Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów

2.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65933

⸱

17 listopada 2023

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Artykuł opisuje metody i odczynniki niezbędne do przeprowadzenia hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, hybrydyzacji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), aby ujawnić wgląd w przestrzenną i komórkową rozdzielczość genów receptorów chemosensorycznych w czułku komara i palpie szczękowym.

Streszczenie

Komary są skutecznymi wektorami śmiertelnych chorób i mogą poruszać się w swoim chemicznym środowisku za pomocą receptorów chemosensorycznych wyrażonych w ich węchowych przydatkach. Zrozumienie, w jaki sposób receptory chemosensoryczne są zorganizowane przestrzennie w obwodowych przydatkach węchowych, może dostarczyć informacji na temat tego, w jaki sposób zapach jest kodowany w układzie węchowym komarów i dostarczyć nowych sposobów zwalczania rozprzestrzeniania się chorób przenoszonych przez komary. Pojawienie się trzeciej generacji hybrydyzacji, reakcji łańcuchowej, fluorescencji RNA, fluorescencji in situ (HCR, RNA, WM-FISH), pozwala na mapowanie przestrzenne i jednoczesne profilowanie ekspresji wielu genów chemosensorycznych. W tym miejscu opisujemy stopniowe podejście do wykonywania HCR RNA WM-FISH na czułce komara Anopheles i palpie szczęki. Zbadaliśmy czułość tej techniki, badając profil ekspresji jonotropowych receptorów węchowych. Zapytaliśmy, czy opisana technika HCR WM-FISH jest odpowiednia do badań multipleksowych poprzez wiązanie sond RNA z trzema spektralnie różnymi fluoroforami. Wyniki dostarczyły dowodów na to, że HCR RNA WM-FISH jest bardzo czuły na jednoczesne wykrywanie wielu genów chemosensorycznych w czułkach i wyrostkach węchowych szczęki. Dalsze badania potwierdzają przydatność HCR WM-FISH do profilowania koekspresji podwójnych i potrójnych celów RNA. Technika ta, po zastosowaniu z modyfikacjami, może być przystosowana do lokalizacji interesujących genów w tkankach węchowych innych gatunków owadów lub w innych przydatkach.

Wprowadzenie

Wektory komarów, takie jak Anopheles gambiae, polegają na bogatym repertuarze genów chemosensorycznych wyrażonych w ich obwodowych wyrostkach węchowych, aby rozwijać się w złożonym świecie chemicznym i identyfikować behawioralnie istotne zapachy emanujące od ludzkich gospodarzy, wykrywać źródła nektaru i lokalizować miejsca składania jaj1. Czułek komara i palp szczęki są wzbogacone w geny chemosensoryczne, które napędzają wykrywanie zapachów w tych wyrostkach węchowych. Trzy główne klasy kanałów jonowych bramkowanych ligandem napędzają wykrywanie zapachów w wyrostkach węchowych komarów: receptory zapachowe (OR), które działają z obowiązkowym koreceptorem receptora zapachowego (Orco); receptory jonotropowe (IR), które oddziałują z jednym lub więcej koreceptorami IR (IR8a, IR25a i IR76b); chemosensoryczne receptory smakowe (GR), które działają jako kompleks trzech białek do wykrywania dwutlenku węgla (CO2) 1,2.

Hybrydyzacja in situ fluorescencji RNA jest potężnym narzędziem do wykrywania ekspresji endogennego mRNA3. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta wykorzystuje znakowaną fluoroforem jednoniciową sondę kwasu nukleinowego z sekwencją komplementarną do docelowego mRNA. Wiązanie fluorescencyjnej sondy RNA z docelowym RNA umożliwia identyfikację komórek wyrażających interesujący nas transkrypt. Najnowsze osiągnięcia umożliwiają teraz wykrywanie transkryptów w całych tkankach komarów4,5. Pierwsza generacja technologii reakcji łańcuchowej hybrydyzacji (HCR) wykorzystywała wzmacniacz HCR oparty na RNA; zostało to ulepszone w metodzie drugiej generacji, która zamiast tego wykorzystywała zmodyfikowane DNA dla wzmacniacza HCR6,7. To ulepszenie spowodowało 10-krotny wzrost sygnału, radykalny spadek kosztów produkcji i znaczną poprawę trwałości odczynników6,7.

W protokole opisujemy wykorzystanie metody trzeciej generacji HCR z fluorescencyjną fluorescencją RNA in situ (HCR RNA WM-FISH), przeznaczonej do wykrywania przestrzennej lokalizacji i ekspresji dowolnego genu8,9. Ta dwuetapowa metoda najpierw wykorzystuje sondy kwasów nukleinowych specyficzne dla interesującego nas mRNA, ale które zawierają również sekwencję rozpoznawania inicjatora; drugi krok wykorzystuje spinki do włosów znakowane fluoroforem, które wiążą się z sekwencją inicjującą w celu wzmocnienia sygnału fluorescencyjnego (Rysunek 1). Metoda ta pozwala również na multipleksowanie dwóch lub więcej sond RNA i wzmacnianie sygnałów sondy w celu ułatwienia wykrywania i kwantyfikacji RNA8. Wizualizacja obfitości transkryptów i wzorców lokalizacji RNA genów chemosensorycznych ulegających ekspresji w przydatkach węchowych oferuje pierwszą linię wglądu w funkcje genów chemosensorycznych i kodowanie zapachów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Rozważania i przygotowanie materiałów

  1. Zdecyduj, czy odpowiedni będzie cały montaż lub kriosekcja tkanki. Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem całościowego obrazowania in situ RNA w czułku komara Anopheles i palpie szczęki bez kriosekcji. Jeśli próbki są grubsze niż 5 mm, zaleca się kriosekcję, aby umożliwić penetrację sondy.
  2. Zidentyfikuj interesujące Cię geny i skopiuj sekwencje, w tym introny i eksony, z odpowiedniej bazy danych. Transkrybuj sekwencję genu na RNA w celu syntezy.
  3. Zdecyduj, czy kupić sondy od dostawców komercyjnych, czy też sondy będą syntetyzowane w laboratorium.
    UWAGA: W tym badaniu sondy in situ zostały zakupione od komercyjnego dostawcy (patrz tabela materiałów). Alternatywnie można go zsyntetyzować w sposób wcześniej zgłoszony10. Odczynniki użyte w badaniu przedstawiono w tabeli 1. Materiały potrzebne do przygotowania odczynników są wymienione w Tabeli Materiałów.

2. Prefiksacja tkanek

  1. Znieczulenie 10-15 dorosłych samic lub samców komarów Anopheles coluzzii (szczep N'Gousso) w wieku 5-10 dni po wschodach, zbierając je za pomocą aspiratora doustnego do papierowego kubka lub plastikowej rurki i umieszczając w wiadrze zawierającym lód. Skuteczne znieczulenie wywołane zimnem można potwierdzić, gdy komary są unieruchomione.
  2. Odetnij im głowę, usuwając głowy z okolicy szyi za pomocą kleszczy. Używając ręki niedominującej, chwyć klatkę piersiową kleszczami i oddziel szyję od ciała kleszczami trzymanymi przez rękę dominującą. Umieść głowy w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 μl buforu dimetylosulfotlenku chitynazy-chymotrypsyny (bufor CCD) na lodzie.
    UWAGA: Zamrożenie zwierząt może zdeformować czułki; Zalecane jest szybkie powalenie na lód. Wiek komara podczas testów może się różnić w zależności od projektu. Ważne jest, aby potwierdzić i skoordynować ich stan fizjologiczny, na przykład czy są karmione krwią, głodzone czy kryte. W tym badaniu pobrano próbki węchowych przydatków od komarów, które były karmione krwią i kojarzone.
  3. Podgrzej głowy komarów w buforze CCD w temperaturze 37 ° C na bloku grzewczym przez 5 minut, a następnie przenieś probówkę zawierającą głowy komarów do pieca hybrydyzacyjnego i obracaj w temperaturze 37 ° C. Czas inkubacji w buforze CCD zależy od rodzaju tkanki. W przypadku czułków żeńskich Anopheles należy stosować 20 min, czułków męskich potrzeba 15 minut, natomiast dłuższy czas inkubacji (1 h) potrzebny jest w przypadku palpów szczękowych.
  4. Przenieś całą zawartość probówki do szkiełka do wycinkowego zegarka. Delikatnie wlej próbkę do wgłębienia szkła zegarka (do sekcji). Jeśli główki komarów utknęły w probówce, użyj pipety, aby dodać bufor CCD do probówki i wypłucz głowicę.
  5. Za pomocą kleszczy ostrożnie przenieś głowy lub wszelkie czułki/palpki oderwane podczas inkubacji i zamocuj w 1 ml wstępnego utrwalacza.
    UWAGA: Pozostały bufor CCD można zachować w temperaturze -20 ° C. Bufor może być ponownie użyty do 3x. Jeśli utrwalacz wstępny zmieni kolor na lekko brązowawy z powodu przenoszenia buforu CCD przez tkanki, należy go zastąpić innym 1 ml utrwalacza.
  6. Obracać głowice w utrwalaczu wstępnym przez 24 godziny w temperaturze 4°C za pomocą nutatora.
    UWAGA: Prędkość kołysania nutatora użytego w tym badaniu nie była regulowana; Zastosowano domyślną prędkość ustawioną przez producenta (12 obr./min).

3. Sekcja tkanek

  1. Płucz głowice 4x (5 min na pranie) 1 ml 0,1% PBS-Tween na lodzie. Aby uniknąć utraty próbki, użyj pipety dołączonej do końcówki ładującej żel, aby usunąć płyn.
    UWAGA: Zamiast kroku 3.1 można wykonać dwa szybkie mycia, a następnie 10-minutowe pranie i końcowe szybkie pranie.
  2. Przenieś głowice w tubie do szkiełka do preparacji. Delikatnie wlej próbkę do wgłębienia szkiełka zegarkowego. Wypłucz głowy komarów, które utknęły w tubie, za pomocą 0,1% PBS-Tween.
  3. Pod mikroskopem preparacyjnym usuń interesujące tkanki (czułki/palpy) z głowy za pomocą ostrych kleszczy. Przytrzymaj tylną część głowy kleszczami i chwyć antenę innymi kleszczami od podstawy. Oczyść kleszcze papierem zwilżonym rozpuszczalnikiem wolnym od RNAzy. Usuń palpy, korzystając z tego samego procesu.
  4. Przenieś czułki i palpy za pomocą kleszczyków do pustych probówek wolnych od DNA/RNaz umieszczonych na lodzie. Oddziel różne części tkanki do wstępnie oznakowanych różnych probówek.
  5. Odwodnić tkankę w 400 μl rozpuszczalnika zawierającego mieszaninę metanolu (MeOH 80%) i dimetylosulfotlenku (DMSO 20%) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Nie ma potrzeby umieszczania tkanki na nutatorze; Pozostaw go na stojaku na probówki w temperaturze pokojowej na stole laboratoryjnym. Zaleca się stosowanie świeżej mieszaniny rozpuszczalników. Aby uzyskać roztwór podstawowy o objętości 500 μl, zmieszaj 400 μl MeOH ze 100 μl DMSO.
  6. Zastąp odczynnik odwadniający 400 μl absolutnego (100%) metanolu i odwodnij tkanki przez noc w temperaturze -20 °C. Pozwól, aby tkanki osiadły grawitacyjnie i użyj pipety do usunięcia cieczy.
    UWAGA: Próbki są zdolne do długotrwałego odwodnienia, testowano do 4 nocy bez utraty sygnału.

4. Tkanka po utrwaleniu

  1. Nawadniaj tkanki w czteroetapowej serii 400 μl MeOH/PBS-Tween przez 10 minut na lodzie. Zacznij od 75% MeOH/25% PBS-Tween, następnie 50% MeOH/50% PBS-Tween, następnie 25% MeOH/75% PBS-Tween, a na końcu 100% PBS-Tween.
    UWAGA: Do usunięcia buforu z probówki można użyć końcówki ładującej żel z małym otworem, aby uniknąć utraty tkanek. Usunięcie buforu można wykonać pod mikroskopem preparacyjnym.
  2. Przemyć 400 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami zawierającej 0,1% Tween-20 (PBS-T) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć, umieszczając próbkę na nutatorze.
  3. Przygotować 20 μg/ml roztworu proteinazy-K i inkubować w 400 μl roztworu proteinazy-K przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Rozcieńczyć 20 mg/ml proteinazy-K (1000x roztwór podstawowy), tj. 2 μl w 2 ml 0,1% PBS-Tween. Resztki można przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 ° C.
  4. Zatrzymaj trawienie enzymatyczne tkanek, przemywając 2x przez 10 min 400 μL 0,1% PBS-tween.
  5. Dodać 400 μl postutrwalacza i inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Prać 3x, 15 min na pranie, z 400 μL 0,1% PBS-Tween.

5. Hybrydyzacja sondy

  1. Inkubować tkankę w 400 μl buforu do hybrydyzacji sondy przez 5 minut. Upewnij się, że tkanka jest całkowicie zanurzona w buforze, delikatnie pipetując.
  2. Przygotuj się do następnego kroku, podgrzewając porcję buforu hybrydyzacyjnego sondy do 37 ° C przez 30 minut.
  3. Usunąć bufor i wstępnie zhybrydyzować 400 μl wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego sondy przez 30 minut w temperaturze 37 ° C.
  4. Przygotować roztwór sondy dla docelowych receptorów chemosensorycznych (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a lub Orco), dodając 8 pM sondy. Dodać 8 μl 1 μM sondy do 500 μl wstępnie podgrzanego buforu hybrydyzacyjnego sondy.
  5. Usuń wstępnie podgrzany bufor hybrydyzacyjny sondy i zastąp go 400 μl podgrzanego roztworu sondy.
  6. Inkubować tkankę w temperaturze 37 ° C przez dwie noce na nutatorze umieszczonym w inkubatorze i przykrytym pod pudełkiem.

6. Wzmocnienie sondy

  1. Podgrzej bufor do płukania sondy do 37 ° C. Usuń nadmiar roztworu sondy, przepłukując chusteczkę 5x, po 10 minut na mycie, 400 μl buforu do płukania sondy w temperaturze 37 ° C, nutując w inkubatorze.
    UWAGA: Można rozpocząć przygotowania do kroku 6.4. Zobacz uwagę w kroku 6.4.
  2. Próbki myć 2x, 5 minut na pranie, 400 μL 5x cytrynianu soli fizjologicznej zawierającego 10% Tween-20 (SSCT) w temperaturze pokojowej. Rozmrozić bufor wzmacniający do temperatury pokojowej na blacie stołu.
  3. Przygotować tkankę do amplifikacji przez inkubację z 400 μl buforu do amplifikacji przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Ze względu na lepkość buforu amplifikacyjnego tkanki mogą nie być całkowicie zanurzone. Wymieszać, delikatnie pipetując bufor amplifikacyjny znajdujący się poniżej tkanki i wyrzucając bufor na wierzch tkanki, aż do zanurzenia.
  4. Oddzielnie przygotuj 18 pM spinki do włosów h1 i 18 pM spinki do włosów h2, podgrzewając 6 μl bulionu 3 μM w temperaturze 95 °C przez 90 s i schładzaj do temperatury pokojowej w ciemnej szufladzie przez 30 minut. Upewnij się, że probówki PCR są szczelnie zamknięte, aby zapobiec parowaniu spinek do włosów podczas podgrzewania w termocyklerze.
    UWAGA: Aby zaoszczędzić czas, krok 6.4 można zainicjować podczas 4.kroku prania w kroku 6.1. Spinki do włosów powinny być oddzielnie podgrzewane, aby zapobiec reakcji krzyżowej. Na tym etapie spinki do włosów nie powinny być rozcieńczane żadnym buforem. Spinki do włosów można kupić u producenta sondy wraz z sondami.
  5. Zastąp bufor wzmacniający dodany w kroku 6.3 mieszaniną zawierającą podgrzane spinki do włosów (z kroku 6.4) wraz ze 100 μl buforu do amplifikacji. Typowa reakcja będzie zawierać 6 μl h1, 6 μl h2 i 100 μl buforu amplifikacyjnego.
    UWAGA: Spinki do włosów h1 i h2 można połączyć po schłodzeniu do temperatury pokojowej, a następnie dodać do 100 μl buforu wzmacniającego. Aby uniknąć przenoszenia próbek tkanek z jednej probówki do drugiej, bufor wzmacniający z kroku 6.3 można usunąć i zastąpić mieszaniną spinek do włosów rozcieńczoną w buforze do amplifikacji.
  6. Inkubować tkankę przez noc i nutować w ciemności w temperaturze pokojowej przy użyciu domyślnej prędkości nutatora.

7. Montaż próbki tkanki

  1. Rozcieńczyć bufor amplifikacyjny w inkubowanej tkance za pomocą 300 μL 5x SSCT (chlorek sodu z cytrynianem sodu rozcieńczony w Tween-20).
    UWAGA: Rozcieńczenie jest pomocne w zmniejszeniu lepkości i ułatwia usunięcie buforu amplifikacyjnego z tkanki. Użyliśmy Triton-X 100 do etapu przed utrwaleniem i Tween-20 do etapu po utrwaleniu ze względu na różnice w ich działaniu jako środków przenikających błonę komórkową.
  2. Przemyj chusteczkę 5x 400 μL 5x SSCT w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: W razie potrzeby chusteczkę należy tymczasowo przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowa do montażu. Nie przekroczyliśmy 2 dni przed wykonaniem badania.
  3. Przygotuj 5 kropel roztworu montażowego na szklanym szkiełku. Odetnij końcówkę końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby ją poszerzyć, a następnie przenieś tkankę do nowego szkiełka podstawowego.
  4. Chwyć próbki tkanek za podstawę za pomocą kleszczy, a następnie delikatnie zanurz i spłucz w serii kropelek roztworu montażowego. Uważaj, aby na tym etapie nie złamać tkanek.
  5. Zamontuj za pomocą roztworu montażowego, umieść szkiełko nakrywkowe i uszczelnij lakierem do paznokci. Obrazowanie próbek tkanek in situ za pomocą mikroskopu konfokalnego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wykrywanie genów chemosensorycznych w czułkach Anopheles
Zbadaliśmy czułość metody HCR FISH (Rysunek 1) w wykrywaniu ekspresji receptorów chemosensorycznych w tkankach węchowych komarów. Kierując się danymi dotyczącymi transkrypcji RNA, zgłoszonymi wcześniej dla czułek samic komara Anopheles, opracowaliśmy sondy skierowane przeciwko różnym IR. Średnie wartości transkrypcji z czterech niezależnych badań transkryptomu czułek wykazały, że Ir41t.1 (11 RPKM)...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Trzecia generacja łańcuchowej reakcji hybrydyzacji (HCR) jest niezwykła ze względu na swoją czułość i solidność w wizualizacji kilku celów RNA8. HCR WM-FISH został z powodzeniem zastosowany na zarodkach Drosophila, kurczaków, myszy i danio pręgowanego, a także na larwach nicieni i danio pręgowanego 10,16,17. Czułki komarów i szczęki są zazwyczaj podatne na wysoką autofluorescencję i słabą penetra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy Margo Herre i laboratorium Leslie Vosshall za udostępnienie ich protokołu hybrydyzacji in-situ dla wyrostków węchowych Aedes aegypti. Praca ta była wspierana przez granty z National Institutes of Health dla C.J.P. (NIAID R01Al137078), stypendium HHMI Hanna Gray dla J.I.R, Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator Award dla J.I.R. oraz stypendium podoktorskie Johns Hopkins Malaria Research Institute dla J.I.R. Dziękujemy Johns Hopkins Malaria Research Institute i Bloomberg Philanthropies za ich wsparcie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Bufor wzmacniającyInstrumenty molekularneInstrumenty molekularne, Inc. | Hybrydyzacja in situ + immunofluorescencja50 ml
chlorku wapnia (CaCl2) 1M Sigma-Aldrich 21115-100ML
ChitynazaSigma-AldrichC6137-50UN
ChymotrypsynaSigma-AldrichCHY5S-10VL 
Dimetylosulfotlenek (DMSO)Sigma-Aldrich472301
Rurka EppendorfVWR20901-5511,5 ml
KleszczeDumont11251Numer 5
Końcówka ładująca żelCostar48531-200 µ Końcówka L
Spinki do włosów Instrumenty molekularneInstrumenty molekularne, Inc. | Hybrydyzacja in situ + inicjator immunofluorescencjih1 i h2 rozdziela
HEPES (1M)Sigma-AldrichH0887
Sonda IR25aInstrumenty molekularne Identyfikatorzestawu sond: PRK149 AGAP010272
Sonda IR41t.1Instrumenty molekularne  Identyfikator zestawu sondy: PRK978AGAP004432
Sonda IR64aInstrumenty molekularne Identyfikatorzestawu sond: PRK700 AGAP004923
Sonda IR75dInstrumenty molekularneZestaw sond ID: PRK976AGAP004969
Sonda IR76bSonda instrumentów molekularnychID: PRI998AGAP011968
Sonda IR7tIdentyfikator zestawu sond do instrumentów molekularnych: PRL355AGAP002763
Sonda IR8aZestaw sond do instrumentów molekularnychID: PRK150AGAP010411
Rurki LoBindVWR80077-2360,5 mL DNA/RNA Probówki LoBind
Chlorek magnezu (MgCl2) 1MThermo FisherAM9530G
MetanolFisher A412-500
Woda wolna od nukleazThermo Fisher43-879-36
NutatorDenville ScientificModel 1353-D Mini rocker
Sonda OrcoInstrumenty molekularneZestaw sond ID PRD954AGAP002560
Paraformaldehyd (20%)Usługi mikroskopii elektronowej 15713-S Sól fizjologiczna
buforowana fosforanami (10X PBS)Thermo FisherAM9625
Bufor hybrydyzacyjny sondyInstrumenty molekularnehttps://www.molecularinstruments.com/50 ml
Bufor do płukania sondyInstrumenty molekularne Instrumenty molekularneInstrumenty molekularne, Inc. | Hybrydyzacja in situ + immunofluorescencja100 ml
Proteinase-KThermo FisherAM2548
Cytrynian soli fizjologicznej (SSC) 20x Thermo Fisher15-557-044
Diament SlowFadeThermo Fisher S36972roztwór montażowy
Chlorek sodu (NaCl) 5MInvitrogenAM9760G
Triton X-100  (10 %)Sigma-Aldrich 93443
Tween-20 (10%) TeknovaT0027
Szkiełko zegarkaCarolina742300  1 5/8" kwadrat; przejrzysty

Bibliografia

  1. Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
  2. Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).
  3. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).
  4. Herre, M., et al. Non-canonical odor coding in the mosquito. Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).
  5. Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito. Cell Rep. 42 (2), 112101(2023).
  6. Choi, H. M. T., et al. Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression. Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).
  7. Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability. ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).
  8. Choi, H. M. T., et al. Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), dev165753(2018).
  9. Schwarzkopf, M., et al. Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization. Development. 148 (22), dev199847(2021).
  10. Choi, H. M. T., et al. Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression. Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).
  11. Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids. Sci Rep. 7, 40297(2017).
  12. Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae. BMC Genomics. 14, 749(2013).
  13. Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Cell Rep. 38 (10), 110494(2022).
  14. Athrey, G., et al. Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus. BMC Genomics. 18 (1), 751(2017).
  15. Task, D., et al. Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons. eLife. 11, e72599(2022).
  16. Shah, S., et al. Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing. Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).
  17. Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos. Development. 145 (1), dev156869(2018).
  18. Herre, M., Greppi, C. RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes. Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).
  19. Marx, V. Method of the Year: spatially resolved transcriptomics. Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transkryptomika przestrzennamultipleksowa ekspresja genówreceptory jonotropowesekcja tkanek
Hybrydyzacja Reakcja łańcuchowa RNA Cała góra Fluorescencja in situ Hybrydyzacja genów chemosensorycznych w przydatkach węchowych komarów
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.