Artykuł metodologiczny

Optymalizacja modelu mysiego z zapaleniem przyzębia indukowanego ligaturą do badań przedklinicznych

DOI:

10.3791/65908

⸱

30 kwietnia 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Comprehensive Care, Department of Periodontology, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric and Public Health, Adams School of Dentistry, University of North Carolina at Chapel Hill, 3Department of Epidemiology, Gillings School of Global Public Health, University of North Carolina at Chapel Hill, 4Department of Applied Physical Sciences, University of North Carolina at Chapel Hill, 5Department of Biostatistics and Health Data Science, School of Medicine, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Model myszy wywołany przez więzanie przyzębia jest skutecznym i coraz popularniejszym narzędziem do badania chorób przyzębia. Przedstawiono szczegółowe wskazówki dotyczące wdrożenia uproszczonej wersji modelu skupionej na interproksymalnym niszczeniu kości pęcherzykowej, w tym projektowaniu badań laboratoryjnych, produkcji narzędzi drukowanych w 3D oraz kwantyfikacji kości za pomocą analizy μCT.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymentalny model przyzębia indukowanego przez wiązanie u myszy odegrał fundamentalną rolę w zrozumieniu patogenezy chorób przyzębia; jednak nie została w pełni wykorzystana do zastosowań translacyjnych i terapeutycznych. Podobnie jak u ludzi, zapalenie przyzębia wywołane wiązaniem u myszy rozwija się w wyniku serii odrębnych zdarzeń mikrobialnych, zapalnych i osteoimmunologicznych. Zniszczenie kości wynosowej wywołane przez więzy przebiega w stosunkowo krótkim czasie i jest łatwe do mierzenia, co czyni go opłacalnym modelem choroby w badaniach przedklinicznych.

Aby pokonać techniczne wyzwanie klasycznego modelu ligatury, opracowano uproszczony model myszy indukowany przez ligaturę z zapaleniem przyzębia. Zamiast wywoływać chorobę na całym obwodzie dwóch sąsiednich zębów, uproszczony model choroby koncentruje się na niszczeniu kości zapalnej tylko w okolicy międzykroksymalnej dwóch tylnych zębów, która jest również obszarem, który u ludzi inicjuje typowa choroba przyzębia. Ponieważ wykorzystuje trójwymiarowe (3D) narzędzia do umieszczania ligatur, podejście jest szybkie i skuteczne, co pozwala na czas proceduralny 5-10 minut na każdą mysz. Podczas gdy sygnalizacja osteoklaszogenna wykrywana jest po 3 dniach od założenia ligatury, degradacja kości rozwija się konsekwentnie po 9 dniach od podwiązania.

Tutaj protokół uproszczonego modelu ligatury rozwijany jest poprzez podkreślenie ważnych elementów specyficznych dla projektowania badania (tj. obliczanie mocy, standaryzacja procedur, kalibracja), opracowanie narzędzi drukowanych w 3D (np. "myszy łóżko dentystyczne" i "uchwyt na ligaturę") oraz kwantyfikacji kości pęcherzyka za pomocą analizy μCT. Ekspresja genów dziąseł Ranka, Rankla i Opg, głównej regulacji osteoklastogenezy, jest wykorzystywana jako pośredni dowód na skuteczność terapeutyczną. Metody przedstawione w niniejszym artykule będą kierować badaczami wdrażaniem uproszczonego modelu przyzębia indukowanego przez ligaturę, aby testować innowacyjne terapie przyzębia w warunkach przedklinicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroba przyzębia to złożony proces zapalny, który prowadzi do zniszczenia struktur podtrzymujących zęby, w tym dziąsła, więzadła przyzębia, cementu oraz kości pęcherzykowej. Aby doszło do utraty kości przyzębia, konieczne jest zerwanie bariery dziąseł i inwazja bakterii, oprócz rekrutacji komórek zapalnych oraz przejścia od wrodzonej dominacji do nabytej odpowiedzi immunologicznej1. Ostateczna nierównowaga między osteoblastami a osteoklastami prowadzi do utraty kości pęcherzyka w wyniku jej niszczenia2. Charakterystycznym odkryciem fenotypowym, które odróżnia diagnozę choroby przyzębia od odwracalnego zapalenia dziąseł (zapalenia dziąseł), jest utrata kości pęcherzykowej pęcherzyka. Dlatego ilość kości pęcherzykowej podtrzymującej zęby jest kluczowym efektem terapeutycznym w warunkach przedklinicznych.

Żaden pojedynczy model zwierzęcy nie jest w stanie odtworzyć wszystkich biologicznych aspektów niezbędnych do opracowania różnych terapii 3,4,5. Model myszy wywołany ligaturą z zapaleniem przyzębia pozwala na mierzalne zniszczenie kości w stosunkowo krótkim czasie (3-9 dni)5, co czyni go opłacalnym modelem do testowania nowych interwencji terapeutycznych zapobiegających i modulujących zapalenie przyzębia. Pomimo sukcesu we wspieraniu rozwoju badań klinicznych fazy II-III na ludziach 6,7,8,9,10, zapalenie przyzębia wywołane ligaturą u myszy rzadko jest wykorzystywane jako model przedkliniczny. Aby przezwyciężyć techniczne wyzwania klasycznego modelu, w którym ligatura otacza ząb, opracowano uproszczony model myszy indukowany przez ligaturę z zapaleniem przyzębia11,12. Prosta modyfikacja klasycznego modelu koncentruje się na skupionym miejscu zniszczenia kości, pomiędzy zębami, a nie wokół nich. Korzyści z tej modyfikacji są liczne, w tym krótsze oczekiwanie na 1) szkolenie personelu, 2) techniczną łatwość przeprowadzenia procedury eksperymentalnej oraz 3) powtarzalność kwantyfikacji kości. Dodatkowo odkryto, że wiele mikrobiologicznych i immunologicznych zdarzeń, które rozwijają się i manifestują w tym uproszczonym modelu, są zgodne z obecnym rozumieniem powszechnej ludzkiej choroby przyzębia 2,11,12,13. Na koniec, skuteczna zapobiegawczość utraty kości wywołana lekami, wcześniej opisana przeznas 2,14, dodatkowo wspiera wykorzystanie uproszczonego modelu przyzębia wywołanego wiązaniem jako narzędzia in vivo do oceny kluczowych aspektów nowych terapii przyzębia.

Innowacyjnym aspektem uproszczonego modelu zapalenia przyzębia wywołanego wiązaniem było opracowanie narzędzi drukowanych w 3D, które ułatwiają proces indukcji choroby11,12. Choć dla niektórych jest to intuicyjne, badacze zgłaszają niemożność złożenia narzędzi drukowanych 3D15, co może dodatkowo utrudniać lub opóźniać rozpoczęcie badań na zwierzętach. Niniejsze badanie rozwija informacje przedstawione w naszym poprzednim badaniu protokołu11i dostarcza szczegółowych informacji umożliwiających pomyślne wdrożenie uproszczonego modelu przyzębia indukowanego przez ligaturę w warunkach laboratoryjnych. Szczegóły zawarte w obecnym protokole są częścią złożonego zestawu czynników, które mogą przyczyniać się do braku powtarzalności wyników wyników 15,16,17. Konsekwentne stosowanie modeli i niezawodna resorpcja kości zidentyfikowane w wielu badaniach 2,11,12,14,18 oraz przez zespoły badawcze 13,19,20,21 w ciągu ostatnich 10 lat podkreślają znaczenie przekazywania szczegółowych informacji w celu promowania powtarzalności w środowisku naukowym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten był zgodny z wytycznymi Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE)22,23. Wszystkie procedury eksperymentalne opisane w tym protokole zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill.

1. Projektowanie eksperymentalne

  1. Obliczanie wielkości próbki
    UWAGA: Ze względu na translacyjny charakter programu badawczego, przedstawione tutaj obliczenia mocy opierają się na pomiarach kości pęcherzyka pęcherzyka u dzikich myszy typu C57Bl6 w wieku 8-12 tygodni.
    1. Przeanalizuj kość na podstawie liniowych pomiarów między połączeniem cementowo-szkliwo a grzebieniem kości pęcherzyka (CEJ-ABC).
      1. Zdrowe myszy mają średni poziom przyczepności (lub pomiar CEJ-ABC) na poziomie 0,2 mm, podczas gdy myszy z zapaleniem przyzębia w 9-dniowym okresie po ligacji mają dwukrotnie wyższy poziom (odległość CEJ-ABC 0,4 mm)111. Utrata kości pęcherzykowa nie wzrasta istotnie od 9 do 18 dni po założeniu więźni11.
      2. Wykonaj analizę obliczeń mocy na podstawie tego rozmiaru efektu, aby określić liczbę myszy potrzebnych do ujawnienia różnic między zdrowiem a chorobą (tutaj łącznie 8-10 myszy [Rysunek 1A]).
        UWAGA: Moc została obliczona, aby uzyskać potęgę między 0,8 a 0,95, α = 0,05, przy użyciu średniej potęgi z dwóch prób. Średnie grupowe i odchylenia standardowe przedstawiono na Rysunku 1B.
    2. Aby określić terapeutyczny wpływ na utratę kości, wykonaj inne obliczenia mocy. Zamiast porównywać zdrowe myszy z chorymi myszami, ponieważ zarówno grupy eksperymentalne, jak i kontrolne u myszy rozwijają zapalenie przyzębia w tym protokole, należy zarezerwować od 19 do 31 myszy na grupę, aby zapewnić powtarzalność wyników podczas testowania modulacji utraty kości za pomocą uproszczonego modelu mysiego z powodu więzania indukowanego przez więzanie (patrz reprezentatywne wyniki i rysunek 1C).
      UWAGA: Moc została obliczona według tego samego testu opisanego powyżej. Średnie grupy i odchylenia standardowe przedstawiono na Rysunku 1D.
  2. Standaryzacja procedur i kalibracja personelu
    1. Przeszkol i kalibruj wszystkich pracowników zaangażowanych w indukcję i ilościową diagnostykę przed rozpoczęciem badań (interkalibracja i intrakalibracja; r2 ≥ 0,90).
      UWAGA: Szacuje się, że szkolenie w zakresie zakładania więzań i ilościowego określania utraty kości wymaga okresu 2-3 miesięcy (oś czasu przedstawiona w Tabeli 1). Pozostałe wymagane kroki przedstawiono w formie osi czasu w Tabeli 1.
    2. Do procedury zakładania więzów dwóch wykwalifikowanych badaczy pracujących razem w sali proceduralnej. Głównym badaczem (wewnątrz- i międzykalibrowanym) pozostaje operatorem, który zakłada ligatury.
    3. Niech drugi badacz pracuje jako asystent proceduralny i wykonuje poniższe kroki:
      1. Rejestruj wagę myszy.
      2. Włóż mysz do pudełka z znieczulaniem.
      3. Przed przekazaniem myszy do "łóżeka zębowego" należy nałożyć mysz maść na oczy przed podanie myszy do umieszczenia jej w "łóżeczku dentystycznym".
      4. Upewnij się, że ≥3 "uchwyty na ligatury" są odpowiednio załadowane i gotowe do użycia.
        UWAGA: Aby zwiększyć efektywność, najlepiej jest mieć ≥3 "uchwyty na ligatury" odpowiednio załadowane do użytku przez operatora. Zaleca się szybkość (czyli czas działania 5-10 minut na mysz), co zwiększa liczbę przeprowadzanych eksperymentów dziennie i zmniejsza potencjalne efekty partii.
      5. Wykonuj monitorowanie myszy (przed i po zabiegu).
        UWAGA: Zapalenie przyzębia wywołane wiązaniem to nieinwazyjny, niechirurgiczny zabieg podobny do nitkowania zęba ludzkiego. Zakładanie ligatury powinno powodować bardzo łagodny dyskomfort u myszy (głównie z powodu nagromadzenia bakterii między dwoma zębami), ale nie powinno wymagać stosowania środków przeciwbólowych. Po założeniu więzy przeprowadzonym przez wykwalifikowaną osobę nie oczekuje się powikłań. Wszystkie zwierzęta są monitorowane co 2-3 dni po założeniu więzy. Punkty końcowe dla osób z użyciem humanitarnych (np. brak pielęgnacji lub karmienia, niemożność wstawania lub chodzenia, ciężkie oddychanie, martwicze lub zakażone rany) powinny być wymienione w zatwierdzonym protokole dotyczącym zwierząt, ale w przypadku wystąpienia powikłań należy skonsultować się z personelem weterynaryjnym w sprawie odpowiednich działań.

2. Tworzenie drukowanych narzędzi wywołujących ligaturowe zapalenie przyzębia u myszy

UWAGA: Aby zoptymalizować rozmieszczenie ligatur, opracowano narzędzia drukowane w 3D o nazwach Mouse Dental Bed oraz Ligature Holder , składające się z kilku indywidualnych elementów drukowanych w 3D, które są osobno drukowane i ręcznie składane. Specyfikacje planów tych urządzeń zostały wcześniej opublikowane11 i mogą być wykorzystywane przez doświadczonych badaczy do tworzenia indywidualnych plików STL. Nowe urządzenia w obecnym badaniu zostały stworzone we współpracy z Centrum Projektowym BeAM Uniwersytetu Karoliny Północnej w Chapel Hill. Materiały można pozyskać w odpowiednim głównym ośrodku lub wydrukować w 3D za pomocą plików STL w Pliku Uzupełniającym 1.

  1. Myszy łóżko dentystyczne
    1. Wydrukuj łożysko dentystyczne myszy (rysunek 2A) i uchwyt na ligaturę (rysunek 2B) za pomocą standardowej jakości druku na drukarce 3D z użyciem filamentu 3,0 mm z kwasem polimlekowym (PLA). Drukuj stół dentystyczny w zaprojektowanej orientacji, a pozostałe części z jednolitymi, płaskimi powierzchniami skierowanymi w dół względem stołu drukującego. Aktywuj opcję materiału pomocniczego , włączając ustawienie Ustawienia Wsparcia. Upewnij się, że materiał nośny dotyka płyty roboczej jako pierwszy, wybierając opcję Dotykanie płyty roboczej.
      UWAGA: Użyj pięciu plików STL w Pliku Uzupełniającym 1 , aby wydrukować wszystkie wymagane elementy, w tym odłączoną rurkę, ligaturę (z nacięciem), łóżko dentystyczne myszy (z nacięciami), pokrywę oraz blokadę uchwytu na ligaturę. Zobacz Tabelę materiałów , aby poznać wymiary każdego przedmiotu (specyfikacje planów przedstawionewcześniej 10).
    2. Po zakończeniu druku przycinaj wszelkie wydrukowane elementy nośne z modeli za pomocą obcinaczy do drutu, szczypiec z igłami lub innego instrumentu.
      UWAGA: Podczas tego zabiegu należy nosić okulary ochronne.
  2. Zespół łóżka dentystycznego dla myszy
    1. Aby przygotować łożysko dentystyczne myszy, rozłóż wszystkie części zgodnie z rysunkiem 3A i przygotuj klej do użycia (Rysunek 3B).
    2. Nałóż kilka kropel kleju (rysunek 3C) i przymocuj śruby tak, jak pokazano (rysunek 3D). Ponownie przygotuj się do przeniesienia kleju (rysunek 3E) na miejsca, gdzie zostanie nałożony. Wsuwaj szczelinę drukowanej rurki (rysunek 3F) tak, że kolczasty koniec jest skierowany tyłem od łóżka dentystycznego Myszy (tam podłącza się wąż do dostarczania izofluranu).
    3. Zabezpiecz elementy stabilizujące głowicę w pozycjach klejem (rysunek 3F).
    4. Zetrzyj nadmiar kleju i utrzymuj lekki nacisk na wszystkie wkładane elementy, aby dobrze się przymocować (Rysunek 3F).
  3. Regulacje uchwytu na ligaturę
    1. Aby zmniejszyć dyskomfort podczas blokowania/odblokowywania mechanizmu, upewnij się, że wszystkie kwadratowe/ostre krawędzie zewnętrznej części zamka uchwytu na ligaturę (rysunek 4A) są lekko fazowane pod kątem 45° przy użyciu rękojeści skalpela 15C, nr 3 z ostrzem 15C.
    2. Aby zapewnić ścisłe dopasowanie mechanizmu blokującego do uchwytu ligatury, wyprostuj wszystkie wewnętrzne, zaokrąglone narożniki zamka na utrzymanie ligatury (rysunek 4B-F) za pomocą skalpela skalpela 15C.
      UWAGA: Pozwala to zamkowi całkowicie ołożyć się z uchwytem na ligaturę i wymaga jedynie drobnych regulacji.
      1. Użyj narzędzia do przycinania druku 3D lub skalpela 15C, aby usunąć "błysk" pozostały na górnej i dolnej krawędzi nawet po usunięciu większości podpor, a krawędzie lekko skośnie pod kątem 45° (podobnie jak w przypadku blokady uchwytu ligatury w kroku 1), aby zapewnić precyzyjny zaryw.
        UWAGA: Nie zdejmuj zbyt dużej ilości materiału, ale tylko tyle, by zamek mógł się wsuwać bez oporu.
    3. Jeśli jest zbyt cienka, przytnij długość każdego końcówki aż do uzyskania grubszego przekroju [co najmniej 0,5 mm], zapewniając, że między końcówkami pozostaje wystarczająco dużo miejsca, aby nie obciążać podniebienia podczas zakładania ligatur. Po cięciu upewnij się, że końcówki mają co najmniej 3 mm długości (rysunek 5A, pokazany przez "CIĘCIE").
    4. Na końcówkach uchwytu na ligaturę usuń wszelkie błyski z "podpory", na której wydrukowano narzędzie, aby upewnić się, że boki końcówek są płaskie (rysunek 5B, strzałka).
    5. Wytnij "cięcie" z boku każdego końcówki pod kątem 45°, aby łatwiej było obciążyć ligaturę na nim, a także zmiękczyć krawędzie, by zapobiec urazom tkanek miękkich (rysunek 5C, oznaczony strzałkami).
    6. Upewnij się, że każdy koniec uchwytu na ligaturę zawiera wcięcie w kształcie litery "V", w którym mogą spoczywać jedwabne ligatury szwowe. Jeśli został usunięty w kroku 2.3.6, ponieważ początkowy wydrukowany grot był zbyt cienki, dopracuj go na wydruku lub odtworz.
      1. Jeśli widoczny jest ten wcięcie w kształcie litery "V", połóż uchwyt na ligaturę na płaskiej powierzchni z obiema końcówkami równolegle do blatu, delikatnie umieść ostrze skalpela 15C u podstawę nacięcia i delikatnie kołysz ostrzem na boki tak, aby krawędź ostrza pozostawała u podstawy litery "V", a bok ostrza dotykał górnych ścianek litery "V". Gdy ostrze znajduje się u podstawy nacięcia, bardzo ostrożnie skieruj ostrze w stronę zewnętrznej powierzchni końcówki i powtórz ten ruch, aby dopracować podstawę nacięcia w kształcie litery "V" na zewnętrznej krawędzi, co ułatwi prowadzenie nici szwowej na miejsce.
        UWAGA: To kołysanie powoduje wystarczający ruch filamentu, by przesunąć go na bok i wyciąć nacięcie bez usuwania nadmiernej ilości materiału.
      2. Jeśli ten wcięcie w kształcie litery "V " nie jest widoczne, połóż uchwyt na ligaturę na płaskiej powierzchni z obiema końcówkami prostopadle do blatu stołu. Patrząc prosto w dół wzdłuż obu końcówek uchwytu na ligaturę, umieść ostrze skalpela 15C na środku końcówek i jednym celowym ruchem wykonaj płytkie cięcie, tworząc początek tego, co ostatecznie stanie się wcięciem w kształcie litery "V".
        UWAGA: Często łatwiej jest wykonać ten ruch na każdym końcówce osobno, niż próbować ustawić ostrze we właściwym miejscu na obu końcówkach jednocześnie.
      3. Powtórz krok 2.3.7.2, jeśli trzeba, upewniając się, że krawędź ostrza skalpela zawsze wraca w to samo miejsce na środku końcówki.
        UWAGA: Jeśli ostrze nie cofa się w to samo miejsce, wykona się wiele cięć, co spowoduje rozwarstwienie filamentu w tych miejscach i może obniżyć wydajność narzędzia.
        UWAGA: Głębokość nacięcia w kształcie litery "V" należy okresowo sprawdzać za pomocą wiązanej ligatury z jedwabiu wiązanego, aby sprawdzić, czy ligatura się trzyma, czy ciągle się zsuwa (co może wskazywać na konieczność dalszego dopracowywania). Uchwyt musi być wydrukowany tak, że wycięcie skierowane jest w dół na płycie roboczej, a blokada uchwytu ligatury skierowana tak, że szerszy otwór dotyka płyty roboczej. Ponownie, materiały nośne można używać z ustawionym Ustawieniem Wsparcia tylko na Dotykanie Płyty Roboczej.
  4. Montaż uchwytu na ligaturę
    UWAGA: Po dokonaniu modyfikacji złóż uchwyt ligatury i sprawdź następujące kwestie:
    1. Gdy ligatura jest zablokowana, upewnij się, że blokada zaciska nitkę do uchwytu na ligaturę (nie widocznego na rysunku 6A jako pokazanego strzałką, ale widocznego na rysunku 6B) na górze lub dole zamka (oba te elementy, jeśli to możliwe, choć może to być trudne do osiągnięcia).
      UWAGA: To tarcie zapewni, że ligatura nie wyślizgnie się z miejsca.
    2. Podczas wkręcania ligatury w rowki uchwytu na ligaturę, jeśli ciągle wysuwa się z końcówek, pogłębij rowki lub przedłuż je dalej na zewnątrz końcówki, tworząc "ścieżkę", w której będzie się znajdować nić.
    3. Sprawdź, czy oba węzły są wyśrodkowane (rysunek 6C) i poziome (prosta linia na rysunku 6D) patrząc z przodu uchwytu na ligaturę; Jeśli nie, to jeden rowek jest głębszy od drugiego.
    4. Sprawdź, czy ligatura znajduje się tuż w tych wcięciach i czy nie jest zbyt głęboka; w przeciwnym razie istnieje zwiększone ryzyko, że czubek uchwytu ligatury zetknie się z tkankami miękkimi i spowoduje uraz podczas zakładania ligatury.
    5. Za pomocą dentystycznej eksploratora (rysunek 6E) potwierdz, że ligatura odbija się z powrotem na miejsce bez ślizgania się, gdy delikatna siła jest przyłożona między węzłami (symuluje to siłę, jaką odczuwa podczas zakładania wiązki).

3. Umiejscowienie więźni

UWAGA: Możliwe jest, aby ligatury były umieszczane między myszymi zębami, niezależnie od dodatku ludzkich patogenów przyzębia11. Analiza zależna od czasu składu mikroorganizmów ligatury (bez uzupełniania z ludzkimi gatunkami bakterii) wykazała przesunięcie społeczności mikrobiomu (dysbioza) podczas rozwoju przyzębia12. Z tego powodu wymiana więźni nie jest zalecana, ponieważ może wpłynąć na powtarzalność wyników. Wprowadzenie gatunków bakteryjnych w połączeniu z ligaturą zależy od pytania poruszanego w konkretnym badaniu. Ze względu na przewidywaną utratę więzań10-15%, ligatury umieszcza się obustronnie w jednej myszy. Takie podejście minimalizuje utratę myszy podczas eksperymentu.

  1. Po znieczulonej znieczuleniu myszy za pomocą wdychanego izofluranu, umieść ją w znieczulonym łóżku dentystycznym z plecami opartymi o łóżko i nosem umieszczonym blisko stożka nosa.
    UWAGA: Myszy powinny być znieczulone przy użyciu izofluranu o stężeniu 4% (vol/vol). Vaporizator izofluranowy i tlen są filtrowane przez filtr powietrza o średnicy 0,2 μm. Po całkowitym znieczuleniu myszy i umieszczeniu jej w Mouse Dental Bed, należy ją utrzymywać z przepływem 1,5-2,5% przez stożek nosowy. Myszy monitoruje się mimowolnymi ruchami ciała i tempem oddechu (~55-65 oddechów na minutę). Myszom wywołanym zapaleniem przyzębia nie jest wymagane podawanie leków przeciwbólowych, ponieważ jest to nieinwazyjny, niechirurgiczny zabieg podobny do nitkowania zęba ludzkiego. Zakładanie wiązek powinno powodować bardzo łagodny dyskomfort u myszy (głównie z powodu gromadzenia się bakterii między dwoma zębami), ale nie powinno wymagać stosowania środków przeciwbólowych. Po założeniu więzy przeprowadzonym przez wykwalifikowaną osobę nie oczekuje się powikłań.
  2. Użyj gumek recepturki, aby ustabilizować głowę myszy i otworzyć jej pysk.
    UWAGA: Opaska wokół siekaczy żuchwowych również cofa język, a napięcie jest bierne, by otworzyć szczękę bez ciągnienia. Wizualizacja trzonowców jest łatwiejsza, gdy źródło światła jest skierowane pod kątem, aby zapobiec zasłanianiu pola widzenia przez cienie. Łóżko zębowe myszy zostało zaprojektowane specjalnie dla uproszczonego modelu przyzębia indukowanego przez więzanie. Odległość między nosem myszy a czopkiem jest wymagana, aby umożliwić mysz niewielkie ruchy ciała podczas procedury eksperymentalnej. Ten ruch myszy pozwala na odpowiednie monitorowanie ruchu ręki operatora podczas używania uchwytu na ligaturę oraz kontroluje siłę użytą podczas jej zakładania. Zakładanie ligatury powinno zająć 5-10 minut na każdą mysz. Procedury powinny być wykonywane w dobrze wentylowanym okapie podczas przeprowadzania eksperymentów na zwierzętach
  3. Aby założyć ligaturę po prawej stronie, trzymaj uchwyt ligatury w prawej ręce, a explorer w lewej.
    UWAGA: Jeśli węzły na ligaturze nie są wyśrodkowane między końcówkami, lecz są bliższe jednemu końcówce, ligatura może być lepiej dopasowana do umieszczenia po konkretnej stronie. Na przykład, jeśli węzły są umieszczone bliżej prawego końca uchwytu na ligaturę, to ligatura może być łatwiejsza do umieszczenia po prawej stronie.
  4. Delikatnie umieść czubek eksploratora poniżej międzybliższego kontaktu pierwszego i drugiego trzonowca po stronie podniebiennej.
    1. Niech czubek explorera najpierw dotknie zębów, a następnie zsunie się w dół i opiera o dziąsło, aby nie urazić tkanek miękkich; Po prawidłowym ustawieniu oprzeć rączkę Explorer w poziomym kątu.
    2. Zanotuj, który koniec eksploratora służy do umieszczenia po prawej stronie, a który po lewej. Upewnij się, że czubek eksploratora zahacza o bliższy kontakt w kierunku górnym, pozwalając jednocześnie zgięciu trzonka położyć się po przeciwległej stronie, aby ustabilizować głowicę przed siłami reakcyjnymi podczas umieszczania.
  5. Używając uchwytu na ligaturę w poziomym kątu, cofnij policzek, najpierw ustawiając uchwyt nad międzykrócznym kontaktem między drugim a trzecim trzonowcem, dociskając krawędź uchwytu do policzka, aby go poruszyć, a następnie ustawiając uchwyt na styku między pierwszym a drugim trzonowcem.
    UWAGA: Ten krok pomaga zapewnić, że błona śluzowa nie zostanie uwięziona między wiązaniem a zębami, co mogłoby zakłócić ułożenie.
  6. Gdy ligatura zostanie ułożona na styku międzykrucialnym między pierwszym a drugim trzonowcem, obróć uchwyt uchwytu o 45° i za pomocą delikatnego kołysania i przesuwania przepchnij ligaturę przez kontakt.
  7. Przecinanie nadmiaru nici:
    1. Użyj cienkiej igły kleszczy, aby zapiąć nadmiar nici przymocowanej do węzła po prawej stronie, przeciągnij nić przez zęby w lewo, a nożyczkami lekko rozchylonymi przesuwaj nożyczki w dół nici, aż znajdą się ~1,5 mm od węzła, zanim przeciniesz.
      UWAGA: Pomaga to zmniejszyć ryzyko niezamierzonego urazu błony śluzowej podczas odcinania nadmiaru.
    2. Powtórz powyższe z odwróconymi kierunkami dla drugiego węzła.
  8. Wzoruj powyższe kroki z wersji 3.3. do 3.7.2. przy zakładaniu ligatury po przeciwnej stronie ust.
    UWAGA: Zaleca się pobieranie wiązań przy poświęceniu, ponieważ przesunięcie dysbiotyczne może być zmienione przez różne testowane warunki eksperymentalne12. Aby ułatwić pobieranie, myszy umieszcza się na łóżku dentystycznym dla myszy, wycina się jeden z węzłów więza, a następnie delikatnie usuwa się klatki piersiowe za pomocą kleszczy. Użycie łóża dentystycznego Mouse podczas pobierania ligatury zapewnia odpowiednią stabilność myszy i łatwy dostęp do miejsca wiązania.

4. Ilościowa destrukcja kości

  1. Analiza μCT
    1. Otwórz oprogramowanie i kliknij Plik | Importuj obraz...
    2. Kliknij Browse w menu wyskakującym oknem, przejdź do folderu zawierającego pliki Dicom dla jednego skanu i wybierz pierwszy plik.
    3. Kliknij na Eksakuj, aby znaleźć i zaznaczyć inne pliki w folderze, które należą do tego samego zeskanowanego przykładu. Kliknij OK.
    4. Po rozpoczęciu ładowania obrazu kliknij Visualize i Isosurface.
    5. Zmień próg obrazu na 5 000 , a współczynnik jakości powierzchni (%) na 55.
    6. Zaznacz pola Włącz wygładzanie obrazu i Clip Surface z aktualnym zwrotem z inwestycji i kliknij Aktualizuj.
    7. Dostosuj właściwości poziomu , klikając prawym przyciskiem myszy na Okno/Poziom na dole (Rysunek 7A) i klikając Edytuj właściwości okna/poziomu. Wybierz wartość gęstości kości , która jest standardowa dla wszystkich próbek. Aby stosować się do tego protokołu, użyj 2 000 , ale zmieniaj je w zależności od gęstości kości próbek i utrzymuj ją stałą przy wszystkich pomiarach.
    8. Manipulowanie samolotami:
      1. Używaj skrótów klawiaturowych I/J/K ukryj/pokaż dla trzech różnych płaszczyzn.
      2. Kliknij prawym przyciskiem myszy i przesuń kursor, aby powiększyć i oddalić.
      3. Naciśnij Shift , a następnie kliknij lewym przyciskiem, aby przesunąć ruch.
      4. Kliknij Slice , aby przesuwać i obracać płaszczyzny.
      5. Kliknij na środek płaszczyzny, aby przesunąć płaszczyznę do przodu/do tyłu lub umieść kursor w centrum wybranej płaszczyzny i używaj strzałek w górę i w dół, aby przesuwać płaszczyznę po kawałku.
      6. Kliknij na krawędź płaszczyzny, aby obrócić się wokół linii równoległej do tej krawędzi w centrum płaszczyzny.
      7. Kliknij na róg samolotu, aby obrócić się wokół niego.
    9. Zorientuj oś z (niebieska tablica na górze ekranu – z-slice) tak, aby powierzchnie/kształty wszystkich trzech zębów były widoczne jednocześnie (lub tak blisko, jak to możliwe) (Rysunek 7B).
    10. Przewiń tę samą płaszczyznę (niebieski panel na górze przekroju ekranu z), aby widoczne były korzenietrzonowców 1.i 2. (Rysunek 7C). Spróbuj wybrać punkt na tyle głęboko u korzeni, by cała otaczająca anatomia była widoczna, ale też tam, gdzie kanały wyglądają wyraźnie i w linii prostej.
      UWAGA: Płaszczyzna może wymagać obrotu, aby pionowo ustawić kanały.
    11. Ukierunkuj oś x (pionowa zielona linia w panelu z-splat) tak, aby była wyrównana z pierwiastkami policzkowymipierwszego i drugiego trzonowca (staraj się ustawić przez centralną część każdego korzenia/kanału, jeśli to możliwe; w przeciwnym razie wyrównaj się przez korzeń policzkowypierwszego trzonowca i dotokobukowy korzeń drugiegotrzonowca) (Rysunek 7D).
    12. Użyj orientacji przekroju x jako odniesienia do wyrównania wykroju y (pionowa niebieska linia w panelu wycięcia x).
      1. Wyrównaj wycinek y tak, aby był pionowo równoległy przez korzeń pierwszego trzonowca w panelu przekroju X (Rysunek 7E). Obróć płaszczyznę, aby ustawić pierwiastek pionowo. Zwróć uwagę, że niebieska linia przecina środek korzenia.
        UWAGA: W obszarach utraty kości (co jest przewidywalne w tym modelu) grzbiet pęcherzyka może mieć wadę; dlatego należy oszacować linię środkową korzenia, ponieważ otaczająca kość może nie być obecna, aby idealnie zdefiniować środek zębodołu.
    13. W panelu wycięcia y zmierz odległość od połączenia cementoenamelowego (CEJ) do grzbietu kości pęcherzyka (ABC), umieszczając kursor w najgłębszym punkcie rowka przy CEJ i naciskając 1, a następnie umieszczając kursor w najbliższym punkcie ABC i naciskając 2 , jak pokazano (rysunek 7F). Pierwszy punkt oznaczony jest niebieską strzałką, a drugi zielonym strzałką.
      1. Jeśli strzałki nie pojawiają się, dopóki nie zostaną wybrane oba punkty, wybierz je, najedź kursorem na pożądane obszary i naciśnij klawisze numeryczne na klawiaturze, bo samo kliknięcie myszką nie zadziała.
      2. Jeśli CEJ jest trudny do określenia, użyj klawiszy strzałek w górę i w dół, aby przewinąć sąsiednie fragmenty i potwierdzić jego lokalizację.
      3. Zmierz wiele punktów ABC, jeśli "najbliższy punkt" jest trudny do ustalenia, aby potwierdzić, że różnice pomiaru są niewielkie lub żadne.
        UWAGA: Aby potwierdzić, że wykonano prawidłowy pomiar, należy zobaczyć przecięcia przecinków x i z nad pożądanym pierwiastkiem oraz wizualnie potwierdzić pomiar w widoku 3D, ukrywając płaszczyzny (rysunek 7F).
  2. Ilościowa ekspresja dziąseł Rankl/Opg i Rankl/Rank
    1. Pobierz tkankę dziąseł zgodnie z opisaniem9.
      UWAGA: Najlepsze wyniki ekstrakcji RNA uzyskuje się na podstawie świeżych próbek tkanek, a oczyszczanie RNA musi być przetwarzane jak najszybciej.
    2. Ekstrakt tkanki dziąsłowej RNA poprzez ubijanie kulek przy użyciu wspomnianego zestawu i ceramicznych koralików. Postępuj zgodnie z instrukcjami w zestawie i przechowuj próbkę w temperaturze -80 °C do czasu analizy metodą qRT-PCR.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

aReprezentatywna analiza danych liniowych pomiarów kości pęcherzykowych u samic i samców myszy WT na poziomie wyjściowym (zdrowie) i 9 dni po ligacji przedstawiona jest na Rysunku 1A. Obliczenia mocy wskazują, że do wykrycia różnic między tymi grupami potrzeba łącznie 10 myszy (4-5 myszy w grupie), jeśli głównym wynikiem jest liniowy poziom kości mierzony przez μCT (rysunek 1B). Jednak obliczenie mocy w badaniach przedklinicznych wymaga, aby obie grupy myszy roz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie dostarcza wnikliwych informacji oraz szczegółowych, krok po kroku wskazówek dotyczących uproszczonego protokołu modelu myszy wywołanego ligaturą przyzębia, wcześniej przedstawionego10. Szczegóły zawarte w obecnym artykule mogą znacząco wpłynąć na powtarzalność i są wspierane przez doświadczenia grupy z tym konkretnym modelem myszy wywołanego ligaturą zapalenia przyzębia 11,12,13,18,19,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pliki STL użyte do stworzenia urządzeń drukowanych w 3D w poprzedniej publikacji9 są objęte umową praw autorskich z Uniwersytetem Karoliny Północnej w Chapel Hill ("UNC-Mouse Surgical Bed and UNC-Ligature Holder" UNC Ref. No. 18-0024). Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania przedstawione w tej publikacji zostały wsparte przez National Institute of Dental & Craniofacial Research przy National Institutes of Health w ramach numerów nagrody K01DE027087 (JTM) i R01DE032830 (JTM). Prace były również wspierane przez National Institute of Allergy and Infectious Diseases przy National Institutes of Health w ramach nagrody o numerze R01-AI153265 (KVS). Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne poglądy Narodowych Instytutów Zdrowia. Dodatkowo, przedstawione tutaj badania są również wspierane przez kod finansowy programu Fulbright/CAPES 001 (TA).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
OstrzeIntegra4-315CŁopatka 15C
Ceramiczne koralikiVWR10158-6080,5 mL x 1,4 mm Ceramiczne koraliki
Klej/żywica materiałFirma Gorilla Glue Company8401519
Uchwyt na ligaturę (z wycięciem)Rdzeń obiektu UNC w Chapel Hill BeAM Design CenterNie ma zastosowania118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Blokada uchwytu na ligaturęRdzeń obiektu UNC w Chapel Hill BeAM Design CenterNie ma zastosowania17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Lulzbot mini v1.0 drukarka 3D & nbsp;Lulzbot (Fargo Addytywna Produkcja 3D, LLC)Nie ma zastosowaniaObiekty Aleph, model Lulzbot Mini v1.0
Oprogramowanie MicroViewInnowacje Parallax2.5.0-3139Oprogramowanie używane do pomiarów kości
Łóżko dentystyczne dla myszy (z nacięciami)Rdzeń obiektu UNC w Chapel Hill BeAM Design CenterNie ma zastosowania103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Górna część łóżka dentystycznego z mysząRdzeń obiektu UNC w Chapel Hill BeAM Design CenterNie ma zastosowania99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Filament kwasu polimlekowego (PLA)Dosłownie552593,0 mm PLA
Zestaw tkankowy Rapidpure RNAMP Biomedicals112721050
Rękojeść ostrza skalpelaBard-Parker371030Uchwyt skalpela 15C
Jedwab szwowyInstrument chirurgiczny RobozSUT-15-1
Zapalniki Taqman qPCRThermo FisherStopień (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765  InvivoGen, San Diego, USA#inh-vx765-1Inhibitor kaspazy-1 stosowany do modulacji gospodarza

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Offenbacher, S. Periodontal diseases: pathogenesis. Ann Periodontol. 1 (1), 821-878 (1996).
  2. Alves, T., Swanson, K. V., Girnary, M. S., Freire, M., Moss, K., Divaris, K., Beck, J., Santos, P. C. P., Brickey, W. J., Wrobel, J. A., Min, H. Y., Syed, M., Morelli, T., Seaman, W. T., Preisser, J. S., Hu, D., Preisser, H., Makhanova, N., Susin, C., Vias, N. P., Styner, M., Zhang, S., Pirih, F. Q., Chang, J., Gill, H. S., Lietzan, A. D., Webster-Cyriaque, J., Ting, J. P. Y., Marchesan, J. T. Inflammasome targeting for periodontitis prevention is sex dependent. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (44), e2507092122(2025).
  3. Padial-Molina, M., et al. Methods to .validate tooth-supporting regenerative therapies. Methods Mol Biol. 887, 135-148 (2012).
  4. Hajishengallis, G. Illuminating the oral microbiome and its host interactions: animal models of disease. FEMS Microbiol Rev. 47 (3), fuad018(2023).
  5. Graves, D. T., Fine, D., Teng, Y. T., Van Dyke, T. E., Hajishengallis, G. The use of rodent models to investigate host-bacteria interactions related to periodontal diseases. J Clin Periodontol. 35 (2), 89-105 (2008).
  6. Hasturk, H., et al. RvE1 protects from local inflammation and osteoclast- mediated bone destruction in periodontitis. FASEB J. 20 (2), 401-403 (2006).
  7. Hasturk, H., et al. Phase IIa clinical trial of complement C3 inhibitor AMY-101 in adults with periodontal inflammation. J Clin Invest. 131 (23), e152973(2021).
  8. Maekawa, T., et al. Genetic and intervention studies implicating complement C3 as a major target for the treatment of periodontitis. J Immunol. 192 (12), 6020-6027 (2014).
  9. Maekawa, T., et al. Antagonistic effects of IL-17 and D-resolvins on endothelial Del-1 expression through a GSK-3beta-C/EBPbeta pathway. Nat Commun. 6, 8272(2015).
  10. Hajishengallis, G., Hasturk, H., Lambris, J. D. Contributing authors. C3-targeted therapy in periodontal disease: moving closer to the clinic. Trends Immunol. 42 (10), 856-864 (2021).
  11. Marchesan, J., et al. An experimental murine model to study periodontitis. Nat Protoc. 13 (10), 2247-2267 (2018).
  12. Ribeiro, A. A., et al. Oral biofilm dysbiosis during experimental periodontitis. Mol Oral Microbiol. 37 (6), 256-265 (2022).
  13. Jiao, Y., et al. Induction of bone loss by pathobiont-mediated Nod1 signaling in the oral cavity. Cell host & microbe. 13 (5), 595-601 (2013).
  14. Marchesan, J. T., et al. Role of inflammasomes in the pathogenesis of periodontal disease and therapeutics. Periodontol 2000. 82 (1), 93-114 (2000).
  15. Chadwick, J. W., Glogauer, M. Robust ligature-induced model of murine periodontitis for the evaluation of oral neutrophils. J Vis Exp. (155), e59667(2020).
  16. Collins, F. S., Tabak, L. A. Policy: NIH plans to enhance reproducibility. Nature. 505 (7485), 612-613 (2014).
  17. Landis, S. C., et al. A call for transparent reporting to optimize the predictive value of preclinical research. Nature. 490 (7419), 187-191 (2012).
  18. Swanson, K. V., et al. Interferon activated gene 204 (Ifi204) protects against bone loss in experimental periodontitis. J Periodontol. 93 (9), 1366-1377 (2022).
  19. Sun, L., et al. IL-10 dampens an IL-17-mediated periodontitis-associated inflammatory network. J Immunol. 204 (8), 2177-2191 (2020).
  20. Offenbacher, S., et al. GWAS for Interleukin-1beta levels in gingival crevicular fluid identifies IL37 variants in periodontal inflammation. Nat Commun. 9 (1), 3686(2018).
  21. Apaza Alccayhuaman, K. A., et al. FasL is a catabolic factor in alveolar bone homeostasis. J Clin Periodontol. 50 (3), 396-405 (2023).
  22. Percie du Sert, N., et al. The ARRIVE guidelines 2.0: updated guidelines for reporting animal research. BMJ Open Sci. 4 (1), e100115(2020).
  23. Percie du Sert, N., et al. Reporting animal research: Explanation and elaboration for the ARRIVE guidelines 2.0. PLoS Biol. 18 (7), e3000411(2020).
  24. Marchesan, J. T. Inflammasomes as contributors to periodontal disease. J Periodontol. 91 Suppl (1), S6-S11 (2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Destrukcja ko ci jamki z bopodniebnejnarz dzia drukowane w 3Dpodk adka stomatologiczna dla myszyuchwyt do ligaturanaliza mikro CTekspresja gen w w dzi lesygnalizacja osteoklastogennazapalna destrukcja ko ci

Powiązane artykuły