Translacyjny model hodowli komórek 3D do oceny wpływu hiperoksji na ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych noworodków

Cynthia M. Carter; Maxwell M. Mathias; Lora Bailey-Downs; Trent E. Tipple; Peter F. Vitiello; Matthew S. Walters; Abhrajit Ganguly

doi:10.3791/65913

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Translacyjny model hodowli komórek 3D do oceny wpływu hiperoksji na ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych noworodków

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 lipca 2024

Cynthia M. Carter¹ , Maxwell M. Mathias¹ , Lora Bailey-Downs¹ , Trent E. Tipple¹ , Peter F. Vitiello¹ , Matthew S. Walters² , Abhrajit Ganguly¹

¹Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, ²Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół do ustanowienia modelu hodowli interfejsu powietrze-ciecz (ALI) wykorzystującego komórki nabłonka dróg oddechowych tchawicy noworodków (nTAEC) i przeprowadzamy fizjologicznie istotną ekspozycję na hiperoksję w celu zbadania wpływu stresu oksydacyjnego wywołanego atmosferą na komórki pochodzące z rozwijającego się nabłonka powierzchni dróg oddechowych noworodka.

Streszczenie

Nabłonek dróg oddechowych noworodków jest stale narażony na stresory środowiskowe. Jednym z tych stresorów u noworodków z chorobami płuc jest ciśnienie tlenu (_O2) wyższe niż atmosfera otoczenia - określane jako hiperoksja (>21%_O2). Wpływ hiperoksji na drogi oddechowe zależy od różnych czynników, w tym etapu rozwoju dróg oddechowych, stopnia hiperoksji i czasu ekspozycji, przy czym zmienne narażenie może prowadzić do unikalnych fenotypów. Chociaż przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad wpływem hiperoksji na pęcherzyki płucne u noworodków i nadreaktywność dróg oddechowych, niewiele wiadomo na temat krótko- i długoterminowego wpływu hiperoksji na ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych noworodków. Głównym tego powodem jest niedobór skutecznego modelu in vitro do badania rozwoju i funkcji nabłonka dróg oddechowych u noworodków. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania i namnażania ludzkich komórek nabłonka tchawicy noworodków (nTAEC) przy użyciu aspiracji ludzkiej tchawicy noworodków i hodowli tych komórek w hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). Wykazaliśmy, że nTAEC tworzą dojrzałą spolaryzowaną monowarstwę komórkową w hodowli ALI i ulegają różnicowaniu śluzowo-rzęskowemu. Przedstawiono również metodę umiarkowanej ekspozycji monowarstwy komórkowej w hiperoksji w hodowli ALI przy użyciu specjalistycznego inkubatora. Dodatkowo opisujemy test do pomiaru komórkowego stresu oksydacyjnego po ekspozycji na hiperoksję w hodowli ALI przy użyciu fluorescencyjnej kwantyfikacji, która potwierdza, że umiarkowana ekspozycja na hiperoksję indukuje komórkowy stres oksydacyjny, ale nie powoduje znacznego uszkodzenia błony komórkowej ani apoptozy. Model ten może być potencjalnie wykorzystany do symulacji klinicznie istotnej ekspozycji na hiperoksję napotykanej przez drogi oddechowe noworodków na Oddziale Intensywnej Terapii Noworodków (NICU) i wykorzystany do badania krótko- i długotrwałego wpływu_O2 na programowanie nabłonka dróg oddechowych noworodków. Badania z wykorzystaniem tego modelu mogą być wykorzystane do zbadania sposobów łagodzenia uszkodzeń oksydacyjnych we wczesnym okresie życia rozwijających się dróg oddechowych, które są związane z rozwojem długotrwałych chorób dróg oddechowych u byłych wcześniaków.

Wprowadzenie

Tlen terapeutyczny (O₂) jest jedną z najczęściej stosowanych terapii na oddziale intensywnej terapii noworodków (NICU)¹. W związku z tym narażenie na hiperoksję (>21%_O2) jest powszechnym stresorem atmosferycznym, z którym borykają się noworodki z poważną chorobą płuc i bez niej. Reakcje płuc na hiperoksję mogą się różnić w zależności od intensywności i/lub czasu trwania ekspozycji oraz lokalizacji anatomicznej, typu komórki i etapu rozwoju płuc²^,³^,⁴^,⁵^,⁶. Większo....