Artykuł metodologiczny

Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii

2.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65930

⸱

23 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Systems Medicine, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV., 2Genomics & Immunoregulation, LIMES Institute, University of Bonn, 3PRECISE Platform for Single Cell Genomics and Epigenomics, DZNE and University of Bonn, 4Immunogenomics & Neurodegeneration, German Center for Neurodegenerative Diseases (DZNE) eV.

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje proces od hodowli komórkowych ex vivo lub in vitro do wstępnego przetwarzania danych transkryptomicznych w celu opłacalnego badania przesiewowego leków opartego na transkryptomie.

Streszczenie

Transkryptomika pozwala uzyskać kompleksowy wgląd w programy komórkowe i ich reakcje na zakłócenia. Pomimo znacznego spadku kosztów produkcji bibliotecznej i sekwencjonowania w ostatniej dekadzie, zastosowanie tych technologii na skalę niezbędną do badań przesiewowych narkotyków pozostaje zbyt drogie, co utrudnia wykorzystanie ogromnego potencjału tych metod. W naszym badaniu przedstawiono efektywny kosztowo system do badań przesiewowych leków na podstawie transkryptomu, łączący zminiaturyzowane kultury perturbacyjne z transkryptomiką mini-masową. Zoptymalizowany protokół mini-bulk dostarcza informacyjnych sygnałów biologicznych przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek. W zależności od wybranego leczenia i czasu inkubacji, protokół ten spowoduje sekwencjonowanie bibliotek w ciągu około 2 dni. Ze względu na kilka punktów zatrzymania w tym protokole, przygotowanie biblioteki, jak również sekwencjonowanie, mogą być wykonywane niezależnie od czasu. Możliwe jest jednoczesne przetwarzanie dużej liczby próbek; Pomiar do 384 próbek został przetestowany bez utraty jakości danych. Nie są również znane żadne ograniczenia co do liczby schorzeń i/lub leków, pomimo uwzględnienia zmienności optymalnego czasu inkubacji leków.

Wprowadzenie

Rozwój nowych leków to złożony i czasochłonny proces, który obejmuje identyfikację potencjalnych leków i ich celów, optymalizację i syntezę kandydatów na leki oraz testowanie ich skuteczności i bezpieczeństwa w badaniach przedklinicznych i klinicznych1. Tradycyjne metody badań przesiewowych leków, tj. systematyczna ocena bibliotek związków kandydujących do celów terapeutycznych, obejmują wykorzystanie modeli zwierzęcych lub testów komórkowych w celu przetestowania wpływu na określone cele lub szlaki. Chociaż metody te okazały się skuteczne w identyfikacji kandydatów na leki, często nie dostarczały wystarczających informacji na temat złożonych mechanizmów molekularnych leżących u podstaw skuteczności leków, a także toksyczności i mechanizmów potencjalnych skutków ubocznych.

Ocena stanów transkrypcyjnych całego genomu stanowi skuteczne podejście do przezwyciężenia obecnych ograniczeń w badaniach przesiewowych leków, ponieważ umożliwia kompleksową ocenę ekspresji genów w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne2. Mierząc transkrypty RNA w sposób obejmujący cały genom wyrażony w danym czasie, transkryptomika ma na celu zapewnienie holistycznego spojrzenia na zmiany transkrypcyjne, które zachodzą w odpowiedzi na leki, w tym zmiany we wzorcach ekspresji genów, alternatywny splicing i niekodującą ekspresję RNA3. Informacje te mogą być wykorzystane do określenia celów leków, przewidywania ich skuteczności i toksyczności oraz optymalizacji dawkowania i schematów leczenia.

Jedną z kluczowych korzyści płynących z połączenia transkryptomiki z bezstronnym badaniem przesiewowym leków jest możliwość identyfikacji nowych celów leków, które wcześniej nie były brane pod uwagę. Konwencjonalne metody badań przesiewowych leków często koncentrują się na ustalonych cząsteczkach docelowych lub szlakach, co utrudnia identyfikację nowych celów i potencjalnie prowadzi do powstania leków o nieprzewidzianych skutkach ubocznych i ograniczonej skuteczności. Transkryptomika może przezwyciężyć te ograniczenia, dostarczając wglądu w zmiany molekularne, które zachodzą w odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, odkrywając potencjalne cele lub szlaki, które mogły nie być wcześniej brane pod uwagę2.

Oprócz identyfikacji nowych celów leków, transkryptomika może być również używana do przewidywania skuteczności i toksyczności leków. Analizując wzorce ekspresji genów związanych z reakcjami na leki, można opracować biomarkery, które można wykorzystać do przewidywania odpowiedzi pacjenta na określony lek lub schemat leczenia. Może to również pomóc w optymalizacji dawkowania leków i zmniejszeniu ryzyka wystąpienia niepożądanych skutków ubocznych4.

Pomimo potencjalnych korzyści, koszt transkryptomiki pozostaje istotną przeszkodą dla jej szerokiego zastosowania w badaniach przesiewowych leków. Analiza transkryptomiczna wymaga specjalistycznego sprzętu, wiedzy technicznej i analizy danych, co może stanowić wyzwanie dla mniejszych zespołów badawczych lub organizacji o ograniczonych funduszach w wykorzystaniu transkryptomiki w badaniach przesiewowych leków. Jednak koszt transkryptomiki stale spada, co czyni ją bardziej dostępną dla społeczności naukowych. Ponadto postęp w technologii i metodach analizy danych sprawił, że transkryptomika stała się bardziej wydajna i opłacalna, co jeszcze bardziej zwiększyło jej dostępność2.

W tym protokole opisujemy wielowymiarowy i eksploracyjny system do badań przesiewowych leków opartych na transkryptomie, łączący zminiaturyzowane kultury perturbacji z analizą transkryptomiczną mini-masową5,6. Dzięki temu protokołowi możliwe jest obniżenie kosztu na próbkę do 1/6 obecnego kosztu komercyjnych rozwiązań do sekwencjonowania mRNA o pełnej długości. Protokół wymaga jedynie standardowego sprzętu laboratoryjnego, a jedynym wyjątkiem jest stosowanie technologii sekwencjonowania z krótkim odczytem, które można zlecić na zewnątrz, jeśli przyrządy do sekwencjonowania nie są dostępne we własnym zakresie. Zoptymalizowany protokół mini-bulk dostarcza bogatych w informacje sygnałów biologicznych przy opłacalnej głębokości sekwencjonowania, umożliwiając szeroko zakrojone badania przesiewowe znanych leków i nowych cząsteczek.

Celem eksperymentu jest sprawdzenie aktywności leków na PBMC w różnych kontekstach biologicznych. Protokół ten może być zastosowany do każdego zagadnienia biologicznego, w którym kilka leków powinno być testowanych z odczytem transkryptomicznym, dając szeroki transkryptom wglądu w komórkowy efekt leczenia.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi lokalnych komisji etycznych Uniwersytetu w Bonn.

1. Przygotowanie buforów, roztworów i sprzętu

  1. Przygotować roztwory i zgromadzić materiały opisane w Tabeli materiałów.
  2. Rozgrzać łaźnię wodną do 37 °C i ogrzać pełną pożywkę wzrostową (RPMI-1640 + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS) + 1% penicyliny/streptomycyny).
  3. Do zbioru komórek należy użyć lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    UWAGA: Podczas pracy z komórkami należy zachować czystość otoczenia w celu utrzymania sterylności.

2. Obsługa komórek

UWAGA: Szczegółowy protokół kriozachowywania mononuklearnych komórek krwi obwodowej (PBMC) z krwi ludzkiej znajduje się w 7.

  1. Rozmrażanie i liczenie komórek
    1. Wyjmij kriotubule z ciekłego azotu i rozmrażaj je w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 - 3 min, delikatnie odwracając probówki.
    2. Przenieś rozmrożone komórki do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.
    3. Przepłucz kriotubulę 1 mL ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej i dodaj ten roztwór kroplami do komórek w probówce (1st etap rozcieńczania).
    4. Powtarzaj rozcieńczanie 1:1, aż do osiągnięcia objętości 32 mL (łącznie 5 rozcieńczeń z odpowiednio 1, 2, 4, 8 i 16 mL ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej). Dodawaj pożywkę kroplami, aby zminimalizować wytrząsanie komórek, lekko agitując probówkę stożkową.
    5. Odwiruj zawiesinę komórkową przez 5 min (300 x g, 20 °C) i usuń supernatant, delikatnie przechylając probówkę stożkową jednym płynnym ruchem.
    6. Resuspenduj komórki w 3 mL ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej i przystąp do liczenia komórek.
    7. W celu liczenia zmieszaj 10 µL zawiesiny komórkowej z Trypan Blue (rozcieńczenie od 1:2 do 1:10 w zależności od gęstości zawiesiny komórkowej), aby odróżnić komórki żywe od martwych podczas liczenia. Komórki martwe lub uszkodzone będą miały kolor niebieski ze względu na pobranie barwnika, natomiast komórki żywe nie zostaną zabarwione.
      UWAGA: Trypan Blue jest lekko cytotoksyczny, zabarwione komórki nie powinny być przechowywane dłużej niż przez 5 min.
    8. Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek lub komory liczbowej, wykorzystując 10 µL zabarwionego roztworu komórek.
      1. Przy użyciu ulepszonej komory Neubauera policz wszystkie komórki w czterech dużych kwadratach znajdujących się w narożnikach i zastosuj poniższe równanie, aby obliczyć stężenie zawiesiny komórkowej.
        Równanie równowagi statycznej, wzór na liczbę komórek; obliczenia dla analizy rozcieńczenia i stężenia.
    9. Rozcieńcz komórki do końcowego stężenia 1 x 106 komórek/mL za pomocą ciepłej, pełnej pożywki wzrostowej. Odwiruj tylko wtedy, gdy wymagana objętość jest mniejsza niż 3 mL, a następnie resuspenduj osad komórkowy do odpowiedniej objętości.
  2. Wysiew i traktowanie komórek
    1. Wysiej 100 µL zawiesiny komórkowej na dołek w 96-dołkowej płytce do hodowli komórek (1 x 105 komórek / dołek).
      UWAGA: Liczba komórek do wysiewu została zoptymalizowana dla kultur PBMC. Podczas gdy niskie stężenia komórek nie dostarczą wystarczającej ilości RNA do sekwencjonowania, nadmierna liczba komórek zwiększy ryzyko suboptimalnej lizy komórek i inhibicji reakcji odwrotnej transkrypcji.
    2. Przygotuj rozcieńczenia leku o stężeniu dwukrotnie większym niż stężenie stosowane podczas traktowania (2x). Wybierz rozpuszczalnik zgodnie z rozpuszczalnością związku, najlepiej pełną pożywkę wzrostową.
      UWAGA: Można stosować PBS lub dimetylosulfotlenek (DMSO), jeśli w inny sposób nie uda się osiągnąć wystarczającej rozpuszczalności. Maksymalne stężenie DMSO w końcowej objętości inkubacji nie powinno przekraczać 0,5 %, aby zapobiec cytotoksyczności indukowanej przez rozpuszczalnik.
    3. Dodaj 100 µL 2-krotnego rozcieńczenia leku (stężenie końcowe w dołku 1X) i inkubuj w 37 °C przez określony czas.
      UWAGA: Należy przeprowadzić badania uzupełniające w celu ustalenia optymalnego czasu inkubacji leku i wykluczenia potencjalnych mechanizmów cytotoksyczności.
  3. Zbiór i liza komórek
    1. Odwiruj płytkę do hodowli komórek przez 10 min (300 x g, 20 °C). Delikatnie usuń supernatant za pomocą pompy próżniowej, trzymając płytkę pod kątem (30°-45°) i kierując końcówkę w stronę dolnego narożnika dołka, aby usunąć jak najmniej komórek.
    2. Przemyj komórki, dodając 200 µL lodowatego PBS do każdego dołka i odwiruj płytkę przez 5 min (300 x g, 4 °C). Usuń supernatant za pomocą pompy próżniowej, ponownie trzymając płytkę pod dużym kątem, aby usunąć jak najwięcej PBS.
    3. Przygotuj bufor do lizy zgodnie z opisem w Tabeli 1 dla wymaganej liczby reakcji (rxn), dodając 10% zapasu.
    4. Dodaj 15 µL buforu do lizy do każdego dołka i szczelnie zamknij płytkę folią uszczelniającą, aby chronić próbki przed kontaminacją. Wymieszaj płytkę w wortexie przed odwirowaniem przez 1 min (1000 x g, 4 °C) i inkubuj przez 5 min na lodzie.
    5. Zabierz 6 µL roztworu lizowanych komórek do płytki PCR i krótko zamroź lizat komórkowy w -80 °C, aby zapewnić optymalną lizę komórek. Pamiętaj, aby unikać wielokrotnych cykli zamrażania płytek.
      UWAGA: PUNKT ZATRZYMANIA: Jeśli produkcja cDNA nie jest przeprowadzana bezpośrednio po tym etapie, lizat komórkowy można przechowywać w -80 °C przez kilka miesięcy bez znacznego spadku jakości RNA.

3. Przygotowanie biblioteki do sekwencjonowania

  1. Reakcja odwrotnej transkrypcji (RT)
    UWAGA: Podczas pracy z RNA wszystkie próbki należy trzymać na lodzie i używać sprzętu wolnego od nukleaz (sterylnych, jednorazowych wyrobów plastikowych) oraz wody wolnej od nukleaz.
    1. Przygotować mieszaninę do reakcji RT zgodnie z Tabelą 2 dla wymaganej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru. Krótko wymieszać mieszaninę wirówkami (vortex) i krótko odwirCować. Mieszaninę przechowywać na lodzie do momentu użycia.
    2. Rozmrozić lizat komórkowy w temperaturze pokojowej (RT) i krótko odwirować, aby zebrać cały lizat na dnie płytki.
    3. Przeprowadzić denaturację mRNA w termocyklerze zgodnie z Tabelą 3.
    4. Wyjąć płytkę z termocyklera i krótko odwirować, aby zebrać potencjalny kondensat. Do każdej studni dodać 6 µL mieszaniny do reakcji RT, tak aby uzyskać końcową objętość 12 µL. Zamknąć płytkę, aby ją zabezpieczyć i uniknąć parowania, wymieszać wirówką i odwirować.
    5. Umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić program reakcji RT zgodnie z Tabelą 3.
  2. Preamplifikacja
    1. Rozmrozić polimerazę DNA o wysokiej wierności oraz starter do PCR in-situ (ISPCR) w temperaturze pokojowej.
    2. Przygotować mieszaninę do preamplifikacji zgodnie z Tabelą 4 dla wymaganej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru. Krótko wymieszać mieszaninę wirówkami i odwirować.
      UWAGA: Mieszanina enzymatyczna jest stabilna w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
    3. Odwirować płytkę PCR, dodać 15 µL mieszaniny do preamplifikacji do każdej studni i zamknąć płytkę.
    4. Umieścić ją w termocyklerze i uruchomić reakcję preamplifikacji zgodnie z Tabelą 5.
      1. Dostosować liczbę cykli do zawartości RNA. Zacząć od mniejszej liczby i zwiększać ją, jeśli wydajność cDNA jest niewystarczająca.
        UWAGA: Z naszego doświadczenia wynika, że optymalną liczbę cykli należy ustalić dla każdego typu komórek; warunki eksperymentalne i traktowanie nie wpływają na optymalną liczbę cykli. Dlatego zalecamy eksperymentalne ustalenie optymalnej liczby cykli przy wdrażaniu tego protokołu dla nowego typu komórek. Generalnie komórki pierwotne wymagają większej liczby cykli w porównaniu do linii komórkowych. PUNKT ZATRZYMANIA: Produkt preamplifikacji można przechowywać w temperaturze - 20 °C.
  3. Oczyszczanie cDNA i kontrola jakości (QC)
    UWAGA: Oczyszczanie próbek można przeprowadzać sekwencyjnie dla każdej płytki, ponieważ próbki są na tym etapie dość stabilne. Zwiększenie liczby próbek wydłuży czas trwania protokołu, ale nie ograniczy liczby próbek, które można przetwarzać jednocześnie.
    1. Przed rozpoczęciem doprowadzić magnetyczne kulki do oczyszczania do temperatury pokojowej i mieszać w wirówce z wysoką prędkością przez 1 min, aby w pełni resuspendować kulki.
    2. Dodać 0,8x v/v (20 µL) magnetycznych kulek do oczyszczania do każdej studni i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Umieścić płytkę PCR na statywie magnetycznym na 5 min, aż kulki zostaną całkowicie oddzielone. Ostrożnie usunąć supernatant.
    4. Trzymając płytkę na statywie magnetycznym, delikatnie dodać 100 µL świeżo przygotowanego 80% etanolu w celu przemycia kulek i inkubować przez 30 s. Użyć pipety o małej objętości do usunięcia supernatantu. Powtórzyć krok dla dodatkowego etapu płukania. Należy upewnić się, że usunięto jak najwięcej etanolu.
    5. Suszyć kulki na powietrzu na statywie magnetycznym w temperaturze pokojowej do 5 min, aż etanol całkowicie odparuje, a kulki przestaną być błyszczące.
    6. Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego, resuspendować kulki w 20 µL wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 2 min.
    7. Ponownie umieścić płytkę na statywie magnetycznym, aż kulki się oddzielą.
    8. Przenieść eluat do nowej płytki PCR w celu kontroli jakości cDNA i tagmentacji.
    9. Przeprowadzić analizę za pomocą TapeStation lub FragmentAnalyser, aby ocenić rozkład wielkości i stężenie biblioteki cDNA (Zalecany test: TapeStation D5000). Szczegóły znajdują się w instrukcjach producenta. Przewidywana typowa wydajność to 20 ng.
  4. Tagmentacja z użyciem zestawu
    UWAGA: Jeśli istnieją już opracowane inne protokoły tagmentacji, można ich użyć.
    1. Rozcieńczyć cDNA do końcowego stężenia 150 - 300 pg/µL, używając wody wolnej od nukleaz.
    2. Zaprogramować termocykler zgodnie z Tabelą 6, aby zapewnić natychmiastowy start reakcji tagmentacji po dodaniu cDNA do mieszaniny enzymatycznej.
    3. Przygotować mieszaninę do tagmentacji zgodnie z Tabelą 7 dla wymaganej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru.
    4. Napiować 3 µL mieszaniny do tagmentacji na jedną reakcję do nowej płytki PCR i dodać 1 µL cDNA do każdej reakcji.
    5. Uruchomić reakcję tagmentacji natychmiast po dodaniu cDNA.
    6. Dezaktywować reakcję, dodając 1 µL buforu neutralizującego tagment (NT; alternatywnie można użyć 0,2% dodecylu siarczanu sodu (SDS)).
  5. PCR wzbogacający
    1. Przygotować mieszaninę do PCR wzbogacającego zgodnie z Tabelą 7 dla odpowiedniej liczby reakcji, doliczając 10% nadmiaru. (Zalecany: zestaw Nextera UDI w celu zapobiegania zjawisku index hopping na przepływach wzorowanych (np. Illumina NovaSeq 6000)).
    2. Dodać 9 µL mieszaniny do PCR wzbogacającego do każdej reakcji, aby uzyskać całkowitą objętość 14 µL.
    3. Uruchomić program PCR wzbogacający zgodnie z Tabelą 8.
      UWAGA: Standardowo w przypadku PCR wzbogacającego stosuje się 16 cykli. Jeśli jakość cDNA jest słaba, można dodać dodatkowe cykle.
  6. Oczyszczanie i kontrola jakości (QC)
    1. Przed rozpoczęciem doprowadzić magnetyczne kulki do oczyszczania do temperatury pokojowej i mieszać w wirówce z wysoką prędkością przez 1 min, aby w pełni resuspendować kulki.
    2. Dodać 1,0x v/v (14 µL) magnetycznych kulek do oczyszczania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
    3. Umieścić płytkę na statywie magnetycznym i odczekać 5 min, aż kulki zostaną całkowicie oddzielone. Ostrożnie usunąć supernatant.
    4. Trzymając płytkę na statywie magnetycznym, delikatnie dodać 100 µL świeżo przygotowanego 80% etanolu w celu przemycia kulek i inkubować przez 30 s. Użyć pipety o małej objętości do usunięcia supernatantu. Powtórzyć krok dla dodatkowego etapu płukania. Należy upewnić się, że usunięto jak najwięcej etanolu.
    5. Suszyć kulki na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 3 min lub do momentu, gdy przestaną być błyszczące.
    6. Zdjąć płytkę ze statywu magnetycznego, resuspendować kulki w 20 µL wody wolnej od nukleaz i inkubować przez 2 min.
    7. Ponownie umieścić płytkę na statywie magnetycznym, aż kulki się oddzielą, i przenieść eluat do nowej płytki PCR w celu kontroli jakości biblioteki.
    8. Przeprowadzić analizę za pomocą TapeStation lub Fragment Analyzer, aby ocenić rozkład wielkości i stężenie biblioteki cDNA (Zalecany test: TapeStation D1000 high-sensitivity). Szczegóły znajdują się w instrukcjach producenta. Średnio spodziewana wydajność wynosi 10 ng.
      ​UWAGA: PUNKT ZATRZYMANIA: Produkt PCR można przechowywać w temperaturze - 20 °C.

4. Sekwencjonowanie i wstępne przetwarzanie danych

  1. Sekwencjonowanie
    UWAGA: Poniższe wytyczne mają zastosowanie do wszystkich instrumentów Illumina do sekwencjonowania krótkich odczytów. W przypadku braku dostępności aparatury, sekwencjonowanie można zlecić zewnętrznemu ośrodkowi sekwencjonowania. Można również zastosować inne podejścia do sekwencjonowania. Dla uproszczenia zdecydowano się opisać wyłącznie najszerzej stosowaną technologię sekwencjonowania.
    UWAGA: Poniższe kroki dotyczące obsługi oprogramowania opisują procedurę na sekwenatorze Illumina NovaSeq 6000.
    1. Połącz biblioteki z unikalnymi indeksami w stosunku ekimolarnym, zgodnie z wynikami uzyskanymi w kroku 3.6.8.
    2. Zmierz stężenie końcowej puli za pomocą wysokoczułego testu, aby obliczyć molarność próbki w następujący sposób:
      Wzór na ilościowe oznaczenie DNA, równanie stężenia kwasów nukleinowych, z uwzględnieniem ng/µL, schemat.
    3. Należy załadować komórkę przepływową zgodnie ze specyfikacją urządzenia oraz optymalizacją eksperymentalną. Przykłady stężeń ładowania dla powszechnie stosowanych urządzeń przedstawiono w Tabela 9.
    4. Dotknij ekranu, aby wybrać Sekwencja w celu rozpoczęcia konfiguracji przebiegu.
    5. Postępuj zgodnie z instrukcjami wyświetlanymi na ekranie i umieść w urządzeniu ogniwo przepływowe, kartridż do sekwencjonowania przez syntezę, kartridż do klastrowania oraz kartridż z buforem, a następnie upewnij się, że pojemniki na odpady są puste.
    6. Po rozpoznaniu przez instrument wszystkich odczynników należy kliknąć Konfiguracja uruchomieniaZdefiniuj tutaj nazwę uruchomienia oraz folder wyjściowy do przechowywania danych.
    7. Zdefiniuj szczegóły sekwencjonowania jako sekwencjonowanie par końców (paired-end), w którym oba odczyty mają długość 51 bp. Sekwencjonowane są również dwa odczyty indeksów, każdy o długości 8 bp.
    8. Naciśnij Przegląd a po sprawdzeniu poprawności wszystkich szczegółów sekwencjonowania należy nacisnąć Rozpocznij przebieg.
      UWAGA: Zalecana głębokość sekwencjonowania wynosi 5 x 106 odczytów/próbkę, z minimum 1 x 106 odczyty/próbka.
  2. Wstępne przetwarzanie danych
    1. Przekształć surowe dane z sekwencjonowania do formatu FASTQ i przeprowadź demultipleksację zgodnie z indeksami próbek przy użyciu narzędzia Bcl2Fastq2. Przeprowadź demultipleksację przy użyciu ustawień domyślnych. Szczegółowe instrukcje dotyczące Bcl2Fastq2 znajdują się w podręczniku referencyjnym.
      UWAGA: Konwersja do formatu FASTQ oraz demultipleksowanie są zazwyczaj wykonywane przez ośrodek sekwencjonowania, jeśli sekwencjonowanie nie jest przeprowadzane wewnątrz jednostki. Ośrodki sekwencjonowania zazwyczaj dostarczają zdemultipleksowane pliki FASTQ do dalszej analizy.
    2. Dostępnych jest kilka opcji dopasowania danych i kwantyfikacji obfitości odczytów sekwencjonowania (zalecany: rurociąg nf-core RNA-seq (https://nf-co.re/rnaseq)). Rurociąg ten oferuje kilka opcji; należy zastosować ustawienia domyślne z programem STAR.8 zgodnie z dopasowaniem i Salmon9 w celu ilościowego oznaczenia poziomu transkrypcji.
    3. UWAGA: Do dalszych analiz bioinformatycznych dostępnych jest kilka metod. Poza zakresem niniejszego protokołu znajduje się opisanie wszystkich z nich (zalecany: potok DEseq2)10). Standardowy skrypt oparty na opracowanym przez nas przepływie pracy DEseq2 znajduje się w serwisie GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Wyniki

Zgodnie z opisanym protokołem, ludzkie PBMC wysiano, poddano działaniu różnych leków immunomodulujących, a po różnych czasach inkubacji zebrano do analizy transkryptomicznej typu bulk, stosując protokół sekwencjonowania (Rycina 1).

Optymalne stężenia leków i czasy inkubacji dla testowanych związków powinny zostać określone przed rozpoczęciem niniejszego protokołu przy użyciu uzupełniających strategii eksperymentalnych i w oparciu o konkretne pytanie badawcze. W większości przypadków inkubacja przez 2 - 4 h oraz 24 h powinna zapewnić reprezentatywny obraz wczesnych i późnych odpowiedzi transkrypcyjnych na zastosowane leczenie.

Najważniejszymi wynikami służącymi do oceny prawidłowości wykonania protokołu są kontrole jakości (QC) cDNA oraz biblioteki (Rysunek 2 oraz Rysunek 3). Profil cDNA powinien charakteryzować się szerokim rozkładem ze średnią wielkością > 1000 bp (Rysunek 2); mniejsza średnia wielkość lub akumulacja cząsteczek o niskiej masie cząsteczkowej (Rysunek 4) może wskazywać na zbyt niską ilość wprowadzonego RNA lub jego degradację.

Przygotowanie wysokiej jakości biblioteki do sekwencjonowania jest również istotnym etapem protokołu; biblioteki po tagmentacji powinny wykazywać dość wąski rozkład fragmentów o długości około 250 bp (Rysunek 3); dłuższe fragmenty będą charakteryzować się niską wydajnością podczas sekwencjonowania (Rysunek 5).

Po sekwencjonowaniu surowe pliki FASTQ są dopasowywane do odpowiedniego genomu referencyjnego (np. ludzkiego lub mysiego), a następnie kwantyfikowana jest obfitość transkryptów dla każdej próbki (patrz: nf-core RNA-seq pipeline (https://nf-co.re/rnaseq)). Następnie przeprowadzona zostanie eksploracyjna analiza danych w celu sprawdzenia ogólnej jakości danych. Dopasowane dane powinny obejmować wysoką liczbę genów kodujących białka, ponieważ w tym protokole wychwycone zostanie tylko RNA poliadenylowane (Rysunek 6A). W próbkach ludzkich spodziewamy się wychwycenia od 15000 do 20000 transkryptów (wartość ta opiera się na adnotacji referencyjnego genomu ludzkiego GENCODE 2711). Dalsza eksploracyjna analiza danych może obejmować analizę głównych składowych (PCA). Dzięki niej struktura danych może zostać zwizualizowana na wykresie dwuwymiarowym. Na Rysunku 6B przedstawiono przykładowy wykres PCA; kropki są tu określone kolorami według zastosowanego leczenia, co pokazuje trzy różne klastry warunków eksperymentalnych prowadzących do podobnych profili transkrypcyjnych. Widać również, że repliki biologiczne (kropki w tym samym kolorze) są transkrypcyjnie podobne, co świadczy o dobrej powtarzalności protokołu. Wyniki przedstawione na tym rysunku zostały wygenerowane za pomocą pipeline'u dostępnego na GitHubie, opartego na workflow DESeq2 (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Schemat od manipulacji komórkami do sekwencjonowania, RT PCR, przygotowanie cDNA, kroki przepływu pracy, konfiguracja laboratorium.
Rysunek 1: Szacowany czas i schemat przepływu pracy. (A) Szacowany czas trwania tego protokołu dla analizy 96 próbek. (B) Schemat każdego kroku w protokole, od rozmrożenia komórek do wstępnego przetwarzania danych. Schemat należy czytać od góry do dołu, zgodnie ze strzałkami. Strzałki w okręgach opisują powtórzenie kroku. Czerwone kropki reprezentują punkty zatrzymania opisane szczegółowo w protokole. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykres wyników elektroforezy; rozkład wielkości fragmentów DNA; zakres wielkości od 15 do 10000 bp.
Rycina 2: Przykładowe wyniki dla bibliotek cDNA. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy obrazujące rozkład wielkości przykładowej biblioteki cDNA. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). Profil cDNA wykazuje szeroki rozkład o średniej wielkości > 1000 bp. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy żelowej; rozkład wielkości DNA; wykres; analiza piku; określanie wielkości cząsteczek.
Rycina 3: Przykładowe wyniki dla bibliotek do sekwencjonowania. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości pomyślnie przygotowanych bibliotek do sekwencjonowania z wąskim rozkładem i średnią wielkością około 250 bp. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wynik elektroforezy, wykres fragmentacji DNA, przedstawiający rozkład wielkości, analiza fragmentów.
Rysunek 4: Przykładowe suboptymalne wyniki dla bibliotek cDNA. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości suboptymalnej biblioteki cDNA o średniej wielkości < 200 bp. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wynik elektroforezy, intensywność próbki względem wielkości, piki drabinki DNA, wykres do analizy genetycznej.
Rysunek 5: Przykładowe nieoptymalne wyniki dla bibliotek sekwencjonowania. Wyniki miniaturyzowanej elektroforezy przedstawiające rozkład wielkości nieoptymalnej biblioteki sekwencjonowania zawierającej dłuższe fragmenty o rozmiarze 200 - 1000 bp. Górne i dolne sygnały reprezentują markery użyte do wyrównania próbki. Niebieskie linie wskazują średnie wielkości fragmentów (niebieskie nawiasy). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza danych ekspresji genów; wykres słupkowy i wykres rozrzutu PCA przedstawiające wariancję po zastosowaniu leków.
Rysunek 6: Eksploracyjna analiza danych. Reprezentatywne wyniki eksploracyjnej analizy danych wykazujące wpływ wybranych leków immunomodulujących na PBMC. (A) Wykres słupkowy liczby wykrytych genów (osie Y) z podziałem na typy genów (osie X). (B) Analiza PCA wszystkich genów w zbiorze danych, z kolorami odpowiadającymi poszczególnym lekom. Kropki tego samego koloru to powtórzenia biologiczne. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

OdczynnikStężenieObjętość [µL] /reakcja
Chlorowodorek guanydyny80 mM7.50
Deoksynukleotydotrifosforany (dNTPs)po 10 mM każdego6.52
Starter SMART dT30VN100 µM0.33
Woda wolna od nukleaz0.65
Objętość całkowita15.00

Tabela 1: Bufor do lizy.

OdczynnikTom [µL] /rxn
bufor SSRT II (5x)2.00
DTT (100 mM)0.50
Betaina (5 M)2.00
MgCl₂2 (1 M)0.14
SSRT II (200 U/µL)0.25
inhibitor RNazy (40 j./µL)0.25
TSO-LNA (100 µM)0.20
Woda wolna od nukleaz0.66
Objętość całkowita6.00

Tabela 2: Mieszanina do reakcji odwrotnej transkrypcji (RT).

denaturacja mRNA
KrokTemperaturaCzas trwania
denaturacja mRNA95 °C2 min
w lodzie2 min
Transkrypcja odwrotna
KrokTemperaturaCzas trwania
Odwrotna transkrypcja42 °C 90 min
Inaktywacja enzymu70 °C15 min
4 °Cprzytrzymać

Tabela 3: Program termocyklera dla denaturacji mRNA i odwrotnej transkrypcji (RT).

OdczynnikObjętość [µL] /reakcja 
Polimeraza DNA o wysokiej wierności 12.50
starter do IS-PCR (10 µM)0.15
Woda wolna od nukleaz2.35
Objętość całkowita15.00

Tabela 4: Mieszanina do preamplifikacji.

KrokiTemperaturaCzas trwania
Wstępna denaturacja98 °C3 min
Denaturacja98 °C20 s16–18 cykli
Wyżarzanie67 °C20 s
Rozszerzenie72 °C 6 min
4 °Cprzytrzymać

Tabela 5: Program termocyklera dla preamplifikacji.

KrokiTemperaturaCzas trwania
Tagmentacja55 °C8 min
4 °Cprzytrzymać

Tabela 6: Program termocyklera do tagmentacji.

Mieszanina do tagmentacji
OdczynnikTom [µL] /rxn 
Mieszanina do tagmentacji amplikonów (ATM)1.0
Bufor do tagmentacji DNA (TD)2.0
Objętość całkowita3.0
Mieszanina do PCR wzbogacającego
OdczynnikObjętość [µL] /rxn
Polimeraza DNA o wysokiej wierności 7.0
Starter indeksujący kompatybilny z Nextera2.0
Objętość całkowita9.0

Tabela 7: Mieszanina do tagmentacji i mieszanina do PCR wzbogacania.

KrokiTemperatura Czas trwania
Szybki start (Hot Start)72 °C5 min
Wstępna denaturacja98 °C30 s
Denaturacja98 °C10 s16 cykli
Wyżarzanie60 °C30 s
Rozszerzenie72 °C1 min
Ostateczna elongacja72 °C5 min
4 °Cprzytrzymać

Tabela 8: Program termocyklera dla PCR wzbogacania.

InstrumentStężenie nakładane
MiSeq v210 pM
NextSeq 500/5501,4 pM
NovaSeq 60001250 pM

Tabela 9: Przykłady stężeń ładowania dla powszechnie stosowanych sekwenatorów.

Dyskusja

Odkrywanie i opracowywanie leków może przynieść ogromne korzyści z holistycznego spojrzenia na procesy komórkowe, które może zapewnić transkryptomika masowa. Niemniej jednak podejście to jest często ograniczone przez wysokie koszty eksperymentu ze standardowym protokołem masowego sekwencjonowania RNA, co uniemożliwia jego zastosowanie w środowisku akademickim, a także jego potencjał skalowalności przemysłowej.

Najbardziej krytycznymi etapami protokołu są rozmrażanie komórek i początkowe etapy przygotowania biblioteki. Zapewnienie wysokiej żywotności komórek po rozmrożeniu ma kluczowe znaczenie dla skutecznego leczenia i analizy transkryptomicznej. Pierwsze etapy zbierania komórek i przygotowania biblioteki do momentu syntezy cDNA mają kluczowe znaczenie dla zachowania integralności RNA. Na tym etapie bardzo ważne jest, aby lizat komórkowy był cały czas utrzymywany na lodzie i przetwarzał próbki tak szybko, jak to możliwe. W przypadku zaobserwowania nadmiernej degradacji RNA, powierzchnie i sprzęt laboratoryjny należy oczyścić specjalnymi produktami, aby zahamować jakąkolwiek aktywność RNazy.

Opisany tutaj protokół jest obecnie zoptymalizowany pod kątem leczenia farmakologicznego na PBMC od zdrowych dawców przez maksymalnie 24 godziny. Aby przeprowadzić eksperyment z innym typem komórek lub dla dłuższego czasu inkubacji, może być konieczne odpowiednie zoptymalizowanie liczby komórek w warunkach siewu i hodowli.

Dzięki temu protokołowi zapewniamy przepływ pracy do analizy transkryptomicznej po leczeniu farmakologicznym na PBMC przy użyciu standardowego sprzętu laboratoryjnego i bez potrzeby stosowania komercyjnych zestawów. Dzięki takiemu podejściu i unikaniu etapu oczyszczania RNA, znacznie obniżyliśmy koszty, co pozwoliło na równoległą analizę dużej liczby związków.

Ponieważ protokół ten opiera się na teście in vitro, jego głównym ograniczeniem jest to, że nie można w nim ocenić żadnego procesu metabolicznego leków, który mógłby prowadzić do różnej bioaktywności. Ponadto liczba przechwyconych transkryptów i głębokość sekwencjonowania będą niższe niż w standardowych masowych metodach transkryptomicznych o pełnej długości, co uniemożliwi wykorzystanie tych danych do zastosowań wymagających większej ilości informacji, takich jak splicing różnicowy lub kwantyfikacja polimorfizmów pojedynczych nukleotydów.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

J.L.S. jest wspierany przez Niemiecką Fundację Badawczą (DFG) w ramach Niemieckiej Strategii Doskonałości (EXC2151-390873048), a także w ramach SCHU 950/8-1; GRK 2168, TP11; CRC SFB 1454 Metaflammacja, IRTG GRK 2168, WGGC INST 216/981-1, CCU INST 217/988-1, finansowany przez BMBF projekt doskonałości Dieta-Ciało-Mózg (DietBB); oraz projekt unijny SYSCID w ramach grantu nr 733100. M.B. jest obsługiwany przez DFG (IRTG2168-272482170, SFB1454-432325352). L.B. jest wspierany przez DFG (ImmuDiet BO 6228/2-1 - Numer projektu 513977171) oraz niemiecką strategię doskonałości (EXC2151-390873048). Obrazy utworzone za pomocą BioRender.com.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurka stożkowa 50 mlFisher Scientific10203001
Samoprzylepne uszczelki płytkowe do PCRThermo Fisher ScientificAB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)IlluminaFC-131-1096Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (96 próbek)
Koraliki AMPure XPBeckman CoulterA 63881
Betaina Sigma-Aldrich61962
Płytki 96-dołkowe do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific260860
Pompa próżniowa do hodowli komórkowych (VACUSAFE)Integra Bioscience158300
Trifosforany deoksynukleotydów (dNTP) mieszają się po 10 mM każdyFermentasR0192
DMSOSigma-Aldrich276855
DTT (100 mM)Invitrogen18064-014
EDTASigma-Aldrich798681do komórek adherentnych
EtanolSigma-Aldrich51976
Surowica bydlęcapłodu Thermo Fisher Scientific26140079
Końcówki filtrujące (10 &mikro; L)Gilson 
Końcówki filtrujące (100 &mikro; L)Gilson 
Końcówki filtrujące (20 &mikro; L)Gilson 
Końcówki filtrujące (200 &mikro; L)Gilson 
Chlorowodorek guanidynySigma-AldrichG3272
Starter ISPCR (10 &mikro; M)Biomers.net GmbHSP100065′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3′
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)KAPA BiosystemsKK2601
Chlorek magnezu (MgCl2) Sigma-AldrichM8266
Podstawka magnetyczna 96AmbionAM10027
Neutralize Tagment (NT) Buffer IlluminaFC-131-1096Zestaw do przygotowania biblioteki DNA Nextera XT (96 próbek), alternatywnie 0,2 % SDS
Starter indeksujący kompatybilny z NexteraIllumina
Woda wolna od nukleazInvitrogen10977049
PBSThermo Fisher ScientificAM9624
PCR 96-dołkowe płytkiThermo Fisher ScientificAB0600
Zgrzewarka do płytek PCRThermo Fisher ScientificHSF0031
Penicylina / Streptomycyna Termo Fisher Scientific15070063
Fluorometr Qubit 4Invitrogen15723679
Rekombinowany inhibitor RNazy (40 U/ul)Pożywka do hodowli komórkowych TAKARA2313A
RPMI-1640 Gibco61870036Jeśli nie działa z PBMC, dostosuj do typu komórki 
Starter SMART dT30VNSigma-Aldrich5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACT30VN-3
Standardowe wyposażenie laboratoryjneróżnenp. wirówka, maszyna do lodu, wiadro na lód, woda destylowana, łaźnia wodna
SuperScript II Odwrotna transkryptaza (SSRT II)Thermo Fisher Scientific18064-014
SuperScript II Bufor odwrotnej transkryptazy (SSRT II) (5x)Thermo Fisher Scientific18064-014
Tagment DNA Buffer (TD)IlluminaFC-131-1096Nextera XT Zestaw do przygotowania biblioteki DNA (96 próbek)
System TapeStation 4200AgilentG2991BA
Thermocycler (S1000)Bio-Rad1852148
TSO-LNA (100 uM)Eurogentec5' Biotyna AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 MixerSigma-AldrichZ258415
F171203F171403F171303F171503

Bibliografia

  1. Hughes, J. P., Rees, S., Kalindjian, S. B., Philpott, K. L. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 162 (6), 1239-1249 (2011).
  2. Yang, X., et al. High-throughput transcriptome profiling in drug and biomarker discovery. Front Genet. 11, 19(2020).
  3. Bonaguro, L., et al. A guide to systems-level immunomics. Nat Immunol. 23 (10), 1412-1423 (2022).
  4. Carraro, C., et al. Decoding mechanism of action and sensitivity to drug candidates from integrated transcriptome and chromatin state. ELife. 11, 78012(2022).
  5. Picelli, S., et al. Smart-seq2 for sensitive full-length transcriptome profiling in single cells. Nat Methods. 10 (11), 1096-1098 (2013).
  6. Picelli, S., et al. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
  7. De Domenico, E., et al. Optimized workflow for single-cell transcriptomics on infectious diseases including COVID-19. STAR Protoc. 1 (3), 100233(2020).
  8. Dobin, A., et al. ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  9. Patro, R., et al. Salmon provides fast and bias-aware quantification of transcript expression. Nat Methods. 14 (4), 417-419 (2017).
  10. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550(2014).
  11. Frankish, A., et al. GENCODE reference annotation for the human and mouse genomes. Nucleic Acids Res. 47, D766-D773 (2019).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transkryptomiczne przesiewanie lek wminiaturyzowana transkryptomika mini bulkkosztowo efektywne sekwencjonowanieprzesiewanie lek w na PBMCp ytka do hodowli kom rkowejodwrotna transkrypcjaoczyszczanie za pomoc kulek magnetycznychreakcja tagmentacjiPCR wzbogacaj cyprzygotowanie biblioteki do sekwencjonowania
Ekonomiczne badania przesiewowe leków oparte na transkryptomii
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.