Artykuł metodologiczny

Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego

3.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65926

⸱

22 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, NYU Grossman School of Medicine, 2The Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Langone Health, 3Department of Cell Biology, NYU Grossman School of Medicine, 4Howard Hughes Medical Institute, NYU Grossman School of Medicine, 5Institute of Enzymology, Centre of Excellence of the Hungarian Academy of Sciences, HUN-REN Research Centre for Natural Sciences

W tym artykule

Podsumowanie

Poniższy protokół przedstawia wykrywanie jednoniciowych ognisk DNA w fazie G1 cyklu komórkowego za pomocą synchronizacji cyklu komórkowego, a następnie barwienia immunofluorescencyjnego RPA2.

Streszczenie

DNA posiada dedykowane ścieżki naprawy komórek, zdolne do radzenia sobie ze zmianami chorobowymi, które mogą pochodzić zarówno z endogennych, jak i / lub egzogennych źródeł. Naprawa DNA wymaga współpracy między wieloma białkami, odpowiedzialnymi za szeroki zakres zadań, od rozpoznawania i sygnalizowania obecności uszkodzenia DNA po jego fizyczną naprawę. Podczas tego procesu często powstają ślady jednoniciowego DNA (ssDNA), które ostatecznie są wypełniane przez polimerazy DNA. Charakter tych ścieżek ssDNA (zarówno pod względem długości, jak i liczby), wraz z polimerazą rekrutowaną w celu wypełnienia tych luk, jest specyficzny dla ścieżki naprawy. Wizualizacja tych śladów ssDNA może pomóc nam zrozumieć skomplikowaną dynamikę mechanizmów naprawy DNA.

Ten protokół dostarcza szczegółową metodę przygotowania zsynchronizowanych komórek G1 do pomiaru powstawania ognisk ssDNA pod wpływem stresu genotoksycznego. Korzystając z łatwego do zastosowania podejścia immunofluorescencyjnego, wizualizujemy ssDNA poprzez barwienie pod kątem RPA2, składnika kompleksu heterotrimerycznego białka replikacyjnego A (RPA). RPA2 wiąże się i stabilizuje produkty pośrednie ssDNA, które powstają w wyniku stresu genotoksycznego lub replikacji, w celu kontrolowania naprawy DNA i aktywacji punktów kontrolnych uszkodzenia DNA. Barwienie 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) służy do wizualizacji replikacji DNA w celu wykluczenia jakichkolwiek komórek fazy S. Protokół ten zapewnia alternatywne podejście do konwencjonalnych, niedenaturujących testów opartych na 5-bromo-2'-deoksyurydynie (BrdU) i lepiej nadaje się do wykrywania ognisk ssDNA poza fazą S.

Wprowadzenie

Aby podtrzymać życie, komórki nieustannie badają i naprawiają DNA, aby zachować integralność genomu. Komórki mogą akumulować różne rodzaje uszkodzeń DNA z powodu zarówno endogennych (np. utlenianie, alkilowanie, deaminacja, błędy replikacji), jak i egzogennych (np. UV, promieniowanie jonizujące) źródeł stresorów DNA. Niepowodzenie w naprawie tych zmian skutkuje apoptozą, zatrzymaniem cyklu komórkowego lub starzeniem się i może prowadzić do chorób1. Uszkodzenia DNA mogą być zwalczane przez jeden z następujących głównych szlaków naprawy DNA: DR (direct reversal repair), który głównie naprawia alkilowane zasady2; BER (naprawa przez wycinanie zasady), która jest ukierunkowana na nieduże błędy zasad DNA i pęknięcia jednoniciowego DNA (SSBs)3; NER (naprawa przez wycinanie nukleotydów) korygowanie dużych, zniekształcających helisę zmian DNA 4; MMR (naprawa niezgodności) ukierunkowana głównie na niedopasowania DNA, pętle insercji/delecji (IDL) i niektóre uszkodzenia podstawowe5; NHEJ (niehomologiczne łączenie końców) i HRR (homologiczna naprawa rekombinacji), które są aktywne przy dwuniciowych pęknięciach DNA (DSB)6; oraz TLS (synteza translezji), która jest mechanizmem omijania uszkodzeń DNA7. Chociaż ścieżki te mają różną specyfikę substratu, istnieją między nimi pewne nakładanie się, aby zapewnić redundancję w celu skutecznej naprawy. Zrozumienie działania różnych szlaków naprawy DNA w różnych fazach cyklu komórkowego jest kluczowe, ponieważ te czynniki naprawy DNA mogą służyć jako podstawowe cele dla podejść terapeutycznych w leczeniu raka, starzenia się i zaburzeń neurologicznych8,9.

Jednoniciowe DNA (ssDNA) jest generowane przez cały cykl komórkowy w wyniku naprawy uszkodzeń DNA generowanych zarówno przez endogenne, jak i egzogenne czynniki uszkadzające DNA. W przypadku stresu genotoksycznego ssDNA jest generowane obficie w fazach S i G2, w których HRR i MMR mają najwyższą aktywność i gdy maszyneria replikacji zatrzymuje się lub załamuje w przypadku napotkania uszkodzeń DNA6,10,11. Inne szlaki naprawy DNA (np. NHEJ/łączenie końców za pośrednictwem mikrohomologii (MMEJ)/wyżarzanie pojedynczej nici [SSA]) również generują ssDNA podczas naprawy DSB12. Te ślady ssDNA zwykle powstają w wyniku resekcji DNA, przeprowadzanej przez egzonukleazy, takie jak EXO1, DNA2 i CtIP podczas HR i MMR, endonukleazy, takie jak XPF i XPG podczas NER, lub w wyniku połączonego działania POLB i FEN1 podczas BER4,13,14,15,16,17,18,19. Ze względu na pracę maszynerii replikacyjnej, ślady ssDNA są również generowane, gdy helikazy DNA rozwijają DNA przed polimerazami replikacyjnymi związanymi z PCNA20. Natomiast w fazie G1 brak HRR i replikacji DNA oraz ograniczona aktywność MMR zmniejszają zakres generowanych śladów ssDNA i dlatego są trudniejsze do wykrycia10,11,21.

Ślady komórkowe ssDNA są bardzo wrażliwymi strukturami, które muszą być chronione, aby uniknąć powstawania DSB. Osiąga się to poprzez pokrycie ścieżek ssDNA RPA. RPA to obfity heterotrimeryczny kompleks białkowy złożony z wielu podjednostek (RPA1, RPA2 i RPA3, określanych również odpowiednio jako RPA70, RPA32 i RPA14), które ulegają wszechobecnej ekspresji w całym cyklu komórkowym22. Każda podjednostka RPA zawiera domenę wiążącą DNA (DBD), zdolną do interakcji z 4-6 nukleotydami, a połączone podjednostki tworzą stabilny rdzeń trimeryzacyjny. W sumie RPA wiąże się z około 20-30 nukleotydami o powinowactwie subnanomolowym23,24.

Konwencjonalne metody wykorzystują mikroskopię immunofluorescencyjną (IF) do wizualizacji ognisk ssDNA poprzez znakowanie 5-bromo-2'-deoksyurydyny (BrdU) włączonej do genomowego DNA za pomocą przeciwciał BrdU25. Podejście to opiera się na fakcie, że przeciwciała BrdU mogą wykryć BrdU tylko w odsłoniętym ssDNA25. Chociaż takie podejście jest proste, ma również pewne ograniczenia. Na przykład, komórki są poddawane wstępnej obróbce w celu włączenia BrdU przed rozpoczęciem eksperymentu, co jest czasochłonne i może zakłócać działanie efektorów. Dlatego wykrywanie ssDNA oparte na BrdU jest ograniczone do replikacji komórek i nie może być stosowane w przypadku komórek w stanie spoczynku. Wyklucza to zastosowanie tej metody do badania naprawy DNA w komórkach niereplikujących, pomimo jej znaczenia w wielu chorobach, takich jak rak i neurodegeneracja5,26. Dodatkowo, ponieważ struktury BrdU i EdU są bardzo podobne, większość przeciwciał BrdU wykazuje reaktywność krzyżową w stosunku do EdU, co należy wziąć pod uwagę, dążąc do eksperymentów z podwójnym znakowaniem27. Barwienie RPA było wcześniej wykorzystywane do pokazywania ognisk ssDNA, głównie w komórkach fazy S; jednak niektóre artykuły z powodzeniem używały go również poza fazą S28,29,30,31,32,33,34,35. Poniższy protokół efektywnie wykorzystuje właściwości RPA, umożliwiając wizualizację ognisk ssDNA po uszkodzeniu DNA w fazie G1 cyklu komórkowego (chociaż może być stosowany we wszystkich fazach cyklu komórkowego).

Protokół

1. Utrzymanie komórek nabłonka barwnikowego siatkówki unieśmierconych hTERT (RPE1)

  1. Utrzymuj linie komórkowe RPE1 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnione 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (Hi-FBS) i 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny (zwanej od teraz pożywką hodowlaną) w wilgotnym inkubatorze z 5% CO2 w temperaturze 37 °C. W przypadku rutynowej hodowli hoduj komórki RPE1 w 15-centymetrowym naczyniu poddanym kulturze tkankowej i podziel po osiągnięciu 80-90% zbiegu (~16-18 × 106 komórek na 15 cm naczynie).
  2. Podczas dzielenia usuń pożywkę i przepłucz komórki 10 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  3. Dodaj 3 ml 0,05% trypsyny-EDTA, aby pokryć całą powierzchnię naczynia. Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C z trypsyną, aż się oderwą.
  4. Po trypsynizacji ponownie zawiesić komórki za pomocą pożywki hodowlanej i odwirowywać je w temperaturze 150 × g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT, 22-25 °C). Usunąć supernatant i delikatnie zawiesić komórki w 10 ml pożywki hodowlanej.
  5. Wysiew 1,6-1,8 × 106 komórek do nowego 15 cm naczynia (~1 ml zawiesiny komórek).
    UWAGA: Wszystkie prace związane z hodowlą tkankową powinny być wykonywane zgodnie z poziomami bezpieczeństwa BSL-2. Czas inkubacji trypsynizacji zależy od zbiegu komórek. Zwykle proces ten trwa 2-3 minuty w przypadku 90% zlewającej się płytki. Komórki powinny być regularnie badane pod kątem zanieczyszczenia Mycoplasma za pomocą dostępnych na rynku zestawów (patrz przykłady w Tabeli materiałów).

2. siRNA niszczące gen będący przedmiotem zainteresowania (GOI)

  1. Wysiew 1.0 × 106 komórek RPE1 na 10 cm płytce poddanej działaniu kultury tkankowej z 10 ml pożywki hodowlanej w dniu poprzedzającym transfekcję.
  2. W dniu transfekcji należy złożyć siRNA. W przypadku płytki o średnicy 10 cm należy użyć końcowego stężenia 20 nM siRPA2 i 12 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w 500 μl pożywki do transfekcji o niskiej surowicy. Delikatnie wymieszać wszystkie składniki, przesuwając probówkę i inkubować w temperaturze pokojowej (22-25 °C) przez 5 minut.
  3. Dodaj skompleksowaną mieszaninę siRNA do komórek kroplami i inkubuj komórki z siRNA przez 48 godzin.

3. Synchronizacja komórek RPE1 z fazą G0

  1. Trypsynizuj komórki RPE1 z kroku 2.3, jak opisano w sekcji 1 (~2 × 106 komórek).
  2. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml i odwirować w temperaturze 150 × g, RT (22-25 °C) przez 5 minut.
  3. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić komórki w 12 ml PBS. Odwirować komórki w temperaturze 150 × g w temperaturze pokojowej (22–25 °C) przez 5 minut. Powtórzyć usuwanie supernatantu i dwukrotnie odwirowanie.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml bezsurowicowego DMEM uzupełnionego 100 μg/ml penicyliny-streptomycyny, 1 mM pirogronianu sodu, 15 mM HEPES i umieścić je na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej.
    UWAGA: Jeśli komórki mają tendencję do zbrylania się, zawieś je ponownie w zaledwie 1 ml DMEM bez surowicy i pipetuj je w górę iw dół 5 razy za pomocą końcówki P1000, aby usunąć grudki przed rozcieńczeniem zawiesiny do końcowej objętości 10 ml.
  5. Po 24 godzinach głodzenia surowicy wprowadzić drugą rundę wyciszania, stosując tę samą procedurę, jak opisano w sekcji 2, dodając skompleksowane siRNA do komórek głodujących surowicę.
  6. Przechowuj komórki RPE1 w DMEM bez surowicy przez 72 godziny przed przystąpieniem do uwalniania G1.

4. Powlekanie szkiełkiem nakrywkowym i uwalnianie komórek do fazy G1

  1. Wysterylizuj pęsetę 70% etanolem i umieść pojedyncze szklane szkiełko nakrywkowe (o średnicy 12 mm i grubości #1,5 [0,17 mm]) w dołku na 24-dołkowej płytce.
  2. Rozcieńczyć matrycę powlekającą witronektyną PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μg/ml. Dodać 500 μl roztworu witronektyny do każdej studzienki zawierającej szkiełka nakrywkowe i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
  3. Usunąć roztwór powlekający i umyć szkiełka nakrywkowe 1 ml PBS.
  4. Odłącz pozbawione surowicy komórki RPE1 od 10-centymetrowej płytki poddanej hodowli tkankowej za pomocą 1 ml 0,05% trypsyny po płukaniu PBS przez 1 minutę w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Komórki odklejają się znacznie szybciej po głodzeniu surowicy. Zachowaj ostrożność podczas mycia komórek PBS i stosuj krótkie czasy trypsynizacji.
  5. Aby dezaktywować trypsynę, należy ponownie zawiesić komórki RPE1 w łącznie 6 ml pożywki hodowlanej. Usunąć inaktywowaną trypsynę, obracając komórki za pomocą 150 × g w temperaturze suchej temperatury (22-25 °C) przez 5 minut.
  6. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej i zmierzyć liczbę komórek.
  7. Seed 4 × 104 komórki RPE1 na powlekanym szkiełku nakrywkowym w sumie 500 μl podłoża hodowlanego.
    UWAGA: Upewnij się, że żywotność ogniw przekracza 90% przed przejściem do dalszych etapów. Żywotność komórek można szybko ocenić za pomocą barwienia błękitem trypanowym na etapie liczenia komórek.
  8. Po 6 godzinach posiewu komórek w pożywce hodowlanej, komórki uwolnione przez G0 znajdą się we wczesnej fazie G1. Wykonuj eksperymenty w G1 w tym 6-12-godzinnym oknie, zanim komórki zaczną wchodzić w fazę S.
  9. Przed wprowadzeniem uszkodzenia DNA należy pulsować komórki 10 μM 5-etynylo-2'-deoksyurydyną (EdU) przez 30 minut w temperaturze 37 °C, rozcieńczoną w pożywce hodowlanej.
  10. Usunąć pożywkę zawierającą EdU i gonić komórki z 10 μM tymidyną przez 10 minut w temperaturze 37 °C, aby zapobiec pozostałej inkorporacji EdU podczas indukcji uszkodzenia DNA.
  11. Usunąć pożywkę z tymidyną i potraktować komórki 250 μM H2O2 przez 1 godzinę, rozcieńczone w pożywce hodowlanej.

5. Barwienie immunofluorescencyjne ssDNA

  1. Umyj komórki raz 1 ml PBS w temperaturze 1 ml PBS w temperaturze RT (22-25 °C) w celu usunięcia pożywki i składników surowicy.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas mycia komórek, aby uniknąć oderwania i wysuszenia. Nie przetwarzaj wielu studni w tym samym czasie.
  2. Ekstrakcja wstępna: Inkubować umyte komórki w 1 ml buforu ekstrakcyjnego CSK (Tabela 1) przez 5 minut w temperaturze pokojowej (22–25 °C).
    UWAGA: Wstępna ekstrakcja CSK usuwa wszystkie białka niezwiązane z chromatyną, w tym rozpuszczalne RPA2.
    UWAGA: Triton X-100 jest szkodliwy po połknięciu i może powodować podrażnienie skóry i uszkodzenie oczu.
  3. Usunąć bufor CSK z komórek i utrwalić je bezpośrednio, dodając 0,5 ml 3,6% roztworu paraformaldehydu (w PBS) zawierającego 0,05% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
    UWAGA: Ważne jest, aby przygotować 3,6% PFA z 32% bulionu PFA na świeżo. Paraformaldehyd może powodować poważne uszkodzenie oczu, podrażnienie skóry i podrażnienie dróg oddechowych.
  4. Umyj komórki raz 1 ml PBS zawierającego 0,05% Triton X-100 w celu usunięcia PFA.
  5. Dalszą przepuszczalność komórek za pomocą 1 ml PBS zawierającego 0,5% Triton X-100 przez 15 minut w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
  6. Reakcja EdU click-IT do wizualizacji replikujących się komórek (faza S)
    1. Usunąć roztwór permeabilizacyjny i przemyć komórki 2x przy użyciu 1 ml buforu blokującego (Tabela 1).
      UWAGA: Albumina surowicy bydlęcej (BSA) może powodować podrażnienie dróg oddechowych.
    2. Dodać 1 ml buforu blokującego (Tabela 1) i delikatnie kołysać płytką zawierającą szkiełko nakrywkowe przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
    3. Usunąć bufor blokujący i dodać 500 μl koktajlu reakcji na kliknięcie zawierającego azydek pikolylu 647 (Tabela 1). Inkubować szkiełka nakrywkowe przez 30 minut w temperaturze pokojowej (22–25 °C), delikatnie kołysząc, a następnie inkubować w ciemności.
      UWAGA: W przypadku stosowania przeciwciał BrdU należy użyć podwójnej ilości (1 ml) i czasu (60 min) reakcji kliknięcia zgodnie z zaleceniami producenta, aby upewnić się, że reakcja jest nasycona, a wbudowany EdU jest oznakowany. Ogranicza to reaktywność krzyżową przeciwciał BrdU27.
  7. Usuń mieszaninę reakcji kliknięcia i przemyj komórki 2x PBS z 0,05% Triton X-100 przez 10 minut w temperaturze RT (22-25 °C) (Rysunek 1 i Rysunek 2).
  8. Dodać 1 ml buforu blokującego i inkubować w temperaturze pokojowej (22-25 °C) przez 30 minut. Alternatywnie należy przez noc utrzymywać komórki w buforze blokującym w temperaturze 4 °C.
  9. Stosować przeciwciało pierwszorzędowe (szczur anty-RPA2, rozcieńczenie 1:1 000) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (22-25 °C) w 250-500 μl buforu blokującego z delikatnym kołysaniem.
  10. Przemyj komórki 2x PBS zawierającym 0,05% Triton X-100, aby szybko usunąć większość roztworu przeciwciał.
  11. Kontynuować mycie komórek przez 3 x 10 minut z buforem blokującym w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
  12. Zastosować przeciwciało drugorzędowe (antyszczurze Alexa-488, rozcieńczenie 1:1,000) w 250-500 μl buforu blokującego w temperaturze RT (22-25 °C) przez 2 godziny z delikatnym kołysaniem.
  13. Umyj komórki buforem blokującym 2x, aby szybko usunąć większość przeciwciał drugorzędowych. Kontynuować mycie komórek przez 3 x 10 minut PBS zawierającym 0,05% Triton X-100 w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
  14. Aby przeciwdziałać barwieniu jąder, należy przemyć komórki raz PBS zawierającym 0,05% Triton X-100 i 1 μg/ml 4',6-diamidino-2-fenyloindolu (DAPI) przez 10 minut w temperaturze pokojowej (22-25 °C). Przemywać komórki raz PBS przez 5 minut w temperaturze pokojowej (22-25 °C).
  15. Zamontuj szkiełko nakrywkowe na szkiełkach mikroskopowych za pomocą 10 μl medium montażowego/szkiełka nakrywkowego. Przed montażem zanurz szkiełka nakrywkowe w wodzie destylowanej, aby pozbyć się kryształków soli. Zobrazuj slajdy następnego dnia i przechowuj je w temperaturze 4 °C przez tygodnie (Rysunek 3).

6. Akwizycja obrazu i kwantyfikacja

  1. Aby uchwycić obrazy, użyj dowolnego dostępnego mikroskopu epifluorescencyjnego wyposażonego w rutynowe zestawy filtrów do obrazowania kanałów DAPI, FITC i Cy5 z co najmniej 60-63-krotnym powiększeniem, dużą aperturą numeryczną i obiektywami olejowymi do wizualizacji ognisk jądrowych.
    UWAGA: Optymalne wzbudzenie DAPI wynosi ~359 nm; Wzbudzenie Alexa 488 wynosi ~488 nm; podczas gdy wzbudzenie Alexa 647 wynosi ~647 nm.
  2. Aby przeprowadzić analizę obrazu, otwórz pliki obrazów w Fidżi/ImageJ.
    1. Wykonaj maski nuklearne za pomocą barwienia DAPI (Rysunek 4A-F i dodatkowe wideo S1).
      1. Otwórz obraz DAPI.
      2. Wybierz punkt menu Process (Proces) | Zwiększ kontrast i ustaw nasycony piksel na 0,35.
      3. Kliknij opcję Process (Proces) | Binarny | Konwertuj na maskę. Wybierz opcję Binarny | Wypełnij otwory i kliknij Analizuj | Analizuj cząstki. Ustaw rozmiar na 10-Nieskończoność.
      4. W menedżerze ROI kliknij Pokaż wszystko.
    2. Znajdowanie ognisk RPA2 w jądrze (Rysunek 4G,H i dodatkowe wideo S1)
      1. Otwórz obraz RPA2.
      2. Wybierz proces | Znajdź Maximę. Ustaw pretensjonalność na wartość, która podświetla ogniska RPA2 (od 500 do 750), oddzielając je od tła.
      3. Na koniec kliknij przycisk Zmierz w Menedżerze zwrotu z inwestycji.
      4. Oblicz całkowitą liczbę ognisk jądrowych ssDNA, dzieląc wartość w kolumnie RawinDen przez 255 (maksymalna wartość intensywności pikseli w każdym ognisku).
    3. Przeprowadzanie analiz statystycznych przy użyciu preferowanego oprogramowania statystycznego.
      UWAGA: Wyklucz z analizy wszystkie komórki EdU-dodatnie i nieprawidłowo segmentowane maski DAPI.

Wyniki

Aby pokonać ograniczenia w wykrywaniu ssDNA w fazie G1, wykorzystaliśmy RPA2, który zwiększa zarówno swoistość, jak i intensywność wykrywania ognisk ssDNA35. W celu precyzyjnej synchronizacji komórek użyliśmy komórek RPE1, które można efektywnie poddać głodzeniu surowiczemu i zsynchronizować w fazie G0. Następnie można je pobudzić do ponownego wejścia w cykl komórkowy poprzez dodanie surowicy po okresie deprywacji. Aby potwierdzić wydajność synchronizacji, oznakowaliśmy komórki za pomocą EdU, a zawartość ich DNA za pomocą jodku propidyny. Dodatkowo zebraliśmy wyniki jakościowe i ilościowe za pomocą cytometrii przepływowej (Supplementary Figure S1A). Wykresy kropkowe pokazują, że po 72 h głodzenia surowiczego ~98% komórek znajduje się w fazie G0. Po dodaniu pożywki zawierającej surowicę przez 6 h, komórki ponownie wchodzą w cykl komórkowy (co widać po wzroście poziomu p27 na Figure 1A), przy czym ~97% komórek znajduje się w fazie G1, podczas gdy tylko <1% komórek jest w fazie S i <2% komórek w fazie G2 (Supplementary Figure S1A). Po 20-28 h od dodania surowicy do komórek, stopniowo przechodzą one przez fazę S, co pokazują wykresy cytometrii przepływowej (Supplementary Figure S1A). Ten protokół synchronizacji komórek daje populację G1 o czystości ~97% (6 h po dodaniu surowicy po 72 h głodzenia surowiczego). Aby dalej zweryfikować wydajność synchronizacji, porównaliśmy ekspresję markerów cyklu komórkowego po przywróceniu surowicy za pomocą analizy western blotting (Figure 1A oraz Supplementary Figure S1B), a równolegle przeprowadziliśmy test inkorporacji EdU w celu wizualizacji replikacji DNA. Barwienie EdU podkreśla również wydajność synchronizacji oraz brak replikacji DNA w fazie G1 (Figure 1B,C).

Konwencjonalne metody wykrywania ssDNA w komórkach ssaków opierają się na detekcji BrdU w ssDNA. Rycina 2A pokazuje, że po traktowaniu H2O2 oraz neokarzinostatyną (NCS) ogniska BrdU były wykrywalne tylko w komórkach w fazie S, podczas gdy w komórkach poza fazą S nie wykryto żadnych ognisk ssDNA. Barwienie przeciwciałem przeciwko BrdU wykazało również wyraźne tło w jąderkach, które można było zaobserwować we wszystkich jądrach, niezależnie od fazy cyklu komórkowego lub zastosowanych zabiegów. Stosując opisany tutaj protokół EdU click, nie udało nam się wykryć kolokalizujących ognisk EdU i BrdU, co jest widoczne w niepoddanych działaniu preparatach na Rycini 2A. Aby całkowicie wykluczyć sygnał BrdU wynikający z reaktywności krzyżowej, zrezygnowaliśmy z znakowania EdU i zamiast tego wykorzystaliśmy cyklinę A2 jako marker faz S-G2. Jednak barwienie cykliną A2 nie pozwalało na preekstrakcję CSK, a w tych warunkach nie zaobserwowaliśmy żadnych ognisk BrdU, nawet po stresie genotoksycznym (Rycina uzupełniająca S2A). Podkreśla to fakt, że preekstrakcja CSK jest niezbędna do barwienia ssDNA opartego na przeciwciałach anty-BrdU. W ramach kontroli przetestowaliśmy barwienie przeciwciałem przeciwko BrdU w warunkach denaturujących. Powoduje to otwarcie DNA i odsłonięcie wbudowanego BrdU, co wykazało, że BrdU zostało wbudowane równomiernie (Rycina uzupełniająca S2B).

W przeciwieństwie do tego, barwienie RPA2 wykazuje zależną od NCS i H2O2 formację ognisk nie tylko w fazie S, ale także w innych fazach cyklu komórkowego (Rycyna 2B). W ramach kontroli potraktowaliśmy komórki HU, co powoduje akumulację ssDNA wyłącznie w komórkach przechodzących replikację. Zgodnie z oczekiwaniami, po zastosowaniu przeciwciała RPA2 wzrost sygnału po traktowaniu HU wykryto jedynie w komórkach EdU-dodatnich, co podkreśla specyficzność tego podejścia. Przeciwciało RPA2 może również wykrywać naturalnie występującą formację ssDNA podczas replikacji w przypadku braku egzogennego stresu genotoksycznego (Rycyna 2B). Wysoka czułość przeciwciała RPA2 skłoniła nas do próby wykorzystania go w fazie G1, w której konwencjonalne barwienie BrdU nie wykazało żadnego sygnału po stresie genotoksycznym (Rycina uzupełniająca S2C). Rycina 3A pokazuje, że formację ognisk ssDNA po traktowaniu H2O2 można było wykryć przy użyciu przeciwciała anty-RPA2, nawet w fazie G1. Po traktowaniu H2O2 w jądrach tych komórek odnotowano istotny wzrost liczby ognisk RPA2 (Rycina 3B). Ogniska te były specyficzne dla RPA2, ponieważ wyciszenie RPA2 zniosło sygnał IF (Rycina 3A,B). Rycina 3C oraz Rycina uzupełniająca S1C przedstawiają wydajność wyciszenia RPA2 w tych komórkach. W porównaniu z konwencjonalnymi metodami, detekcja ssDNA oparta na RPA2 jest wysoce czuła, a zatem jej zastosowanie można rozszerzyć na komórki w fazie G1.

Analiza białek cyklu komórkowego; obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; Western blotting; wyniki testu EdU.
Rycina 1: Efektywność synchronizacji komórek RPE1 po głodzeniu surowiczym. (A) Immunobloty przedstawiają poziomy wskazanych białek w asynchronicznych komórkach RPE1 oraz komórkach zsynchronizowanych w fazach G1 i S. (B) Reprezentatywne obrazy przedstawiają asynchroniczne komórki RPE1 oraz komórki zsynchronizowane w fazach G1 i S, które przed utrwaleniem były eksponowane na 10 µM EdU przez 30 min, a następnie wizualizowane za pomocą reakcji Click-IT. Do barwienia przeciwstawnego DNA jądrowego użyto DAPI. Paski skali = 50 µm. (C) Wykres przedstawia odsetek komórek EdU-dodatnich w całkowitej populacji komórek ocenianej za pomocą DAPI. Słupek błędu reprezentuje błąd standardowy średniej, a analizowana liczba jąder wynosiła odpowiednio: AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Skróty: RPE1 = unieśmiertelnione hTERT komórki nabłonka barwnikowego siatkówki; AS = asynchroniczne; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyurydyna; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki mikroskopii immunofluorescencyjnej analizy cyklu komórkowego z użyciem DAPI, EdU i ssDNA (BrdU/RPA2).
Rycina 2: Detekcja ssDNA przy użyciu przeciwciała BrdU lub przeciwciała RPA2 po uszkodzeniu DNA. (A) Reprezentatywne obrazy ilustrują ogniska ssDNA z użyciem αBrdU (zielony), komórki w fazie S są zaznaczone EdU (fioletowy), a DAPI został użyty do kontrastowania DNA jądrowego (niebieski). Komórki RPE1 inkubowano w 10 µM BrdU przez 48 h przed jakimkolwiek dodatkowym traktowaniem. Po 48 h komórki poddano pulsowi 10 µM EdU przez 30 min, a następnie traktowano H2O2 (250 μM) przez 1 h lub neokarcynostatyną (0,5 μg/mL) przez 4 h. Komórki utrwalono po preekstrakcji CSK. Biała przerywana linia oznacza granicę każdego jądra. Pasek skali = 5 µm. Panele po prawej stronie to powiększone obrazy wskazanych jąder w fazie S lub poza fazą S. (B) Reprezentatywne obrazy ilustrują ogniska ssDNA z użyciem przeciwciała αRPA2 (zielony). Komórki w fazie S są zaznaczone EdU (fioletowy), a DAPI został użyty do kontrastowania DNA jądrowego (niebieski). Komórki RPE1 poddano pulsowi 10 µM EdU przez 30 min, a następnie traktowano H2O2 (250 μM) przez 1 h, hydroksymocznikiem (2 mM) przez 4 h lub NCS (0,5 μg/mL) przez 4 h. Komórki utrwalono po preekstrakcji CSK. Biała przerywana linia oznacza granicę każdego jądra. Pasek skali = 10 µm. Panele po prawej stronie to powiększone obrazy wskazanych jąder w fazie S lub poza fazą S. Skróty: ssDNA = jednoniciowe DNA; BrdU = 5-bromo-2'-deoksyurydyna; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol; RPE1 = unieśmiertelnione hTERT komórki nabłonka barwnikowego siatkówki; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyurydyna; NCS = neokarcynostatyna; HU = hydroksymocznik. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

analiza replikacji ssDNA; mikroskopia, wykres, Western blot; wpływ H2O2 na liczbę ognisk RPA2 na jądro.
Rycina 3: Detekcja ognisk ssDNA w fazie G1 z użyciem przeciwciała RPA2. (A) Komórki RPE1 przetransfekowano siRNA skierowanymi przeciwko RPA2 lub kontrolnym siRNA niecelującym, a następnie zsynchronizowano w fazie G1 i poddano pulsowemu znakowaniu 10 µM EdU przez 30 min przed ewentualną inkubacją z H2O2 (250 μM) przez 1 h. Do przeciwbarwienia DNA jądrowego użyto DAPI. Komórki utrwalono po wstępnej ekstrakcji CSK. Biała przerywana linia oznacza granicę każdego jądra. Pasek skali = 5 µm. (B) Pomiary liczby ognisk RPA2 na jądro przeprowadzono w dwóch niezależnych eksperymentach. Do analizy włączono wyłącznie komórki EdU-ujemne. Linie na wykresach reprezentują wartość średnią. Do analizy statystycznej zastosowano nieparametryczny test ANOVA (Kruskal-Wallis). Gwiazdki oznaczają P < 0.0001. Przeanalizowano następującą liczbę jąder: siNT bez H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 bez H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) Efektywność wyciszenia siRNA pokazano na analizie immunoblottingowej. Skróty: siNT = kontrolne siRNA niecelujące; BrdU = 5-bromo-2'-deoksyurydyna; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol; RPE1 = unieśmiertelnione hTERT komórki nabłonka barwnikowego siatkówki; EdU = 5-etynyl-2'-deoksyurydyna. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Schemat analizy komórek; etapy przetwarzania obrazu A-G; interfejs oprogramowania; mikroskopia fluorescencyjna.
Rycina 4: Kwantyfikacja ognisk ssDNA przy użyciu programu Fiji. Szczegółowe kroki w programie Fiji pokazujące, jak ocenić liczbę ognisk RPA2 w jądrze komórkowym. (A-E) Tworzenie maski jądra przy użyciu kanału DAPI. (F-H) Progowanie w celu zidentyfikowania poszczególnych jądrowych ognisk ssDNA na tle sygnału tła. Skróty: ssDNA = jednoniciowy DNA; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenyloindol. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

bufor cytoszkieletowy (CSK)
PIPES pH 7,0 10 mM
NaCl 100 mM
EDTA pH 8 1 mM
MgCl₂2 3 mM
D-sacharoza300 mM
Triton X-100 0.20%
Koktajl inhibitorów fosfataz1 tabletka na 10 ml
Koktajl inhibitorów proteaz1 tabletka na 10 mL
rozcieńczone w ddH2O2ONie dotyczy
Bufor płuczący
Triton X-100 0.05%
rozcieńczone w PBSBrak danych
Bufor permeabilizujący
Triton X-100 0.50%
rozcieńczone w PBSNie dotyczy
Roztwór utrwalający
Paraformaldehyd 3.60%
Triton X-100 0.05%
rozcieńczone w PBSn/a
Bufor blokujący
Seryjna albumina wołowa (BSA) 5%
Triton X-100 0.10%
rozcieńczone w PBSNie dotyczy
koktajl reakcyjny Click-iT Plus
1x bufor do reakcji Click-iT 435 ml
roztwór PCA z Alexa Fluor5 mL
CuSO₄4-gotowa mieszanina ochronna miedzi10 ml
1x dodatek do buforu Click-iT50 mL
Objętość całkowita 500 ml

Tabela 1: Skład buforów wykorzystanych w niniejszym protokole.

Rysunek uzupełniający S1. (A) Komórki RPE1 zsynchronizowano w fazie G0 poprzez 72-godzinne głodzenie surowicze, a następnie wprowadzono w różne fazy cyklu komórkowego poprzez ponowne dodanie surowicy. Wykresy kropkowe przedstawiają komórki w fazach G0/G1, S lub G2/M, gdzie godziny wskazują czas po ponownym dodaniu surowicy po głodzeniu surowiczym. Wykres po prawej stronie przedstawia procent komórek w fazach G0/G1, S i G2/M w każdym wariancie. Analizę FACS przeprowadzono przy użyciu dostępnego komercyjnie zestawu do badania proliferacji komórek z wykorzystaniem EdU i jodku propidyny zgodnie z zaleceniami producenta. (B) Nieprzycięte skany western blot do Rysunku 1. Liczby wskazują markery masy cząsteczkowej w kDa. PARP1 służył jako kontrola załadunku i został naniesiony na żel, który rozwinięto również przeciwko CCNA2, p27 (następnie poddany strippingowi dla PCNA) oraz pH3 (S10) (następnie poddany strippingowi dla H3) poprzez pocięcie membrany. CCNB1 i RPA2 naniesiono na osobny żel, stosując tę samą ilość lizatu białkowego, aby zapewnić porównywalność. (C) Nieprzycięte skany western blot do Rysunku 3. Liczby wskazują markery masy cząsteczkowej w kDa. Skrót: EdU = 5-etynylo-2'-deoksyurydyna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S2: (A) Reprezentatywne obrazy przedstawiają ogniska ssDNA z wykorzystaniem przeciwciała przeciwko BrdU (zielony); komórki w fazie S są zaznaczone cykliną A2 (czerwony); a DAPI został użyty do kontrastowania DNA jądrowego (niebieski). Komórki RPE1 inkubowano w 10 µM BrdU przez 48 h przed dalszą obróbką. Po 48 h komórki traktowano H2O2 (250 μM) przez 1 h lub neokarzinostatyną (0,5 µg/mL) przez 4 h przed utrwaleniem. Biała przerywana linia oznacza granicę każdego jądra. Pasek skali = 5 µm. (B) Barwienie BrdU komórek RPE1 z zastosowaniem i bez zastosowania warunków denaturacji. Asynchroniczne komórki RPE1 poddano wstępnej obróbce 10 µM BrdU przez 48 h. Pasek skali = 10 µm. (C) Pomiary liczby ognisk BrdU/jądro przeprowadzono w dwóch niezależnych eksperymentach na komórkach RPE1 zsynchronizowanych w fazie G1. Podczas analizy uwzględniono wyłącznie komórki EdU-ujemne. Linie na wykresach reprezentują wartość średnią. Do analizy statystycznej zastosowano nieparametryczny test ANOVA (Kruskal-Wallis). Oznaczenie „ns” wskazuje na brak istotnej różnicy. Analizowana liczba jąder była następująca: NT n = 52, NCS n = 105, H2O2 n = 82. Skróty: siNT = kontrolne siRNA nietargetujące; BrdU = 5-bromo-2'-deoksyurydyna; DAPI = 4',6-diamidyno-2-fenyloindol; RPE1 = hTERT-unieśmiertelnione komórki nabłonka barwnikowego siatkówki; NCS = neokarzinostatyna. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający S1: Nagranie ekranu z analizy ognisk RPA2 w programie Fiji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Utrzymanie zdrowej, wolnej od mykoplazmy hodowli komórkowej ma kluczowe znaczenie dla wszystkich opisanych powyżej eksperymentów. Komórki RPE1 są silnie przywiązane do wyrobów z tworzyw sztucznych poddanych kulturze tkankowej pod normalnymi pożywkami hodowlanymi; Jednak ich właściwości wiążące znacznie się zmniejszają, gdy są przechowywane w warunkach wolnych od surowicy. Dodatkowo, aby uchwycić obrazy ognisk ssDNA w wysokiej rozdzielczości pod mikroskopem, komórki muszą być posiane na szkle nakrywkowym o grubości 0,17 mm, które nie jest wystarczająco hydrofilowe, aby umożliwić prawidłowe przyłączenie komórek RPE1. Bez odpowiednio spłaszczonych i równomiernie rozmieszczonych komórek bardzo trudno jest uwidocznić poszczególne ogniska ssDNA. Dlatego tak ważne jest, aby wybrać odpowiedni materiał powlekający (np. witronektynę) i pozostawić odpowiedni czas (6-12 godzin) na rozprzestrzenienie się i przyczepienie komórek po uwolnieniu ich do fazy G1.

Trudną częścią protokołu jest uzyskanie jednorodnych komórek RPE1 zsynchronizowanych z G1. Wymaga to dwóch kluczowych kroków. Po pierwsze, aby skutecznie zagłodzyć surowicę, komórki muszą zostać poddane trypsynizacji, dokładnie umyte PBS i bezpośrednio wysiane na nowe szalki do hodowli tkankowych przy użyciu pożywki bez surowicy. Mycie komórek bezpośrednio w naczyniach do hodowli tkankowych w celu usunięcia surowicy nie zapewni wydajnej synchronizacji G0. Po drugie, podczas uwalniania komórek do fazy G1, komórki muszą zostać ponownie wytrypsynizowane i wysiane na świeże płytki do hodowli tkankowych. Podobnie, sama zmiana pożywki i dodanie do komórek pożywki hodowlanej zawierającej surowicę nie spowoduje synchronicznego wejścia G1. Dodatkowo, aby wprowadzić G1, gęstość wysiewu komórek na powlekanych szkłach nakrywkowych musi być na określonych poziomach konfluencji. Podczas gdy idealna synchronizacja komórek jest na ogół nieosiągalna, ten opisany tutaj protokół synchronizacji daje ~97% czystej populacji G1. Zalecana gęstość wysiewu dla RPE1 na szkiełku nakrywkowym o średnicy 12 mm wynosi ~4 × 104 w celu uzyskania jednorodnego pola widzenia do obrazowania, z około 70% zbieżnością. Wyższa gęstość wysiewu powoduje oderwanie się komórek i "odklejanie się" po ekstrakcji CSK, co skutkuje wyższym sygnałem tła podczas akwizycji obrazu.

Aby zredukować sygnał tła i uzyskać korzystny stosunek sygnału do szumu, niezbędne jest dokładne mycie po inkubacji przeciwciał pierwszorzędowych i wtórnych. Ponieważ należy zastosować wiele etapów mycia, ważne jest również, aby zapobiec wysychaniu studni podczas każdego etapu mycia. Minimalizujemy ten artefakt, stosując co najmniej 0,05% Triton X-100 na wszystkich etapach mycia i inkubacji. Gdy studzienki wyschły, komórki wykazywały zmieniony stosunek sygnału do szumu; Prowadzi to do powstania wzoru przypominającego mozaikę pod mikroskopem i może zakłócać ocenę. Akwizycja obrazu Z-stack w połączeniu z dekonwolucją może pomóc w uchwyceniu ognisk w różnych płaszczyznach ogniskowych w celu poprawy analizy.

Metody konwencjonalne polegają na wykrywaniu włączonego BrdU w warunkach niedenaturacyjnych. Metody te zależą jednak od wstępnego traktowania komórek wysokimi dawkami BrdU przez co najmniej 1-2 dni (lub czas odpowiadający pełnemu cyklowi komórkowemu w użytej linii komórkowej) w celu zapewnienia jednolitej inkorporacji genomowej. Niepożądane, rozległe włączenie BrdU może powodować zakłócenia cyklu komórkowego36. Aby rozwiązać te ograniczenia, metoda ta wykorzystuje endogenny RPA2 do wykrywania ognisk ssDNA. Takie podejście nie wymaga inkorporacji BrdU sterowanej replikacją, może być również stosowane w komórkach postmitotycznych. Ponieważ nie jest konieczne wprowadzanie szeroko zakrojonych BrdU, oszczędza to czas i zmniejsza złożoność eksperymentów. Używając barwienia RPA2 do wizualizacji ssDNA, możemy użyć 2′-deoksy-5-etynylurydyny (EdU) i chemii kliknięć do oznaczania replikacji DNA, unikając jednocześnie możliwej reaktywności krzyżowej przeciwciał BrdU przeciwko EdU 27,37,38. Należy zachować szczególną ostrożność, aby prawidłowo zamaskować wbudowaną EdU podczas reakcji kliknięcia, tak aby przeciwciała BrdU nie wchodziły w reakcję krzyżową z EdU27,39.

Wreszcie, ważną korzyścią płynącą z zastosowania RPA2 zamiast BrdU jest po prostu lepszy stosunek sygnału do szumu w porównaniu z barwieniem BrdU poza fazą S. Odkryliśmy, że niedenaturujące barwienie BrdU i jego zdolność do wizualizacji ssDNA jest ograniczona do fazy S nawet w replikujących się komórkach (Figura 2). Przeciwciało BrdU wiąże się tylko z wystarczająco odsłoniętym BrdU w odcinkach ssDNA. Wiązanie białek naprawczych, w tym RPA2, z odcinkami ssDNA może hamować lub utrudniać wystarczającą ekspozycję BrdU w ssDNA. Stwierdziliśmy również, że wstępna ekstrakcja CSK jest niezbędna do wizualizacji ssDNA przy użyciu przeciwciała BrdU. Jest to możliwe, ponieważ ścieżki ssDNA nie są dostępne dla przeciwciała bez usunięcia z nich lekko związanych składników białkowych.

Niemniej jednak istnieją pewne ograniczenia związane z tym protokołem. Ograniczeniem stosowania RPA2 do detekcji ssDNA jest konieczność optymalizacji etapu wstępnej ekstrakcji CSK. Niezwiązany nadmiar RPA2 musi zostać wypłukany z DNA przed utrwaleniem komórek. Z jednej strony niedostateczna ekstrakcja prowadzi do wysokiego tła ze względu na frakcję białka RPA2, która nie jest związana z ssDNA. Z drugiej strony, nadmierna ekstrakcja doprowadzi do utraty sygnału. W przypadku wykrywania BrdU nie jest to zmienna, ponieważ BrdU jest stabilnie włączony do DNA i nie może zostać wypłukany przez wstępną ekstrakcję. W związku z tym należy dokładnie rozważyć czas wstępnej ekstrakcji CSK, ilość Tritona X-100 w buforze, objętość i temperaturę, w której przeprowadza się ekstrakcję wstępną. Wstępna ekstrakcja CSK ogranicza również użycie wielkości jądra do odróżnienia komórek G0/G1 od komórek S/G2.

Ponadto nie możemy wykluczyć możliwości, że część sygnału pochodzącego z RPA2 pochodzi z jego wiązania z innymi interaktorami białkowymi wiążącymi chromatynę. Należy również wziąć pod uwagę swoistość gatunkową przeciwciała RPA2. Przeciwciało użyte w tym protokole może rozpoznać RPA2 człowieka, myszy, szczura, chomika i małpy. Innym ograniczeniem tego podejścia jest to, że nie wszystkie linie komórkowe mogą być głodne surowicy do synchronizacji G0. Większość linii komórek rakowych może ominąć punkty kontrolne cyklu komórkowego i namnażać się nawet w pożywkach pozbawionych surowicy. Chociaż głód surowicy jest korzystny, ponieważ nie powoduje uszkodzenia DNA, należy uważnie monitorować wydajność synchronizacji komórek, aby upewnić się, że osiągnięto odpowiednie wzbogacenie faz cyklu komórkowego. W przypadku komórek, które nie reagują na deprywację surowicy, należy rozważyć inne metody synchronizacji komórek (np. Mitotyczne otrząsanie, hamowanie CDK1 w celu zatrzymania G2 lub techniki nieinwazyjne, takie jak elutriacja odśrodkowa). Inną możliwą metodą jest wykorzystanie obrazowania o wysokiej zawartości do pomiaru zawartości EdU i jądrowego DNA do profilowania cyklu komórkowego komórek asynchronicznych31. Należy wziąć pod uwagę implikacje wykorzystania alternatywnych metod synchronizacji, aby zapobiec zakłóceniom w dalszej analizie. Na przykład zastosowanie podwójnego bloku tymidynowego lub afidikoliny, często stosowanych w literaturze, spowoduje stres replikacyjny i uszkodzenie DNA40.

Badania nad mechanizmami naprawy DNA nadal stanowią centralny punkt dyskusji w dziedzinie nowotworów i biologii komórki. Przedstawiony tutaj protokół oferuje cenne podejście do przygotowania komórek, umożliwiając wizualizację i analizę ilościową ssDNA po ekspozycji na czynniki uszkadzające DNA. Warto zauważyć, że protokół ten podkreśla wykorzystanie białka wiążącego ssDNA, RPA2, wykazując jego wysoką specyficzność w celu wizualizacji niewielkich ilości ognisk ssDNA przy jednoczesnym unikaniu niepożądanej reaktywności krzyżowej we wszystkich fazach cyklu komórkowego. Zastosowanie RPA2 daje wiele korzyści, szczególnie dla badaczy dążących do analizy komórek w fazie G1 cyklu komórkowego. Protokół ten uwzględnia kilka ograniczeń i rozwiązuje problemy związane z zakłóceniami sygnału, niepożądanym szumem tła i reaktywnością krzyżową podczas korzystania z barwienia RPA2 lub BrdU do wykrywania ssDNA.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Michele Pagano za wsparcie i pomocne spostrzeżenia, Ashley Chui i Sharon Kaisari za krytyczne przeczytanie manuskryptu, a Jeffreyowi Estradzie i Vilmie Diaz za ich ciągłe wsparcie. Prace te zostały wsparte suplementem dotyczącym różnorodności do grantu National Institutes of Health GM136250.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Przeciwciało alfa-tubulinySigma-AldrichT6074(1:5 000)
Mikroskop odwrócony Axio ObserverZeissnamikroskop
Bis-Tris Plus Mini żele białkowe, 4-12%Invitrogen NW04127BOXWestern Blot
Albumina surowicy bydlęcej Jackson ImmunoResearch 001-000-162blokujący
BrdU (5-Bromo-2'-deoksyurydyna)Sigma-AldrichB5002-100MGanalog nukleotydu
Przeciwciało BrdU BU1/75Przeciwciałoab6326(1:500)
CellAdhere DilutionBuffer Stemcell Technologies07183odczynnik do powlekania
Zestawy do testów cytometrii przepływowej Click-iT Plus EdU Invitrogen C10632cytomera przepływowa 
Zestaw do proliferacji komórek Click-iT Plus EdU do obrazowania, barwnik Alexa Fluor 647do reakcji klikThermo Fisher ScientificC10640
Tabletki na inhibitory proteazy OdczynnikSigma-Aldrich5892791001
Countess 3 Automatyczny licznik komórek Thermo ScientificAMQAX2000licznik komórek
Szkiełko nakrywkowe neuVitroGG12PREkultura tkankowa
Przeciwciało cykliny A2Cruz Biotechnologysc-271682przeciwciało pierwszorzędowe (1:1,000) dla przeciwciała IF i WB
Cyklina B1Cruz Biotechnologysc-245przeciwciało pierwszorzędowe (1:5,000)
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-AldrichD2650-100MLkontrola pojazdu
DMEM, wysoka zawartość glukozy, z HEPESGibco12430051pożywka do hodowli komórkowych RPE
DPBS, bez wapnia, bez magnezu Gibco14190144PBS używany w całym protokole
Odczynnik D-SacharozaThermo Fisher Scientificbp220-1
Mikroskop epifluorescencyjny serii Eclipse Ti2 Nikonnamikroskopie
EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna)nukleotyduThermo Fisher ScientificC10637
Falcon 24-dołkowa płytkaCorning 351147kultura tkankowa
Falcon Cell Culture Dish 100 mmCorning 353003hodowla tkankowa
Płodowa surowica bydlęca, inaktywowana termiczniePożywkadla 16140071 Gibco
Fidżi (ImageJ)NIHwersja 1.54foprogramowanie i algorytmy
FxCycle PI/RNaza Roztwór do barwieniaInvitrogen F10797Barwienie PI Kozie
przeciwciało anty-mysie IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher ScientificA21422(1:1,000)
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) Wysoce adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, Alexa Fluor Plus 488Thermo FisherScientific A48262(1:1,000)
Przeciwciało histonowe H3Abcamab1791przeciwciało pierwotne (1:10 000)
hTERT RPE1Linia komórkowaATCCCRL-3216
Kwas solnyOdczynnik Sigma-AldrichH1758-100ML
Nadtlenek wodoru 30% soultionOdczynnik Sigma-AldrichH1009-100ML
Hydroksymocznik, 98% proszekOdczynnik Sigma-AldrichH8627-5G
Invitrogen Ultra Pure 0,5 M EDTA pH 8,0Thermo Fisher Scientific15-575-020odczynnik
transfekcji Lipfectamine RNAiMAXInvitrogen 13778150odczynnik do transfekcji
Roztwór chlorku magnezu 1 MSigma-AldrichM1028-100MLodczynnik
MycoFluorThermo FisherM7006Zestaw do wykrywania mykoplazmy
Neokarzynostyna ze Streptomyces carzinostaticus Sigma-AldrichN9162-100UGodczynnik
NuPage MES SDS Running Buffer (20x)Invitrogen NP0002Western Blot
onTARGETplus Human RPA2 siRNADharmaconL-017058-01-0005przeciwciało siRNA
p27BD Biosciences 610241przeciwciało pierwotne (1:1,000)
Wodny roztwór paraformaldehydu (32%)Mikroskopia elektronowa Sciences50-980-494utrwalające
przeciwciało PARP1Technologia sygnalizacji komórkowej Przeciwciało pierwotne 9542S(1:1,000)
Przeciwciało PCNATechnologia sygnalizacji komórkowej 13110S(1:2,000)
Penicylina-StreptomycynaGibco15140163suplement podłoża
Przeciwciało pH3Technologia sygnalizacji komórkowej Przeciwciało3377S(1:2,000)
Tabletki inhibitora fosfatazy PhosSTOPOdczynnik4906837001 Sigma-Aldrich
RURY Bufor 0,5 M roztwór, pH 7,0Bioworld41620034-1odczynnik
Precision Plus Kalejdoskop białkowy Prestained Protein StandardsBio-Rad1610395Western Blot
PrismGraphPadwersja 10analiza statystyczna i wykres
Podłoże montażoweProLong Diamond Antifade ThermoScientificP36961
Pożywka o zmniejszonej surowicy (Opti-MEM)Gibco31985070używany do transfekcji
Przeciwciało Rpa32/rpa2 (mysz)EMD MilliporeNA19L(1:1,000) dla przeciwciała WB
Rpa32/rpa2 (szczur)Technologia sygnalizacji komórkowej Przeciwciało pierwszorzędowe 2208S (1:1,000) dla
roztworu chlorku sodu IF (5 M)OdczynnikSigma-AldrichS5150
Pirogronian sodu (100 mM)Suplement pożywkiGibco11360070
Tetraboran sodu DekahydratSigma-AldrichB3535-500G
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain Thermo Scientific62248barwnik kwasem nukleinowym
Tymidyna, proszekOdczynnik Sigma-AldrichT1985-1G
Roztwór wodny Triton X-100 (10%)Sigma-Aldrich11332481001detergent
Trypsyna-EDTA (0,5%), bez czerwieni fenolowejGibco1540054środek dysocjacji komórek
Vitronectin XFStemcell Technologies07180odczynnik do powlekania
ZE5 Cell AnalyzerBio-Radnacytomeryę przepływową 
Przeciwciało pierwszorzędowe pierwszorzędowe Abcam Zestaw Santa Santa Analog Przeciwciało drugorzędowe Przeciwciało drugorzędowe do Przeciwciało pierwszorzędowe pierwszorzędowe Przeciwciało pierwszorzędowe

Bibliografia

  1. Hakem, R. DNA-damage repair; the good, the bad, and ugly. EMBO J. 27 (4), 589-605 (2008).
  2. Gutierrez, R., O'Connor, T. R. DNA direct reversal repair and alkylating agent drug resistance. Cancer Drug Resist. 4 (2), 414-423 (2021).
  3. Krokan, H. E., Bjoras, M. Base excision repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a012583(2013).
  4. Marteijn, J. A., Lans, H., Vermeulen, W., Hoeijmakers, J. H. Understanding nucleotide excision repair and its roles in cancer and ageing. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (7), 465-481 (2014).
  5. Li, G. M. Mechanisms and functions of DNA mismatch repair. Cell Res. 18 (1), 85-98 (2008).
  6. Hustedt, N., Durocher, D. The control of DNA repair by the cell cycle. Nat Cell Biol. 19 (1), 1-9 (2016).
  7. Yang, W., Gao, Y. Translesion and repair DNA polymerases: diverse structure and mechanism. Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).
  8. Bhat, D. S., et al. Therapeutic disruption of RAD52-ssDNA complexation via novel drug-like inhibitors. NAR Cancer. 5 (2), zcad018(2023).
  9. Gupta, P., Saha, B., Chattopadhyay, S., Patro, B. S. Pharmacological targeting of differential DNA repair, radio-sensitizes WRN-deficient cancer cells in vitro and in vivo. Biochem Pharmacol. 186, 114450(2021).
  10. Pena-Diaz, J., et al. Noncanonical mismatch repair as a source of genomic instability in human cells. Mol Cell. 47 (5), 669-680 (2012).
  11. Schroering, A. G., Edelbrock, M. A., Richards, T. J., Williams, K. J. The cell cycle and DNA mismatch repair. Exp Cell Res. 313 (2), 292-304 (2007).
  12. Scully, R., Panday, A., Elango, R., Willis, N. A. DNA double-strand break repair-pathway choice in somatic mammalian cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 20 (11), 698-714 (2019).
  13. Escribano-Diaz, C., et al. A cell cycle-dependent regulatory circuit composed of 53BP1-RIF1 and BRCA1-CtIP controls DNA repair pathway choice. Mol Cell. 49 (5), 872-883 (2013).
  14. Genschel, J., Modrich, P. Mechanism of 5'-directed excision in human mismatch repair. Mol Cell. 12 (5), 1077-1086 (2003).
  15. Hu, J., et al. Nucleotide excision repair in human cells: fate of the excised oligonucleotide carrying DNA damage in vivo. J Biol Chem. 288 (29), 20918-20926 (2013).
  16. Huertas, P., Jackson, S. P. Human CtIP mediates cell cycle control of DNA end resection and double strand break repair. J Biol Chem. 284 (14), 9558-9565 (2009).
  17. Keijzers, G., et al. Human exonuclease 1 (EXO1) regulatory functions in DNA replication with putative roles in cancer. Int J Mol Sci. 20 (1), 74(2018).
  18. Symington, L. S. End resection at double-strand breaks: mechanism and regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (8), a016436(2014).
  19. Liu, Y., et al. DNA polymerase beta and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair. J Biol Chem. 280 (5), 3665-3674 (2005).
  20. Wold, M. S., Kelly, T. Purification and characterization of replication protein A, a cellular protein required for in vitro replication of simian virus 40 DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 85 (8), 2523-2527 (1988).
  21. Wienholz, F., Vermeulen, W., Marteijn, J. A. Amplification of unscheduled DNA synthesis signal enables fluorescence-based single cell quantification of transcription-coupled nucleotide excision repair. Nucleic Acids Res. 45 (9), e68(2017).
  22. Wold, M. S. Replication protein A: a heterotrimeric, single-stranded DNA-binding protein required for eukaryotic DNA metabolism. Annu Rev Biochem. 66, 61-92 (1997).
  23. Chen, R., Wold, M. S. Replication protein A: single-stranded DNA's first responder: dynamic DNA-interactions allow replication protein A to direct single-strand DNA intermediates into different pathways for synthesis or repair. Bioessays. 36 (12), 1156-1161 (2014).
  24. Kang, Y., et al. Alteration of replication protein A binding mode on single-stranded DNA by NSMF potentiates RPA phosphorylation by ATR kinase. Nucleic Acids Res. 51 (15), 7936-7950 (2023).
  25. Kilgas, S., Kiltie, A. E., Ramadan, K. Immunofluorescence microscopy-based detection of ssDNA foci by BrdU in mammalian cells. STAR Protoc. 2 (4), 100978(2021).
  26. Madabhushi, R., Pan, L., Tsai, L. H. DNA damage and its links to neurodegeneration. Neuron. 83 (2), 266-282 (2014).
  27. Liboska, R., Ligasova, A., Strunin, D., Rosenberg, I., Koberna, K. Most anti-BrdU antibodies react with 2'-deoxy-5-ethynyluridine -- the method for the effective suppression of this cross-reactivity. PLoS One. 7 (12), e51679(2012).
  28. Biehs, R., et al. DNA double-strand break resection occurs during non-homologous end joining in G1 but is distinct from resection during homologous recombination. Mol Cell. 65 (4), 671-684.e5 (2017).
  29. Cruz-Garcia, A., Lopez-Saavedra, A., Huertas, P. BRCA1 accelerates CtIP-mediated DNA-end resection. Cell Rep. 9 (2), 451-459 (2014).
  30. Ercilla, A., et al. Physiological tolerance to ssDNA enables strand uncoupling during DNA replication. Cell Rep. 30 (7), 2416-2429.e7 (2020).
  31. Lezaja, A., et al. RPA shields inherited DNA lesions for post-mitotic DNA synthesis. Nat Commun. 12 (1), 3827(2021).
  32. Mukherjee, B., Tomimatsu, N., Burma, S. Immunofluorescence-based methods to monitor DNA end resection. Methods Mol Biol. 1292, 67-75 (2015).
  33. Ochs, F., et al. 53BP1 fosters fidelity of homology-directed DNA repair. Nat Struct Mol Biol. 23 (8), 714-721 (2016).
  34. Raderschall, E., Golub, E. I., Haaf, T. Nuclear foci of mammalian recombination proteins are located at single-stranded DNA regions formed after DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 1921-1926 (1999).
  35. Forment, J. V., Walker, R. V., Jackson, S. P. A high-throughput, flow cytometry-based method to quantify DNA-end resection in mammalian cells. Cytometry A. 81 (10), 922-928 (2012).
  36. Mistrik, M., et al. Cells and stripes: A novel quantitative photo-manipulation technique. Sci Rep. 6, 19567(2016).
  37. Aten, J. A., Bakker, P. J., Stap, J., Boschman, G. A., Veenhof, C. H. DNA double labelling with IdUrd and CldUrd for spatial and temporal analysis of cell proliferation and DNA replication. Histochem J. 24 (5), 251-259 (1992).
  38. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-phase labeling of dividing stem cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
  39. Cappella, P., Gasparri, F., Pulici, M., Moll, J. Cell proliferation method: click chemistry based on BrdU coupling for multiplex antibody staining. Curr Protoc Cytom. Chapter 7, Unit7.34 (2008).
  40. Ligasova, A., Koberna, K. Strengths and weaknesses of cell synchronization protocols based on inhibition of DNA synthesis. Int J Mol Sci. 22 (19), 10759(2021).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Naprawa DNAbarwienie RPA2wbudowywanie EdUsynchronizacja komórekmikroskopia immunofluorescencyjnaodpowiedź na uszkodzenia DNAtraktowanie nadtlenkiem wodorubiałko replikacyjne A
Wizualizacja ognisk jednoniciowego DNA w fazie G1 cyklu komórkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.