Artykuł metodologiczny

Wykrywanie i oznaczanie ilościowe mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa

2.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65934

⸱

29 marca 2024

 ,  , 
1Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Infectología e Inmunología, Instituto Nacional de Perinatología

W tym artykule

Podsumowanie

Pseudomonas aeruginosa wytwarza biosurfaktanty ramnolipidowe. Chromatografia cienkowarstwowa wykrywa i określa proporcję mono- i di-ramnolipidów wytwarzanych przez każdy szczep. Kwantyfikacja całkowitych ramnolipidów polega na ocenie ekwiwalentów ramnozy obecnych w tych biosurfaktantach wyekstrahowanych z supernatantów hodowlanych metodą orcinolu.

Streszczenie

Bakteria środowiskowa Pseudomonas aeruginosa jest oportunistycznym patogenem o wysokiej oporności na antybiotyki, który stanowi zagrożenie dla zdrowia. Bakteria ta wytwarza wysoki poziom biosurfaktantów znanych jako ramnolipidy (RL), które są cząsteczkami o znacznej wartości biotechnologicznej, ale są również związane z cechami wirulencji. W związku z tym wykrywanie i oznaczanie ilościowe RL może być przydatne zarówno w zastosowaniach biotechnologicznych, jak i w biomedycznych projektach badawczych. W tym artykule demonstrujemy krok po kroku technikę wykrywania wytwarzania dwóch form RL wytwarzanych przez P. aeruginosa za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC): mono-ramnolipidów (mRL), cząsteczek utworzonych przez dimer kwasów tłuszczowych (głównie C10-C10) połączonych z jedną grupą ramnozy, oraz di-ramnolipidów (dRL), cząsteczek utworzonych przez podobny dimer kwasu tłuszczowego połączony z dwoma ugrupowaniami ramnozy. Dodatkowo przedstawiamy metodę pomiaru całkowitej ilości RL w oparciu o kwaśną hydrolizę tych biosurfaktantów wyekstrahowanych z supernatantu kultury P. aeruginosa, a następnie wykrywanie stężenia ramnozy, która reaguje z orcynolem. Połączenie obu technik można wykorzystać do oszacowania przybliżonego stężenia mRL i dRL wytwarzanych przez określony szczep, czego przykładem są szczepy typu PAO1 (filogrupa 1), PA14 (filogrupa 2) i PA7 (filogrupa 3).

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa jest bakterią środowiskową i oportunistycznym patogenem, który budzi duże obawy ze względu na wytwarzanie cech związanych ze zjadliwością i wysoką odporność na antybiotyki1,2. Charakterystycznym metabolitem wtórnym wytwarzanym przez tę bakterię jest biosurfaktant RL, który jest wytwarzany w sposób skoordynowany z kilkoma cechami związanymi ze zjadliwością, takimi jak piocyjanina fenazynowa, antybiotyk o aktywności redoks i elastaza proteaza3. Właściwości tensjoaktywne i emulgujące RL zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach przemysłowych i są obecnie skomercjalizowane4.

Większość szczepów P. aeruginosa, należących do filogrup 1 i 2, wytwarza dwa typy RL: mRL, który składa się z jednej grupy ramnozy połączonej z dimerem kwasu tłuszczowego głównie o 10 atomach węgla, oraz dRL, który zawiera dodatkowe ugrupowanie ramnozy połączone z pierwszym rhamnozą4 (zobacz Rysunek 1). Doniesiono jednak, że dwie pomniejsze filogrupy P. aeruginosa (grupy 3 i 5) wytwarzają tylko mRL5,6. Te dwa typy RL zawierają mieszaninę dimerów kwasów tłuszczowych, które, jak wspomniano, są głównie C10-C10, ale wytwarzane są również mniejsze proporcje cząsteczek zawierających dimery C12-C10, C12-C12 i C10-C12:1. Opisano charakterystykę kongenerów RL wytwarzanych przez różne szczepy przy użyciu HPLC MS/MS: 7,8. Metody opisane w tej pracy mogą jedynie rozróżnić mRL i dRL, ale nie mogą być stosowane do charakterystyki kongenerów RL.

P. aeruginosa i niektóre gatunki Burkholderia są naturalnymi producentami RL9, ale ta pierwsza bakteria jest najbardziej wydajnym producentem. Jednak komercyjnie stosowany RL jest obecnie wytwarzany w pochodnych Pseudomonas putida KT2440 eksprymujących geny P. aeruginosa, aby uniknąć stosowania tego oportunistycznego patogenu10,11. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe RL wytwarzanego przez P. aeruginosa ma ogromne znaczenie dla badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w ekspresję cech związanych ze zjadliwością12, w charakterystyce szczepów należących do kladów 3 lub 513, oraz dla konstruowania pochodnych P. aeruginosa, które nadprodukują te biosurfaktanty, jednocześnie zmniejszając zjadliwość14. Wytwarzanie biosurfaktantów przez różne mikroorganizmy zostało wykryte na podstawie pewnych ogólnych cech tych związków, takich jak metoda zapadania się lub indeks emulgacji15, ale metody te nie są ani dokładne, ani specyficzne16.

Tutaj opisujemy protokół wykrywania mRL i dRL za pomocą płynnej ekstrakcji całkowitego RL z supernatantów kulturowych różnych szczepów typu P. aeruginosa i separacji obu typów RL za pomocą TLC. W tej metodzie RL wyekstrahowany z supernatantu hodowli jest rozdzielany przez ich różnicową rozpuszczalność w rozpuszczalnikach stosowanych do TLC, powodując różnicową migrację na płytce żelu krzemionkowego. W związku z tym mRL mają szybszą migrację niż dRL i można je wykryć jako oddzielne miejsca, gdy płytki są suszone i barwione α-naftolem.

Opisana tutaj metoda wykrywania mRL i dRL przez TLC opiera się na wcześniej opublikowanym artykule17, który jest łatwy do wykonania i nie wymaga drogiego sprzętu. Ta metoda była przydatna do wykrywania RL w różnych izolatach P. aeruginosa13 przy użyciu odpowiednich kontroli, takich jak mutant pochodzący z P. aeruginosa, który nie jest w stanie wytworzyć RL. Nie jest to jednak preferowana metoda charakteryzowania nowych biosurfaktantów wytwarzanych przez bakterie inne niż Pseudomonas aeruginosa ze względu na brak swoistości.

Dodatkowo, przedstawiono metodę ilościowego oznaczania ekwiwalentów ramnozy całkowitego RL wyekstrahowanego z supernatantu kultury P. aeruginosa. Metoda ta określa ilościowo te biosurfaktanty w oparciu o reakcję orcyny z cukrami redukcyjnymi, w wyniku czego otrzymujemy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 421 nm, jak opisano wcześniej18. Ponieważ reakcja z orcynolem nie jest specyficzna dla ramnozy, ważne jest, aby przeprowadzić tę metodę z RL wyekstrahowanym z supernatantu hodowli, który nie zawiera znacznych ilości innych cząsteczek zawierających cukier, takich jak lipopolisacharydy (LPS). Zakwaszona mieszanina chloroformu/metanolu jest tutaj używana do płynnej ekstrakcji RL18, ale można również użyć octanu etylu, a ekstrakcja do fazy stałej (SPE) daje bardzo dobre wyniki19. Opisana tutaj metoda orcynowa nie wymaga wyrafinowanego sprzętu i może zapewnić wiarygodne wyniki, jeśli zostanie wykonana ze szczególną starannością w przygotowaniu analizowanych próbek, jak wspomniano. Aby zapewnić prawidłowe przygotowanie próbki, ważne jest, aby uwzględnić mutanta Pseudomonas aeruginosa rhlA, który nie jest w stanie wytworzyć RL20 oraz wykonać trzy powtórzenia biologiczne i trzy techniczne dla każdego oznaczenia.

W literaturze pojawiły się znaczące kontrowersje16,21dotyczące oznaczania RL metodą orcinolu, przy czym niektóre badania sugerują, że produkcja RL jest przeszacowana i że test nie ma specyficzności dla ramnozy, potencjalnie wykrywając inne cukry. Pokazujemy jednak tutaj, że opisane metody mogą być dokładne i specyficzne w odpowiednich warunkach. Ponadto, w celu porównania z procedurami opisanymi w tym artykule, wykorzystujemy detekcję UPLC-MS/MS wzorca dRL i wykazujemy, że podobne wyniki uzyskuje się metodą orcinol. Szczegółowy protokół ilościowego oznaczania RL przy użyciu tej metody znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

Te protokoły są zilustrowane przy użyciu szczepów typu PAO1 (filogrupa 1), PA14 (filogrupa 2) i PA7 (filogrupa 3). Szczepy te zostały wybrane, ponieważ są dobrze scharakteryzowane i wytwarzają różne profile RL.

Protokół

Ta procedura jest schematycznie opisana na rysunku uzupełniającym 1. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wykrywanie mRL i dRL w supernatantach hodowlanych P. aeruginosa za pomocą TLC

  1. Zacznij od odwirowanego bulionu interesującego szczepu P. aeruginosa, uprawianego w płynnym podłożu przez 24 godziny (aby osiągnąć stacjonarną fazę wzrostu, w której wytwarzany jest RL). Zazwyczaj kultury te zawierają 1 x 109 bakterii na ml.
  2. Dostosuj pH kultury do 2 za pomocą stężonego HCl.
  3. Umieścić 5 ml zakwaszonego supernatantu hodowli w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodać 5 ml mieszaniny chloroformu: metanol w stosunku 2:1.
  4. Mieszaj probówkę przez odwrócenie trzy razy, za każdym razem przez 10 s, i pozostaw probówkę bez odwrócenia na 2 minuty między każdym mieszaniem.
  5. Pozostawić probówkę bez mieszania na około 3 godziny, aż obie fazy zostaną oddzielone, lub odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
  6. Przenieś fazę organiczną (dolna warstwa) do czystej probówki i pozostaw probówkę w okapie ekstrakcyjnym do momentu wyschnięcia.
  7. Powtórzyć proces, zaczynając od kroku 1.3, umieszczając fazę organiczną z drugiego chloroformu: ekstrakcji metanolem do probówki, która została użyta w pierwszej ekstrakcji.
  8. Odparować fazę organiczną, aż pozostanie 1 ml lub 1,5 ml. Przenieś tę objętość do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odparuj rozpuszczalnik do sucha przez noc.
  9. Dodać 50 μl metanolu do wysuszonej probówki w celu ponownego zawieszenia RL.
  10. Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową na płytkach z żelem krzemionkowym.
    UWAGA: Rozmiar płytki TLC należy przyciąć zgodnie z liczbą próbek, które będą analizowane. Każdą próbkę należy nanieść na odległość 1,5 cm, a punkt aplikacji powinien znajdować się 1 cm od krawędzi płytki (narysuj poziomą linię ołówkiem).
  11. Nanieść 5 μl każdej próbki za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl.
  12. Faza ciekła TLC składa się z mieszaniny chloroformu: metanol: kwas octowy w proporcji 65:15:2. Aby przygotować 35 ml tej mieszaniny, zmieszaj 26 ml chloroformu, 6 ml metanolu i 0,8 ml 20% roztworu podstawowego kwasu octowego. Wymieszać te rozpuszczalniki i umieścić je w zamkniętej komorze TLC na co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem chromatografii, tak aby atmosfera była nasycona lotnymi rozpuszczalnikami.
  13. Umieścić płytkę TLC w komorze, unikając kontaktu z punktem, w którym nałożono próbki.
  14. Zamknąć komorę i pozostawić TLC do momentu, gdy rozpuszczalnik osiągnie 1 cm przed krawędzią płytki. W tym momencie wyjmij płytkę i pozostaw ją do wyschnięcia (można zastosować przepływ powietrza, aby przyspieszyć proces).
  15. Przygotować roztwór α-naftolu, rozpuszczając 5 g tego związku w 33 ml etanolu. Po rozpuszczeniu dodaj 127,5 ml etanolu, 12,6 ml wody i 20,5 ml zimnegoH2SO4.
  16. W celu wykrycia obecności mRL i dRL należy rozpylić roztwór α-naftolu na płytkę w okapie ekstrakcyjnym i umieścić spryskaną płytkę w suszarce w temperaturze 85 °C na kilka minut, aż pojawi się różowawy ślad RL.
  17. Użyj obrazu TLC, aby obliczyć proporcję mono- i di-RL obecnych w każdej próbce za pomocą oprogramowania, które wykrywa gęstość każdej plamki.

2. Kwantyfikacja całkowitej ilości RL mierząca ekwiwalenty ramnozy obecne w biosurfaktancie

  1. Umieścić 1,2 ml kultury w fazie stacjonarnej (hodowanej przez 24 godziny) w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 3 minuty przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w czystej probówce.
  2. Przenieść 333 μl do czystej probówki (wykonać ten krok trzykrotnie) i dodać 1 ml eteru.
  3. Energicznie mieszaj w wirze przez 30 sekund. Powtórz tę procedurę z jedną rurką na raz.
  4. Wirować przez 2 minuty przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać fazę organiczną (faza górna), przenieść ją do czystej probówki i pozostawić otwartą w okapie ekstrakcyjnym do momentu wyschnięcia.
  5. Powtórzyć ekstrakcję eterem zgodnie z opisem w kroku 2.2. Powtórz kroki 2.3 i 2.4.
  6. Po całkowitym wysuszeniu dodaj 1 ml wody do każdej probówki. Pozostaw probówki na 12 godzin, aby RL mógł się nawodnić, a następnie energicznie wymieszaj w wirze.
  7. Umieścić czystą kolbę w lodzie na 5 minut (ponieważ jest to reakcja egzotermiczna). Przygotować roztwór 60% H2SO4 (chronić kolbę przed światłem).
  8. W czystej probówce przygotuj 1,6% roztwór orcyny w wodzie destylowanej. Aby przygotować odczynnik orcyny, zmieszaj 4,4 ml 60% roztworu H2SO4 z 0,6 ml 1,6% roztworu orcyny.
  9. Obliczyć końcową objętość potrzebnego odczynnika orcyny. Dodać 900 μl tego odczynnika do każdej próbki i do każdego stężenia krzywej kalibracyjnej, stosując różne stężenia ramnozy (zazwyczaj stosuje się 9 stężeń ramnozy w zakresie od 1 μg/ml do 9 μg/ml) i jedno ze 100 μl wody, upewniając się, że wszystkie są wykonywane w trzech powtórzeniach.
  10. Dodać 100 μl każdej próbki RL do 900 μl odczynnika orcyny w szklanej probówce i wymieszać oba roztwory.
  11. Inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 80 °C.
  12. Pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
  13. Odczytać absorbancję próbek i krzywą kalibracyjną przy długości fali 421 nm za pomocą ogniwa kwarcowego.
  14. Obliczyć stężenie ramnozy w każdej próbce, interpolując absorbancję na krzywej kalibracyjnej i biorąc pod uwagę objętość użytą do oznaczenia.
  15. Aby obliczyć stężenie μM, podziel stężenie uzyskane w μg/ml przez 182,2 (masa cząsteczkowa ramnozy) i pomnóż przez 1000.

Wyniki

W niniejszym artykule wykorzystano trzy różne szczepy typowe P. aeruginosa reprezentujące trzy filogrupy, z których każda charakteryzuje się różnym poziomem produkcji RL oraz różnymi proporcjami mRL i dRL. Szczepy te obejmują PAO1 (izolat z rany z Australii, 195522), PA14 (izolat roślinny z USA, 197723), oraz PA7 (izolat kliniczny z Argentyny, 201024). Jako kontrolę negatywną zastosowano szczep PAO1 rhlA wykorzystano mutant, który nie jest zdolny do produkcji RL. Wszystkie szczepy hodowano przez 24 h w pożywce PPGAS, zaprojektowanej specjalnie w celu promowania wysokiego poziomu RL25, w 37 °CKultury PPGAS zaszczepiono przy gęstości optycznej 0,05 przy 600 nm, stosując podłoże LB.26 kultura nocna. Zazwyczaj P. aeruginosa szczepy osiągają gęstość optyczną równą 2 mierzoną przy 600 nm w pożywce PPGAS po 24 h, co odpowiada w przybliżeniu 1 x 109 bakterii na ml. W celu zebrania nadsączów hodowli do detekcji i oznaczania ilościowego RL, hodowle odwirowano przy 3 000 x g w 4 °C przez 15 min, a osad komórkowy usunięto. Wyniki uzyskane przy użyciu tych dwóch metod (Rycina 2 i Rycina 3) wykazują, że zarówno typy RL produkowane przez każdy szczep, jak i ilość ich produkcji różnią się pomiędzy trzema analizowanymi szczepami. Jak przedstawiono w Rysunek 2PAO1 produkuje około 30% mRL i 70% dRL, podczas gdy PA14 produkuje równą ilość 50% mRL i 50% dRL, a PA7 produkuje wyłącznie mRL. Ten profil produkcji RL jest zgodny z wcześniejszymi doniesieniami12,14.

Rysunek 3A ilustruje ilość ekwiwalentów ramnozy obecnych w RL produkowanych przez każdy z tych trzech typów szczepów. Na podstawie wykrytych ilości ramnozy widać, że szczep PA14 produkuje największą ilość RL, natomiast szczep PA7 produkuje najmniejszą ilość. Jednak same te wyniki nie mogą służyć do oszacowania stężenia RL w µM produkowanego przez każdy szczep. Ponadto sama metoda orcinolu nie może dostarczyć przybliżonego stężenia RL, ponieważ opiera się ona na charakterystyce proporcji mRL i dRL produkowanych przez każdy analizowany szczep. Dlatego, aby uzyskać szacunkowe stężenie RL w µM, należy uwzględnić proporcję każdego typu RL określoną w TLC oraz dołączyć krzywą wzorcową z różnymi stężeniami ramnozy (Rysunek 3B).

Metodę orcinolową można rzeczywiście wykorzystać do oznaczenia stężenia RL, gdy produkowany jest tylko jeden typ tego biosurfaktantu. W takich przypadkach stężenie ramnozy wyrażone w μM odpowiada bezpośrednio stężeniu mRL w μM. W przypadku dRL, ponieważ w wyniku hydrolizy każdej cząsteczki dRL uwalniane są dwie cząsteczki ramnozy, stężenie ramnozy wykryte w RL (wyrażone w μM) należy podzielić przez 2, aby uzyskać ich stężenie w μM (patrz Rysunek 4).

Większość szczepów P. aeruginosa produkuje jednak oba typy RL w różnych proporcjach (jak pokazano na Rysunku 2), co pozwala na określenie jedynie przybliżonego stężenia całkowitego RL. Biorąc to pod uwagę, produkcję RL przez każdy szczep oszacowano w następujący sposób: w przypadku szczepu PA7, ponieważ produkuje on wyłącznie mRL, część rhamnozy tworząca RL (44,6 µg/mL + 4,5 µg/mL) odpowiada bezpośrednio stężeniu w µM (244,78), co reprezentuje stężenie tego biosurfaktantu w supernatancie hodowli, gdyż każda cząsteczka RL zawiera jedną grupę rhamnozy. Jednak w przypadku szczepu PAO1, mimo że wykryte stężenie rhamnozy wynosiło 111,55 µg/mL + 11,41 µg/mL, tylko 30% odpowiada mRL. Zatem 70% cząsteczek RL zawiera dwie rhamnozy w jednej cząsteczce. Aby oszacować stężenie RL, stężenie rhamnozy w µM (612,24) podzielono przez 5, przyjmując, że 1/5 odpowiada stężeniu mRL w µM (122,49), a 2/5 (244,89) dRL. Tym samym przybliżone stężenie RL w µM produkowane przez ten szczep wynosi 367,39.

W przypadku szczepu PA14 wykryte stężenie ramnozy wynosiło 194,39 µg/mL + 11,5 µg/mL, co przeliczono na stężenie w µM (1 066,9), a następnie podzielono przez 3. Wynik ten reprezentuje stężenie każdego typu RL, przy założeniu, że każdy typ był produkowany w ilości 50% oraz że dRL zawiera 2 cząsteczki ramnozy w jednej cząsteczce. Zatem szczep ten produkuje 355,63 µM mRL oraz taką samą ilość dRL, co daje przybliżone stężenie RL wynoszące 711,27 µM, co stanowi prawie dwukrotność stężenia u szczepu PAO1 i prawie trzykrotność stężenia produkowanego przez szczep PA7.

Porównanie struktury chemicznej mono-ramnolipidu i di-ramnolipidu, schemat cząsteczkowy.
Rycina 1: Skład chemiczny głównych kongenerów mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów. (A) Mono-ramnolipidy. (B) Di-ramnolipidy. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) do rozdziału biosurfaktantów wraz z odpowiadającą analizą na wykresie słupkowym.
Rycina 2: Detekcja mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. (A) Zdjęcie płytki TLC przedstawiające standardy RL oraz RL produkowane przez szczepy PAO1, PA14, PA7 oraz mutant ΔrhlA pochodny od PAO1. (B) Oszacowanie proporcji każdego typu RL (mRL i dRL) w każdej z próbek badanych w punkcie (A) przy użyciu oprogramowania ImageJ. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres ilościowego oznaczenia ramnozy i krzywa wzorcowa, analiza absorbancji przy 421 nm.
Rycina 3: Ilościowe oznaczenie stężenia RL metodą orcinolu. (A) Stężenie ramnozy (µg/mL) zawartej w RL wyekstrahowanym z nadsączów hodowli szczepów PAO1 (czarny słupek), PA14 (jasnoszary słupek) i PA7 (ciemnoszary słupek). Słupki oznaczają odchylenie standardowe. (B) Krzywa kalibracyjna ramnozy dla eksperymentu przedstawionego w (A). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki chromatografii; wykres, tabela stężeń ramnozy, analiza d-RL.
Rycina 4: Walidacja metody orcinolowej w porównaniu z UPLC-MS/MS do oznaczania ilości dRL. (A) Standard dRL został oznaczony ilościowo przy użyciu UPLC-MS/MS. (B) Metoda orcinolowa w porównaniu ze stężeniem ramnozy wyrażonym w mM. (C) Takie samo stężenie dRL w mM jak ramnozy daje w przybliżeniu dwukrotną absorbancję przy 421 nm, zgodnie z oczekiwaniami. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek uzupełniający 1: Schematyczny przedstawienie protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowy protokół ilościowego oznaczania dRL metodą UPLC-MS/MS. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Najdokładniejszą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania RL jest HPLC sprzężona ze spektrometrią mas (MS)7,8,27; Wymaga to jednak specjalistycznego i drogiego sprzętu, który może nie być dostępny dla wielu badaczy. Opisane tutaj metody mogą być rutynowo wykonywane przy użyciu podstawowych materiałów i sprzętu laboratoryjnego w celu wykrywania i szacowania stężeń RL, ale mają pewne ograniczenia, w szczególności ich niedokładność w oznaczaniu mieszanin mRL i dRL. Ponadto należy starannie przygotować próbkę używaną do oznaczania ilościowego RL. Hodowle stosowane do wykrywania i oznaczania ilościowego RL nie powinny znajdować się w późnej fazie stacjonarnej, ponieważ komórki mogą być agregowane lub poddawane lizie, co prowadzi do powstania niejednorodnych zawiesin komórek, które mogą powodować zmienność uzyskanych wyników. Dodatkowo szczątki komórkowe mogą zakłócać metodę orcinol.

Dokładne wyniki można uzyskać, gdy opisany protokół jest wykonywany z odpowiednimi kontrolami, takimi jak szczep Pseudomonas aeruginosa niezdolny do wytwarzania RL (jak PAO1 ΔrhlA mutant20 użyty w tej pracy, ryc. 2). Wyniki te są przydatne do charakteryzowania różnych izolatów P. aeruginosa 12,13, genetycznej modyfikacji szczepów w celu zwiększenia produkcji RL14 lub badania genetyki molekularnej produkcji RL przez różne izolaty P. aeruginosa 12.

W związku z tym opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do scharakteryzowania szczepów Pseudomonas aeruginosa pod kątem wytwarzania przez nie czynników wirulencji i oceny ich potencjału biotechnologicznego, zwłaszcza we wczesnych stadiach badań. Ważne jest, aby pamiętać, że metody te nie są przeznaczone jako substytuty technik takich jak HPLC/MS, ale raczej jako dostępne techniki wstępnej charakterystyki szczepu i manipulacji genetycznej szczepów P. aeruginosa.

Ponadto, jeśli badania koncentrują się na produkcji RL do celów biomedycznych, ważne jest, aby przyznać, że produkcja RL jest tylko jednym z kilku czynników wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa. Ponadto rodzaj wytwarzanych RL lub wielkość ich produkcji nie jest ściśle skorelowany z zjadliwością danego szczepu, ponieważ na zjadliwość wpływa wiele czynników28.

Jeśli chodzi o odtwarzalność opisanych tutaj metod, należy zwrócić szczególną uwagę na otrzymywanie faz organicznych zarówno w wykrywaniu RL przez TLC (krok 1.6), jak i przy pomiarze RL metodą orcynolu (krok 2.4). Nawet niewielka ilość drugiej fazy pobrana podczas ekstrakcji może prowadzić do znacznych różnic w uzyskanych wynikach. Ekstrakcja RL z supernatantu hodowli jest kluczowym krokiem w osiąganiu wiarygodnych i powtarzalnych wyników metodą orcinol. Bardzo ważne jest, aby podczas zbierania fazy organicznej wykluczyć fazę interfazową i fazę ciekłą. Jeśli faza eterowa nie zostanie całkowicie wysuszona w ciągu 3 godzin, prawdopodobnie zawiera wodę, co wymaga nowej ekstrakcji.

Zastosowanie metody orcyny do oznaczania ilościowego RL było przedmiotem dyskusji, z argumentami przeciwko jej dokładności i swoistości. Twierdzi się, że RL są często przeszacowane, a metoda nie jest specyficzna, ponieważ orcynol może reagować z różnymi cukrami, nie tylko z ramnozą. Obecne dane pokazują, że jeśli RL są skutecznie ekstrahowane z supernatantu hodowli, technika ta jest specyficzna, o czym świadczy brak reakcji, gdy mutant rhlA jest używany jako kontrola ujemna. Jednakże, aby dostarczyć dodatkowych dowodów na dokładność metody w wykrywaniu, niezależnie od procedury ekstrakcji, wykryliśmy wzorzec dRL za pomocą UPLC-MS/MS, jak opisano wcześniej27, i porównaliśmy wyniki uzyskane metodą orcinol18 (plik uzupełniający 1, rysunek 4A). Znaleźliśmy, jak zgłoszono18, bardzo dobrą korelację między stężeniem RL mierzonym tą metodą, gdzie każde wykryte stężenie μM dRL odpowiada w przybliżeniu dwukrotnie większej absorbancji przy 421 nm niż to samo stężenie ramnozy μM (Rysunek 4B, C). Ten eksperyment kontrolny wyraźnie pokazuje dokładność tej metody oznaczania ilościowego RL.

Jednak ze względu na wyzwanie, jakim jest pomiar stężenia mieszanin mRL i dRL metodą orcinol, większość publikacji podaje wyniki jako ekwiwalenty ramnozy w RL. Wartość ta może nie mieć bezpośredniego związku z rzeczywistym stężeniem RL, jak pokazano w przedstawionych tutaj przykładach, niemniej jednak służy jako użyteczny sposób porównywania ilości RL w różnych warunkach, zwłaszcza w przypadku stosowania tego samego szczepu P. aeruginosa .

Opisano alternatywną metodę oznaczania ilościowego mRL i dRL, która opiera się na solubilizacji hydrofobowego barwnika Victoria Pure Blue BO, powszechnie stosowanego w długopisach29. Ta metoda jest szybka i niedroga. Jednak protokół ten został opracowany w celu ilościowego określenia heterologicznej produkcji RL przez P. putida i nie jest wykonalny do stosowania z RL wytwarzanym przez P. aeruginosa, ponieważ ekspresja niebieskiej toksyny pyocyjaniny zakłóca tę metodę.

Podsumowując, opisane tutaj metody stanowią realną alternatywę dla wykrywania i oznaczania ilościowego RL wytwarzanego przez P. aeruginosa, które nie wymagają skomplikowanego i drogiego sprzętu. Stanowią one praktyczne podejście dla badaczy do oceny produkcji RL w różnych warunkach eksperymentalnych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Podziękowania

Laboratorium GSCh jest częściowo wspierane przez IN201222 grantowe od Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1-NAPHTHOLSIGMA-ALDRICH70442
KWAS OCTOWYJ.T. BAKER9508-02
WIRÓWKADo probówek do wirowania 1,5 ml i  50
mL CHLOROFORMJ.T. BAKER9180-02
ETER DO PIECA
J.T. BAKER9244-02
SZKLANA PIPETASIGMA-ALDRICH
KWAS SOLNYJ.T. BAKER5622-02
LB
L-RAMNOZA MONOHYDRATSIGMA-ALDRICHR-3875
METANOLJ.T. BAKER9049-02
ORCINOL MONOHYDRATSIGMA-ALDRICHO1875
BulionTris HCL (0,12 M), Chlorek potasu ( 0,02 M) Chlorek amonu (0,02 M),  Pepton (1%), pH 7,4    Autoklawowane. Dodaj  Glukoza (5%) i siarczan magnezu (0,0016M)
KOMÓRKA KWARCOWA (KUWETA)SIGMA-ALDRICHZ276669
PROSTOKĄTNY TLC ROZWIJAJĄCY ZBIORNIKFISHER SCIENTIFIC
RAMNOLIPIDY SPEKTROFOTOMETR
OPRYSKIWACZSIGMA-ALDRICHZ529710-1EA
KWAS SIARKOWYJT BAKER9681-02
TES PROBÓWKI 5mLCORNING352002
TLC ŻEL KRZEMIONKOWY 60 F254MERCK1.05554.0001
> 80 ° Z
SUSZĄCEGO CLS706510 PPGAS K4161801020 SIGMA-ALDRICH R-90 VIS ŁAŹNIA WODNA

Bibliografia

  1. Moradali, M. F., Ghods, S., Rehm, B. H. A. Pseudomonas aeruginosa lifestyle: A paradigm for adaptation, survival, and persistence. Frontiers in Cell Infection and Microbiology. 7, 1-29 (2017).
  2. Gellatly, S. L., Hancock, R. E. W. Pseudomonas aeruginosa: New insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
  3. Williams, P., Cámara, M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules. Current Opinion in Microbiology. 12 (2), 182-191 (2009).
  4. Soberón-Chávez, G., González-Valdez, A., Soto-Aceves, M. P., Cocotl-Yañez, M. Rhamnolipids produced by Pseudomonas: From molecular genetics to the market. Microbial Biotechnology (MBT). 14 (1), 136-146 (2021).
  5. Freschi, L., et al. The Pseudomonas aeruginosa pan-genome provides new insights on its population structure, horizontal gene transfer, and pathogenicity. Genome Biology and Evolution. 11 (1), 109-120 (2019).
  6. Quiroz-Morales, S. E., García-Reyes, S., Ponce-Soto, G. Y., Servin-Gonzalez, L. Tracking the origins of Pseudomonas aeruginosa phylogroups by diversity and evolutionary analysis of important pathogenic marker genes. Diversity. 14 (5), 345(2022).
  7. Déziel, E., et al. Liquid chromatography/mass spectrometry analysis of mixtures of rhamnolipids produced by Paeudomonas aeruginosa strain 57RP grown on mannitol or naphthalene. Biochemistry and Biophysic Acta. 1440 (2-3), 244-252 (1999).
  8. Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Rhamnolipids: Diversity of structures, microbial origins, and roles. Applied Microbiology and Biotechnology. 86 (5), 1323-1336 (2010).
  9. Toribio, J., Escalante, A. E., Soberón-Chávez, G. Production of rhamnolipids in bacteria other than Pseudomonas aeruginosa. European Journal of Lipid Science and Technology. 112, 1082-1087 (2010).
  10. Filbig, M., et al. Metabolic and process engineering on the edge-Rhamnolipids are a true challenge: A review. Biosurfactants. Foundations and Frontiers in Enzymology. Soberón-Chávez, G., et al. , Academic Press. New York. Chapter 8 157-181 (2023).
  11. Noll, P., et al. Limits for sustainable biosurfactant production: Techno-economic and environmental assessment of a rhamnolipid production process. Bioresource Technology. 25, 101767(2024).
  12. García-Reyes, S., Cocotl-Yañez, M., González-Valdez, A., Servín-González, L., Soberón Chávez, G. The PqsR-independent quorum-sensing response of Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 outlier-strain reveals new insights on the PqsE effect on RhlR activity. Molecular Microbiology. 116 (4), 1113-1123 (2021).
  13. Grosso-Becerra, M. V., et al. Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 is a non-virulent strain suitable for mono-rhamnolipids production. Applied Microbiology and Biotechnology. 100 (23), 9995-10004 (2016).
  14. Gutiérrez-Gómez, U., Soto-Aceves, M. P., Servín-González, L., Soberón-Chávez, G. Overproduction of rhamnolipids in Pseudomonas aeruginosa PA14 by redirection of the carbon flux from polyhydroxyalcanoate synthesis and overexpression of the rhlAB-R operon. Biotechnology Letters. 40 (11), 1561-1566 (2018).
  15. Zibek, S., Soberón-Chávez, G. Overview on glycosylated lipids produced by bacteria and fungi: Rhamno-, Sophoro-, Mannosylerythritol and Cellobiose Lipids. Biosurfactants for a Biobased. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. Hausmann, R., Henkel, M. , Springer. Berlin, Heidelberg. Chapter 4 181(2022).
  16. Twigg, M. S., et al. Microbial biosurfactant research: time to improve the rigour in the reporting of synthesis, functional characterization and process development. Microbial Biotechnology. 14 (1), 147-170 (2021).
  17. Matsuyama, T., Sogawa, M., Yano, I. Direct colony thin layer chromatography and rapid characterization of Serratia marscescens wetting agents. Applied and Environmental Microbiology. 53 (5), 1186-1188 (1987).
  18. Chandrasekaran, E. V., Bemiller, J. N. Constituent analyses of glycosaminoglycans. Methods on Carbohydrate Chemistry. 8, 89-96 (1980).
  19. Behrens, B., Engelen, J., Tiso, T., Blank, L. M., Hayen, H. Characterization of rhamnolipids by liquid chromatography/mass spectrometry after solid-phase extraction. Analytic and Bioanalytic Chemistry. 408 (10), 2505-2514 (2016).
  20. Rahim, R., et al. Cloning and functional characterization of the Pseudomonas aeruginosa rhlC gene that encodes rhamnosyltransferase 2, an enzyme responsible for di-rhamnolipid biosynthesis. Molecular Microbiology. 40 (3), 708-718 (2001).
  21. Irorere, V. U., Tripathi, L., Marchant, R., McClean, S., Banat, I. M. Microbial rhamnolipid production: A critical re-evaluation of published data and suggested future publication criteria. Applied Microbiology and Biotechnology. 101 (10), 3941-3951 (2017).
  22. Holloway, B. W. Genetic Recombination in Pseudomonas aeruginosa. Journal of General Microbiology. 13 (3), 572-581 (1955).
  23. Mathee, K. Forensic investigaction into the origin of Pseudomonas aeruginosa PA14-old but not lost. Journal of Medical Microbiology. 67 (8), 1019-1021 (2018).
  24. Roy, P. H., et al. Complete genome sequence of the multiresistant taxonomic outlier Pseudomonas aeruginosa PA7. PLoS ONE. 5, e8842(2010).
  25. Zhang, Y., Miller, R. M. Enhanced octadecane dispersion and biodegradation by a Pseudomonas rhamnolipid surfactant (biosurfactant). Applied and Environmental Microbiology. 58 (10), 3276-3282 (1992).
  26. Miller, J. Experiments in Molecular Genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory. New York. 352-355 (1992).
  27. Abdel-Mawgoud, A. M., Lépine, F., Déziel, E. Liquid chromatography/mass spectrometry for the identification and quantification of rhamnolipids. Pseudomonas Methods and Protocols. 30, 359-373 (2014).
  28. Lee, D. G., et al. Genomic analysis reveals that Pseudomonas aeruginosa virulence is combinatorial. Genome Biology. 7 (10), 90(2006).
  29. Kubicki, S., et al. A straightforward assay for screening and quantification of biosurfactants in microbial culture supernatants. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 958(2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wykrywanie ramnolipid wOznaczanie ilo ci ramnolipid wChromatografia cienkowarstwowaHydroliza kwasowaEkstrakcja biosurfaktant wPomiar ramnozyCzynniki wirulencji
Wykrywanie i oznaczanie ilościowe mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.