Method Article

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

DOI:

10.3791/65930

⸱

February 23rd, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Systems Medicine, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV., 2Genomics & Immunoregulation, LIMES Institute, University of Bonn, 3PRECISE Platform for Single Cell Genomics and Epigenomics, DZNE and University of Bonn, 4Immunogenomics & Neurodegeneration, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV.

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transkryptomika pozwala uzyskać kompleksowy wgląd w programy komórkowe i ich reakcje na zakłócenia. Pomimo znacznego spadku kosztów produkcji bibliotecznej i sekwencjonowania w ostatniej dekadzie, zastosowanie tych technologii na skalę niezbędną do badań przesiewowych narkotyków pozostaje zbyt drogie, co utrudnia wykorzystanie ogromnego potencjału tych metod. W naszym badaniu przedstawiono efektywny kosztowo system do badań przesiewowych leków na podstawie transkryptomu, łączący zminiaturyzowane kultury perturbacyjne z transkryptomiką mini-masową. Zoptymalizowany protokół mini-bulk dostarcza informacyjnych sygnałów biologicznych przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek. W zależności od wybranego leczenia i czasu inkubacji, protokół ten spowoduje sekwencjonowanie bibliotek w ciągu około 2 dni. Ze względu na kilka punktów zatrzymania w tym protokole, przygotowanie biblioteki, jak również sekwencjonowanie, mogą być wykonywane niezależnie od czasu. Możliwe jest jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek; Pomiar do 384 próbek został przetestowany bez utraty jakości danych. Nie są również znane żadne ograniczenia co do liczby schorzeń i/lub leków, pomimo uwzględnienia zmienności optymalnego czasu inkubacji leków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozwój nowych leków to złożony i czasochłonny proces, który obejmuje identyfikację potencjalnych leków i ich celów, optymalizację i syntezę kandydatów na leki oraz testowanie ich skuteczności i bezpieczeństwa w badaniach przedklinicznych i klinicznych1. Tradycyjne metody badań przesiewowych leków, tj. systematyczna ocena bibliotek związków kandydujących do celów terapeutycznych, obejmują wykorzystanie modeli zwierzęcych lub testów komórkowych w celu przetestowania wpływu na określone cele lub szlaki. Chociaż metody te okazały się skuteczne w identyfikacji kandydatów na leki, często nie dostarczały wystarczających informacji na temat złożonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności leków, a także toksyczności i mechanizmów potencjalnych skutków ubocznych.

Ocena stanów transkrypcyjnych całego genomu stanowi skuteczne podejście do przezwyciężenia obecnych ograniczeń w badaniach przesiewowych leków, ponieważ umożliwia kompleksową ocenę ekspresji genów w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne2. Mierząc transkrypty RNA w sposób obejmujący cały genom wyrażony w danym czasie, transkryptomika ma na celu zapewnienie holistycznego spojrzenia na zmiany transkrypcyjne, które zachodzą w odpowiedzi na leki, w tym zmiany we wzorcach ekspresji genów, alternatywny splicing i niekodującą ekspresję RNA3. Informacje te mogą być wykorzystane do określenia celów leków, przewidywania ich skuteczności i toksyczności oraz optymalizacji dawkowania i schematów leczenia.

Jedną z kluczowych korzyści płynących z połączenia transkryptomiki z bezstronnym badaniem przesiewowym leków jest możliwość identyfikacji nowych celów leków, które wcześniej nie były brane pod uwagę. Konwencjonalne metody badań przesiewowych leków często koncentrują się na ustalonych cząsteczkach docelowych lub szlakach, co utrudnia identyfikację nowych celów i potencjalnie prowadzi do powstania leków o nieprzewidzianych skutkach ubocznych i ograniczonej skuteczności. Transkryptomika może przezwyciężyć te ograniczenia, dostarczając wglądu w zmiany molekularne, które zachodzą w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, odkrywając potencjalne cele lub szlaki, które mogły nie być wcześniej brane pod uwagę2.

Oprócz identyfikacji nowych celów leków, transkryptomika może być również używana do przewidywania skuteczności i toksyczności leków. Analizując wzorce ekspresji genów związanych z reakcjami na leki, można opracować biomarkery, które można wykorzystać do przewidywania odpowiedzi pacjenta na określony lek lub schemat leczenia. Może to również pomóc w optymalizacji dawkowania leków i zmniejszeniu ryzyka wystąpienia niepożądanych skutków ubocznych4.

Pomimo potencjalnych korzyści, koszt transkryptomiki pozostaje istotną przeszkodą dla jej szerokiego zastosowania w badaniach przesiewowych leków. Analiza transkryptomiczna wymaga specjalistycznego sprzętu, wiedzy technicznej i analizy danych, co może stanowić wyzwanie dla mniejszych zespołów badawczych lub organizacji o ograniczonych funduszach w wykorzystaniu transkryptomiki w badaniach przesiewowych leków. Jednak koszt transkryptomiki stale spada, co czyni ją bardziej dostępną dla społeczności naukowych. Ponadto postęp w technologii i metodach analizy danych sprawił, że transkryptomika stała się bardziej wydajna i opłacalna, co jeszcze bardziej zwiększyło jej dostępność2.

W tym protokole opisujemy wielowymiarowy i eksploracyjny system do badań przesiewowych leków opartych na transkryptomie, łączący zminiaturyzowane kultury perturbacji z analizą transkryptomiczną mini-masową5,6. Dzięki temu protokołowi możliwe jest obniżenie kosztu na próbkę do 1/6 obecnego kosztu komercyjnych rozwiązań do sekwencjonowania mRNA o pełnej długości. Protokół wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego, a jedynym wyjątkiem jest stosowanie technologii sekwencjonowania z krótkim odczytem, które można zlecić na zewnątrz, jeśli przyrządy do sekwencjonowania nie są dostępne we własnym zakresie. Zoptymalizowany protokół mini-bulk dostarcza bogatych w informacje sygnałów biologicznych przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek.

Celem eksperymentu jest sprawdzenie aktywności leków na PBMC w różnych kontekstach biologicznych. Protokół ten może być zastosowany do każdego zagadnienia biologicznego, w którym kilka leków powinno być testowanych z odczytem transkryptomicznym, dając szeroki transkryptom wglądu w komórkowy efekt leczenia.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest zgodny z wytycznymi lokalnych komisji etycznych Uniwersytetu w Bonn.

1. Przygotowanie, roztworów i sprzętu

  1. Przygotuj roztwory i zbierz materiały opisane w Tabeli Materiałów.
  2. Podgrzej łaźnię wodną do temperatury 37 °C i rozgrzej całą pożywkę wzrostową (RPMI-1640 + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1% penicyliny/streptomycyny).
  3. Do pobierania komórek należy używać lodowatej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
    UWAGA: Podczas pracy z komórkami należy zachować czyste środowisko, aby zachować sterylność.

2. Obsługa komórek

UWAGA: Szczegółowy protokół kriokonserwacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej można znaleźć w7.

  1. Rozmrażanie i zliczanie komórek
    1. Usunąć kriowiale z ciekłego azotu i rozmrozić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty, delikatnie odwracając.
    2. Przenieś rozmrożone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    3. Przepłukać kriowial 1 ml ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej i dodawać ten roztwór kroplami do komórek w probówce (1. etap rozcieńczania).
    4. Powtarzać rozcieńczanie w stosunku 1:1 aż do uzyskania objętości 32 ml (łącznie 5 rozcieńczeń z odpowiednio 1, 2, 4, 8 i 16 ml ciepłej kompletnej pożywki wzrostowej). Dodaj pożywkę kroplami, aby zmniejszyć zakłócenia komórek, jednocześnie lekko mieszając stożkową rurkę.
    5. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut (300 x g, 20 °C) i usunąć supernatant, delikatnie przechylając stożkową rurkę jednym płynnym ruchem.
    6. Ponownie zawiesić komórki w 3 ml ciepłej, kompletnej pożywki wzrostowej i przystąpić do liczenia komórek.
    7. Do liczenia należy zmieszać 10 μl zawiesiny komórek z błękitem trypanowym (rozcieńczenie 1:2 do 1:10 w zależności od gęstości zawiesiny komórek), aby odróżnić komórki żywe od martwych podczas liczenia. Martwe lub uszkodzone komórki będą wyglądać na niebieskie z powodu wchłaniania barwnika, podczas gdy ważne komórki nie są barwione.
      UWAGA: Błękit trypanowy jest lekko cytotoksyczny, wybarwione komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż 5 minut.
    8. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory liczącej, używając 10 μl barwionego roztworu komórek.
      1. Korzystając z ulepszonej przez Neubauera komory komórkowej, policz wszystkie komórki w czterech dużych kwadratach znajdujących się w rogach i użyj następującego równania, aby obliczyć stężenie zawiesiny komórek.
        figure-protocol-1
    9. Rozcieńczyć komórki do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/ml ciepłym kompletnym podłożem wzrostowym. Odwirować tylko wtedy, gdy wymagana objętość jest mniejsza niż 3 ml i ponownie zawiesić osad komórkowy do odpowiedniej objętości.
  2. Wysiew i leczenie komórek
    1. Wysiewaj 100 μl zawiesiny komórkowej na basenie na 96-dołkowej płytce do hodowli komórkowej (1 x 105 komórek / studzienkę).
      UWAGA: Numer komórki do wysiewu został zoptymalizowany pod kątem kultur PBMC. Podczas gdy niskie stężenia komórek nie zapewnią wystarczającej ilości RNA do sekwencjonowania, nadmierna liczba komórek zwiększy ryzyko nieoptymalnej lizy komórek i zahamowania reakcji odwrotnej transkrypcji.
    2. Przygotować rozcieńczenia leku w stężeniu dwukrotnie większym niż stosowane w leczeniu (2x). Rozpuszczalnik należy dobrać w zależności od rozpuszczalności związku, najlepiej kompletną pożywkę wzrostową.
      UWAGA: PBS lub dimetylosulfotlenek (DMSO) mogą być stosowane, jeśli w inny sposób nie można osiągnąć wystarczającej rozpuszczalności. Maksymalne stężenie DMSO w powstałej objętości inkubacji nie powinno przekraczać 0,5 %, aby zapobiec cytotoksyczności wywołanej przez rozpuszczalnik.
    3. Dodać 100 μl 2x rozcieńczenia leku (końcowe stężenie w studzience 1X) i inkubować w temperaturze 37 °C przez określony czas.
      UWAGA: Należy przeprowadzić badania uzupełniające w celu ustalenia optymalnego czasu inkubacji leku i wykluczenia potencjalnych mechanizmów cytotoksyczności.
  3. Pobieranie i liza komórek
    1. Odwirować płytkę do hodowli komórkowej przez 10 minut (300 x g, 20 °C). Delikatnie usuń supernatant za pomocą pompy próżniowej, trzymając płytkę pod kątem (30°-45°), jednocześnie kierując końcówkę w dolny róg studzienki, aby usunąć jak najmniej komórek.
    2. Przemyć komórki, dodając 200 μl lodowatego PBS do każdego dołka i odwirować płytkę przez 5 minut (300 x g, 4 °C). Usunąć supernatant za pomocą pompy próżniowej, ponownie trzymając płytkę pod ostrym kątem, aby usunąć jak najwięcej PBS.
    3. Przygotować bufor do lizy zgodnie z opisem w Tabeli 1 dla potrzebnej liczby reakcji (rxn), dodając 10% nadwyżki.
    4. Do każdego dołka dodać 15 μl buforu do lizy i uszczelnić płytkę samoprzylepną folią uszczelniającą, aby chronić próbki przed zanieczyszczeniem. Wirować płytkę przed odwirowaniem przez 1 minutę (1000 x g, 4 °C) i inkubować przez 5 minut na lodzie.
    5. Zebrać 6 μl roztworu komórek zlizowanych na płytce do PCR i krótko zamrozić lizat komórkowy w temperaturze -80 °C, aby zapewnić optymalną lizę komórek. Pamiętaj, aby unikać wielokrotnych cykli zamrażania płyt.
      UWAGA: PUNKT ZATRZYMANIA: Jeśli produkcja cDNA nie zostanie przeprowadzona później, lizat komórkowy może być przechowywany w temperaturze -80 °C przez okres do kilku miesięcy bez znacznego spadku jakości RNA.

3. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania

  1. Reakcja odwrotnej transkryptazy (RT)
    UWAGA: Podczas pracy z RNA umieść wszystkie próbki na lodzie i upewnij się, że używasz sprzętu wolnego od nukleaz (sterylne, jednorazowe naczynia z tworzyw sztucznych) i wody.
    1. Przygotować mieszaninę reakcyjną RT zgodnie z opisem w Tabeli 2 dla liczby potrzebnych reakcji, dodając 10% nadwyżki. Krótko zmieszaj mieszankę i krótko ją odwiruj. Trzymaj mieszankę na lodzie do czasu użycia.
    2. Rozmrozić lizat komórkowy w temperaturze pokojowej (RT) i krótko go odwirować, aby zebrać cały lizat komórkowy na dnie płytki.
    3. Przeprowadzić denaturację mRNA na termocyklerze zgodnie z tabelą 3.
    4. Wyjmij płytkę z termocyklera i krótko ją odwiruj, aby zebrać potencjalny kondensat. Dodać 6 μl mieszanki reakcyjnej RT do każdego dołka, aby uzyskać końcową objętość 12 μl. Uszczelnij płytkę, aby chronić płytkę i uniknąć parowania, odwirować ją i odwirować.
    5. Umieść płytkę na termocyklerze i uruchom program reakcji RT zgodnie z tabelą 3.
  2. Wstępne wzmocnienie
    1. Rozmrozić polimerazę DNA o wysokiej wierności i starter do PCR in situ (ISPCR) w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotuj mieszankę przed amplifikacją zgodnie z tabelą 4 dla liczby potrzebnych reakcji, dodając 10% nadwyżki. Krótko wymieszaj mieszankę i odkręć ją w dół.
      UWAGA: Mieszanina enzymów jest stabilna w temperaturze pokojowej przez wiele godzin.
    3. Odwiruj płytkę PCR, dodaj 15 μl mieszanki do wstępnego amplifikacji do każdego dołka i zamknij płytkę.
    4. Umieść go na termocyklerze i rozpocznij reakcję wstępnego amplifikacji zgodnie z tabelą 5.
      1. Dostosuj liczbę cykli ze względu na zawartość RNA. Zacznij od mniejszej liczby i zwiększaj, jeśli wydajność cDNA nie jest wystarczająca.
        UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że optymalna liczba cykli powinna być ustalona dla każdego typu komórki, warunki eksperymentalne i leczenie nie wpłyną na optymalną liczbę cykli. Dlatego zalecamy eksperymentalne ustalenie optymalnej liczby cykli podczas ustalania tego protokołu dla nowego typu komórki. Ogólnie rzecz biorąc, komórki pierwotne będą wymagały większej liczby cykli w porównaniu z liniami komórkowymi. PUNKT ZATRZYMANIA: Produkt przed amplifikacją może być przechowywany w temperaturze -20 °C.
  3. Oczyszczanie i kontrola jakości cDNA (QC)
    UWAGA: Oczyszczanie próbki można przeprowadzić sekwencyjnie dla każdej płytki, ponieważ na tym etapie próbki są raczej stabilne. Zwiększenie liczby próbek doprowadzi do wydłużenia czasu trwania protokołu, ale nie ograniczy liczby próbek, które mogą być przetwarzane jednocześnie.
    1. Przed rozpoczęciem doprowadź magnetyczne kulki oczyszczające do temperatury pokojowej i wiruj na wysokich obrotach przez 1 minutę, aby całkowicie zawiesić kulki.
    2. Dodać 0,8 x v/v (20 μl) magnetycznych kulek oczyszczających do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Umieść płytkę PCR na stojaku magnetycznym na 5 minut, aż kulki zostaną całkowicie oddzielone. Ostrożnie usunąć supernatant.
    4. Trzymając płytkę na stojaku magnetycznym, delikatnie dodaj 100 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby umyć kulki i inkubować przez 30 sekund. Użyj pipety o małej objętości, aby usunąć supernatant. Powtórz dla dodatkowego etapu prania. Pamiętaj, aby usunąć jak najwięcej etanolu.
    5. Suszyć kulki na powietrzu na stojaku magnetycznym w temperaturze pokojowej do 5 minut, aż etanol całkowicie odparuje i kulki przestaną wyglądać na błyszczące.
    6. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego, ponownie zawieś kulki w 20 μl wody wolnej od nukleaz i inkubuj przez 2 minuty.
    7. Umieść talerz ponownie na stojaku magnetycznym, aż koraliki zostaną oddzielone.
    8. Odzyskaj eluat na nowej płytce PCR w celu kontroli jakości cDNA i znakowania.
    9. Wykonaj test TapeStation lub FragmentAnalyser, aby ocenić rozkład wielkości i stężenie biblioteki cDNA (zalecane: test TapeStation D5000). Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta. Należy spodziewać się typowej wydajności 20 ng.
  4. Tagowanie za pomocą kit
    UWAGA: Można użyć innych protokołów tagowania, jeśli zostały już ustanowione.
    1. Rozcieńczyć cDNA do końcowego stężenia 150 - 300 pg/μl za pomocą wody wolnej od nukleaz.
    2. Zaprogramuj termocykler zgodnie z tabelą 6, aby zapewnić natychmiastowe rozpoczęcie reakcji znakowania po dodaniu cDNA do mieszanki enzymów.
    3. Przygotuj mieszankę do oznaczania zgodnie z tabelą 7 dla liczby potrzebnych reakcji, dodając 10% nadwyżki.
    4. Dozować 3 μl mieszaniny znakującej na reakcję na nową płytkę PCR i dodawać 1 μl cDNA do każdej reakcji.
    5. Rozpocznij reakcję znakowania natychmiast po dodaniu cDNA.
    6. Reakcję inaktywować przez dodanie 1 μl neutralizującego buforu znakującego (NT; alternatywnie można użyć 0,2% dodecylosiarczanu sodu (SDS)).
  5. Wzbogacanie PCR
    1. Przygotować wzbogacającą mieszankę PCR w tabeli 7 dla liczby reakcji, dodając 10% nadwyżki. (Zalecane: Nextera UDI ustawione, aby zapobiec przeskakiwaniu indeksu na komórkach przepływu o wzorze (np. Illumina NovaSeq 6000)).
    2. Do każdej reakcji dodać 9 μl wzbogacającej mieszaniny PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 14 μl.
    3. Uruchom program PCR wzbogacający zgodnie z tabelą 8.
      UWAGA: W przypadku PCR wzbogacającego standardem jest 16 cykli. Jeśli jakość cDNA jest niska, można dodać dodatkowe cykle.
  6. Oczyszczanie i kontrola jakości
    1. Przed rozpoczęciem doprowadź magnetyczne kulki oczyszczające do temperatury pokojowej i wiruj z dużą prędkością przez 1 minutę, aby całkowicie zawiesić kulki.
    2. Dodać 1,0 x v/v (14 μl) magnetycznych kulek oczyszczających i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    3. Umieść talerz na stojaku magnetycznym i odczekaj 5 minut, aż koraliki zostaną całkowicie oddzielone. Ostrożnie usunąć supernatant.
    4. Trzymając płytkę na stojaku magnetycznym, delikatnie dodaj 100 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu, aby umyć kulki i inkubować przez 30 sekund. Użyj pipety o małej objętości, aby usunąć supernatant. Powtórz dla dodatkowego etapu prania. Pamiętaj, aby usunąć jak najwięcej etanolu.
    5. Suszyć koraliki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3 minuty lub do momentu, gdy przestaną wyglądać na błyszczące.
    6. Wyjmij płytkę ze stojaka magnetycznego, ponownie zawieś kulki w 20 μl wody wolnej od nukleaz i inkubuj przez 2 minuty.
    7. Umieść płytkę ponownie na stojaku magnetycznym, aż koraliki się rozdzielą i odzyskaj eluat na nowej płytce PCR do kontroli jakości biblioteki.
    8. Wykonaj test TapeStation lub analizatora fragmentów, aby ocenić rozmiar, rozkład i stężenie biblioteki cDNA (zalecane: test o wysokiej czułości TapeStation D1000). Szczegółowe informacje można znaleźć w instrukcjach producenta. Średnio należy spodziewać się plonu na poziomie 10 ng.
      UWAGA: PUNKT ZATRZYMANIA: Produkt PCR może być przechowywany w temperaturze -20 °C.

4. Sekwencjonowanie i wstępne przetwarzanie danych

  1. Sekwencjonowanie
    UWAGA: Poniższe wytyczne będą miały zastosowanie do wszystkich instrumentów Illumina do sekwencjonowania z krótkim odczytem. Jeśli oprzyrządowanie nie jest dostępne, sekwencjonowanie może być wykonane przez zewnętrzne urządzenie do sekwencjonowania. Można również zastosować inne podejścia do sekwencjonowania. Dla uproszczenia zdecydowaliśmy się raportować tylko o najczęściej używanej technologii sekwencjonowania.
    UWAGA: Poniższe kroki związane z użytkowaniem oprogramowania opisują procedurę na sekwencerze Illumina NovaSeq6000.
    1. Puluj unikatowo indeksowane biblioteki w stosunku równomolowym zgodnie z wynikami uzyskanymi w kroku 3.6.8.
    2. Zmierzyć stężenie końcowej puli za pomocą testu o wysokiej czułości, aby obliczyć molowość próbki w następujący sposób:
      figure-protocol-2
    3. Załaduj komórkę przepływową zgodnie ze specyfikacją przyrządu i do optymalizacji eksperymentalnej. Przykłady stężeń obciążenia popularnych przyrządów przedstawiono w tabeli 9.
    4. Dotykając ekranu, wybierz opcję Sekwencja, aby zainicjować konfigurację uruchamiania.
    5. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie i załaduj komorę przepływową, kasetę sekwencyjną przez syntezę, kasetę klastrową, kasetę buforową i upewnij się, że pojemniki na odpady są puste.
    6. Gdy wszystkie odczynniki zostaną rozpoznane przez urządzenie, kliknij Uruchom konfigurację. Zdefiniuj tutaj nazwę uruchomienia i folder wyjściowy do przechowywania danych.
    7. Zdefiniuj szczegóły sekwencjonowania jako sparowane końce z obydwoma odczytami 51 pz. Dwa odczyty indeksu są również sekwencjonowane z 8 pz każdy.
    8. Naciśnij przycisk Review i po sprawdzeniu, czy wszystkie szczegóły sekwencjonowania są poprawne, naciśnij Start Run.
      UWAGA: Zalecana głębokość sekwencjonowania to 5 x 106 odczytów/próbkę, przy czym minimalna głębokość 1 x 106 odczytów/próbkę.
  2. Wstępne przetwarzanie danych
    1. Przekształć surowe dane sekwencjonowania do formatu FASTQ i zdemultipleksuj zgodnie z przykładowymi indeksami za pomocą narzędzia Bcl2Fastq2. Wykonaj demultipleksowanie z ustawieniami domyślnymi. Szczegółowe instrukcje dotyczące Bcl2Fastq2 można znaleźć w podręczniku referencyjnym.
      UWAGA: Konwersja i demultipleksowanie FASTQ są zwykle wykonywane przez urządzenie do sekwencjonowania, jeśli sekwencjonowanie nie jest wykonywane wewnętrznie. Urządzenia do sekwencjonowania zwykle zapewniają zdemultipleksowany FASTQ do dalszego przetwarzania.
    2. Dostępnych jest kilka opcji dopasowywania danych i kwantyfikacji liczebności odczytów sekwencjonowania (zalecane: potok sekwencyjny RNA-rdzenia nf-core (https://nf-co.re/rnaseq)). Potok udostępnia kilka opcji, użyj ustawienia domyślnego z STAR8 jako wyrównanym i Salmon9, aby określić ilościowo obfitość transkryptu.
    3. UWAGA: Do dalszej analizy bioinformatycznej dostępnych jest kilka metod. Nie jest on objęty zakresem tego protokołu, aby objąć wszystkie (zalecane: DEseq2 pipeline10). Standardowy skrypt oparty na opracowanym przez nas workflow DEseq2 można znaleźć na GitHubie (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z raportowanym protokołem, ludzkie PBMC zostały wysiane, potraktowane różnymi lekami immunomodulującymi i, po różnych czasach inkubacji, zebrane do masowej analizy transkryptomicznej przy użyciu protokołu sekwencjonowania (Rysunek 1).

Idealne stężenia leków i czasy inkubacji dla badanych związków powinny być określone przed tym protokołem za pomocą uzupełniających strategii eksperymentalnych i w oparciu o konkretne pytanie naukowe. W większości przypadków inkubacja trwająca 2 - 4 godziny i 24 godziny powinna zapewnić odzwierciedlenie wczesnej i późnej odpowiedzi transkrypcyjnej na leczenie.

Najważniejszymi wynikami do oceny poprawności wykonania protokołu są cDNA i biblioteki QC (Rysunek 2 i Rysunek 3). Profil cDNA powinien mieć szeroki rozkład o średniej wielkości > 1000 pz (Rysunek 2), niższą średnią wielkość lub akumulację cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (Rysunek 4) może wskazywać na niski poziom wejścia RNA lub degradację RNA.

Przygotowanie dobrej biblioteki sekwencjonowania jest również ważnym krokiem w protokole; biblioteki po tagowaniu powinny mieć raczej wąski rozkład około 250 bp (Rysunek 3); dłuższe fragmenty będą słabo działać podczas sekwencjonowania (Rysunek 5).

Po sekwencjonowaniu, surowe pliki FASTQ są zestawiane z odpowiednim genomem referencyjnym (np. ludzkim lub myszy), a obfitość transkryptu jest określana ilościowo dla każdej próbki (patrz potok sekwencyjny RNA z rdzeniem nf-core (https://nf-co.re/rnaseq)). Zostanie teraz przeprowadzona eksploracyjna analiza danych w celu sprawdzenia ogólnej jakości danych. Dopasowane dane powinny uchwycić dużą liczbę genów kodujących białka, ponieważ tylko poliadenylowane RNA zostanie wychwycone za pomocą tego protokołu (Figura 6A). W próbkach ludzkich spodziewamy się przechwycić od 15000 do 20000 transkryptów (wartość ta jest oparta na referencyjnej adnotacji genomu ludzkiego GENCODE 2711). Dalsza eksploracyjna analiza danych może obejmować analizę głównych składowych (PCA). W tym miejscu podstawowa struktura danych może być wizualizowana na dwuwymiarowym wykresie. W Rysunek 6B pokazujemy przykładowy wykres PCA; Kropki są tutaj pokolorowane według leczenia, pokazując trzy różne skupiska warunków eksperymentalnych prowadzących do podobnych profili transkryptomicznych. Można tu również zauważyć, że kontrpróby biologiczne (kropki o tym samym kolorze) są podobne pod względem transkrypcji, co świadczy o dobrej solidności protokołu. Wyniki pokazane na tym rysunku zostały wygenerowane za pomocą potoku dostępnego w usłudze GitHub na podstawie przepływu pracy DESeq2 (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

figure-results-1
Rysunek 1: Szacowany czas i przepływ pracy. (A) Szacunki czasowe tego protokołu dla serii z 96 próbkami. (B) Schemat każdego kroku w ramach protokołu od rozmrożenia komórek do wstępnego przetwarzania danych. Schemat należy czytać od góry do dołu zgodnie ze strzałkami. Strzałki w kółkach opisują powtórzenie kroku. Czerwone kropki reprezentują punkty zatrzymania opisane w protokole. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przykładowe wyniki dla bibliotek cDNA. Wyniki zminiaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości przykładowej biblioteki cDNA. Górny i dolny sygnał reprezentują znaczniki używane do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie rozmiary fragmentów (niebieskie nawiasy). Profil cDNA pokazuje szeroki rozkład ze średnią wielkością > 1000 pz. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Przykładowe wyniki dla bibliotek sekwencjonowania. Wyniki zminiaturyzowanej elektroforezy pokazujące rozkład wielkości pomyślnie przygotowanych bibliotek sekwencjonowania o wąskim rozkładzie i średniej wielkości około 250 pz. Górny i dolny sygnał reprezentują znaczniki używane do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie rozmiary fragmentów (niebieskie nawiasy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Przykładowe nieoptymalne wyniki dla bibliotek cDNA. Wyniki zminiaturyzowanej elektroforezy pokazujące rozkład wielkości suboptymalnej biblioteki cDNA o średniej wielkości < 200 pz. Górny i dolny sygnał reprezentują znaczniki używane do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie rozmiary fragmentów (niebieskie nawiasy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Przykładowe nieoptymalne wyniki dla bibliotek sekwencjonowania. Wyniki zminiaturyzowanej elektroforezy pokazujące rozkład wielkości nieoptymalnej biblioteki sekwencjonowania zawierającej dłuższe fragmenty o długości 200 - 1000 pz. Górny i dolny sygnał reprezentują znaczniki używane do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie rozmiary fragmentów (niebieskie nawiasy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Eksploracyjna analiza danych. Reprezentatywne wyniki eksploracyjnej analizy danych pokazujące wpływ wybranych leków immunomodulujących na PBMC. (A) Wykres słupkowy liczby wykrytych genów (osie Y) oddzielonych według typu genu (osie X). (B) PCA wszystkich genów w zbiorze danych zabarwionych przez różne terapie farmakologiczne. Kropki o tym samym kolorze są replikatami biologicznymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

pkt. pkt. pkt.
OdczynnikkoncentracjaObjętość [μL] /rxn
Chlorowodorek guanidyny80 mMgodz. 7.50
Trifosforany deoksynukleotydów (dNTP)10 mM każdy6,52
Podkład SMART dT30VN100 μM0,33
Woda wolna od nukleaz0,65
Całkowita objętość godz. 15.00

Tabela 1: Bufor do lizy.

pkt. pkt. pkt. pkt. pkt.
OdczynnikObjętość [μL] /rxn
Bufor SSRT II (5x)Godzina 2.00
Naziemna telewizja cyfrowa (100 mM)0,50
Betaina (5 M)Godzina 2.00
MgCl2 (1 M)0,14
SSRT II (200 U/μL)0,25
Inhibitor RNAzy (40 U/μL)0,25
TSO-LNA (100 μM)0,20
Woda wolna od nukleaz0,66
Całkowita objętośćgodz. 6.00

Tabela 2: Mieszanina reakcji odwrotnej transkryptazy (RT).

denaturacja mRNA
kroktemperaturaczas trwania
Denaturacja mRNA95 °CCzas trwania: 2 min
na lodzieCzas trwania: 2 min
Odwrotna transkrypcja
kroktemperaturaczas trwania
Odwrotna transkrypcja42 °C Czas trwania: 90 min
Inaktywacja enzymów70 °CCzas trwania: 15 min
4 °Ctrzymać

Tabela 3: Program termocyklera do denaturacji mRNA i odwrotnej transkryptazy (RT).

pkt.
OdczynnikObjętość [μL] /rxn
Polimeraza DNA o wysokiej wierności godz. 12.50
Starter ISPCR (10 μM)0,15
Woda wolna od nukleazGodzina 2,35
Całkowita objętośćgodz. 15.00

Tabela 4: Mieszanka przed wzmocnieniem.

Krokitemperaturaczas trwania
Początkowa denaturacja98 °CCzas trwania: 3 min
denaturacja98 °C20 sekund16 – 18 cykli
Wyżarzanie67 °C20 sekund
rozszerzenie72 °C Czas trwania: 6 min
4 °Ctrzymać

Tabela 5: Program termocyklera przed wzmocnieniem.

Krokitemperaturaczas trwania
Tagowanie55 °C8 min
4 °Ctrzymać

Tabela 6: Program termocyklera do oznaczania.

Mieszanka tagmentacji
OdczynnikObjętość [μL] /rxn
Amplicon Tagment Mix (ATM)1,0
Bufor DNA do znakowania (TD)2.0
Całkowita objętośćWersja 3.0
Wzbogacająca mieszanka PCR
OdczynnikObjętość [μL] /rxn
Polimeraza DNA o wysokiej wierności 7,0
Podkład indeksujący kompatybilny z Nextera2.0
Całkowita objętość9,0

Tabela 7: Mieszanka tagmentacji i wzbogacanie PCR.

Krokitemperatura czas trwania
Gorący start72 °CCzas trwania: 5 min
Początkowa denaturacja98 °C30 sekund
denaturacja98 °C10 sekund16 cykli
Wyżarzanie60 °C30 sekund
rozszerzenie72 °C1 min
Końcowe przedłużenie72 °CCzas trwania: 5 min
4 °Ctrzymać

Tabela 8: Program termocyklera do PCR wzbogacającego.

instrumentKoncentracja obciążenia
MiSeq v2godz. 22
NastępnySeq 500/550godz. 13.4
NovaSeq 60001250 mln

Tabela 9: Przykłady wczytywania stężeń popularnych przyrządów do sekwencjonowania.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odkrywanie i opracowywanie leków może przynieść ogromne korzyści z holistycznego spojrzenia na procesy komórkowe, które może zapewnić transkryptomika masowa. Niemniej jednak podejście to jest często ograniczone przez wysokie koszty eksperymentu ze standardowym protokołem masowego sekwencjonowania RNA, co uniemożliwia jego zastosowanie w środowisku akademickim, a także jego potencjał skalowalności przemysłowej.

Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są rozmrażanie komórek i początkowe etapy przygotowania biblioteki. Zapewnienie wysokiej żywotności komórek po rozmrożeniu ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia i analizy transkryptomicznej. Pierwsze etapy zbierania komórek i przygotowania biblioteki do momentu syntezy cDNA mają kluczowe znaczenie dla zachowania integralności RNA. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby lizat komórkowy był cały czas utrzymywany na lodzie i przetwarzał próbki tak szybko, jak to możliwe. W przypadku zaobserwowania nadmiernej degradacji RNA, powierzchnie i sprzęt laboratoryjny należy oczyścić specjalnymi produktami, aby zahamować jakąkolwiek aktywność RNazy.

Opisany tutaj protokół jest obecnie zoptymalizowany pod kątem leczenia farmakologicznego na PBMC od zdrowych dawców przez maksymalnie 24 godziny. Aby przeprowadzić eksperyment z innym typem komórek lub dla dłuższego czasu inkubacji, może być konieczne odpowiednie zoptymalizowanie liczby komórek w warunkach siewu i hodowli.

Dzięki temu protokołowi zapewniamy przepływ pracy do analizy transkryptomicznej po leczeniu farmakologicznym na PBMC przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i bez potrzeby stosowania komercyjnych zestawów. Dzięki takiemu podejściu i unikaniu etapu oczyszczania RNA, znacznie obniżyliśmy koszty, co pozwoliło na równoległą analizę dużej liczby związków.

Ponieważ protokół ten opiera się na teście in vitro, jego głównym ograniczeniem jest to, że nie można w nim ocenić żadnego procesu metabolicznego leków, który mógłby prowadzić do różnej bioaktywności. Ponadto liczba przechwyconych transkryptów i głębokość sekwencjonowania będą niższe niż w standardowych masowych metodach transkryptomicznych o pełnej długości, co uniemożliwi wykorzystanie tych danych do zastosowań wymagających większej ilości informacji, takich jak splicing różnicowy lub kwantyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.L.S. jest wspierany przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości (EXC2151-390873048), a także w ramach SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammacja, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, finansowany przez BMBF projekt doskonałości Dieta-Ciało-Mózg (DietBB); oraz projekt unijny SYSCID w ramach grantu nr 733100. M.B. jest obsługiwany przez DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. jest wspierany przez DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Numer projektu 513977171) oraz niemiecką strategię doskonałości (EXC2151-390873048). Obrazy utworzone za pomocą BioRender.com.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Rurka stożkowa 50 mlFisher Scientific10203001
Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCRThermo Fisher ScientificAB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)IlluminaFC-131-1096Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (96 próbek)
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA 63881
Betaina Sigma-Aldrich61962
Płytki 96-dołkowe do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific260860
Pompa próżniowa do hodowli komórkowych (VACUSAFE)Integra Bioscience158300
Trifosforany deoksynukleotydów (dNTP) mieszają się po 10 mM każdyFermentasR0192
DMSOSigma-Aldrich276855
DTT (100 mM)Invitrogen18064-014
EDTASigma-Aldrich798681do komórek adherentnych
EtanolSigma-Aldrich51976
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific26140079
Końcówki filtrujące (10 &mikro; L)Gilson 
Końcówki filtrujące (100 &mikro; L)Gilson 
Końcówki filtrujące (20 &mikro; L)Gilson 
Końcówki filtrujące (200 &mikro; L)Gilson 
Chlorowodorek guanidynySigma-AldrichG3272
Starter ISPCR (10 &mikro; M)Biomers.net GmbHSP100065′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)KAPA BiosystemsKK2601
Chlorek magnezu (MgCl2) Sigma-AldrichM8266
Podstawka magnetyczna 96AmbionAM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer IlluminaFC-131-1096Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (96 próbek), alternatywnie 0,2 % SDS
Starter indeksujący kompatybilny z NexteraIllumina
Woda wolna od nukleazInvitrogen10977049
PBSThermo Fisher ScientificAM9624
PCR 96-dołkowe płytkiThermo Fisher ScientificAB0600
Zgrzewarka do płytek PCRThermo Fisher ScientificHSF0031
Penicylina / Streptomycyna Termo Fisher Scientific15070063
Fluorometr Qubit 4Invitrogen15723679
Rekombinowany inhibitor RNazy (40 U/ul)Pożywka do hodowli komórkowych TAKARA2313A
RPMI-1640 Gibco61870036Jeśli nie działa z PBMC, dostosuj do typu komórki 
Starter SMART dT30VNSigma-Aldrich5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standardowe wyposażenie laboratoryjneróżnenp. wirówka, maszyna do lodu, wiadro na lód, woda destylowana, łaźnia wodna
SuperScript II Odwrotna transkryptaza (SSRT II)Thermo Fisher Scientific18064-014
SuperScript II Bufor odwrotnej transkryptazy (SSRT II) (5x)Thermo Fisher Scientific18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)IlluminaFC-131-1096Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (96 próbek)
System TapeStation 4200AgilentG2991BA
Thermocycler (S1000)Bio-Rad1852148
TSO-LNA (100 uM)Eurogentec5' Biotyna AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 MixerSigma-AldrichZ258415
F171203F171403F171303F171503

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).">Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19(2020).">Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19(2020).
  3. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).">Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
  4. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012(2022).">Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012(2022).
  5. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).">Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
  6. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).">Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
  7. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233(2020).">De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233(2020).
  8. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).">Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  9. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).">Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  10. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).">Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  11. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).">Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Transcriptomic Drug ScreeningMini Bulk TranscriptomicsCost Effective SequencingPBMC Drug ScreeningCell Culture PlateReverse TranscriptionMagnetic Bead PurificationTagmentation ReactionEnrichment PCRSequencing Library Preparation

Related Articles