Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna za pośrednictwem kurkuminoidów na mysim modelu kandydozy jamy ustnej

Kandydoza jamy ustnej (OC) jest główną infekcją grzybiczą jamy ustnej; jest spowodowana przerostem Candida spp. Czynniki predysponujące do OC obejmują dysfunkcję endokrynologiczną, stosowanie antybiotyków o szerokim spektrum działania, radio- i chemioterapię, niedobory żywieniowe, kserostomię (niski przepływ śliny), używanie protez zębowych, złą higienę, a zwłaszcza immunosupresję¹. Wśród gatunków Candida Candida albicans jest najbardziej rozpowszechniona i zjadliwa; Występuje jako gatunek komensalny w organizmie człowieka i jako patogen oportunistyczny. C. albicans ma zdolność zmiany morfologii z drożdży komensalnych (blastoporów) na patogenne włókna (strzępki i pseudostrzępki)². Formy nitkowate, zwłaszcza strzępki, mogą atakować nabłonek gospodarza poprzez endocytozę lub aktywną penetrację, powodując infekcję³. Inne czynniki wirulencji C. albicans obejmują adhezję, tworzenie biofilmu oraz wydzielanie enzymów i toksyn lipolitycznych i hydrolitycznych, takich jak lipazy, fosfolipazy, proteinazy i kandydalizyna⁴.

Zabiegi OC polegają na stosowaniu środków przeciwgrzybiczych, zwłaszcza miejscowych polienów i azoli (nystatyny i mikonazolu)⁵. Wykazują one jednak tylko krótkotrwałą skuteczność, a nawroty są częste. Ponadto nadużywanie leków przeciwgrzybiczych spowodowało problem rozwoju i rozprzestrzeniania się oporności na leki przeciwgrzybicze⁶. Dlatego potrzebne są alternatywne terapie, takie jak przeciwdrobnoustrojowa terapia fotodynamiczna (aPDT), która łączy fotosensybilizator (PS) i światło o odpowiedniej długości fali (takiej samej, jak absorpcja PS) w obecności tlenu. PS są wiązane lub pobierane przez komórki, a po aktywacji przez światło wytwarzają reaktywne formy tlenu (ROS), które są toksyczne dla uczulonych komórek⁷.

W aPDT, jednym z zastosowanych fotosensybilizatorów (PS) jest kurkumina (CUR), naturalnie występujący związek pozyskiwany z kłączy kurkumy (Curcuma longa L.). Kurkumina posiada liczne właściwości terapeutyczne, w tym właściwości przeciwzapalne, przeciwutleniające, przeciwnowotworowe i przeciwbakteryjne^8,9. Wcześniejsze badanie wykazało, że aPDT wykorzystujący CUR skutecznie zmniejszał C. albicans w mysim modelu kandydozy jamy ustnej, nie powodując żadnych szkód w tkankach gospodarza¹⁰. CUR jest głównym kurkuminoidem ekstrahowanym z kurkumy, ale w tej roślinie znajdują się również inne polifenole, takie jak demetoksykurkumina i bis-demetoksykurkumina. APDT za pośrednictwem kurkuminoidów wykazał działanie przeciwbakteryjne przeciwko biofilmom Staphylococcus aureus hodowanym w cewnikach¹¹. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, jego działanie przeciwgrzybicze wobec C. albicans pozostaje niejasne. Dlatego w tym badaniu oceniliśmy aPDT, w którym pośredniczy sól kurkuminoidowa przeciwko C. albicans w mysim modelu OC.

Protokół badawczy dotyczący wykorzystania myszy został zatwierdzony przez Komitet Etyki ds. Wykorzystania Zwierząt (numery spraw 05/2008 i 09/2020) w School of Dentistry, Araraquara, UNESP. Jako szczep referencyjny użyto C. albicans (ATCC 90028). Do niniejszego badania wykorzystano sześciotygodniowe samice myszy szwajcarskich (n = 45) o masie ciała w zakresie 20-30 g. Zwierzęta zostały dostarczone przez Uniwersytet Stanowy São Paulo, UNESP, Botucatu.

1. Przygotowanie PS i wybór źródła światła dla aPDT

1. Przygotować PS zgodnie ze specyfikacją substancji, która ma być badana.
   UWAGA: W tym badaniu jako PS użyto rozpuszczalnej w wodzie mieszaniny kurkuminoidów (mieszanina soli rozpuszczalnych w wodzie na bazie CUR¹²) (patrz Tabela materiałów i Rysunek 1). Rozcieńczenia w temperaturze 20 μM, 40 μM i 80 μM (odpowiednio 15,6, 29,2 i 58,4 mg/l) przygotowywano w ultraczystej wodzie bezpośrednio przed użyciem i utrzymywano w temperaturze 5 °C.
2. Należy wybrać sprzęt świetlny o odpowiedniej długości fali (takiej samej jak długość fali absorpcji PS), który jest w stanie oświetlić cały fotouczulny cel równomiernie i jednocześnie bez podgrzewania tkanki.
   UWAGA: W tym badaniu użyto rękojeści zawierającej diodę elektroluminescencyjną (LED, patrz tabela materiałów), która została zaprojektowana w Instituto de Física de São Carlos (Uniwersytet w São Paulo, São Carlos, SP, Brazylia). Moc wyjściowa dostarczana przez światło wynosiła 89,2 mW/^cm2 przy niebieskiej długości fali około 455 nm.

2. Przygotowanie inokulum C. albicans

1. Szczep referencyjny C. albicans (ATCC 90028) należy przechowywać w drożdżowo-peptonowo-glukozowym (YEPD, patrz Tabela Materiałów) z 50% glicerolem w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
2. Rozmrozić zamrożony szczep w temperaturze pokojowej, rozprowadzić 100 μl podwielokrotności na szalce Petriego z agarem z dekstrozy Sabouraud (SDA) z chloramfenikolem (patrz tabela materiałów) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
3. Przenieść pięć kolonii do 10 ml bulionu azotowego z drożdży z 2% glukozą (YNBg) i rosnąć tlenowo w temperaturze 37 °C przez 16 godzin.
4. Rozcieńczyć kulturę drożdży w świeżym YNBg (1:10) i inkubować w stanie tlenowym w temperaturze 37 °C do momentu, gdy gęstość optyczna osiągnie środkową logarytmiczną fazę wzrostu.
   UWAGA: Wcześniej ustandaryzuj krzywą wzrostu drobnoustrojów dla każdego laboratorium. W obecnych badaniach kulturom pozostawiono inkubację przez około 8 godzin, aż osiągnęły środkową fazę wzrostu, na co wskazuje gęstość optyczna przy 540 nm (OD₅₄₀), ze średnią wartością 0,536 ± 0,062 dowolnej jednostki (średnia ± odchylenie standardowe [SD]).
5. Odwirować kulturę przy 5 000 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, wyrzucić supernatant i przemyć osad dwukrotnie tą samą objętością sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS; 0,136 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM KH₂PO₄, 10 mM Na₂HPO₄, pH 7,4).
6. Użyć 100 μl podwielokrotności do wykonania czterech seryjnych 10-krotnych rozcieńczeń w PBS, rozprowadzić rozcieńczenia na płytkach SDA i inkubować w temperaturze 37 °C przez 48 godzin w celu zliczenia kolonii. Standardowo stosuje się zawiesiny grzybów w stężeniach około 4,5 × 10⁷ jednostek tworzących kolonie na mililitr (jtk/ml)].

3. Indukcja OC u myszy

UWAGA: Poniższa metodologia została wcześniej opisana przez Takakura et al.¹³ i powielona przez naszą grupę^10,14, z pewnymi modyfikacjami.

1. Losowo rozmieść myszy w dziewięciu grupach (n = 5), odpowiadających tej samej liczbie zabiegów (plik uzupełniający 1).
   UWAGA: Jama ustna myszy powinna być ujemna dla wzrostu Candida. Należy to sprawdzić, pobierając wymaz z jamy ustnej i posiewając próbkę na SDA.
2. Trzymaj zwierzęta w pudełkach z propylenem¹⁰ (maks. 5 myszy w pudełku), z wiórami drzewnymi na wykładzinę podłogową, w wiwarium o kontrolowanej temperaturze 23 ± 2 °C w cyklu 12/12 godzin światło/ciemność. Nie ma potrzeby dostarczania specjalnego wzbogacenia.
3. Utrzymuj myszy na diecie ekstrudowanych myszy i filtrowanej wodzie ad libitum.
4. Podskórnie wstrzyknąć lek immunosupresyjny, prednizolon (100 mg/kg masy ciała, patrz Tabela Materiałów), po raz pierwszy w pierwszym dniu wszystkim członkom grup C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20 μM, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ i C-L- (Plik uzupełniający 1).
   UWAGA: Trzymaj myszy z tej samej grupy w tym samym pudełku i monitoruj je codziennie pod kątem wszelkich oznak stresu i utraty wagi. Zasięgnij porady weterynarza w sprawie leków przeciwbólowych lub zmienionej żywności/wody, jeśli zauważysz stres lub utratę wagi.
5. Począwszy od pierwszego dnia i do końca eksperymentu, podawaj chlorowodorek tetracykliny w wodzie pitnej w ilości 0,83 mg/ml¹³.
6. Zaszczepić języki myszy drugiego dnia, w tym grupy C+L+ 20, C+L+ 40, C+L+ 80, C+L- 20, C+L- 40, C+L- 80, C-L+ i C-L- (Plik uzupełniający 1), inokulum C. albicans. Nie należy szczepić myszy z ujemnej grupy kontrolnej (NCtrl).
   1. Uspokoić zwierzęta poprzez wstrzyknięcie domięśniowe 10 mg/kg chlorku chloropromazyny (patrz tabela materiałów) w każdy mięsień uda przed przeprowadzeniem szczepienia.
   2. Przeprowadzić inokulację wewnątrzustną myszy, mocząc sterylny wacik (po jednym na zwierzę) w świeżo przygotowanej (tj. przygotowanej bezpośrednio przed inokulacją) standaryzowanej zawiesinie C. albicans.
   3. Umieść myszy z uspokojeniem w pozycji leżącej. Delikatnie wyciągnij ich języki z ust za pomocą sterylnych kleszczy. Pocieraj język każdej myszy nasączonym wacikiem przez 30 sekund. Monitoruj myszy, dopóki nie wyzdrowieją z sedacji.
7. W piątym dniu należy podać uzupełniające podskórne wstrzyknięcie prednizolonu (100 mg/kg masy ciała) w celu utrzymania immunosupresji.
   UWAGA: Ten protokół jest wystarczający do utrzymania infekcji przez 7 dni po inokulacji wewnątrzustnej. Oś czasu protokołu jest pokazana w Rysunek 2.

4. Przeciwbakteryjna terapia fotodynamiczna i odzyskiwanie C. albicans ze zmian w jamie ustnej

1. W siódmym dniu, przed leczeniem, znieczulić zwierzęta za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia chlorowodorku ketaminy (100 mg/kg masy ciała) w połączeniu z ksylazyną (10 mg/kg masy ciała) (patrz tabela materiałów).
2. Umieść każde zwierzę w pozycji leżącej na podłożu na podkładce^14,15wyposażone w druty ze stali nierdzewnej, które można owinąć wokół siekaczy, aby utrzymać otwarte usta.
   UWAGA: Podkładki izotermiczne są zalecane do ogrzewania myszy podczas sedacji, zapobiegając hipotermii w temperaturze pokojowej i unikając śmiertelności związanej ze znieczuleniem¹⁵. Każde znieczulone zwierzę powinno być monitorowane pod kątem braku odruchu wycofania, gdy palce u nóg są ściśnięte w celu potwierdzenia głębokości znieczulenia. W razie potrzeby można podać jedną dawkę podtrzymującą ketaminy w 1/3 dawki pierwotnej (bez ksylazyny).
3. Z cofniętą żuchwą i policzkami delikatnie umieść język na zewnątrz jamy ustnej.
4. W przypadku myszy z grup C+L+ należy odpipetować 70 μl PS na grzbiet języka (w jednym z badanych stężeń). Trzymaj myszy w ciemnym otoczeniu przez okres 20 minut jako okres przed napromienianiem. Upewnij się, że w tym czasie język każdego zwierzęcia pozostaje umieszczony w jamie ustnej, aby zapobiec połknięciu fotouczulacza (PS).
5. Po okresie fotouczulenia wyciągnij język z ust w celu oświetlenia. Umieść urządzenie LED na grzbiecie języka i zapal przy 37,5 J/cm² (7 minut z obecnym urządzeniem) (Rysunek 3).
6. W przypadku zwierząt z grupy C+L- należy odpipetować 70 μl PS w jednym z badanych stężeń na grzbiecie języka i trzymać myszy w ciemności przez 27 minut.
7. W przypadku zwierząt z grupy C-L+ (leczonych światłem bez wcześniejszego uczulenia na światło) należy odpipetować 70 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej na grzbiecie języka. Trzymaj myszy w ciemności przez 20 minut, a następnie oświetl ich języki napięciem 37,5 J/^cm2 (7 minut z niniejszym urządzeniem).
8. W przypadku myszy z grupy C-L- (nieleczonych PS ani światłem) należy odpipetować 70 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej na grzbiecie języka i trzymać je w ciemności przez 27 minut.
9. Odzyskać C. albicans z języków wszystkich myszy natychmiast po leczeniu. Przetrzyj grzbiet języka przez 1 minutę sterylnym wacikiem.
10. Umieść każdy wymazówkę z próbką w probówce zawierającej 1 ml sterylnej soli fizjologicznej i wiruj przez 1 minutę w celu ponownego zawieszenia komórek drobnoustrojów.
11. Natychmiast wykonać 10-krotne seryjne rozcieńczenia w PBS i płytkę 25 μl podwielokrotności na płytkach SDA w dwóch egzemplarzach. Inkubować płytki w warunkach tlenowych w temperaturze 37 °C przez 48 godzin.
12. Po 48 godzinach użyj cyfrowego licznika kolonii (patrz Tabela materiałów), aby określić liczbę kolonii drożdży. Obliczyć obciążenie C. albicans (jtk/ml) dla każdego zwierzęcia.
13. Przekształć wartości jtk/ml w log₁₀ i przeanalizuj je prawidłowo, zgodnie z projektem eksperymentu i założeniami dotyczącymi danych.
    UWAGA: W niniejszym dochodzeniu użyto jednoczynnikowego testu ANOVA Welcha i testu post-hoc Gamesa-Howella (α = 0,05)¹⁶.

5. Analizy histopatologiczne

1. W ósmym dniu znieczulić myszy ketaminą w dawce 100 mg/kg w połączeniu z ksylazyną w dawce 10 mg/kg we wstrzyknięciu dootrzewnowym i poddać je eutanazji za pomocą przedawkowania ketaminy (200 mg/kg podawanej dootrzewnowo). Potwierdź zgon, sprawdzając, czy nie ma ruchów oddechowych (bezdech) i nie ma bicia serca (asystolia).
2. Ostrożnie uszczypnij język i wyciągnij go z pyska zwierzęcia. Za pomocą ręcznego skalpela wykonaj nacięcie przed brodawkami okołowymi, aby chirurgicznie usunąć cały język, nie powodując żadnych obrażeń w przedniej i środkowej części.
3. Utrwal język w 10% buforowanej formalinie (pH 7,2-7,4) na 24 godziny i myj go pod bieżącą wodą przez 2 godziny.
4. Kontynuuj włączanie do procesu parafinowego: odwodnienie, klarowanie i impregnacja^10,14.
5. Wyciąć odcinki szeregowe (o grubości 5 μm) za pomocą mikrotomu, a następnie przymocować sekcje do szkiełek podstawowych. Przystąp do barwienia tych skrawków za pomocą kwasu okresowego Schiffa i hematoksyliny (PAS-H) do badania histopatologicznego i identyfikacji grzybów poprzez obserwację pod mikroskopem świetlnym.
6. Poproś patologa, najlepiej ślepego na badane grupy, aby zbadał reakcję tkanek spowodowaną zakażeniem C. albicans.
7. Opisz charakterystykę histologiczną tkanki (nabłonka i tkanki łącznej), zwłaszcza miejscowe reakcje zapalne o różnym nasileniu.

Mysi model OC pokazał typowe białe plamy i pseudobłony na języku wszystkich zainfekowanych myszy (Rysunek 4A). C. albicans odzyskany od zwierząt C-L- potwierdził kolonizację tkanek przez ten mikroorganizm (wartości wahały się od 1,62 x 104 do 4,80 x 105 CFU/ml). Zgodnie z oczekiwaniami, zwierzęta z grupy NCtr nie wykazywały żadnych zmian tkankowych ani wzrostu kolonii po pobraniu próbki (Rysunek 4B).

aPDT zmniejszyło żywotność C. albicans, gdy kurkuminoidy były używane w temperaturze 80 μM do fotouczulenia (Rysunek 5). Średnia redukcja log10 osiągnięta przy aPDT za pośrednictwem 80 μM PS wynosiła 2,47 w porównaniu z grupą C-L- (p = 0,008).

Liczba kolonii C. albicans odzyskanych z języków myszy nie różniła się znacząco między myszami leczonymi kurkuminoidami bez oświetlenia (grupy C+L-), myszami leczonymi światłem, ale wcześniej nie światłoczułymi (grupy C-L+) i myszami nieleczonymi (grupa C-L-) (p ≥ 0,210).

Cechy histologiczne języków niezakażonych zwierząt (NCtr) wykazały normalne/zdrowe tkanki, w tym nienaruszoną blaszkę właściwą, błonę podstawną i brodawki nitkowate (Rysunek 6A). Natomiast podczas badania obrazów histopatologicznych języków myszy z grupy C-L- było oczywiste, że drożdże i włókna były obecne w zrogowaciałej warstwie nabłonka, chociaż nie było nacieku grzybów. W leżącej poniżej tkance łącznej zaobserwowano łagodną reakcję zapalną, w której pośredniczą głównie komórki jednojądrzaste, a brodawki nitkowate były wyraźnie nieobecne (Figura 6B). Analiza histologiczna języków myszy zarówno w grupie C+L- jak i C-L+ wykazała podobne cechy. W przeciwieństwie do tego, odcinki języka myszy leczonych 80 μM kurkuminoidem aPDT ujawniły zmniejszoną liczbę komórek grzybów, głównie ograniczoną do zrogowaciałej warstwy nabłonka (Ryc. 6C).

Rysunek 1: Struktura chemiczna fotosensybilizatora. Struktura chemiczna mieszaniny soli rozpuszczalnych w wodzie stosowanych jako fotouczulacz, składającej się w 53,4% z naturalnej kurkuminy i 46,6% z innych kurkuminoidów (demetoksykurkuminy i bis-demetoksykurkuminy). Ostateczna średnia masa cząsteczkowa wynosi 730,32 g/mol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Harmonogram protokołu dla mysiego modelu kandydozy jamy ustnej i aPDT. Oś czasu przedstawiająca protokół mysiego modelu kandydozy jamy ustnej i przeciwdrobnoustrojowej terapii fotodynamicznej (aPDT). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Oświetlenie języków myszy po fotouczuleniu.Po fotouczuleniu (inkubacji zakażonej tkanki za pomocą fotouczulacza), języki zostały oświetlone pod ciśnieniem 37,5 J/cm2 za pomocą niebieskiego (~455 nm) światła LED. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Białe zmiany w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. (A) Reprezentatywne obrazy przedstawiające białe zmiany obserwowane w mysim modelu kandydozy jamy ustnej. (B) Kontrola ujemna (niezakażona). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Candida albicans odzyskała zdrowie z języków myszy. Dane reprezentują średnie wartości ± odchylenie standardowe logarytmu10 (jtk / ml) z grup leczonych. Jednoczynnikowa ANOVA Welcha wykazała, że efekty leczenia były statystycznie istotnie różne między grupami (p < 0,001). Różne małe litery (a, b, c) obok średnich wskazują na statystycznie istotne różnice według testu Gamesa-Howella (p≤ 0,030). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Reprezentatywne obrazy histologicznych odcinków języków myszy. Histologiczne skrawki języków myszy wybarwiono PAS-H, a obrazy uchwycono 200x. (A) Myszy kontrolne ujemne bez indukowanej kandydozy jamy ustnej, fotouczulenia i oświetlenia (grupa NCtr). (B) Myszy z indukowaną kandydozą jamy ustnej, nieuczulone na światło ani nie wystawione na działanie oświetlenia LED (grupa C-L). (C) Zwierzęta z indukowaną kandydozą jamy ustnej, narażone na kurkuminoidy o sile 80 μM i oświetleniu LED 37,5 J/cm2 (grupa C+L+ 80). Podziałka = 100 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Grupy eksperymentalne. Wykaz grup eksperymentalnych wykorzystanych w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

C. albicans has been associated with oral and esophageal infections in individuals with an immunocompromised state, diabetes mellitus, prolonged use of antibiotics, and poor oral hygiene^1,3. The study of human infectious diseases requires both in vitro and in vivo investigations before clinical trials can be safely and accurately designed. The present study describes a method for establishing a murine model of OC, which can be used to evaluate the pathogenesis of oral infections by C. albicans and the efficacy of antifungal approaches^{15,16,17,18,19}.

The murine model of OC employed here was successfully established, as evidenced by the substantial fungal load recovery from lesions as well as by the characteristic infection features observed in the macroscopic and histopathological analyses of the tongues of infected mice. Many studies have used similar murine models of OC. In such models, female mice are immunosuppressed and inoculated with C. albicans, resulting in lesions on the tongue^{10,13,14,15,20,21}. Immunosuppression with prednisolone, a glucocorticoid, inhibits the activity of neutrophils against C. albicans²². In this study, female mice were immunosuppressed with two subcutaneous injections of prednisolone, one day prior to and three days after infection with C. albicans¹³. In addition, the administration of tetracycline in drinking water during the course of the experiment caused oral dysbiosis by disturbing oral bacteria and helping C. albicans to thrive^23,24. Furthermore, the sedation caused by the intramuscular injection of chlorpromazine chloride prevented the animals from drinking water and eating immediately after inoculation. Thus, fungal cells stayed in contact with the dorsum of the tongue for a longer time, enabling the development of germ tubes and the transition from yeasts to filaments (hyphae and pseudohyphae), which are the pathogenic morphologies of C. albicans that can invade the human epithelium. Teichert et al.²⁵ used an immunodeficiency protocol to induce OC in mice and recovered only 2 x 10² CFU/mL of C. albicans.

While Totti et al.²⁶ utilized sialoadenectomized mice and conducted four separate inoculations with a C. albicans suspension, it's noteworthy that, in their case, the infection was not sustained in most animals over the course of the experiment. In contrast, in the present study, the inoculation with fungal cells was carried out only once, and it resulted in the recovery of 10⁴ CFU/mL of C. albicans from the oral cavity. This study employed the murine model of candidiasis described by Takakura et al.¹³, who performed oral inoculation with a clinical strain isolated from a patient with cutaneous candidiasis (10⁶ CFU/mL). Three to seven days post-inoculation, 10⁵-10⁶ CFU/mL of C. albicans were recovered from the oral cavity of mice¹³. The differences between the method of Takakura et al.¹³ and this study include the use of different fungal concentrations in the inoculum (this study used 10⁷ CFU/mL of C. albicans) and different C. albicans strains for oral inoculation (the reference strain ATCC 90028 was used here). Carmello et al.²⁰ employed a similar protocol, which involved using immunosuppressed animals. However, they administered two additional subcutaneous injections of prednisolone to the animals on days 1, 5, 9, and 13 of the experiment. Their study revealed a positive correlation between the scores assigned to the oral lesions of the infected animals and the number of CFU/mL over a period ranging from 5 to 16 days post-infection. It has been well-established in previous research that it is crucial to closely monitor animals under anesthesia to prevent hypothermia. Additional maintenance doses of ketamine should be administered with discretion, only when necessary²⁷.

Regarding the efficacy of aPDT application, the results showed that the irradiation of tongues previously treated with an 80 µM curcuminoid salt mixture caused a significant reduction (2.47 log₁₀) in the viability of C. albicans. Histological analyses revealed that sections from tongues treated with 80 µM curcuminoid-mediated aPDT showed a reduced number of fungal cells, which were limited to the keratinized layer, and a low inflammatory response. It is worth emphasizing that an inflammatory response was detected in all mice that were infected with C. albicans. This observation implies that the inflammation observed in all the aPDT groups might be linked to Candida infection rather than being attributed to aPDT, a consistent finding in line with our prior investigations^10,13,14,15.

Previous investigations used CUR, methylene blue, and photodithazine (PDZ) as PSs and obtained promising results^{10,20,24,25,27}. In a similar study¹⁰, a combined exposure to CUR and LED light caused a significant reduction in the viability of C. albicans; however, the use of 80 µM CUR and light reduced fungal viability by 4.0 log₁₀. Dovigo et al.¹⁰ used only CUR as PS, whereas we used a salt containing the three main curcuminoids from C. longa. When CUR (260 µM) and LED light were used for five consecutive days in the treatment of oral candidiasis in mice, the authors observed a reduction of 1.11 log₁₀ in fungal viability²¹. When methylene blue was used as PS at 450 µg/mL and 500 µg/mL, aPDT totally eradicated C. albicans from the oral cavity of mice²⁵. Moreover, when aPDT was mediated by PDZ (100 mg/L), a 3.0 log₁₀ reduction and complete remission of oral lesions were observed²⁰. In addition, aPDT increased TNF-α expression in comparison with that in the untreated group²⁰. In a study where a fluconazole-resistant strain was used, aPDT mediated by PDZ (200 mg/L) promoted a reduction equivalent to 1.3 log₁₀²⁷. Moreover, the combination of aPDT with nystatin resulted in a substantial reduction in fungal viability, amounting to a decrease of 2.6 log₁₀, along with notable improvements in oral lesions and a reduction in the inflammatory response²⁷. Collectively, these studies provide compelling evidence for the effectiveness of aPDT in reducing fungal burden within the murine model of oral candidiasis, underscoring its potential as a clinical treatment option due to its antimicrobial efficacy without causing harm to host tissues.

In conclusion, the murine model of OC used in this study is appropriate for mimicking infection and evaluating aPDT efficacy. As a limitation, the OC model used here employed only one reference strain of C. albicans (other strains, clinical isolates, and non-albicans Candida species were not evaluated). In addition, the corticosteroid-induced immunosuppression used in mice to develop oral infection may not mimic other immunodeficiency states, such as that due to HIV infection. There may also be differences in the host conditions for developing OC, such as the oral microbiota of mice and humans. This protocol should be expanded further to evaluate mixed biofilms formed by more than one species or by different strains from the same species. Furthermore, keeping mice adequately sedated and preventing hypothermia while avoiding anesthesia-related mortality are the most difficult steps of the protocol.