Artykuł metodologiczny

Translacyjny model hodowli komórek 3D do oceny wpływu hiperoksji na ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych noworodków

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65913

⸱

12 lipca 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół do ustanowienia modelu hodowli interfejsu powietrze-ciecz (ALI) wykorzystującego komórki nabłonka dróg oddechowych tchawicy noworodków (nTAEC) i przeprowadzamy fizjologicznie istotną ekspozycję na hiperoksję w celu zbadania wpływu stresu oksydacyjnego wywołanego atmosferą na komórki pochodzące z rozwijającego się nabłonka powierzchni dróg oddechowych noworodka.

Streszczenie

Nabłonek dróg oddechowych noworodków jest stale narażony na stresory środowiskowe. Jednym z tych stresorów u noworodków z chorobami płuc jest ciśnienie tlenu (O2) wyższe niż atmosfera otoczenia - określane jako hiperoksja (>21%O2). Wpływ hiperoksji na drogi oddechowe zależy od różnych czynników, w tym etapu rozwoju dróg oddechowych, stopnia hiperoksji i czasu ekspozycji, przy czym zmienne narażenie może prowadzić do unikalnych fenotypów. Chociaż przeprowadzono szeroko zakrojone badania nad wpływem hiperoksji na pęcherzyki płucne u noworodków i nadreaktywność dróg oddechowych, niewiele wiadomo na temat krótko- i długoterminowego wpływu hiperoksji na ludzkie komórki nabłonka dróg oddechowych noworodków. Głównym tego powodem jest niedobór skutecznego modelu in vitro do badania rozwoju i funkcji nabłonka dróg oddechowych u noworodków. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania i namnażania ludzkich komórek nabłonka tchawicy noworodków (nTAEC) przy użyciu aspiracji ludzkiej tchawicy noworodków i hodowli tych komórek w hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). Wykazaliśmy, że nTAEC tworzą dojrzałą spolaryzowaną monowarstwę komórkową w hodowli ALI i ulegają różnicowaniu śluzowo-rzęskowemu. Przedstawiono również metodę umiarkowanej ekspozycji monowarstwy komórkowej w hiperoksji w hodowli ALI przy użyciu specjalistycznego inkubatora. Dodatkowo opisujemy test do pomiaru komórkowego stresu oksydacyjnego po ekspozycji na hiperoksję w hodowli ALI przy użyciu fluorescencyjnej kwantyfikacji, która potwierdza, że umiarkowana ekspozycja na hiperoksję indukuje komórkowy stres oksydacyjny, ale nie powoduje znacznego uszkodzenia błony komórkowej ani apoptozy. Model ten może być potencjalnie wykorzystany do symulacji klinicznie istotnej ekspozycji na hiperoksję napotykanej przez drogi oddechowe noworodków na Oddziale Intensywnej Terapii Noworodków (NICU) i wykorzystany do badania krótko- i długotrwałego wpływuO2 na programowanie nabłonka dróg oddechowych noworodków. Badania z wykorzystaniem tego modelu mogą być wykorzystane do zbadania sposobów łagodzenia uszkodzeń oksydacyjnych we wczesnym okresie życia rozwijających się dróg oddechowych, które są związane z rozwojem długotrwałych chorób dróg oddechowych u byłych wcześniaków.

Wprowadzenie

Tlen terapeutyczny (O2) jest jedną z najczęściej stosowanych terapii na oddziale intensywnej terapii noworodków (NICU)1. W związku z tym narażenie na hiperoksję (>21%O2) jest powszechnym stresorem atmosferycznym, z którym borykają się noworodki z poważną chorobą płuc i bez niej. Reakcje płuc na hiperoksję mogą się różnić w zależności od intensywności i/lub czasu trwania ekspozycji oraz lokalizacji anatomicznej, typu komórki i etapu rozwoju płuc2,3,4,5,6. Większość badań nad hiperoksyjnym uszkodzeniem płuc u noworodków koncentrowała się na wpływie ekspozycji na hiperoksję w kontekście pęcherzyków płucnych po urodzeniu w celu modelowania dysplazji oskrzelowo-płucnej (BPD) - najczęstszej przewlekłej choroby płuc dotykającej wcześniaki6,7,8,9,10,11. Nasilenie BPD jest klasyfikowane na podstawie ilości wsparcia oddechowego i O2 potrzebnego w 36 tygodniu po menstruacji9. U większości dzieci z BPD klinicznie poprawia się z czasem, gdy płuca nadal rosną, przy czym większość z nich odstawia wspomaganie oddychania przed swoimi pierwszymi urodzinami12,13. Niezależnie od nasilenia BPD po urodzeniu, istotne choroby, które dotykają byłych wcześniaków, obejmują 5-krotnie zwiększone ryzyko świszczącego oddechu w wieku przedszkolnym, astmy, nawracających infekcji dróg oddechowych w dzieciństwie i przewlekłej obturacyjnej choroby płuc o wczesnym początku12,14,15,16,17,18,19. Wpływ hiperoksji na długotrwałe choroby dróg oddechowych i infekcje płuc u wcześniaków badano przy użyciu modeli zwierzęcych in vitro i in vivo20,21,22,23,24. Jednak większość z tych modeli koncentrowała się na roli tkanki mezenchymalnej, nabłonka wyrostka zębodołowego i mięśni gładkich dróg oddechowych25,26,27,28.

Nabłonek powierzchni dróg oddechowych wyznacza całą drogę układu oddechowego, rozciągając się od tchawicy do końcowego oskrzelika, kończąc tuż przed poziomem pęcherzyków płucnych29. Komórki podstawne dróg oddechowych są pierwotnymi komórkami macierzystymi w nabłonku dróg oddechowych, posiadającymi zdolność różnicowania się w cały repertuar dojrzałych linii nabłonka dróg oddechowych, który obejmuje komórki rzęskowe i wydzielnicze (komórki klubowe: niewytwarzające śluzu i komórki kubkowe: wytwarzające śluz)29,30,31,32. Badania nad hodowlami komórkowymi w kontekście hiperoksycznego uszkodzenia płuc u noworodków wykorzystywały głównie linie komórkowe raka u dorosłych ludzi lub myszy33,34. Dodatkowo, w większości eksperymentów in vitro stosowano zanurzone systemy hodowli, które nie pozwalają na różnicowanie komórek w nabłonek śluzowo-rzęskowy przypominający nabłonek dróg oddechowych in vivo u ludzi35. W związku z tym istnieje luka w wiedzy na temat wpływu uszkodzenia płuc wywołanego hiperoksją na rozwój komórek nabłonka dróg oddechowych u ludzkich noworodków. Jednym z powodów jest niedobór modeli translacyjnych do badania wpływu ekspozycji atmosferycznej na nabłonek dróg oddechowych u noworodków. Hiperoksyczne uszkodzenie płuc we wczesnym okresie życia może prowadzić do długotrwałej choroby dróg oddechowych i zwiększonego ryzyka infekcji, co skutkuje konsekwencjami zmieniającymi życie u byłych wcześniaków14,36,37. U niemowląt, które nie przeżyły z ciężkim BPD, nabłonek powierzchni dróg oddechowych ma wyraźne nieprawidłowości, w tym przerost komórek kubkowych i nieuporządkowany rozwój rzęsek, co oznacza nieprawidłowy klirens śluzowo-rzęskowy i zwiększoną wysokość nabłonka, co zagraża kaliberowi dróg oddechowych38. W ciągu ostatniej dekady wzrosło zainteresowanie hodowlą pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych na granicy faz powietrze-ciecz (ALI) w celu zbadania rozwoju nabłonka dróg oddechowych po urodzeniu39,40,41,42. Jednak modele ALI komórek nabłonka dróg oddechowych noworodków nie były wykorzystywane w kontekście modeli atmosferycznych zaburzeń redoks, takich jak ekspozycja na hiperoksję.

Korzystając z wcześniej opublikowanej metody39, wykorzystaliśmy próbki aspiratu tchawicy noworodków uzyskane od zaintubowanych noworodków na OIOM-ie dla noworodków oraz z powodzeniem wyizolowaliśmy i rozszerzyliśmy pierwotne komórki nabłonkowe tchawicy noworodków (nTAECs). Wykorzystaliśmy inhibitory Rho, Smad, kinazy syntazy glikogenu (GSK3) i sygnalizacji ssaczego celu rapamycyny (mTOR), aby zwiększyć zdolność ekspansji i opóźnić starzenie się w tych komórkach, jak opisano wcześniej39,42, co pozwala na efektywne i późniejsze przechodzenie nTAEC. Protokół opisuje metody ustanawiania kultur 3D ALI przy użyciu nTAEC i przeprowadzania ekspozycji na hiperoksję na monowarstwach nTAEC. Hamowanie Rho i Smad stosuje się przez pierwsze 7 dni hodowli ALI (dni ALI od 0 do 7), po czym inhibitory te są usuwane z pożywki różnicującej na pozostałą część czasu trwania hodowli ALI. Wierzchołkowa powierzchnia monowarstwy komórek nabłonka dróg oddechowych hodowanych przez ALI pozostaje wystawiona na działanie środowiska43, co umożliwia badania perturbacji atmosferycznych i bardzo przypomina patobiologię rozwijających się dróg oddechowych noworodków narażonych na hiperoksję in vivo. Stężenie O2 stosowane w poprzednich badaniach hodowli komórkowych (niezależnie od komórek unieśmiertelnionych lub pierwotnych) hiperoksycznego uszkodzenia płuc u noworodków różni się znacznie (od 40% do 95%), podobnie jak czas trwania ekspozycji (od 15 minut do 10 dni)36,44,45,46,47. W tym badaniu monowarstwę komórek ALI wystawiono na działanie 60%O2 przez 7 dni od 7 do 14 dnia ALI (po usunięciu inhibitorów Rho / Smad z pożywki różnicującej). Ekspozycję na hiperoksję przeprowadzono we wczesnej-środkowej fazie różnicowania śluzowo-rzęskowego (ALI od 7 do 14 dnia), w przeciwieństwie do w pełni zróżnicowanego dojrzałego nabłonka, a zatem symuluje rozwój nabłonka dróg oddechowych in vivo u wcześniaków. Ta strategia narażenia minimalizuje ryzyko ostrej toksycznościO2 (która jest oczekiwana przy wyższych stężeniachO2), jednocześnie wywierając stres oksydacyjny w fizjologicznie istotnym zakresie i przypomina krytyczne okno przejścia ze stosunkowo niedotlenionego środowiska wewnątrzmacicznego do hiperoksycznego środowiska zewnętrznego u wcześniaków.

Protokół

Próbki aspiratu tchawicy noworodków zostały pobrane tylko po świadomej zgodzie rodziców, a protokół używany do pobierania, transportu i przechowywania został zatwierdzony przez Institutional Review Board (IRB) Centrum Nauk o Zdrowiu Uniwersytetu Oklahoma (IRB 14377).

1. Przygotowanie do izolacji, pasażu i hodowli ALI nTAEC

  1. Przygotowanie podłoża
    1. Ośrodek z nabłonkiem oskrzelowym (BLEAM) z inhibitorami (BLEAM-I): Przygotuj 500 ml (1 butelka, przechowywana w temperaturze 4 °C) BLEAM, dodając 1,25 ml suplementu HLL (500 μg/ml albuminy surowicy ludzkiej, 0,6 μM kwasu linolowego, 0,6 μg/ml lecytyny), 15 ml L-glutaminy (6 mM), 2 ml ekstraktu P (0,4%, ekstrakt z przysadki bydlęcej), 5 ml TM1 (1 μM epinefryny, 5 μg/ml transferyny, 10 nM trójjodotyroniny, 0,1 μg/ml hydrokortyzonu, 5 ng/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), 5 ng/ml insuliny), 1 ml roztworu antybiotyku (Normocin, 0,1 mg/ml). Aby zapobiec starzeniu się komórek pierwotnych i poprawić efektywność ekspansji, dodaj następujące inhibitory czynnika wzrostu, jak opisano wcześniej39: Y-27632 (kinaza białkowa związana z Rho lub inhibitor ROCK) o końcowym stężeniu 5 μM, A83-01 (hamuje sygnalizację Smad) o końcowym stężeniu 1 μM, CHIR 99021 (inhibitor kinazy syntazy glikogenu-3 lub GSK3) o końcowym stężeniu 0,4 μM i Rapamycyna (inhibitor celu molekularnego rapamycyna lub mTOR) o końcowym stężeniu 5 nM. Przefiltruj media przez filtr o wielkości porów 0,22 μm. Zapoznaj się z Tabelą 1, aby zapoznać się z listą komponentów nośnika.
    2. Podłoże ALI dla ludzkich komórek nabłonka oskrzeli/tchawicy (HBTEC): Przygotować 500 ml pożywki HBTEC, rozmrażając butelkę w temperaturze 37 °C i dodając 1 ml roztworu antybiotyku (Normocin, 0,1 mg/ml). Po dodaniu przefiltruj pożywkę przez filtr o wielkości porów 0,22 μm.
    3. Pożywki HBTEC z inhibitorami (HBTEC-I): Przygotować pożywkę HBTEC jak powyżej. Przed filtrowaniem należy dodać następujące inhibitory: Y-27632 o końcowym stężeniu 5 μM i A83-01 o końcowym stężeniu 0,5 μM. Przefiltrować media przez filtr o wielkości porów 0,22 μm.
      UWAGA: Pożywki BLEAM-I, HBTEC i HBTEC-I należy przechowywać w temperaturze 4 °C, opatrzone datą i etykietą, w ciemności (zawinięte w folię) i rozgrzać tylko porcje tego, co jest potrzebne (okres trwałości wynosi 30 dni).
    4. HEPES/FBS: Dodać 500 ml soli fizjologicznej buforowanej przez HEPES i 88 ml FBS (stężenie końcowe wynosi 15%). Po dodaniu przefiltruj roztwór przez filtr porów 0,22 μm i przechowuj go w temperaturze 4 °C, opatrzony datą i oznaczony etykietą.
      UWAGA: Podwielokrotność i ciepło BLEAM, HEPES-FBS i Trypsin-EDTA do 37 °C (co najmniej 30 min) przed użyciem.
  2. Powlekanie kolb hodowlanych i wkładek do hodowli komórkowych ALI pożywką kondycjonowaną 804G
    1. Przygotuj pożywkę kondycjonowaną matrycowo z komórkami 804G (linia komórek nabłonka pęcherza szczura) zgodnie z wcześniejszym opisem39.
    2. Kolbę do hodowli komórkowych i wkładki do hodowli komórkowych pokryć pożywką kondycjonowaną 804G przez co najmniej 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 . Patrz Tabela 2, aby zapoznać się z ilościami pożywki potrzebnymi do pokrycia różnych kolb hodowlanych i wkładek do kultur komórkowych.

2. Izolacja i ekspansja nTAEC oraz przygotowanie do kolejnej hodowli ALI

  1. Podczas rutynowego odsysania rurki dotchawiczej intubowanych noworodków należy zaopatrzyć się w świeży aspirat tchawicy (około 1 ml) i zebrać aspirat do pułapki śluzowej. Jeśli objętość aspiratu jest niewystarczająca, aby dotrzeć do pułapki śluzu, przepłucz cewnik ssący 1-3 ml sterylnego soli fizjologicznej.
  2. Oznaczyć próbkę i przechowywać ją w torbie na lodzie w torbie na wypadek zagrożenia biologicznego.
    UWAGA: Próbki można przechowywać na lodzie w temperaturze 4 °C przez maksymalnie 24 godziny. Jednak wydajność jest wyższa w przypadku świeżych próbek.
  3. Przetransportować próbkę z OIOM-u dla noworodków do laboratorium. Pokryj kolbę T25 pożywką o kondycjonowaniu 804G i przygotuj się do inokulacji próbki w momencie transportu aspiratu tchawicy do laboratorium.
  4. Wyjmij pułapkę śluzu z worka na zagrożenie biologiczne i dokładnie wyczyść zewnętrzne powierzchnie 70% etanolem, aby uniknąć zanieczyszczenia. Ostrożnie otwórz nakrętkę pułapki śluzu pod sterylnym kapturem do hodowli komórkowych.
  5. Rozcieńczyć próbkę aspiratu tchawicy sterylnym PBS do 5 ml (w celu rozcieńczenia śluzu) i przenieść całą zawartość do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
  6. Odwirować probówkę w temperaturze 250 x g, 20 °C-23 °C przez 5 minut i odrzucić supernatant (łącznie ze śluzem).
    UWAGA: Wszystkie wirowania tutaj odbywają się w temperaturze 250 x g, 20 °C-23 °C przez 5 minut, chyba że określono inaczej.
  7. Zawiesić osad w 5 ml BLEAM-I.
  8. Wyjąć kolbę T25 z inkubatora i wyrzucić pożywkę kondycjonowaną zgodnie z 804G przed posiewem próbki.
  9. Umieścić próbkę w kolbie T25 i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 (będzie to określane jako przejście 0 lub P0).
  10. Zmień pożywkę za pomocą BLEAM-I 24 godziny po posianiu, aby wypłukać nieprzyłączone komórki, a następnie co 48 godzin.
    UWAGA: Po przetworzeniu próbki aspiratu tchawicy i inkubacji jej w pożywce BLEAM-I, komórki w kształcie prostopadłościanu pojawiają się 7-10 dni po posiewie. Około 3 tygodnie po posiewie komórki są gęsto upakowane i wymagają trypsynizacji w celu późniejszego pasażowania, rozszerzania i przechowywania. Komórki wczesnego pasażu (P1 - P2) umieszcza się w krioprobówkach (2,5 x 10,6 komórek na 500 μl pożywki do zamrażania na krioprobówkę) i przechowuje w ciekłym azocie do długotrwałego przechowywania.
  11. Szybko rozmrozić zamrożone komórki z ciekłego azotu w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przenieść zawiesinę komórek do sterylnej probówki o odpowiedniej wielkości zawierającej BLEAM-I.
  12. Policz komórki, aby określić całkowitą i żywą liczbę komórek, używając niebieskiego barwnika trypana i automatycznego lub ręcznego licznika komórek, jak opisano wcześniej48. Rozcieńczyć zawiesinę komórek odpowiednią objętością BLEAM-I, tak aby końcowe stężenie wynosiło 2,1 x 106 komórek w 15 ml zawiesiny komórek (dla kolby T75).
    UWAGA: W przypadku kolby T25 do wysiewu zwykle używa się 0,7 x 106 komórek w 5 ml zawiesiny komórek.
  13. Przenieść zawiesinę komórek o objętości 15 ml do kolby T75 i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  14. Następnego ranka wymień media na nowe BLEAM-I. Następnie wymieniaj media na nowe BLEAM-I co 2 dni. Gdy komórki osiągną około 80%-90%, są gotowe do trypsynizacji do hodowli ALI.
  15. Nałóż 5 ml trypsyny-EDTA (T75) na monowarstwę komórek.
    UWAGA: Pamiętaj, aby używać świeżej trypsyny. Unikaj używania trypsyny, która została wielokrotnie podgrzana.
  16. Inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 5 minut w inkubatorze. Następnie dotknij boku kolby 8x-10x, aby usunąć komórki. Sprawdź pod mikroskopem, aby potwierdzić, że komórki zostały usunięte po trypsynizacji. Jeśli >50% komórek pozostanie w kolbie, przemyć PBS 2x i powtórzyć etap trypsynizacji ze skróconym czasem inkubacji do 2-3 minut.
  17. Zatrzymaj reakcję za pomocą 15 ml HEPES-FBS i pipetuj w górę iw dół 4x-5x. Przenieś komórki do sterylnej probówki o odpowiedniej wielkości i odwiruj przy 250 x g przez 5 minut, aby osadzać komórki.
  18. Po odwirowaniu ostrożnie zassać supernatant. Rozpuść osad komórkowy w 1 ml BLEAM-I, delikatnie pipetując w górę iw dół 5x-10x.
  19. Policz komórki, aby określić całkowitą i aktywną liczbę komórek. Rozcieńczyć zawiesinę komórek odpowiednią objętością BLEAM-I, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 x 105 żywych komórek na 100 μl zawiesiny komórek.

3. Kultura ALI nTAEC

UWAGA: Wkładki do hodowli komórkowych powinny być pokryte pożywką kondycjonowaną 804G i inkubowane przez co najmniej 4 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przed następnym krokiem (patrz krok 1.2).

  1. Wyjąć z inkubatora 24-dołkową płytkę (płytki) do hodowli komórkowych zawierające wkładki do hodowli komórkowych i wyrzucić pożywkę kondycjonowaną 804G.
  2. Dodać 1 ml BLEAM-I do podstawno-bocznej (dolnej) komory każdego dołka ALI. Dodać 100 μl zawiesiny komórkowej (1 x 105 komórek) do komory wierzchołkowej wkładek do hodowli komórkowych ALI i inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Ten etap jest definiowany jako ALI dzień -2.
  3. Następnego dnia należy zmienić pożywkę w komorze podstawno-bocznej (1 ml) i wierzchołkowej (100 μl) na świeży BLEAM-I. Podczas wymiany pożywki w komorze wierzchołkowej należy uważać, aby nie naruszyć monowarstwy ogniwa. Ten etap jest definiowany jako ALI dzień -1.
  4. Następnego dnia usuń pożywkę zarówno z komory podstawno-bocznej, jak i wierzchołkowej.
    UWAGA: Potrzeba 2 dni, aby komórki na błonie hodowli komórkowej zlały się w warunkach zanurzenia. Na tym etapie można ustalić ALI.
  5. Dodać 1 ml pożywki HBTEC-I do komory podstawno-bocznej, ale pożywkę z komory wierzchołkowej należy pozostawić wolną i wystawioną na działanie powietrza. Ten etap jest zdefiniowany jako ALI dzień 0.
  6. Kontynuować wymianę pożywki HBTEC-I (1 ml) w komorze podstawno-bocznej co 48 godzin od dnia ALI 0 do 6. Przestaw się na zwykłą pożywkę HBTEC (bez inhibitorów) w 7 dniu ALI aż do pożądanego punktu zbiorów.
    UWAGA: W ciągu pierwszych 7 dni hodowli ALI pożywka z komory podstawno-bocznej może przeciekać do komory wierzchołkowej. Pożywka ta musi być ostrożnie odsysana każdego dnia, aby utrzymać zdrowie warstwy komórkowej i umożliwić jej różnicowanie.
  7. Zbieraj komórki, wstawki do kultur komórkowych i podłoża podstawno-boczne w różnych punktach czasowych w celu zastosowania technik molekularnych, testów i analiz.
    1. W przypadku tego protokołu, w dniach ALI 0, 7 i 28, pobiera się komórki do analizy ekspresji genu qPCR (standardowy protokół producenta) markerów różnicowania nabłonka. W dniach ALI 0, 7, 14 i 28 należy pobrać wkładki do hodowli komórkowych w celu zbadania funkcji bariery (metody opisane poniżej).
    2. W dniach ALI 0 i 28 użyj utrwalonych formaliną wkładek do hodowli komórkowych do barwienia immunofluorescencyjnego markerami różnicowania nabłonka (wykorzystując wcześniej opublikowany protokół)49. W dniu ALI 14 należy pobrać podłoża podstawno-boczne w celu uwolnienia dehydrogenazy mleczanowej (LDH) (standardowy protokół producenta), lizaty komórkowe do qPCR markerów stresu oksydacyjnego oraz immunoblot z przeciwciałami kaspazy-3 i rozszczepionej kaspazy-3 (standardowy protokół producenta) oraz wstawki do hodowli komórkowych do testu stresu oksydacyjnego (metoda opisana poniżej).

4. Testowanie funkcji bariery podczas różnicowania ALI

  1. Pomiar przeznabłonkowej rezystancji elektrycznej (TEER)
    UWAGA: Zmierz TEER za pomocą nabłonkowego woltomierza/omomierza (EVOM) podczas różnicowania ALI, aby ocenić integralność warstwy komórkowej50.
    1. Przed pomiarem wartości rezystancji filtra testowego należy użyć kultury ogniw pokrytych pożywką 804G (pozbawionej jakichkolwiek komórek), aby zmierzyć wartość rezystancji tła w omach (Ω)
    2. Odejmij wartość rezystancji tła od wartości rezystancji filtra testowego i pomnóż różnicę przez powierzchnię wzrostu komórki, aby uzyskać wartość TEER dla każdego filtra testowego.
      TEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = nabłonkowy opór elektryczny trans (Ω.cm2)
      ΩT = Testowa wartość rezystancji filtra (Ω)
      ΩB = wartość oporu tła (Ω)
      C = Powierzchnia wzrostu komórki (cm2)
      UWAGA: Wkładki do hodowli komórkowych używane do pomiarów TEER są następnie utrwalane 10% buforowaną formaliną i natychmiast używane do barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii fluorescencyjnej (metoda opisana poniżej) lub przechowywane w temperaturze 4 °C w celu późniejszego barwienia.
  2. Test przepuszczalności nabłonka fluoresceiny i isetynianu dekstranu (FITC-dextran)
    UWAGA: Test przepuszczalności nabłonka przeprowadzono przy użyciu dwóch różnych mas cząsteczkowych FITC-dekstranu (10 kD i 20 kD) podczas różnicowania ALI.
    1. Przygotować roztwór roboczy FITC-dekstranu (1 mg/ml): odmierzyć 5 mg FITC i wymieszać z 1 ml DMSO (5 mg/ml). Zawiesić zapas 5 mg/ml w pożywce HBTEC ogrzanej do temperatury 37 °C do stężenia 1 mg/ml. Chronić roztwór przed światłem.
    2. Przenieść filtry testowe (zawierające komórki) na nową płytkę 12-dołkową i dodać 1 ml pożywki HBTEC do komory podstawno-bocznej.
    3. Odessać pożywkę z komory wierzchołkowej (jeśli występuje) i zastąpić 250 μl roztworu roboczego FITC-dekstranu. Inkubować w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez 60 minut.
    4. Zakończyć test FITC-dekstranu, wyjmując filtry testowe (zawierające roztwór roboczy FITC-dekstranu) z płytki 12-dołkowej.
    5. Zebrać podłoże podstawno-boczne z płytki 12-dołkowej do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i odwirować.
    6. Przenieść 100 μl podwielokrotności z każdej probówki do 96-dołkowej mikropłytki z czarnego polistyrenu z przezroczystym dnem w trzech egzemplarzach. Przenieść 100 μl pożywki HBTEC do dodatkowych studzienek w płytce 96-dołkowej jako kontrolę ujemną w celu pomiaru fluorescencji tła.
    7. Zmierzyć intensywność fluorescencji za pomocą spektrofotometru przy maksymalnym wzbudzeniu 490 nm i maksymalnej emisji 520 nm.
    8. Odejmij średnią wartość fluorescencji tła od wartości fluorescencji filtra testowego, aby uzyskać skorygowaną fluorescencję i wyraź wartości jako procent w stosunku do skorygowanych wartości fluorescencji w dniu ALI 0 dla FITC 10 kD i 20 kD.

5. Ekspozycja na hiperoksję za pomocą inkubatora TriGas

  1. W 7 dniu ALI określ liczbę wkładek do hodowli komórkowych, które należy umieścić w hiperoksji w oparciu o potrzeby eksperymentalne i żniwne.
  2. Ustaw poziomO2 w inkubatorze TriGas na 60%O2. Zwykle potrzeba ~30-45 minut, aby poziom O2 osiągnął 60%.
  3. Gdy poziomO2 ustabilizuje się na poziomie 60%, umieść 24-dołkową płytkę do hodowli komórkowej z wkładkami do hodowli komórkowych przypisanymi do grupy hiperoksji wewnątrz inkubatora i zamknij drzwi inkubatora.
    UWAGA: Ten krok należy wykonać tak skutecznie, jak to możliwe, aby zapobiec znacznemu spadkowi poziomuO2 wewnątrz inkubatora.
  4. Zmienić pożywkę we wkładkach do hodowli komórkowych wystawionych na działanie hiperoksji zgodnie z tym samym harmonogramem, co w studzienkach kontrolnych (21% O2 naświetlanych). Codziennie sprawdzaj wkładki do hodowli komórkowych pod kątem wycieków z pożywki i delikatnie zasysaj wszelkie wycieki do komory hodowli komórkowej.
  5. Kontynuuj ekspozycję na hiperoksję przez 7 dni (ALI dni od 7 do 14). Po zakończeniu ekspozycji na hiperoksję należy pobrać komórki lub wykonać testy z wykorzystaniem wkładek do hodowli komórkowych w 14 dniu ALI.

6. Test stresu oksydacyjnego do oceny skutków hiperoksji

UWAGA: Użyliśmy zestawu testowego CM-H2DCFDA i zmierzyliśmy intensywność fluorescencji w 14 dniu ALI jako marker stresu oksydacyjnego we wstawkach do hodowli komórkowych po ekspozycji na O2. H2DCFDA jest chemicznie zredukowaną i acetylowaną formą 2′,7′-dichlorofluoresceiny (DCF), która jest żywym wskaźnikiem reaktywnych form tlenu (ROS) przenikanym przez komórkę. CM-H2DCFDA jest tiolowo-reaktywną chlorometylową pochodnąH2DCFDA, która sprzyja dalszemu kowalencyjnemu wiązaniu ze składnikami wewnątrzkomórkowymi, umożliwiając dłuższe zatrzymywanie barwnika w komórce. Cząsteczki te są niefluorescencyjne, dopóki grupy octanowe nie zostaną usunięte przez działanie esterazy wewnątrzkomórkowych, a utlenianie zachodzi w cell51. Po utlenieniu wewnątrzkomórkowym wynikowy wzrost fluorescencji można zmierzyć za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego jako zastępczą miarę komórkowego stresu oksydacyjnego52. Odczynnik jest lekki i wrażliwy na powietrze, dlatego musi być chroniony przed światłem i w miarę możliwości szczelny.

  1. Przygotowanie roztworu do oznaczania CM-H2DCFDA: Każda fiolka zawiera 50 μg barwnika odczynnika w postaci sproszkowanej. Aby przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 1 mM, dodaj 80 μl sterylnego DMSO do fiolki, dobrze wymieszaj pipetą i delikatnie przemieszaj. Aby uzyskać końcowe stężenie barwnika 1 μM we wstawkach do hodowli komórkowych, dodać 0,1 μl 1 mM podstawowego produktu na 100 μl PBS (np. dodać 0,6 μl roztworu podstawowego do 600 μl PBS dla 6 wkładek do hodowli komórkowych).
    UWAGA: Końcowe stężenie barwnika może wahać się w granicach 1-5 μM. Dawka musi być zoptymalizowana dla każdego warunku hodowli.
  2. Dodać 100 μl roztworu barwnika o stężeniu 1 μM do każdej hodowli komórkowej zarówno dla grupy narażonej na hiperoksję, jak i na normoksję. Stosować co najmniej 1 hodowlę komórkową jako kontrolę ujemną z każdej grupy poddawanej działaniu substancji (100 μl PBS bez barwnika). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, chroniąc przed światłem. Umyć 1x PBS.
  3. Przygotowanie szkiełek: Odcedź nadmiar PBS. Ostrożnie przytrzymaj wkładki do hodowli komórkowych i użyj ostrza, aby powoli wyciąć błonę hodowli komórkowej. Wlej 1-2 krople płynu montażowego na szkiełko. Za pomocą kleszczyków z płaską końcówką ostrożnie przytrzymaj róg membrany, połóż ją komórką do dołu na mocowaniu i przykryj szkiełkiem nakrywkowym. Usuń nadmiar płynu montażowego i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Slajdy są teraz gotowe do obrazowania.
    UWAGA: Przygotowanie preparatu i mikroskopia fluorescencyjna powinny być wykonane tak szybko, jak to możliwe, ponieważ intensywność fluorescencji znacznie zanika w ciągu 2-3 godzin.
  4. Mikroskopia fluorescencyjna: Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z wykorzystaniem kanału Cy2 (cyjanina-2). Przechwytuj obrazy z trzech oddzielnych, nienakładających się na siebie obszarów na hodowlę komórkową.
  5. Fluorescencyjna detekcja stresu oksydacyjnego
    UWAGA: Użyj obrazów z mikroskopii fluorescencyjnej do pomiaru skorygowanej całkowitej fluorescencji komórek (CTCF) przy użyciu oprogramowania ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) i przepływu pracy opisanego poniżej. CTCF służy jako marker stresu oksydacyjnego we wstawkach kultur komórkowych po ekspozycji na hiperoksję i jest mierzony poprzez eliminację fluorescencji tła za pomocą oprogramowania ImageJ.
    1. Otwórz obraz mikroskopowy w ImageJ i wybierz obszar zainteresowania za pomocą narzędzia prostokąta. Zapisz obszar wyboru (α), klikając prawym przyciskiem myszy i wybierając Dodaj do menedżera ROI (region zainteresowania). Użyj tego obszaru zaznaczenia na obrazach.
    2. Wybierz parametry do pomiaru w obszarze Analizuj > ustaw pomiary, a następnie wybierz opcję Obszar, Zintegrowana gęstość i Średnia wartość szarości na karcie ustawień.
    3. Dla każdego obrazu użyj tego samego obszaru wyboru z menedżera ROI i wybierz opcję Analizuj > Zmierz. Zintegrowana wartość gęstości reprezentuje całkowitą fluorescencję (Ft) wybranego obszaru. Zanotuj wartości pomiarów w wyskakującym okienku.
    4. Aby skorygować fluorescencję tła (Fb) na każdym obrazie, zaznacz mały obszar obszaru niefluorescencyjnego za pomocą narzędzia prostokąt. Wybierz pozycję Analizuj > Mierz dla tego regionu. Średnia wartość intensywności oznacza Fb. Zanotuj wartości pomiarów w wyskakującym okienku.
    5. Obliczyć CTCF, mnożąc średnią intensywność fluorescencji odczytów tła przez całkowitą powierzchnię ROI i odejmując tę liczbę od zintegrowanej wartości gęstości ROI. Powtórz ten proces dla wszystkich obrazów dla obu grup badanych (kontrolna i hiperoksja).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = skorygowana całkowita fluorescencja komórek (A.U.)
      Ft = fluorescencja całkowita
      Fb = fluorescencja tła
      α = Obszar wyboru

Wyniki

Aby wyizolować nTAECs, pobraliśmy aspiraty tchawicy od zaintubowanych noworodków na OIOM-ie i przetransportowaliśmy je na lodzie do laboratorium w celu dalszego przetwarzania (Rysunek 1A). Po wysianiu próbek aspiratu tchawicy w pożywce wzrostowej nabłonka dróg oddechowych (BLEAM-I zawierającej inhibitory Rho/Smad, GSK3 i mTOR), komórki prostopadłościenne pojawiły się w ciągu 7-10 dni. Po 14 dniach komórki były w 50%-60% zlewane, a około 21 dni po posiewie komórki były gęsto upakowane i wymagały trypsynizacji w celu późniejszego pasażowania i ekspansji. Szeregowe pasaże tych komórek (do P3) poddano kriokonserwacji w ciekłym azocie w celu długotrwałego przechowywania. Komórki (≤ pasażu 3) zostały następnie rozmrożone do hodowli ALI.

nTAEC były hodowane w ALI po osiągnięciu około 80%-90% konfluencji na płycie T75 w warunkach zanurzenia. Przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne monowarstwy nTAEC w dniu ALI 0 za pomocą markerów specyficznych dla komórek podstawnych - cytokeratyny-5 (KRT5) 53 i białko nowotworowe p63 (TP63) 54 ( Rysunek 1B). W dniu ALI 0 prawie wszystkie komórki są KRT5 i TP63 dodatnie, co sugeruje fenotyp komórek podstawnych dróg oddechowych z minimalnym różnicowaniem. Po ustaleniu ALI, TEER mierzono za pomocą EVOM (Figura 1C) i gwałtownie wzrosła we wczesnej fazie hodowli ALI (ALI dzień od 0 do 7), gdy nTAEC zaczęły tworzyć dojrzałą spolaryzowaną monowarstwę komórkową, z późniejszym plateauem TEER między 7 dniem ALI a dniem 28 (Rysunek 1D). Ponadto FITC-dekstran o dwóch masach cząsteczkowych (10 kD i 20 kD) zastosowano do oceny przepuszczalności parakomórkowej podczas różnicowania ALI i wykazano ogólny stopniowy spadek fluorescencji w czasie (Rysunek 1E). Koreluje to z powstawaniem dojrzałej monowarstwy komórkowej podczas różnicowania ALI ze zmniejszającą się przepuszczalnością substancji rozpuszczonych.

Podczas hodowli ALI komórki podstawne różnicują się w dojrzałe linie nabłonkowe, które obejmują komórki rzęskowe, komórki klubowe niewydzielające śluzu i komórki kubkowe wydzielające śluz39. Analiza ekspresji genów markerów specyficznych dla dojrzałych komórek nabłonkowych w dniu ALI 0 wykazała minimalną lub żadną ekspresję białka J155 (FOXJ1, marker komórek rzęskowych), uteroglobiny56 (SCGB1A1, marker komórki klubowej) i mucyny-5AC57 (MUC5AC, marker komórki kubkowej; Rysunek 2A), z późniejszym wzrostem (ALI dzień 7 i 28) sugerującym różnicowanie się do tych dojrzałych podtypów nabłonka dróg oddechowych podczas hodowli ALI. Dodatkowo przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne w 28 dniu ALI przy użyciu markerów specyficznych dla dojrzałych komórek nabłonkowych i ilościowego różnicowania nabłonka składającego się z acetylowanych tubuliny < klasa sup = "xref">58 (TUBA4A) dodatnich komórek rzęskowych (~ 22%), SCGB1A1 dodatnich komórek klubowych (~ 13%) i MUC5AC dodatnich komórek kubkowych (~ 3%), a reszta to komórki podstawne KRT5 dodatnie (~ 51%) i inne rzadkie typy komórek (Rysunek 2B).

Inhibitory Rho i Smad były używane podczas pierwszych 7 dni hodowli ALI (dni ALI od 0 do 7), a następnie usunięte z pożywki różnicującej na resztę czasu trwania hodowli ALI (Rysunek 3A). Wierzchołkowa powierzchnia monowarstwy komórki podczas hodowli ALI jest wystawiona na działanie powietrza, co umożliwia badanie zaburzeń atmosferycznych. Ekspozycję na hiperoksję monowarstwy komórkowej przeprowadzono z 60%O2 w sposób ciągły przez 7 dni od 7 do 14 dnia ALI przy użyciu inkubatora TriGas. Grupę kontrolną utrzymywano w oddzielnym inkubatorze z ekspozycją na powietrze w pomieszczeniu (21%O2). Biorąc pod uwagę przyszły zamiar zbadania długotrwałych konsekwencji (1-2 tygodnie po zakończeniu ekspozycji naO2) ekspozycji naO2 dla rozwoju i regeneracji nabłonka dróg oddechowych, istotne było, aby narażenie naO2 nie spowodowało ostrej cytotoksyczności lub uszkodzenia błony w stopniu, w którym znacząco zakłóciłoby monowarstwę komórek ALI. Aby ocenić uszkodzenie błony komórkowej, zmierzyliśmy uwalnianie LDH w pożywkach podstawno-bocznych w 14 dniu ALI, które nie wykazały znaczącej różnicy między hiperoksją a kulturami traktowanymi powietrzem w pomieszczeniu (Figura 3B). Aby dalej ocenić, czy efekty cytotoksyczne z O2 były wystarczająco znaczące, aby indukować apoptozę w nTAEC, przeprowadziliśmy immunoblot dla całkowitej kaspazy-3 i rozszczepionej kaspazy-359 na lizatach komórkowych zebranych z hiperoksji i grup narażonych na powietrze w pomieszczeniu w dniu 14 ALI (Figura 3C). Całkowita ekspresja kaspazy-3 była porównywalna między obiema grupami, a rozszczepiona ekspresja kaspazy-3 nie została wykryta, co sugeruje, że 7 dni ekspozycji na 60%O2 nie wywołało apoptozy w nTAEC w 14. dniu ALI. Dodatkowo zaprojektowano kontrolę pozytywną z nocną inkubacją nTAEC w warunkach zanurzenia ze wzrostem stężeń staurosporyny (0,5 μM, 1 μM i 2 μM), czynnika cytotoksycznego i induktora apoptozy. Immunoblotting całkowitej ekspresji kaspazy-3 i rozszczepionej kaspazy-3 potwierdził skuteczną indukcję apoptozy. Aby zmierzyć stres oksydacyjny wywołany ekspozycją na 60%O2, przeprowadzono komórkowy test stresu oksydacyjnego z pomiarem intensywności fluorescencji na monowarstwach komórek nTAEC na ALI 14 (Rysunek 3D)". Ekspozycja na hiperoksję spowodowała znaczny wzrost intensywności fluorescencji (obliczonej na podstawie skorygowanej całkowitej fluorescencji komórek lub CTCF) w porównaniu z komórkami wystawionymi na działanie powietrza w pomieszczeniu, co sugeruje zwiększony komórkowy stres oksydacyjny. Analiza ekspresji genów przeciwutleniających wykazała, że 60% O2 spowodowało regulację w górę tych genów przeciwutleniających w 14 dniu ALI, przy czym katalaza, SOD1, SOD2 i GPX3 były znacznie regulowane w górę (Figura 3E).

figure-results-1
Rysunek 1: Komórki nabłonka tchawicy noworodków (nTAEC) zostały pomyślnie wyizolowane z aspiratów tchawicy noworodków i hodowane na granicy powietrze-ciecz (ALI). (A) nTAEC wyizolowane za pomocą aspiracji tchawicy od zaintubowanych noworodków zostały przeniesione w stanie zanurzonym z późniejszą hodowlą ALI. (B) Komórki pobrano w dniu ALI 0 w celu barwienia immunofluorescencyjnego markerami komórek podstawnych dróg oddechowych - KRT5 (czerwony) i TP63 (czerwony). Jądra są zabarwione na niebiesko za pomocą DAPI. Podziałka = 50 μm. (C) Pomiar przeznabłonkowego oporu elektrycznego (TEER) we wstawkach do hodowli komórkowych za pomocą nabłonkowego woltomierza/omomierza (EVOM). (D) TEER mierzono podczas różnicowania ALI. Dane przedstawione jako średnia (n=2 dawców, 5-10 dołków na dawcę na punkt czasowy). Słupki błędów wskazują SEM. (E) Test przepuszczalności przeznabłonkowej izotiocyjanianianu fluoresceiny (FITC-dekstranu) przeprowadzono podczas różnicowania ALI przy użyciu dwóch różnych mas cząsteczkowych FITC-dekstranu (10 kD i 20 kD). Do komory wierzchołkowej dodano roztwór FITC-dekstranu (10 kD lub 20 kD), a wkładki do hodowli komórkowych inkubowano w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Fluorescencję w ośrodku komory podstawno-bocznej mierzono spektrofotometrycznie w płytkach 96-dołkowych. Fluorescencję tła (pożywki HBTEC) odjęto od pomiarów testowych w celu uzyskania skorygowanej wartości fluorescencji (wyrażonej w procentach w porównaniu z wartościami dnia 0). Dane przedstawione jako średnia (n = 2 dawców, trzy studzienki na dawcę na punkt czasowy dla każdej masy cząsteczkowej dekstranu FITC). Słupki błędów wskazują SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Komórki nabłonka tchawicy noworodków (nTAEC) ulegają różnicowaniu śluzowo-rzęskowemu podczas hodowli na granicy faz powietrze-ciecz (ALI). (A) Komórki zostały pobrane w dniach ALI 0, 7 i 28 do analizy qPCR markerów specyficznych dla komórek nabłonkowych: cytokeratyna-5 (KRT5) dla podstawy, białko J1 (FOXJ1) dla komórek rzęskowych, uteroglobina (SCGB1A1) dla maczugi i mucyna-5AC (MUC5AC) dla komórek kubkowych. Względną ekspresję każdego genu określono metodą δCt z GAPDH jako kontrolą endogenną. Dane przedstawione jako średnia (od n = 3 dawców, trzy studnie na dawcę na punkt czasowy). Słupki błędów wskazują SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu dwukierunkowej ANOVA z analizą post-hoc Tukeya, *p=0,0114, ***p=0,0005, ***p<0,0001. (B) Barwienie immunofluorescencyjne komórek podstawowych (KRT5, czerwony), rzęskowych (acetylowana tubulina lub TUBA4A, zielony), maczugowych (SCGB1A1, czerwony) i kubkowych (MUC5AC, zielony) przeprowadzono w 28. dniu ALI w celu ilościowego określenia różnicowania nabłonka. Jądra są zabarwione na niebiesko za pomocą DAPI. Dane dotyczące procentu (%) komórek dodatnich przedstawione jako średnia (n = 2 dawców, dwie wkładki do hodowli komórkowych na dawcę, 6-8 nienakładających się obrazów na szkiełko, minimum 3000 komórek zliczonych na szkiełku). Słupki błędów wskazują SEM. Podziałka = 50 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Hiperoksja indukuje komórkowy stres oksydacyjny w komórkach nabłonka dróg oddechowych noworodków, ale nie powoduje znaczącego uszkodzenia błony komórkowej ani apoptozy. (A) Eksperymentalny harmonogram ekspozycji nTAEC na hiperoksję przy użyciu inkubatora Trigas. Ekspozycję na tlen rozpoczęto po usunięciu inhibitorów z pożywki różnicującej w 7. dniu ALI i kontynuowano przez 7 dni (ALI od 7 do 14 dnia). (B) Pożywki podstawno-boczne pobrano do testu uwalniania LDH w celu oceny uszkodzenia błony komórkowej między powietrzem w pomieszczeniu (kontrola) a grupą narażoną na 60% O2 (hiperoksja) w 14 dniu ALI. Dane przedstawione jako indywidualne punkty danych (skorygowana absorbancja) z liniami oznaczającymi średnią główną dla każdej grupy, n = 3 dawców oznaczonych odpowiednio czarnymi okręgami, kwadratami i trójkątami z czterema dołkami na dawcę. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t, p=0,6184. (C) Komórki pobrano w 14 dniu ALI i przeprowadzono immunoblotting dla markerów apoptozy (kaspaza-3 i rozszczepiona kaspaza-3) w celu porównania odpowiedzi między powietrzem w pomieszczeniu a nTAEC wystawionymi na działanieO2. Kontrolę pozytywną dla testu zaprojektowano poprzez inkubację nTAEC przez noc ze staurosporyną (Stau 0,5 μM, 1 μM i 2 μM) lub kontrolą nośnika (Veh Ctrl) w warunkach zanurzonej hodowli. Komórki pobrano w celu uzyskania immunoblot z całkowitym przeciwciałem kaspazy-3 i rozszczepionym przeciwciałem kaspazy-3. Densytometrię przeprowadzono z α-tubuliną jako genem porządkowym. Dane przedstawione jako średnia (od n=2-3 dawców, od jednego do dwóch dołków na dawcę). Słupki błędów wskazują SEM. Niesparowany test t zastosowano w celu porównania całkowitej ekspresji kaspazy-3 między powietrzem w pomieszczeniu a grupą 60%O2, p = 0,4. Jednoczynnikowa ANOVA została użyta do porównania całkowitej ekspresji kaspazy-3 i rozszczepionej kaspazy-3 między grupami narażonymi na Veh Ctrl i Stau, *p<0,05, ***p<0,0005. (D) Test CM-H2DCFDA na komórkowy stres oksydacyjny przeprowadzono w 14 dniu ALI z wkładkami do hodowli komórkowych zebranymi z powietrza w pomieszczeniu i nTAEC wystawionymi na działanieO2. Pokazano reprezentatywne obrazy mikroskopii fluorescencyjnej wkładek do hodowli komórkowych naświetlonych powietrzem w pomieszczeniu (kontrola) i 60% O2 (hiperoksja). Skorygowana całkowita fluorescencja komórek (CTCF) została obliczona w celu porównania komórkowego stresu oksydacyjnego między powietrzem w pomieszczeniu a nTAEC narażonymi na 60%O2. Dane CTCF przedstawione jako indywidualne punkty danych z linią oznaczającą średnią wielką dla każdej grupy, 6-7 obrazów/grupę od 2 indywidualnych dawców (czarne kółka i kwadraty) z dwoma dołkami na dawcę. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t, *p<0,05. Pasek skali = 50 μm. (E) Komórki pobrano w 14 dniu ALI z powietrza w pomieszczeniu i przeprowadzono studzienki naświetlone hiperoksją do analizy qPCR genów stresu oksydacyjnego, w tym katalazy, dysmutazy ponadtlenkowej 1 i 2 (SOD1 i SOD2), peroksydazy glutationowej 1, 2 i 3 (GPX1, GPX2 i GPX3). Dane dotyczące zmiany krotności każdego genu określono przy użyciu metody δCt z 18s rRNA jako kontrolą endogenną. Dane przedstawione jako średnia (od n=3 dawców, dwa dołki na dawcę). Słupki błędów wskazują SEM. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu niesparowanego testu t, *p<0,05, **p=0,006. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

powiedział: powiedział: )
Komponent MediaIlośćStężenie końcowe
BLEAM-I
BLEAM media500 ml
Suplement HLL 1,25 ml500 μg/ml albuminy surowicy ludzkiej
0,6 μM kwasu linolowego; 0,6 μg/ml lecytyny
L-glutamina 15 ml6mM
Wyciąg P2 ml0,4% ekstrakt z przysadki bydlęcej
TM15 ml1 μM Epinefryna; 5 μg/ml Transferyna
10 nM trójjodotyronina; 0,1 μg/ml Hydrokortyzon
5ng / ml Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)
5 ng/ml insuliny
Normocin (Normocyna)1 ml0,1 mg/ml
Y-27632Może się różnić w zależności od numeru partii5 μM
A83-01Może się różnić w zależności od numeru partii1 μM
CHIR 99021 Może się różnić w zależności od numeru partii0,4 μM
RapamycynaMoże się różnić w zależności od numeru partii5 nM
Firma HBTEC (HBTEC
Nośniki HBTEC500 ml
Normocin (Normocyna)1 ml0,1 mg/ml
HBTEC-I
Nośniki HBTEC500 ml
Normocin (Normocyna)1 ml0,1 mg/ml
Y-27632Może się różnić w zależności od numeru partii5 μM
A83-01Może się różnić w zależności od numeru partii0,5 μM

Tabela 1: Składniki mediów dla ośrodka nabłonkowego dróg oddechowych z inhibitorami (BLEAM-I), Ludzkie media nabłonkowe komórek oskrzelowych/tchawicy ALI z inhibitorami (HBTEC-I) oraz HBTEC.

Kolba do hodowli komórkowych/wkładki do hodowli komórkowychPożywka kondycjonowana komórkowo 804G (ml)
Kolba T253 ml
Kolba T755 ml
24-dołkowa wkładka do hodowli komórkowej (wielkość porów 0,4 μm, powierzchnia 0,33cm2)400 μL

Tabela 2: Objętości pożywek kondycjonowanych matrycowo pochodzących z komórek 804G wymagane do kolb hodowlanych i wkładek do hodowli komórkowych.

Dyskusja

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje metodę pobierania i przetwarzania próbek aspiratu tchawicy noworodków od zaintubowanych noworodków przebywających na OIOM-ie, a następnie izolacji i namnażania żywych nTAEC z tych próbek przy użyciu wcześniej ustalonych metod39. Ponadto opisaliśmy metodę hodowli nTAEC na ALI i scharakteryzowania ich różnicowania w spolaryzowany nabłonek śluzowo-rzęskowy dróg oddechowych w funkcji czasu poprzez pomiar TEER, test FITC-dekstran, barwienie immunofluorescencyjne i analizę qPCR markerów specyficznych dla typu komórki (tj. podstawowej, rzęskowej, klubowej i kielichowej). Nowatorskim aspektem tego protokołu jest atmosferyczna perturbacja redoks przeprowadzana poprzez umiarkowaną ekspozycję na hiperoksję (60%O2) na rozwijających się monowarstwach nTAEC. Wykazaliśmy, że 60% ekspozycja naO2 przez 7 dni indukuje komórkowy stres oksydacyjny w nTAEC. Dalej pokazujemy, że strategia ekspozycji naO2 nie indukuje ostrej znaczącej apoptozy komórkowej ani uszkodzenia błony komórkowej, co pozwala na utrzymanie tych nTAEC w hodowli ALI po zakończeniu ekspozycji naO2 . W związku z tym model ten może być potencjalnie wykorzystany do badania zarówno krótko-, jak i długotrwałego wpływu ekspozycji naO2 na programowanie nabłonka dróg oddechowych noworodków.

Hodowla nTAEC w ALI daje pewne zalety w porównaniu z konwencjonalną hodowlą zanurzoną, ponieważ sprzyja tworzeniu spolaryzowanej monowarstwy nabłonka dróg oddechowych ze ścisłym tworzeniem połączeń i różnicowaniem śluzowo-rzęskowym60,61. Wcześniejsze badania z nTAEC wykazały, że we wczesnej fazie hodowli ALI (ALI dzień od 0 do 7) komórki ulegają pseudo-stratyfikacji (pojawiają się jako wielowarstwowe, w przeciwieństwie do pojedynczej warstwy komórkowej) i ostatecznie tworzą dojrzały pseudostratyfikowany nabłonek pod koniec drugiego tygodnia 42,62. Tworzenie się ścisłych połączeń przebiega podobną trajektorią we wczesnej fazie hodowli ALI, czemu towarzyszy szybki wzrost TEER z późniejszym plateauem63, co wykazano w modelu z nTAEC. Co więcej, komórki nabłonka dróg oddechowych hodowane w ALI zwiększają ekspresję i wierzchołkowo-boczną lokalizację klaudyny-1 (składnika kompleksu połączeń ścisłych), co zwiększa właściwości uszczelniające połączeń ścisłych podczas hodowli ALI, sprzyjając tworzeniu monowarstwy dojrzałej komórki63. Koreluje to ze zmniejszoną przepuszczalnością parakomórkową, która została przetestowana w modelu z testem FITC-dekstran i wykazała ogólną tendencję spadkową przepuszczalności jednowarstwowej. Nakreśliliśmy wzorzec różnicowania śluzowo-rzęskowego w nTAEC z barwieniem immunologicznym dla markerów specyficznych dla komórek rzęskowych (TUBA4A), klubowych (SCGB1A1) i kubkowych (MUC5AC) w 28. dniu ALI. Dodatkowo przeprowadziliśmy ekspresję genów markerów specyficznych dla komórek rzęskowych (FOXJ1), klubowych (SCGB1A1) i kubkowych (MUC5AC) podczas trwania ALI. Inne grupy wykazały, że czynnik transkrypcyjny FOXJ1 jest niezbędny do ruchliwej ciliogenezy, podczas gdy TUBA4A jest obecny zarówno w rzęskach pierwotnych, jak i ruchliwych 64,65. W tym modelu wzorzec ekspresji genu dla FOXJ1 podczas różnicowania ALI nTAEC z grubsza koreluje z czasem pojawienia się ruchliwych rzęsek w kulturze nabłonka dróg oddechowych z poprzednich badań 64,66.

Niedawne badanie przeprowadzone przez Teape i wsp. oceniło proteomiczne i metabolomiczne skutki ekspozycji na hiperoksję na hodowlę ALI67. Jednak komórki pochodziły od dorosłych dawców. Wcześniejsze badania nad syncytialnym wirusem oddechowym (RSV)62,68,69,70 i niedawną pandemią COVID-19 71 podkreśliły znaczenie związanych z wiekiem różnic w odpowiedzi i funkcji nabłonka dróg oddechowych. Zhao i in. wykorzystali podobne przepływy pracy do wyizolowania komórek nabłonka dróg oddechowych noworodków i dorosłych i wykazali, że po 21 dniach różnicowania ALI nie było znaczących różnic w składzie komórkowym między komórkami nabłonka dróg oddechowych noworodka i dorosłego62. Stwierdzono jednak wyraźne różnice w ich odpowiedzi na zakażenie RSV, przy czym komórki noworodków wykazywały więcej komórek zakażonych RSV i uszkodzeń nabłonka w porównaniu z dorosłymi. Ogólnie rzecz biorąc, warunki hodowli zastosowane przez Zhao i wsp. spowodowały silniejsze zróżnicowanie nTAEC w porównaniu z naszymi, z większą liczbą komórek rzęskowych (41% vs 22%) i kubkowych (10% vs 3%). Różnice te można przypisać zastosowaniu różnych pożywek wzrostowych. Wykazano, że pożywka PneumaCult-ALI stosowana przez ich grupę (w przeciwieństwie do pożywki HBTEC-ALI) indukuje silniejsze różnicowanie przy większej liczbie komórek rzęskowych i kubkowych72. W tym modelu ekspresja genów markerów specyficznych dla typu komórkowego dla komórek rzęskowych, klubowych i kubkowych wykazała początkowy szybki wzrost (ALI dzień od 0 do 7) z późniejszym spadkiem około 28 dnia ALI. Możliwą przyczyną może być plateau różnicowania po 14 dniu ALI, co wykazano w poprzednich badaniach z nTAEC42.

Opisaliśmy stosowanie umiarkowanej ekspozycji na hiperoksję (60%O2) przez 7 dni, co naszym zdaniem bardziej symuluje rzeczywiste doświadczenia wcześniaków na OIOM-ie dla noworodków w porównaniu ze stosowaniem bardzo wysokich poziomówO2 (> 80%O2)67 , gdzie ryzyko ostrej toksycznościO2 jest zwiększone1, Rozdział 5. Rzeczywiście, wykazano, że 95% ekspozycja na O2 w tkance płucnej noworodka indukuje apoptozę komórkową poprzez aktywację kaspazy73. Jednak ta strategia ekspozycji jest istotna tylko u niewielkiego odsetka dzieci przebywających na OIOM-ie, u których w wyniku ostrego uszkodzenia płuc wywołanego przezO2 rozwija się ciężkie BPD z przewlekłymi patologiami oskrzeli (model ostrego uszkodzenia płuc)37. W nowoczesnej erze rozsądnego stosowania terapiiO2 większość wcześniaków nie jest narażona na tak wysoki poziomO2; Jednak nadal są narażeni na rozwój chorób dróg oddechowych w przyszłości (model zaburzeń rozwojowych). W tej ostatniej grupie uraz spowodowany zaburzeniami redoks we wczesnym okresie życia może być początkowo cichy, ale objawia się później w wieku niemowlęcym lub później w postaci przewlekłej choroby dróg oddechowych37. Nasze dane wykorzystujące komórkowy test stresu oksydacyjnego wykazały, że umiarkowana ekspozycja na hiperoksję (60%O2) znacznie zwiększyła stres oksydacyjny w monowarstwie komórki nTAEC. Analiza uwalniania LDH i aktywacji komórkowej kaspazy-3 sugerowała, że nasza strategia ekspozycji na hiperoksję nie spowodowała znaczącej śmierci komórki. Opisane przez nas metody i system modelowy mogą być potencjalnie wykorzystane do odkrycia wrażliwych naO2 mechanizmów molekularnych we wczesnym okresie życia jako ogniwa prowadzącego do późniejszego rozwoju choroby płuc u byłych wcześniaków.

W życiu płodowym komórki nabłonka dróg oddechowych są zanurzone w płynie płucnym i występują w stosunkowo niedotlenionym środowisku wewnątrzmacicznym26. Komórki nabłonka dróg oddechowych noworodków ulegają szybkiemu obrotowi i różnicowaniu oraz tworzą krytyczną barierę między płucami a światem zewnętrznym. Gdy noworodki przechodzą do życia poporodowego, komórki nabłonka dróg oddechowych są wystawione na działanie stosunkowo hiperoksycznego środowiska poporodowego. Przejście to jest bardziej nagłe u wcześniaków i noworodków chorych klinicznie, ponieważ one również rutynowo wymagają terapeutycznego O2 w ramach swojej opieki40,74, co naraża je na wysokie ryzyko uszkodzenia oksydacyjnego po urodzeniu1. Podczas gdy wpływ hiperoksji na poporodową pęcherzyk płucnych został dobrze scharakteryzowany przy użyciu modeli zwierzęcych75, wpływ ekspozycji na hiperoksję na rozwój komórek nabłonka dróg oddechowych jest stosunkowo słabo zbadany38. Wykorzystanie ludzkich komórek nabłonka dróg oddechowych pochodzących od noworodków z fizjologicznie istotną ekspozycją na hiperoksję podczas ALI dodaje naszemu modelowi znaczenia translacyjnego. Ponadto zastosowanie ekspozycji na hiperoksję we wczesnej-środkowej fazie aktywnego różnicowania i tworzenia monowarstwy komórek, a nie w pełni zróżnicowanego dojrzałego nabłonka dróg oddechowych67, potencjalnie symuluje scenariusz kliniczny u skrajnych wcześniaków (< 28 tygodniu ciąży), które rodzą się we wcześniejszych stadiach rozwoju płuc (kanałowo do workowatego), a nie w stadiumpęcherzykowym 7.

Nasz model ma ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę, stosując go do rozwoju człowieka i chorób. Zastosowaliśmy warunkowe przeprogramowanie pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowych noworodka, wcześniej opublikowanych w modelu ALI nTAEC39. Zastosowanie inhibitorów czynników wzrostu (Rho/Smad/GSK3/mTOR) umożliwia szybsze i późniejsze przechodzenie tych komórek. Próbowaliśmy hodować nTAEC zarówno w warunkach zanurzonych, jak i ALI bez inhibitorów w pożywce wzrostowej; jednak ekspansja i pasażowanie tych komórek były znacznie wolniejsze, a monowarstwa komórkowa w ALI stała się nieszczelna pod koniec drugiego tygodnia (dane nie pokazane). Inna grupa wykorzystująca te same inhibitory do hodowli pierwotnych komórek nabłonka dróg oddechowychnoworodków 42 przeprowadziła sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki, aby wykazać, że obecność tych inhibitorów nie powodowała znaczącej zróżnicowanej ekspresji genów zaangażowanych w stres oksydacyjny, przejście nabłonkowo-mezenchymalne lub starzenie się komórek. Niemniej jednak uwzględniliśmy to ograniczenie w naszym modelu i zdecydowaliśmy się przeprowadzić ekspozycję na hiperoksję po usunięciu inhibitorów Rho i Smad z pożywki różnicującej. W tym badaniu przetestowaliśmy tylko umiarkowany wpływ hiperoksji (60%O2) na nTAEC. Jednak przyszłe badania mają na celu wykorzystanie stopniowanej ekspozycji na hiperoksję (40%, 60% i 95%O2) i porównanie odpowiedzi w nTAEC. Chociaż opisany tutaj model ma atrakcyjność translacyjną, biorąc pod uwagę wykorzystanie komórek od ludzkich noworodków przyjętych na OIOM, jest to model hodowli komórkowej in vitro , a zatem znaczące odkrycia wykorzystujące ten model uzasadniałyby potwierdzenie za pomocą komplementarnego modelu zwierzęcego in vivo .

Podsumowując, opisaliśmy krok po kroku metodę tworzenia modelu hodowli ALI in vitro 3D z wykorzystaniem komórek nabłonka dróg oddechowych noworodków wyizolowanych z aspiratów tchawicy zaintubowanych na OIOM-ie. Wykorzystaliśmy ten model do zbadania skutków umiarkowanej ekspozycji na hiperoksję, powszechną zniewagę środowiskową u wcześniaków przebywających na OIOM-ie. Ekspozycja na hiperoksję indukowała komórkowy stres oksydacyjny w monowarstwie komórki, nie powodując znaczącego uszkodzenia błony komórkowej ani śmierci komórki, co pozwoliło na kontynuację hodowli ALI w celu zbadania długotrwałych skutków ekspozycji naO2 na rozwój i funkcję nabłonka dróg oddechowych noworodków. Przyszłe zastosowania wykorzystujące te metody mogą potencjalnie odkryć wczesne mechanizmy chorobowe związane z indukowanym hiperoksją długoterminowym rozwojem chorób płuc, często obserwowanych u wcześniaków.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia ani nie mają do zgłoszenia żadnego konfliktu interesów.

Podziękowania

Ta praca jest wspierana przez fundusze z Presbyterian Health Foundation (PHF) i Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 z Institutional Development Award (IDeA) od NIGMS) dla AG. Chcielibyśmy podziękować dr Paulowi LeRou i dr Xingbin Ai z Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, za dostarczenie komórek dawcy noworodków wykorzystanych w niektórych eksperymentach. Figury zostały stworzone za pomocą Biorenderu. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą GraphPad Prism.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% buforowana formalinaFisher Scientific23-426796
1X roztwór PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem), pH 7,4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
ALI Transwell Inserts, 6,5 mmCorning3470
Anti-acetylated tubulina przeciwciało, mysi monoklonalnySigmaT7451
Przeciwciało anty-alfa tubulinyAbcamab7291
Przeciwciało anty-cytokeratyny 5Abcamab53121
BronchiaLife Nabłonkowe medium do dróg oddechowych (BLEAM)Technologia komórkowa LifeLineLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Rozszczepione przeciwciało kaspazy-3Sygnalizacja komórkowa9664T
SCGB1A1 lub białko z komórek klubowych (CC16) Ludzkie, królicze przeciwciało poliklonalneBioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (Ogólny wskaźnik stresu oksydacyjnego)Thermo ScientificC6827
Kolby T25 poddane hodowli komórek Corning430639
Corning Uning Un-Shaped Cell Culture T75Corning430641U
Test cytotoksyczności CyQUANT LDHThermo ScientificC20300
DAPI Roztwór (1 mg / ml)Fisher ScientificEN62248
Dimetylosulfotlenek [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Woda destylowanaGibco15230162
EVOM Instrukcja pomiaru TEERŚwiatowy precyzyjny instrumentEVM-MT-03-01
FBS (płodowa surowica bydlęca)Gibco10082147
Izotiocyjanian fluoresceiny Dekstran (średnia mol 10 000 m.)Fisher ScientificF0918100MG
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstran (średnia mol wag. 20,00)SigmaFD20-100MG
Koza Anty-Mysie IgG (H + L), Ludzkie reklamy-HRPSouthern Biotech1031-05
Kozie przeciwciało wtórne anty-mysie IgG2b adsorbowane, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Kozie przeciwciało anty-królicze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało wtórne, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Kozia anty-królik IgG (H + L), mysz / człowiek ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Interfejs powietrzno-cieczowy (ALI) Medium różnicujące TechnologiakomórkowaLifeLine LM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Trójgazowy inkubator CO2 Heracell VIOS 160i, 165 lThermo Scientific51030411
zestaw do odwrotnej transkrypcji cDNA o dużej pojemnościSuplement Thermo Scientific4368814
HLLLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/A
Invivogen Normocin - Odczynnik przeciwdrobnoustrojowyFisher ScientificNC9273499
L-GlutaminaLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Normalna surowica koziaGibco
Przeciwciało NormocinInvivogenANT-NR-05
P63Santa Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Testy eksresji genów Taqmana: 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Testy eksresji genów Taqmana: CATThermo ScientificHs00156308_m1
Testy eksresji genu Taqmana: FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Testy eksresji genów Taqmana: GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Testy eksresji genu Taqmana: GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Testy eksresji genu Taqmana: GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Testy eksresji genu Taqmana: GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Testy eksresji genu Taqmana: KRT5Thermo Scientific
Testy eksresji genu Taqmana: MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Testy eksresji genu Taqmana: SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Testy wyeksresji genu Taqmana: SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Testy eksresji genu Taqmana: SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Sterylne jednorazowe filtry o szybkim przepływie z membraną PES (0,22 μ m porów, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Suplement złożonyLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Przeciwciało przeciwko całkowitej kaspazie-3Sygnalizacja komórkowa14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsyna-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGibco25300062
Y-27632 2 HClTocris12-541-0
imagej.nih.gov/ij/ PCN5000Hs00361185_m1

Bibliografia

  1. Torres-Cuevas, I., et al. Oxygen and oxidative stress in the perinatal period. Redox Biol. 12, 674-681 (2017).
  2. Hanidziar, D., Robson, S. C. Hyperoxia and modulation of pulmonary vascular and immune responses in COVID-19. Am J Physiol-Lung Cell Mol Physiol. 320 (1), L12-L16 (2021).
  3. Amarelle, L., Quintela, L., Hurtado, J., Malacrida, L. Hyperoxia and lungs: What we have learned from animal models. Front Med. 8, 606678(2021).
  4. Mach, W. J., Thimmesch, A. R., Pierce, J. T., Pierce, J. D. Consequences of hyperoxia and the toxicity of oxygen in the lung. Nursing Res Pract. 2011, 260482(2011).
  5. Kallet, R. H., Matthay, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respir Care. 58 (1), 123-141 (2013).
  6. Penkala, I. J., et al. Age-dependent alveolar epithelial plasticity orchestrates lung homeostasis and regeneration. Cell Stem Cell. 28 (10), 1775-1789 (2021).
  7. Thébaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  8. Ibrahim, J., Bhandari, V. The definition of bronchopulmonary dysplasia: an evolving dilemma. Pediatr Res. 84 (5), 586-588 (2018).
  9. Higgins, R. D., et al. Bronchopulmonary Dysplasia: Executive summary of a workshop. J Pediatr. 197, 300-308 (2018).
  10. Collins, J. J. P., Tibboel, D., de Kleer, I. M., Reiss, I. K. M., Rottier, R. J. The future of bronchopulmonary Dysplasia: Emerging pathophysiological concepts and potential new avenues of treatment. Front Med (Lausanne). 4, 61(2017).
  11. Northway, W. H., Rosan, R. C., Porter, D. Y. Pulmonary disease following respirator therapy of hyaline-membrane disease. Bronchopulmonary dysplasia. N Engl J Med. 276 (7), 357-368 (1967).
  12. Collaco, J. M., McGrath-Morrow, S. A. Bronchopulmonary dysplasia as a determinant of respiratory outcomes in adult life. Pediatr Pulmonol. 56 (11), 3464-3471 (2021).
  13. Tepper, R. S., Morgan, W. J., Cota, K., Taussig, L. M. Expiratory flow limitation in infants with bronchopulmonary dysplasia. J Pediatr. 109 (6), 1040-1046 (1986).
  14. Davidson, L. M., Berkelhamer, S. K. Bronchopulmonary Dysplasia: Chronic lung disease of infancy and long-term pulmonary outcomes. J Clin Med. 6 (1), 4(2017).
  15. Filbrun, A. G., Popova, A. P., Linn, M. J., McIntosh, N. A., Hershenson, M. B. Longitudinal measures of lung function in infants with bronchopulmonary dysplasia. Pediatr Pulmonol. 46 (4), 369-375 (2011).
  16. Stoll, B. J., et al. Neonatal outcomes of extremely preterm infants from the NICHD Neonatal Research Network. Pediatrics. 126 (3), 443-456 (2010).
  17. Colin, A. A., McEvoy, C., Castile, R. G. Respiratory morbidity and lung function in preterm infants of 32 to 36 weeks gestational age. Pediatrics. 126 (1), 115-128 (2010).
  18. Doyle, L. W., Ranganathan, S., Cheong, J. Bronchopulmonary dysplasia and expiratory airflow at 8 years in children born extremely preterm in the post-surfactant era. Thorax. 78 (5), 484-488 (2022).
  19. Doyle, L. W., et al. Ventilation in extremely preterm infants and respiratory function at 8 Years. N Engl J Med. 377 (4), 329-337 (2017).
  20. Brozmanova, M., Hanacek, J., Tatar, M., Strapkova, A., Szepe, P. Effects of hyperoxia and allergic airway inflammation on cough reflex intensity in guinea pigs. Physiol Res. 51 (5), 529-536 (2002).
  21. Burghardt, J. S., Boros, V., Biggs, D. F., Olson, D. M. Lipid mediators in oxygen-induced airway remodeling and hyperresponsiveness in newborn rats. Am J Respir Crit Care Med. 154, 4 Pt 1 837-842 (1996).
  22. Mazurek, H., Haouzi, P., Belaguid, A., Marchal, F. Persistent increased lung response to methacholine after normobaric hyperoxia in rabbits. Respir Physiol. 99 (2), 199-204 (1995).
  23. Onugha, H., et al. Airway hyperreactivity is delayed after mild neonatal hyperoxic exposure. Neonatology. 108 (1), 65-72 (2015).
  24. Regal, J. F., Lawrence, B. P., Johnson, A. C., Lojovich, S. J., O'Reilly, M. A. Neonatal oxygen exposure alters airway hyper-responsiveness but not the response to allergen challenge in adult mice. Pediatr Allergy Immunol. 25 (2), 180-186 (2014).
  25. Mayer, C. A., et al. CPAP-induced airway hyper-reactivity in mice is modulated by hyaluronan synthase-3. Pediatr Res. 92 (3), 685-693 (2022).
  26. Ganguly, A., Martin, R. J. Vulnerability of the developing airway. Respir Physiol Neurobiol. 270, 103263(2019).
  27. Yee, M., Buczynski, B. W., O'Reilly, M. A. Neonatal hyperoxia stimulates the expansion of alveolar epithelial type II cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (4), 757-766 (2014).
  28. Balasubramaniam, V., Mervis, C. F., Maxey, A. M., Markham, N. E., Abman, S. H. Hyperoxia reduces bone marrow, circulating, and lung endothelial progenitor cells in the developing lung: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292 (5), L1073-L1084 (2007).
  29. Crystal, R. G., Randell, S. H., Engelhardt, J. F., Voynow, J., Sunday, M. E. Airway epithelial cells. Proc Am Thoracic Soc. 5 (7), 772-777 (2008).
  30. Whitsett, J. A. Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance. Ann Am Thor Soc. 15, Supplement_3 S143-S148 (2018).
  31. Davis, J. D., Wypych, T. P. Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium. Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).
  32. Whitsett, J. A., Kalin, T. V., Xu, Y., Kalinichenko, V. V. Building and regenerating the lung cell by cell. Physiol Rev. 99 (1), 513-554 (2019).
  33. Maeda, H., et al. Involvement of miRNA-34a regulated Krüppel-like factor 4 expression in hyperoxia-induced senescence in lung epithelial cells. Respir Res. 23 (1), 340(2022).
  34. Zhu, Y., Mosko, J. J., Chidekel, A., Wolfson, M. R., Shaffer, T. H. Effects of xenon gas on human airway epithelial cells during hyperoxia and hypothermia. J Neonatal Perinatal Med. 13 (4), 469-476 (2020).
  35. Cao, X., et al. Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives. In Vitro Cell Dev Biol - Animal. 57 (2), 104-132 (2021).
  36. Garcia, D., et al. Short exposure to hyperoxia causes cultured lung epithelial cell mitochondrial dysregulation and alveolar simplification in mice. Pediatr Res. 90 (1), 58-65 (2020).
  37. Crist, A. P., Hibbs, A. M. Prematurity-associated wheeze: current knowledge and opportunities for further investigation. Pediatr Res. 94 (1), 74-81 (2022).
  38. Lee, R. M., O'Brodovich, H. Airway epithelial damage in premature infants with respiratory failure. Am Rev Respir Dis. 137 (2), 450-457 (1988).
  39. Amonkar, G. M., et al. Primary culture of tracheal aspirate-derived human airway basal stem cells. STAR Protoc. 3 (2), 101390(2022).
  40. Shui, J. E., et al. Prematurity alters the progenitor cell program of the upper respiratory tract of neonates. Sci Rep. 11 (1), 10799(2021).
  41. Hillas, J., et al. Nasal airway epithelial repair after very preterm birth. ERJ Open Res. 7 (2), 00913-02020 (2021).
  42. Lu, J., et al. Rho/SMAD/mTOR triple inhibition enables long-term expansion of human neonatal tracheal aspirate-derived airway basal cell-like cells. Pediatr Res. 89 (3), 502-509 (2020).
  43. Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells. Meth Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).
  44. You, K., et al. Moderate hyperoxia induces senescence in developing human lung fibroblasts. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 317 (5), L525-L536 (2019).
  45. Wang, H., et al. Severity of neonatal hyperoxia determines structural and functional changes in developing mouse airway. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 307 (4), L295-L301 (2014).
  46. Ravikumar, P., et al. α-Klotho protects against oxidative damage in pulmonary epithelia. Am J Physi-Lung Cell Mol Physiol. 307 (7), L566-L575 (2014).
  47. Hartman, W. R., et al. Oxygen dose responsiveness of human fetal airway smooth muscle cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 303 (8), L711-L719 (2012).
  48. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  49. Bodas, M., et al. Cigarette smoke activates NOTCH3 to promote goblet cell differentiation in human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 64 (4), 426-440 (2021).
  50. Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
  51. Jakubowski, W., Bartosz, G. 2,7-dichlorofluorescin oxidation and reactive oxygen species: what does it measure. Cell Biol Int. 24 (10), 757-760 (2000).
  52. Oksvold, M. P., Skarpen, E., Widerberg, J., Huitfeldt, H. S. Fluorescent histochemical techniques for analysis of intracellular signaling. J Histochem Cytochem. 50 (3), 289-303 (2002).
  53. Hewitt, R. J., et al. Lung extracellular matrix modulates KRT5(+) basal cell activity in pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 6039(2023).
  54. Hawkins, F. J., et al. Derivation of airway basal stem cells from human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 28 (1), 79-95 (2021).
  55. Zou, X. L., et al. Down-expression of Foxj1 on airway epithelium with impaired cilia architecture in non-cystic fibrosis bronchiectasis implies disease severity. Clin Respir J. 17 (5), 405-413 (2023).
  56. Li, X., et al. Low CC16 mRNA expression levels in bronchial epithelial cells are associated with asthma severity. Am J Respir Crit Care Med. 207 (4), 438-451 (2023).
  57. Li, T., Wang, Y., Huang, S., Tang, H. The regulation mechanism of MUC5AC secretion in airway of obese asthma. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 68 (7), 153-159 (2022).
  58. Nekooki-Machida, Y., Hagiwara, H. Role of tubulin acetylation in cellular functions and diseases). Med Mol Morphol. 53 (4), 191-197 (2020).
  59. Creagh, E. M., Conroy, H., Martin, S. J. Caspase-activation pathways in apoptosis and immunity. Immunol Rev. 193, 10-21 (2003).
  60. Abo, K. M., et al. Air-liquid interface culture promotes maturation and allows environmental exposure of pluripotent stem cell-derived alveolar epithelium. JCI Insight. 7 (6), e155589(2022).
  61. Guénette, J., Breznan, D., Thomson, E. M. Establishing an air-liquid interface exposure system for exposure of lung cells to gases. Inhal Toxicol. 34 (3-4), 80-89 (2022).
  62. Zhao, C., et al. Age-related STAT3 signaling regulates severity of respiratory syncytial viral infection in human bronchial epithelial cells. bioRxiv. , (2023).
  63. Lochbaum, R., et al. Retinoic acid signalling adjusts tight junction permeability in response to air-liquid interface conditions. Cellular Signalling. 65, 109421(2020).
  64. Jain, R., et al. Temporal relationship between primary and motile ciliogenesis in airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (6), 731-739 (2010).
  65. You, Y., et al. Role of f-box factor foxj1 in differentiation of ciliated airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 286 (4), L650-L657 (2004).
  66. Pan, J., You, Y., Huang, T., Brody, S. L. RhoA-mediated apical actin enrichment is required for ciliogenesis and promoted by Foxj1. J Cell Sci. 120, Pt 11 1868-1876 (2007).
  67. Teape, D., et al. Hyperoxia impairs intraflagellar transport and causes dysregulated metabolism with resultant decreased cilia length. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (3), L325-L334 (2023).
  68. Hall, C. B. Respiratory syncytial virus and parainfluenza virus. N Engl J Med. 344 (25), 1917-1928 (2001).
  69. Guillien, A., et al. Determinants of immunoglobulin G responses to respiratory syncytial virus and rhinovirus in children and adults. Front Immunol. 15, 1355214(2024).
  70. Ito, K., Daly, L., Coates, M. An impact of age on respiratory syncytial virus infection in air-liquid-interface culture bronchial epithelium. Front Med (Lausanne). 10, 1144050(2023).
  71. Zimmermann, P., Curtis, N. Why does the severity of COVID-19 differ with age?: Understanding the mechanisms underlying the age gradient in outcome following SARS-CoV-2 infection. Pediatr Infect Dis J. 41 (2), e36-e45 (2022).
  72. Leung, C., Wadsworth, S. J., Yang, S. J., Dorscheid, D. R. Structural and functional variations in human bronchial epithelial cells cultured in air-liquid interface using different growth media. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1063-L1073 (2020).
  73. Dieperink, H. I., Blackwell, T. S., Prince, L. S. Hyperoxia and apoptosis in developing mouse lung mesenchyme. Pediatric research. 59 (2), 185-190 (2006).
  74. Looi, K., et al. Preterm birth: Born too soon for the developing airway epithelium. Paediatr Respir Revi. 31, 82-88 (2019).
  75. Hilgendorff, A., Reiss, I., Ehrhardt, H., Eickelberg, O., Alvira, C. M. Chronic lung disease in the preterm infant. Lessons learned from animal models. Am J Respir Cell Mol Biol. 50 (2), 233-245 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Tr jwymiarowa hodowla kom rkowaekspozycja na hiperoksjnoworodkowe kom rki dr g oddechowychinterfejs powietrze ciecztest stresu oksydacyjnegogoizolacja z aspiratu tchawiczegor nicowanie mukocyliarnepolaryzacja monowarstwy kom rkowejnoworodkowa choroba p uc
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.