedstawiliśmy zmiany czasowe szybkości intensywności fluorescencji dla każdego ROI (Rycyna 2B). Zaobserwowane oscylacje Ca2+ na powierzchni wykazywały wzorzec wybuchowy z tłumieniem (burst suppression), polegający na naprzemiennych okresach niskiej aktywności i zmianach fluorescencji o wysokiej amplitudzie. Ten wzorzec aktywności jest zgodny z poprzednimi odkryciami, w których jednocześnie mierzono EEG powierzchni kory oraz dynamikę Ca2+26.
Mimo globalnych lub regionalnych fluktuacji powierzchniowego poziomu Ca2+ między stanami tłumienia i wybuchów, konkretny region kory inicjujący gwałtowny wzrost poziomu wapnia może być różny. Jak raportowano wcześniej, gdy sygnał stymuluje lokalny region kory, oczekuje się aktywacji tego obszaru, co następnie prowadzi do globalnej zmiany stanu kory27,28.
Zmiany w dynamice Ca2+ w korze po wewnątrzżołądkowym wstrzyknięciu glukozy
Następnie, aby wyjaśnić, w jaki sposób podanie glukozy lub wody wpływa na aktywność kory, monitorowano dynamikę Ca2+ w obrębie całej kory podczas i po wstrzyknięciu. W rezultacie stwierdzono zmiany w dynamice Ca2+ w korze po wewnątrzżołądkowym wstrzyknięciu glukozy. W przeciwieństwie do aktywności spontanicznej, przejawiającej się w różnych obszarach aktywacji korowej, zaobserwowano natychmiastową aktywację w obszarze przedczołowym lub wtórnej korze ruchowej (M2) po bezpośrednim wstrzyknięciu glukozy do jelita przez cewnik; efekt ten nie wystąpił po wewnątrzżołądkowym wstrzyknięciu wody (Rysunek 3A-C). Ponadto zaobserwowano, że te przejściowe, wyraźne zdarzenia Ca2+ miały tendencję do występowania w sposób ciągły przez około 10 s po wewnątrzżołądkowym wstrzyknięciu glukozy. Takie trwałe zjawiska nie były widoczne po podaniu wody (Rysunek 3D-F).
Zdarzenia Ca2+ w każdym ROI charakteryzowano poprzez obliczenie stosunku zmiany natężenia fluorescencji, przyjmując korę słuchową (Reference) jako punkt odniesienia, w momencie pierwszego piku występującego w ciągu 4-8 s po zakończeniu podaży glukozy. W rezultacie, po porównaniu odpowiedzi w regionie M2 z użyciem kory słuchowej jako referencji przed i po wstrzyknięciu, zaobserwowano istotną zmianę po podaniu glukozy.
W przeciwieństwie do tego, nie zaobserwowano takiej zmiany po wstrzyknięciu wody (Rycina 3G, woda N = 7: przed vs po wstrzyknięciu, 2,38 ± 2,53 vs 2,05 ± 1,84, p > 0,05; glukoza N = 7: przed vs po wstrzyknięciu, 2,48 ± 0,97 vs 3,76 ± 2,76, p < 0,01, test znaków Wilcoxona). Następnie, określając poziomy aktywacji w każdym obszarze kory poprzez stosunek wartości po wstrzyknięciu do wartości przed wstrzyknięciem, istotną różnicę zaobserwowano jedynie w obszarze M2 (Rycina 3H, M2: 0,92 ± 0,89 vs 1,30 ± 0,32, p = 0,006; Somato: 0,95 ± 0,076 vs 1,04 ± 0,13, p = 0,27; Visual: 0,92 ± 0,3 vs 1,00 ± 0,06, p = 0,89; RSC: 0,97 ± 0,27 vs 1,10 ± 0,27, p = 0,60, test t).
Rysunek 1: Przegląd metody. (A) Tworzenie cewnika: (a) Odciąć rurkę silikonową. (b) Przymocować plastikową kuleczkę do rurki silikonowej za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. (c) Odciąć igłę 23 G 1,5 cm od końcówki. (d) Połączyć odcięty koniec igły z rurką silikonową. (B) Montaż wstrzykiwacza: (a) Przyciąć igłę do iniekcji 23 G o 1 cm. (b) Połączyć przyciętą igłę do iniekcji ze strzykawką 2,5 mL. (c) Osłonić przyciętą sekcję igły do iniekcji rurką silikonową. (d) Odciąć igłę 23 G 1,5 cm od końcówki. (e) Połączyć odcięty koniec igły z rurką silikonową. (C) Procedura chirurgiczna: (a) Depilacja obszaru operacyjnego. (b) Nacięcie skóry i ściany brzusznej na długość około 1,5 cm. (c) Wykonanie niewielkiej perforacji (o średnicy około 1,5 mm) w przedżołądku odrodkowym za pomocą nożyczek i wprowadzenie cewnika (rurki silikonowej). Przymocowanie cewnika do przedżołądka odrodkowego za pomocą medycznego kleju cyjanoakrylowego. (d) Zaszycie ściany brzusznej i skóry przy użyciu nici jedwabnej 5/0 i igły. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
Rysunek 2: Spontaniczne oscylacje Ca2+ w obrębie kory u myszy G7NG817 z wszczepionym cewnikiem. (A) Reprezentatywny przykład oscylacji Ca2+ w obrębie kory, wyświetlonych w odstępach 0,2 s. Zmiany intensywności fluorescencji przedstawiono za pomocą nałożenia pseudokolorów. Okno czasowe otoczone przerywaną linią w sekcji B pokazuje pierwszy pojawiający się przejściowy wzrost stężenia Ca2+, którego szczyt wyznaczono jako czas 0. Reprezentacja pseudokolorowa przyjmuje szczyt tego wzrostu Ca2+ jako wartość maksymalną, a średnią +1 SD jako wartość minimalną. (B) Zmiany szeregów czasowych intensywności fluorescencji dla każdego ROI w przykładzie. Kolory linii odpowiadają różnym obszarom kory: czerwony reprezentuje M2; magenta reprezentuje obszar somatosensoryczny (Somato); niebieski reprezentuje obszar wzrokowy (Visual); a zielony reprezentuje region retrosplenialny. Łososiowy pasek wskazuje czas wstrzyknięcia. (C) Pojedynczy szczyt wewnątrz przerywanego obrysu został wyizolowany i przedstawiony w powiększeniu. Skróty: SD = odchylenie standardowe; ROI = obszar zainteresowania; RSC = region retrosplenialny. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
Rycina 3: Odpowiedź Ca2+ w obrębie kory podczas i po wstrzyknięciu glukozy lub wody. (A) Reprezentatywny przykład podania glukozy wyświetlony w odstępach 0,2 s. Zmiany intensywności fluorescencji przedstawiono za pomocą nakładki pseudokolorystycznej. Okno czasowe otoczone przerywaną linią w punkcie B pokazuje pierwszy pojawiający się transient Ca2+ po wstrzyknięciu, z jego szczytem wyznaczonym jako czas 0. Reprezentacja pseudokolorystyczna opiera się na szczycie pierwszego transientu Ca2+ po wstrzyknięciu jako wartości maksymalnej oraz średniej +1 SD jako wartości minimalnej. (B) Zmiany szeregów czasowych intensywności fluorescencji dla każdego ROI w przykładzie. Kolory linii odpowiadają różnym obszarom korowym: czerwony reprezentuje M2, purpurowy reprezentuje obszar somatosensoryczny (Somato), niebieski reprezentuje obszar wzrokowy (Visual), a zielony reprezentuje obszar retrosplenialny. (C) Pojedynczy szczyt w obrębie przerywanego obrysu został wyizolowany i wyświetlony w powiększeniu. Analizowaną docelową falą wapniową jest najwcześniejsza fala, która pojawiła się w ciągu 4–8 s po wstrzyknięciu. (D) Reprezentatywny przykład wstrzyknięcia wody jako danych kontrolnych dla glukozy. (E) Zmiany szeregów czasowych intensywności fluorescencji dla każdego ROI w przykładzie. Kolory linii są takie same jak w punkcie B. (F) Pojedynczy szczyt w obrębie przerywanego obrysu został wyizolowany i wyświetlony w powiększeniu. Analizowaną docelową falą wapniową jest najwcześniejsza fala, która pojawiła się w ciągu 4–8 s po wstrzyknięciu. (G) Porównanie aktywności spontanicznej M2 (przed) i odpowiedzi po wstrzyknięciu (injected). Obliczono średnie zmiany intensywności fluorescencji przez 50 s przed wstrzyknięciem oraz szczytową odpowiedź w obszarze M2 między 4 s a 8 s po wstrzyknięciu, przyjmując korę słuchową jako punkt odniesienia. (H) Porównanie poziomów aktywacji w każdym obszarze korowym po podaniu wody lub glukozy. Dla każdego obszaru obliczono stosunek wartości po wstrzyknięciu do wartości przed wstrzyknięciem, zgodnie z metodą opisaną w punkcie G. N.S. oznacza brak istotności statystycznej (p > 0,05). ** <0,01. Słupki błędów określono jako błąd standardowy średniej. Skróty: SD = odchylenie standardowe; ROI = obszar zainteresowania; RSC = obszar retrosplenialny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.
Dyskusja
W tym artykule przedstawiono, jak podłączyć cewnik do jelita i obserwować sygnały Ca2 + o szerokości kory przezczaszkowej u myszy transgenicznych, które wyrażają genetycznie kodowany wskaźnik Ca2 + . W tym eksperymencie nie uzyskaliśmy danych obrazowych, które wykorzystują wtórną długość fali źródła światła. Dzieje się tak, ponieważ myszy transgeniczne, które zatrudniliśmy w tym badaniu, wykazują bardzo wysoki wskaźnik zmiany intensywności fluorescencji (~kilkadziesiąt procent) w odpowiedzi na bodźce czuciowe ze względu na właściwości zastosowanego białka wskaźnikowego Ca2 + (G-CaMP7). W związku z tym myśleliśmy, że zanieczyszczenie hemodynamiką jest znikome. Co więcej, reakcje neuronalne, na których się skupiliśmy, pojawiły się szybko w ciągu kilku sekund, więc uznaliśmy, że nie ma potrzeby uwzględniania następnie wygenerowanego miejscowego przekrwienia czynnościowego. Ta metoda implantacji cewnika jest w stanie połączyć się z innymi genetycznie zmodyfikowanymi myszami, aby obserwować aktywność neuronalną w innych regionach mózgu i w różnych skalach czasowych. Jeśli jednak wykorzystuje się inne genetycznie zmodyfikowane myszy, należy przeprowadzić eksperyment kontrolny opisany powyżej.
Ta metoda mocowania cewnika do jelita jest odpowiednia do wstrzykiwania pojedynczej dawki przy niskich kosztach i jest łatwa i mniej inwazyjna niż metoda zaproponowana wcześniej29. Tradycyjnie chłonną bawełnę nakłada się na narząd trawienny i zszywa. Jednak szycie może pogorszyć powrót do zdrowia po operacji u myszy. Dlatego przyjęliśmy metodę dołączania. Powodem, dla którego wybraliśmy plastikowe koraliki, jest to, że lepiej przylegają do silikonu za pomocą używanego przez nas kleju cyjanoakrylowego.
Tradycyjnie postuluje się, że mózg postrzega glukozę na podstawie eskalacji poziomu glukozy we krwi w osoczu i towarzyszącego jej uwalniania hormonów. W związku z tym mózg potrzebuje od kilku minut do kilku godzin, aby wykryć glukozę po jej wchłonięciu z jelita4. Niektóre badania sugerują, że wyczuwanie jelit kontroluje preferencje smakowe myszy oprócz doustnego odbioru słodkiego smaku 1,3,17,22. Jako ilustracyjny przykład, naukowcy dostarczyli dowodów na to, że aromatyzowany roztwór nieodżywczy w parze z glukozą w żołądku (IG) i niemetabolizowany niemetabolizowany nieodżywczy roztwór nieodżywczy IG w parze z α-metylo-d-glukopiranozydem (MDG) mogą wywoływać preferencje dla każdego aromatyzowanego roztworu nieodżywczego w porównaniu z grupą IG sparowaną z wodą. Ponieważ dootrzewnowe wstrzyknięcie glukozy nie stymulowało przyjmowania roztworu nieodżywczego30, przewidywano, że wyczuwanie składników odżywczych w jelitach będzie odgrywać kluczową rolę w wyborach żywieniowych myszy 1,19,22.
Niedawne badania ujawniły obecność elektrycznie pobudliwej komórki w jelitach, określanej jako "komórka neuropodów", która wykorzystuje receptory molekularne do wykrywania i przekazywania bodźców czuciowych do nerwu błędnego za pośrednictwem synapsy glutaminergicznej. Podczas gdy poprzednie badania koncentrowały się głównie na roli GLP-1 w kontrolowaniu odżywiania się myszy, ostatnie badania wykazały, że aktywacja nerwu błędnego przez komórki nerwowe moduluje apetyt myszy. Nerw błędny następnie aktywuje jądro traktowe samodzielne, co prowadzi do późniejszej aktywacji neuronów dopaminergicznych19. Nie wiadomo jednak, czy aktywacja neuronów dopaminergicznych aktywuje również korę mózgową. Aby sklasyfikować reakcje mózgowe po dożołądkowym wlewie glukozy, udoskonaliliśmy technikę mocowania cewnika do celów obrazowania. Podczas stosowania tej technologii należy zachować ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniom narządów, ze szczególnym uwzględnieniem wątroby, która jest podatna na urazy podczas manipulacji wymaganej w celu ustalenia lokalizacji żołądka.
Nasze odkrycia wskazują, że dożołądkowe wstrzyknięcie glukozy aktywuje korę przedczołową w ciągu kilku sekund. Jednak dożołądkowe podawanie glukozy inicjuje jednocześnie wiele szlaków sygnałowych, takich jak drogi hormonalne, nerw błędny i rdzeń doprowadzający. Sygnały te są przetwarzane w pniu mózgu w różnych skalach czasowych. Dlatego przyszłe badania powinny zbadać, w jaki sposób te skomplikowane sygnały są przetwarzane i integrowane w mózgu.
Co więcej, transgeniczna linia myszy BAC GLT-1-G-CaMP7, którą zastosowaliśmy w niniejszym badaniu, wykazuje ekspresję czujnika Ca2 + , G-CaMP7, zarówno w neuronach, jak i astrocytach. Zasadniczo przedczołowe uniesienie Ca2 + uzyskane przez obrazowanie Ca2 + o szerokości kory przezczaszkowej pochodzi z neuronów i / lub astrocytów. Ponieważ jednak astrocyty wyrażają receptory dopaminy, jeśli zaangażowana jest sygnalizacja dopaminowa, sugeruje to potencjalną aktywację astrocytarnej sygnalizacji IP3 / Ca2 + . Ponieważ astrocytowa sygnalizacja IP3 / Ca2 + reguluje plastyczność synaptyczną, może również odgrywać ważną rolę w zmianach preferencji sacharozy i zmianach w zachowaniu żywieniowym po otrzymaniu glukozy. W związku z tym obrazowanie w rozdzielczości komórkowej przy użyciu mikroskopii dwufotonowej byłoby wymagane do określenia, czy odpowiedź obserwowana w korze przedczołowej po podaniu glukozy pochodziła z neuronów czy astrocytów w przyszłych badaniach. Inna skuteczna metoda polega na obserwacji specyficznej dla komórki ekspresji wskaźnika Ca2 + u myszy przy użyciu wirusa związanego z adenowirusem (AAV) za pomocą fotometrii światłowodowej. Ponadto konieczne jest sprawdzenie, za pomocą technik elektrofizjologicznych, czy bodziec glukozowy do jelita rzeczywiście stymulował nerw błędny. Jeśli komórki nerwowe przekazują sygnały do nerwu błędnego poprzez otrzymywanie glukozy, spodziewamy się braku odpowiedzi ze strony nerwu błędnego po podaniu inhibitora SGLT-1. Wreszcie, walidacja przy użyciu różnych antagonistów receptora dopaminy byłaby konieczna, aby potwierdzić, czy projekcje nerwu błędnego do jądra tractus solitarii (NTS) aktywowały neurony dopaminergiczne, zwiększając sygnały Ca2 + kory przedczołowej. Ogólnie rzecz biorąc, system ten umożliwia kompleksowe badanie efektów szybkiej transmisji neuronalnej z jelit do mózgu. Przedstawiono w nim bardzo obiecującą metodologię, która może potencjalnie wyjaśnić mechanizmy, takie jak to, w jaki sposób stres zmienia preferencje dotyczące sacharozy w odniesieniu do interakcji jelitowo-mózgowych.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Uniwersytet Ochanomizu, granty KAKENHI (18K14859, 20K15895), program JST FOREST, grant numer JPMJFR204G, Fundację Badawczą Opto-Science and Technology, Kao Research Council for the Study of Healthcare Science, Japońskie Stowarzyszenie Innowacji Chemicznych oraz fundację nauk przyrodniczych TERUMO. Autor dziękuje dr Takashi Tsuboi, Kazuki Harada i Akiyo Natsubori za nadzór nad eksperymentami. Autor dziękuje również członkom laboratorium za wsparcie.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Strzykawka 2,5 ml TERUMO Igła | TERUMO | ss-02Sz | |
| 23 G | TERUMO | 4987350390691 | |
| Znieczulenie (roztwór do inhalacji ISOFLURANE) | viatris | 871119 | |
| wacik | bawełniany lokalna firma | ||
| Klej cyjanoakrylowy (AronArufa A) | TOAGOSEI | 7990700Q1022 | |
| dentystyczny cement akrylowy C& B | Słońce Medyczne | 221AABZX00115000 | |
| Krem do depilacji | Kracie | lokalnej firmy | |
| Cyfrowy aparat CMOS | Fotonika Hamamatsu | ORCA-Spark | |
| Pałąk na ucho | NARISHIGE | EB-5N | |
| Zestaw filtrów (U-MWB2) | Ewidentny | U-MWB2 | |
| Cienkie nożyczki | Fine Dcience Tools | 14040-10 | |
| G7NG817 myszy | RIKEN BRC | RBRC09650 | |
| Oprogramowanie do obrazowania | Hamamatsu Photonics | Oprogramowanie | |
| Isoflurane vapolizer | shinanoseisakusyo | SN-487-0T | |
| Źródło światła (U-HGLGPS) | Ewidentna | U-HGLGPS | |
| (MVX10) | Ewidentne | ||
| plastikowe koraliki (średnica wewnętrzna 3 mm, średnica zewnętrzna 5 mm) | lokalna firma | ||
| Szczypce | lokalna firma | ||
| Szew polidioksanonowy, monodiox | Alfresa Pharma | HR1305MV45-KF2R | Ten wchłanialny, monofilamentowy szew PDS służy do zamykania nacięcia chirurgicznego |
| Kleszcze okrągłe | zakończone FST; | 11617-12 | |
| sól fizjologiczna | Fabryka Farmaceutyczna Otsuka | 35061311 | |
| Rurka silikonowa (średnica wewnętrzna 0,5 mm, średnica zewnętrzna 1,0 mm) | JAKO JEDEN CORPORATIO | 33151413 | lokalna firma |
| mała igła chirurgiczna | Natsume Seisakusho Co., Ltd. | ||
| Stolik stereotaktyczny | NARISHIGE | MA-6N | |
| Xylocaine Jelly 2% | Sandoz K.K. | 614429303 | Galaretka ta jest stosowana jako miejscowy środek przeciwbólowy w celu złagodzenia bólu chirurgicznego |
Bibliografia
- Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
- Reimann, F. Molecular mechanisms underlying nutrient detection by incretin-secreting cells. International Dairy Journal. 20 (4), 236-242 (2010).
- Kreuch, D., et al. Gut mechanisms linking intestinal sweet sensing to glycemic control. Frontiers in Endocrinology. 9, 741(2018).
- Gorboulev, V., et al. Na(+)-D-glucose cotransporter SGLT1 is pivotal for intestinal glucose absorption and glucose-dependent incretin secretion. Diabetes. 61 (1), 187-196 (2012).
- Harada, N., Inagaki, N. Role of sodium-glucose transporters in glucose uptake of the intestine and kidney. Journal of Diabetes Investigation. 3 (4), 352-353 (2012).
- Kaelberer, M. M., Rupprecht, L. E., Liu, W. W., Weng, P., Bohórquez, D. V. Neuropod cells: The emerging biology of gut-brain sensory transduction. Annual Review of Neuroscience. 43, 337-353 (2020).
- Stanley, S., Wynne, K., McGowan, B., Bloom, S. Hormonal regulation of food intake. Physiological Reviews. 85 (4), 1131-1158 (2005).
- Larsen, P. J., Tang-Christensen, M., Jessop, D. S. Central administration of glucagon-like peptide-1 activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat. Endocrinology. 138 (10), 4445-4455 (1997).
- Alhadeff, A. L., Rupprecht, L. E., Hayes, M. R. GLP-1 neurons in the nucleus of the solitary tract project directly to the ventral tegmental area and nucleus accumbens to control for food intake. Endocrinology. 153 (2), 647-658 (2012).
- Raybould, H. E. Gut chemosensing: interactions between gut endocrine cells and visceral afferents. Autonomic Neuroscience: Basic & Clinical. 153 (1-2), 41-46 (2010).
- Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant. Physiology & Behavior. 76 (3), 403-413 (2002).
- Secher, A., et al. The arcuate nucleus mediates GLP-1 receptor agonist liraglutide-dependent weight loss. The Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4473-4488 (2014).
- Williams, E. K., et al. Sensory neurons that detect stretch and nutrients in the digestive system. Cell. 166 (1), 209-221 (2016).
- Borgmann, D., et al. Gut-brain communication by distinct sensory neurons differently controls feeding and glucose metabolism. Cell Metabolism. 33 (7), 1466-1482.e7 (2021).
- Krashes, M. J., et al. Rapid, reversible activation of AgRP neurons drives feeding behavior in mice. The Journal of Clinical Investigation. 121 (4), 1424-1428 (2011).
- Aponte, Y., Atasoy, D., Sternson, S. M. AGRP neurons are sufficient to orchestrate feeding behavior rapidly and without training. Nature Neuroscience. 14 (3), 351-355 (2011).
- Zhang, L., Han, W., Lin, C., Li, F., de Araujo, I. E. Sugar metabolism regulates flavor preferences and portal glucose sensing. Frontiers in Integrative Neuroscience. 12, 57(2018).
- Goldstein,, et al. Hypothalamic detection of macronutrients via multiple gut-brain pathways. Cell Metabolism. 33 (3), 676-687.e5 (2021).
- Fernandes, A. B., et al. Postingestive modulation of food seeking depends on vagus-mediated dopamine neuron activity. Neuron. 106 (5), 778-788.e6 (2020).
- Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. 361 (6408), Science. New York, N.Y. eaat5236(2018).
- Bohórquez, D. V., et al. Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells. The Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 782-786 (2015).
- Tan, H. -E., et al. The gut-brain axis mediates sugar preference. Nature. 580 (7804), 511-516 (2020).
- Wang, D., et al. Whole-brain mapping of the direct inputs and axonal projections of POMC and AgRP neurons. Frontiers in Neuroanatomy. 9, 40(2015).
- Yamada, S., Wang, Y., Monai, H. Transcranial cortex-wide Ca2+ imaging for the functional mapping of cortical dynamics. Frontiers in Neuroscience. 17, 1119793(2023).
- Monai, H., et al. Calcium imaging reveals glial involvement in transcranial direct current stimulation-induced plasticity in mouse brain. Nature Communications. 7 (1), 11100(2016).
- Ferron, J. -F., Kroeger, D., Chever, O., Amzica, F. Cortical Inhibition during Burst Suppression Induced with Isoflurane Anesthesia. The Journal of Neuroscience. 29 (31), 9850-9860 (2009).
- Ming, Q., et al. Isoflurane-induced burst suppression is a thalamus-modulated, focal-Onset rhythm with persistent local asynchrony and variable propagation patterns in rats. Frontiers in Systems Neuroscience. 14, 599781(2021).
- Schwalm, M., et al. Functional states shape the spatiotemporal representation of local and cortex-wide neural activity in mouse sensory cortex. Journal of Neurophysiology. 128 (4), 763-777 (2022).
- Ueno, A., et al. Mouse intragastric infusion (iG) model. Nature Protocols. 7 (4), 771-781 (2012).
- Zukerman, S., Ackroff, K., Sclafani, A. Post-oral glucose stimulation of intake and conditioned flavor preference in C57BL/6J mice: A concentration-response study. Physiology & Behavior. 109, 33-41 (2013).
Przedruki i uprawnienia
