Wykrywanie i oznaczanie ilościowe mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa

Podsumowanie

Pseudomonas aeruginosa wytwarza biosurfaktanty ramnolipidowe. Chromatografia cienkowarstwowa wykrywa i określa proporcję mono- i di-ramnolipidów wytwarzanych przez każdy szczep. Kwantyfikacja całkowitych ramnolipidów polega na ocenie ekwiwalentów ramnozy obecnych w tych biosurfaktantach wyekstrahowanych z supernatantów hodowlanych metodą orcinolu.

Streszczenie

Bakteria środowiskowa Pseudomonas aeruginosa jest oportunistycznym patogenem o wysokiej oporności na antybiotyki, który stanowi zagrożenie dla zdrowia. Bakteria ta wytwarza wysoki poziom biosurfaktantów znanych jako ramnolipidy (RL), które są cząsteczkami o znacznej wartości biotechnologicznej, ale są również związane z cechami wirulencji. W związku z tym wykrywanie i oznaczanie ilościowe RL może być przydatne zarówno w zastosowaniach biotechnologicznych, jak i w biomedycznych projektach badawczych. W tym artykule demonstrujemy krok po kroku technikę wykrywania wytwarzania dwóch form RL wytwarzanych przez P. aeruginosa za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC): mono-ramnolipidów (mRL), cząsteczek utworzonych przez dimer kwasów tłuszczowych (głównie C10-C10) połączonych z jedną grupą ramnozy, oraz di-ramnolipidów (dRL), cząsteczek utworzonych przez podobny dimer kwasu tłuszczowego połączony z dwoma ugrupowaniami ramnozy. Dodatkowo przedstawiamy metodę pomiaru całkowitej ilości RL w oparciu o kwaśną hydrolizę tych biosurfaktantów wyekstrahowanych z supernatantu kultury P. aeruginosa, a następnie wykrywanie stężenia ramnozy, która reaguje z orcynolem. Połączenie obu technik można wykorzystać do oszacowania przybliżonego stężenia mRL i dRL wytwarzanych przez określony szczep, czego przykładem są szczepy typu PAO1 (filogrupa 1), PA14 (filogrupa 2) i PA7 (filogrupa 3).

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa jest bakterią środowiskową i oportunistycznym patogenem, który budzi duże obawy ze względu na wytwarzanie cech związanych ze zjadliwością i wysoką odporność na antybiotyki1^,2. Charakterystycznym metabolitem wtórnym wytwarzanym przez tę bakterię jest biosurfaktant RL, który jest wytwarzany w sposób skoordynowany z kilkoma cechami związanymi ze zjadliwością, takimi jak piocyjanina fenazynowa, antybiotyk o aktywności redoks i elastaza proteaza³. Właściwości tensjoaktywne i emulgujące RL zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach przemysłowych i są obecnie skomercjalizowane⁴.

Większość szczepów P. aeruginosa, należących do filogrup 1 i 2, wytwarza dwa typy RL: mRL, który składa się z jednej grupy ramnozy połączonej z dimerem kwasu tłuszczowego głównie o 10 atomach węgla, oraz dRL, który zawiera dodatkowe ugrupowanie ramnozy połączone z pierwszym rhamnozą⁴ (zobacz Rysunek 1). Doniesiono jednak, że dwie pomniejsze filogrupy P. aeruginosa (grupy 3 i 5) wytwarzają tylko mRL^5,6. Te dwa typy RL zawierają mieszaninę dimerów kwasów tłuszczowych, które, jak wspomniano, są głównie C10-C10, ale wytwarzane są również mniejsze proporcje cząsteczek zawierających dimery C12-C10, C12-C12 i C10-C12:1. Opisano charakterystykę kongenerów RL wytwarzanych przez różne szczepy przy użyciu HPLC MS/MS: ^7,8. Metody opisane w tej pracy mogą jedynie rozróżnić mRL i dRL, ale nie mogą być stosowane do charakterystyki kongenerów RL.

P. aeruginosa i niektóre gatunki Burkholderia są naturalnymi producentami RL⁹, ale ta pierwsza bakteria jest najbardziej wydajnym producentem. Jednak komercyjnie stosowany RL jest obecnie wytwarzany w pochodnych Pseudomonas putida KT2440 eksprymujących geny P. aeruginosa, aby uniknąć stosowania tego oportunistycznego patogenu^10,11. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe RL wytwarzanego przez P. aeruginosa ma ogromne znaczenie dla badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w ekspresję cech związanych ze zjadliwością¹², w charakterystyce szczepów należących do kladów 3 lub 5¹³, oraz dla konstruowania pochodnych P. aeruginosa, które nadprodukują te biosurfaktanty, jednocześnie zmniejszając zjadliwość¹⁴. Wytwarzanie biosurfaktantów przez różne mikroorganizmy zostało wykryte na podstawie pewnych ogólnych cech tych związków, takich jak metoda zapadania się lub indeks emulgacji¹⁵, ale metody te nie są ani dokładne, ani specyficzne¹⁶.

Tutaj opisujemy protokół wykrywania mRL i dRL za pomocą płynnej ekstrakcji całkowitego RL z supernatantów kulturowych różnych szczepów typu P. aeruginosa i separacji obu typów RL za pomocą TLC. W tej metodzie RL wyekstrahowany z supernatantu hodowli jest rozdzielany przez ich różnicową rozpuszczalność w rozpuszczalnikach stosowanych do TLC, powodując różnicową migrację na płytce żelu krzemionkowego. W związku z tym mRL mają szybszą migrację niż dRL i można je wykryć jako oddzielne miejsca, gdy płytki są suszone i barwione α-naftolem.

Opisana tutaj metoda wykrywania mRL i dRL przez TLC opiera się na wcześniej opublikowanym artykule¹⁷, który jest łatwy do wykonania i nie wymaga drogiego sprzętu. Ta metoda była przydatna do wykrywania RL w różnych izolatach P. aeruginosa¹³ przy użyciu odpowiednich kontroli, takich jak mutant pochodzący z P. aeruginosa, który nie jest w stanie wytworzyć RL. Nie jest to jednak preferowana metoda charakteryzowania nowych biosurfaktantów wytwarzanych przez bakterie inne niż Pseudomonas aeruginosa ze względu na brak swoistości.

Dodatkowo, przedstawiono metodę ilościowego oznaczania ekwiwalentów ramnozy całkowitego RL wyekstrahowanego z supernatantu kultury P. aeruginosa. Metoda ta określa ilościowo te biosurfaktanty w oparciu o reakcję orcyny z cukrami redukcyjnymi, w wyniku czego otrzymujemy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 421 nm, jak opisano wcześniej¹⁸. Ponieważ reakcja z orcynolem nie jest specyficzna dla ramnozy, ważne jest, aby przeprowadzić tę metodę z RL wyekstrahowanym z supernatantu hodowli, który nie zawiera znacznych ilości innych cząsteczek zawierających cukier, takich jak lipopolisacharydy (LPS). Zakwaszona mieszanina chloroformu/metanolu jest tutaj używana do płynnej ekstrakcji RL¹⁸, ale można również użyć octanu etylu, a ekstrakcja do fazy stałej (SPE) daje bardzo dobre wyniki¹⁹. Opisana tutaj metoda orcynowa nie wymaga wyrafinowanego sprzętu i może zapewnić wiarygodne wyniki, jeśli zostanie wykonana ze szczególną starannością w przygotowaniu analizowanych próbek, jak wspomniano. Aby zapewnić prawidłowe przygotowanie próbki, ważne jest, aby uwzględnić mutanta Pseudomonas aeruginosa rhlA, który nie jest w stanie wytworzyć RL²⁰ oraz wykonać trzy powtórzenia biologiczne i trzy techniczne dla każdego oznaczenia.

W literaturze pojawiły się znaczące kontrowersje^16,21dotyczące oznaczania RL metodą orcinolu, przy czym niektóre badania sugerują, że produkcja RL jest przeszacowana i że test nie ma specyficzności dla ramnozy, potencjalnie wykrywając inne cukry. Pokazujemy jednak tutaj, że opisane metody mogą być dokładne i specyficzne w odpowiednich warunkach. Ponadto, w celu porównania z procedurami opisanymi w tym artykule, wykorzystujemy detekcję UPLC-MS/MS wzorca dRL i wykazujemy, że podobne wyniki uzyskuje się metodą orcinol. Szczegółowy protokół ilościowego oznaczania RL przy użyciu tej metody znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

Te protokoły są zilustrowane przy użyciu szczepów typu PAO1 (filogrupa 1), PA14 (filogrupa 2) i PA7 (filogrupa 3). Szczepy te zostały wybrane, ponieważ są dobrze scharakteryzowane i wytwarzają różne profile RL.

Protokół

Ta procedura jest schematycznie opisana na rysunku uzupełniającym 1. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wykrywanie mRL i dRL w supernatantach hodowlanych P. aeruginosa za pomocą TLC

1. Zacznij od odwirowanego bulionu interesującego szczepu P. aeruginosa, uprawianego w płynnym podłożu przez 24 godziny (aby osiągnąć stacjonarną fazę wzrostu, w której wytwarzany jest RL). Zazwyczaj kultury te zawierają 1 x 10⁹ bakterii na ml.
2. Dostosuj pH kultury do 2 za pomocą stężonego HCl.
3. Umieścić 5 ml zakwaszonego supernatantu hodowli w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodać 5 ml mieszaniny chloroformu: metanol w stosunku 2:1.
4. Mieszaj probówkę przez odwrócenie trzy razy, za każdym razem przez 10 s, i pozostaw probówkę bez odwrócenia na 2 minuty między każdym mieszaniem.
5. Pozostawić probówkę bez mieszania na około 3 godziny, aż obie fazy zostaną oddzielone, lub odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
6. Przenieś fazę organiczną (dolna warstwa) do czystej probówki i pozostaw probówkę w okapie ekstrakcyjnym do momentu wyschnięcia.
7. Powtórzyć proces, zaczynając od kroku 1.3, umieszczając fazę organiczną z drugiego chloroformu: ekstrakcji metanolem do probówki, która została użyta w pierwszej ekstrakcji.
8. Odparować fazę organiczną, aż pozostanie 1 ml lub 1,5 ml. Przenieś tę objętość do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odparuj rozpuszczalnik do sucha przez noc.
9. Dodać 50 μl metanolu do wysuszonej probówki w celu ponownego zawieszenia RL.
10. Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową na płytkach z żelem krzemionkowym.
    UWAGA: Rozmiar płytki TLC należy przyciąć zgodnie z liczbą próbek, które będą analizowane. Każdą próbkę należy nanieść na odległość 1,5 cm, a punkt aplikacji powinien znajdować się 1 cm od krawędzi płytki (narysuj poziomą linię ołówkiem).
11. Nanieść 5 μl każdej próbki za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl.
12. Faza ciekła TLC składa się z mieszaniny chloroformu: metanol: kwas octowy w proporcji 65:15:2. Aby przygotować 35 ml tej mieszaniny, zmieszaj 26 ml chloroformu, 6 ml metanolu i 0,8 ml 20% roztworu podstawowego kwasu octowego. Wymieszać te rozpuszczalniki i umieścić je w zamkniętej komorze TLC na co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem chromatografii, tak aby atmosfera była nasycona lotnymi rozpuszczalnikami.
13. Umieścić płytkę TLC w komorze, unikając kontaktu z punktem, w którym nałożono próbki.
14. Zamknąć komorę i pozostawić TLC do momentu, gdy rozpuszczalnik osiągnie 1 cm przed krawędzią płytki. W tym momencie wyjmij płytkę i pozostaw ją do wyschnięcia (można zastosować przepływ powietrza, aby przyspieszyć proces).
15. Przygotować roztwór α-naftolu, rozpuszczając 5 g tego związku w 33 ml etanolu. Po rozpuszczeniu dodaj 127,5 ml etanolu, 12,6 ml wody i 20,5 ml zimnego_H2SO4.
16. W celu wykrycia obecności mRL i dRL należy rozpylić roztwór α-naftolu na płytkę w okapie ekstrakcyjnym i umieścić spryskaną płytkę w suszarce w temperaturze 85 °C na kilka minut, aż pojawi się różowawy ślad RL.
17. Użyj obrazu TLC, aby obliczyć proporcję mono- i di-RL obecnych w każdej próbce za pomocą oprogramowania, które wykrywa gęstość każdej plamki.

2. Kwantyfikacja całkowitej ilości RL mierząca ekwiwalenty ramnozy obecne w biosurfaktancie

1. Umieścić 1,2 ml kultury w fazie stacjonarnej (hodowanej przez 24 godziny) w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 3 minuty przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w czystej probówce.
2. Przenieść 333 μl do czystej probówki (wykonać ten krok trzykrotnie) i dodać 1 ml eteru.
3. Energicznie mieszaj w wirze przez 30 sekund. Powtórz tę procedurę z jedną rurką na raz.
4. Wirować przez 2 minuty przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać fazę organiczną (faza górna), przenieść ją do czystej probówki i pozostawić otwartą w okapie ekstrakcyjnym do momentu wyschnięcia.
5. Powtórzyć ekstrakcję eterem zgodnie z opisem w kroku 2.2. Powtórz kroki 2.3 i 2.4.
6. Po całkowitym wysuszeniu dodaj 1 ml wody do każdej probówki. Pozostaw probówki na 12 godzin, aby RL mógł się nawodnić, a następnie energicznie wymieszaj w wirze.
7. Umieścić czystą kolbę w lodzie na 5 minut (ponieważ jest to reakcja egzotermiczna). Przygotować roztwór 60% H_2SO4 (chronić kolbę przed światłem).
8. W czystej probówce przygotuj 1,6% roztwór orcyny w wodzie destylowanej. Aby przygotować odczynnik orcyny, zmieszaj 4,4 ml 60% roztworu H_2SO4 z 0,6 ml 1,6% roztworu orcyny.
9. Obliczyć końcową objętość potrzebnego odczynnika orcyny. Dodać 900 μl tego odczynnika do każdej próbki i do każdego stężenia krzywej kalibracyjnej, stosując różne stężenia ramnozy (zazwyczaj stosuje się 9 stężeń ramnozy w zakresie od 1 μg/ml do 9 μg/ml) i jedno ze 100 μl wody, upewniając się, że wszystkie są wykonywane w trzech powtórzeniach.
10. Dodać 100 μl każdej próbki RL do 900 μl odczynnika orcyny w szklanej probówce i wymieszać oba roztwory.
11. Inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 80 °C.
12. Pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
13. Odczytać absorbancję próbek i krzywą kalibracyjną przy długości fali 421 nm za pomocą ogniwa kwarcowego.
14. Obliczyć stężenie ramnozy w każdej próbce, interpolując absorbancję na krzywej kalibracyjnej i biorąc pod uwagę objętość użytą do oznaczenia.
15. Aby obliczyć stężenie μM, podziel stężenie uzyskane w μg/ml przez 182,2 (masa cząsteczkowa ramnozy) i pomnóż przez 1000.

Wyniki

W tym artykule, trzy różne szczepy typu P. aeruginosa zostały użyte do reprezentowania trzech filogrup, każda o różnych poziomach produkcji RL i proporcjach mRL i dRL. Szczepy te obejmują PAO1 (izolat ran z Australii, 1955²²), PA14 (izolat roślinny z USA, 1977²³) i PA7 (izolat kliniczny z Argentyny, 2010²⁴). Jako kontrolę negatywną zastosowano mutanta PAO1 rhlA, który jest niezdolny do produkcji RL. Wszystkie szczepy były uprawiane przez 24 godziny w pożywce PPGAS, specjalnie zaprojektowanej do promowania wysokiego poziomu RL²⁵, w temperaturze 37 °C. Kultury PPGAS inokulowano przy gęstości optycznej 0,05 przy długości fali 600 nm przy użyciu pożywki LB ²⁶ przez noc. Zazwyczaj szczepy P. aeruginosa osiągają gęstość optyczną 2 mierzoną przy 600 nm w pożywce PPGAS po 24 godzinach, co w przybliżeniu odpowiada 1 x 10⁹ bakterii na ml. Aby zebrać supernatanty hodowlane do wykrywania i oznaczania ilościowego RL, kultury odwirowywano w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut, a osad komórkowy wyrzucono. Wyniki uzyskane przy użyciu tych dwóch metod (Rysunek 2 i Rysunek 3) ilustrują, że zarówno rodzaje RL wytwarzane przez każdy szczep, jak i ilość ich produkcji różnią się między trzema analizowanymi szczepami. Jak pokazano w Rysunek 2, PAO1 wytwarza około 30% mRL i 70% dRL, podczas gdy PA14 wytwarza równy stosunek 50% mRL i 50% dRL, a PA7 wytwarza wyłącznie mRL. Ten profil produkcyjny RL jest spójny z poprzednimi raportami^12,14.

Rysunek 3A ilustruje ilość ekwiwalentów ramnozy obecnych w RL wytwarzanych przez każdy z tych trzech typów szczepów. Z wykrytych ilości ramnozy jasno wynika, że szczep PA14 wytwarza największą ilość RL, podczas gdy szczep PA7 wytwarza najmniejszą ilość. Jednak same te wyniki nie mogą być wykorzystane do oszacowania stężenia μM RL wytwarzanego przez każdy szczep. Ponadto sama metoda orcynowa nie może zapewnić przybliżonego stężenia RL, ponieważ opiera się na scharakteryzowaniu proporcji mRL i dRL wytwarzanych przez każdy interesujący nas szczep. Dlatego, aby uzyskać oszacowanie stężenia μM RL, należy wziąć pod uwagę proporcję każdego rodzaju RL określoną w TLC i dołączyć krzywą standardową z różnymi stężeniami ramnozy (Rysunek 3B).

Metoda orcinol może być rzeczywiście wykorzystana do ilościowego określenia stężenia RL, gdy produkowany jest tylko jeden rodzaj tego biosurfaktantu. W takich przypadkach stężenie μM wykrytej ramnozy odpowiada bezpośrednio stężeniu μM mRL. W przypadku dRL, ponieważ dwie ramnozy są wytwarzane przez hydrolizę każdej cząsteczki dRL, stężenie μM ramnozy wykryte w RL należy podzielić przez 2, aby uzyskać ich stężenie μM (patrz Rysunek 4).

Jednak większość szczepów P. aeruginosa wytwarza oba typy RL w różnych proporcjach (jak pokazano w Rysunek 2), co pozwala określić tylko przybliżone stężenie całkowitego RL. Biorąc to pod uwagę, oszacowaliśmy produkcję RL przez każdy szczep w następujący sposób: W przypadku szczepu PA7, ponieważ wytwarza on tylko mRL, ramnoza stanowiąca część RL (44,6 μg/ml + 4,5 μg/mL) odpowiada bezpośrednio stężeniu μM (244,78), reprezentującemu stężenie tego biosurfaktantu w supernatancie hodowli, ponieważ każda cząsteczka RL zawiera jedną cząstkę ramnozy. Jednak dla szczepu PAO1, mimo że wykryte stężenie ramnozy wynosiło 111,55 μg/ml + 11,41 μg/ml, tylko 30% odpowiada mRL. Dlatego 70% cząsteczek RL zawiera dwie ramnozy na cząsteczkę. Aby oszacować stężenie RL, stężenie μM ramnozy (612,24) podzielono przez 5, biorąc pod uwagę, że 1/5 odpowiada stężeniu μM mRL (122,49), a 2/5 (244,89) dRL. Zatem przybliżone stężenie μM RL wytwarzanego przez ten szczep wynosi 367,39.

Dla szczepu PA14 wykryte stężenie ramnozy wynosiło 194,39 μg/ml + 11,5 μg/mL, które zostało przeliczone na stężenie μM (1,066,9) i podzielone przez 3. Wynik reprezentuje stężenie każdego typu RL, biorąc pod uwagę, że każdy typ został wyprodukowany w 50% i że dRL zawiera 2 ramnozy na cząsteczkę. W ten sposób szczep ten wytwarza 355,63 μM mRL i takie samo stężenie dRL, co daje przybliżone stężenie μM RL wynoszące 711,27, prawie dwa razy więcej niż szczep PAO1 i prawie trzy razy większe niż stężenie wytwarzane przez szczep PA7.

Rysunek 1: Skład chemiczny głównych kongenerów mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów. (A) Mono-ramnolipidy. (B) Di-ramnolipidy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Wykrywanie mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. (A) Zdjęcie płytki TLC pokazującej wzorce RL i RL wytwarzane przez szczepy PAO1, PA14, PA7 i mutant ΔrhlA pochodzący z PAO1. (B) Oszacowanie proporcji każdego typu RL (mRL i dRL) w każdej z próbek badanych w (A), przy użyciu oprogramowania ImageJ. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Kwantyfikacja stężenia RL metodą orcinolu. (A) Stężenie ramnozy (μg/ml) zawarte w RL wyekstrahowanym z supernatantów hodowlanych szczepów PAO1 (pasek), PA14 (jasnoszary pasek) i PA7 (ciemnoszary pasek). Słupki oznaczają odchylenie standardowe. (B) Krzywa kalibracji ramnozy dla eksperymentu pokazanego w (A). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Walidacja metody orcinol w porównaniu z UPLC-MS/MS do kwantyfikacji dRL. (A) Wzorzec dRL został określony ilościowo za pomocą UPLC-MS/MS. (B) Metoda orcinol w porównaniu ze stężeniem ramnozy wyrażonym w mM. (C) To samo stężenie mM dRL co ramnoza daje w przybliżeniu dwukrotnie większą absorbancję przy 421 nm, zgodnie z oczekiwaniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Schematyczne przedstawienie protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 1: Szczegółowy protokół do ilościowego oznaczania dRL przez UPLC-MS/MS. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Najdokładniejszą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania RL jest HPLC sprzężona ze spektrometrią mas (MS)^7,8,27; Wymaga to jednak specjalistycznego i drogiego sprzętu, który może nie być dostępny dla wielu badaczy. Opisane tutaj metody mogą być rutynowo wykonywane przy użyciu podstawowych materiałów i sprzętu laboratoryjnego w celu wykrywania i szacowania stężeń RL, ale mają pewne ograniczenia, w szczególności ich niedokładność w oznaczaniu mieszanin mRL i dRL. Ponadto należy starannie przygotować próbkę używaną do oznaczania ilościowego RL. Hodowle stosowane do wykrywania i oznaczania ilościowego RL nie powinny znajdować się w późnej fazie stacjonarnej, ponieważ komórki mogą być agregowane lub poddawane lizie, co prowadzi do powstania niejednorodnych zawiesin komórek, które mogą powodować zmienność uzyskanych wyników. Dodatkowo szczątki komórkowe mogą zakłócać metodę orcinol.

Dokładne wyniki można uzyskać, gdy opisany protokół jest wykonywany z odpowiednimi kontrolami, takimi jak szczep Pseudomonas aeruginosa niezdolny do wytwarzania RL (jak PAO1 ΔrhlA mutant²⁰ użyty w tej pracy, ryc. 2). Wyniki te są przydatne do charakteryzowania różnych izolatów P. aeruginosa ^12,13, genetycznej modyfikacji szczepów w celu zwiększenia produkcji RL¹⁴ lub badania genetyki molekularnej produkcji RL przez różne izolaty P. aeruginosa ¹².

W związku z tym opisane tutaj metody mogą być wykorzystane do scharakteryzowania szczepów Pseudomonas aeruginosa pod kątem wytwarzania przez nie czynników wirulencji i oceny ich potencjału biotechnologicznego, zwłaszcza we wczesnych stadiach badań. Ważne jest, aby pamiętać, że metody te nie są przeznaczone jako substytuty technik takich jak HPLC/MS, ale raczej jako dostępne techniki wstępnej charakterystyki szczepu i manipulacji genetycznej szczepów P. aeruginosa.

Ponadto, jeśli badania koncentrują się na produkcji RL do celów biomedycznych, ważne jest, aby przyznać, że produkcja RL jest tylko jednym z kilku czynników wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa. Ponadto rodzaj wytwarzanych RL lub wielkość ich produkcji nie jest ściśle skorelowany z zjadliwością danego szczepu, ponieważ na zjadliwość wpływa wiele czynników²⁸.

Jeśli chodzi o odtwarzalność opisanych tutaj metod, należy zwrócić szczególną uwagę na otrzymywanie faz organicznych zarówno w wykrywaniu RL przez TLC (krok 1.6), jak i przy pomiarze RL metodą orcynolu (krok 2.4). Nawet niewielka ilość drugiej fazy pobrana podczas ekstrakcji może prowadzić do znacznych różnic w uzyskanych wynikach. Ekstrakcja RL z supernatantu hodowli jest kluczowym krokiem w osiąganiu wiarygodnych i powtarzalnych wyników metodą orcinol. Bardzo ważne jest, aby podczas zbierania fazy organicznej wykluczyć fazę interfazową i fazę ciekłą. Jeśli faza eterowa nie zostanie całkowicie wysuszona w ciągu 3 godzin, prawdopodobnie zawiera wodę, co wymaga nowej ekstrakcji.

Zastosowanie metody orcyny do oznaczania ilościowego RL było przedmiotem dyskusji, z argumentami przeciwko jej dokładności i swoistości. Twierdzi się, że RL są często przeszacowane, a metoda nie jest specyficzna, ponieważ orcynol może reagować z różnymi cukrami, nie tylko z ramnozą. Obecne dane pokazują, że jeśli RL są skutecznie ekstrahowane z supernatantu hodowli, technika ta jest specyficzna, o czym świadczy brak reakcji, gdy mutant rhlA jest używany jako kontrola ujemna. Jednakże, aby dostarczyć dodatkowych dowodów na dokładność metody w wykrywaniu, niezależnie od procedury ekstrakcji, wykryliśmy wzorzec dRL za pomocą UPLC-MS/MS, jak opisano wcześniej²⁷, i porównaliśmy wyniki uzyskane metodą orcinol¹⁸ (plik uzupełniający 1, rysunek 4A). Znaleźliśmy, jak zgłoszono¹⁸, bardzo dobrą korelację między stężeniem RL mierzonym tą metodą, gdzie każde wykryte stężenie μM dRL odpowiada w przybliżeniu dwukrotnie większej absorbancji przy 421 nm niż to samo stężenie ramnozy μM (Rysunek 4B, C). Ten eksperyment kontrolny wyraźnie pokazuje dokładność tej metody oznaczania ilościowego RL.

Jednak ze względu na wyzwanie, jakim jest pomiar stężenia mieszanin mRL i dRL metodą orcinol, większość publikacji podaje wyniki jako ekwiwalenty ramnozy w RL. Wartość ta może nie mieć bezpośredniego związku z rzeczywistym stężeniem RL, jak pokazano w przedstawionych tutaj przykładach, niemniej jednak służy jako użyteczny sposób porównywania ilości RL w różnych warunkach, zwłaszcza w przypadku stosowania tego samego szczepu P. aeruginosa .

Opisano alternatywną metodę oznaczania ilościowego mRL i dRL, która opiera się na solubilizacji hydrofobowego barwnika Victoria Pure Blue BO, powszechnie stosowanego w długopisach²⁹. Ta metoda jest szybka i niedroga. Jednak protokół ten został opracowany w celu ilościowego określenia heterologicznej produkcji RL przez P. putida i nie jest wykonalny do stosowania z RL wytwarzanym przez P. aeruginosa, ponieważ ekspresja niebieskiej toksyny pyocyjaniny zakłóca tę metodę.

Podsumowując, opisane tutaj metody stanowią realną alternatywę dla wykrywania i oznaczania ilościowego RL wytwarzanego przez P. aeruginosa, które nie wymagają skomplikowanego i drogiego sprzętu. Stanowią one praktyczne podejście dla badaczy do oceny produkcji RL w różnych warunkach eksperymentalnych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
KWAS OCTOWY	J.T. BAKER	9508-02
WIRÓWKA			Do probówek do wirowania 1,5 ml i  50
mL CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
ETER DO PIECA
	J.T. BAKER	9244-02
SZKLANA PIPETA	SIGMA-ALDRICH
KWAS SOLNY	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RAMNOZA MONOHYDRAT	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRAT	SIGMA-ALDRICH	O1875
Bulion			Tris HCL (0,12 M), Chlorek potasu ( 0,02 M) Chlorek amonu (0,02 M),  Pepton (1%), pH 7,4    Autoklawowane. Dodaj  Glukoza (5%) i siarczan magnezu (0,0016M)
KOMÓRKA KWARCOWA (KUWETA)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
PROSTOKĄTNY TLC ROZWIJAJĄCY ZBIORNIK	FISHER SCIENTIFIC
RAMNOLIPIDY	SPEKTROFOTOMETR
OPRYSKIWACZ	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
KWAS SIARKOWY	JT BAKER	9681-02
TES PROBÓWKI 5mL	CORNING	352002
TLC ŻEL KRZEMIONKOWY 60 F254	MERCK	1.05554.0001
			> 80 ° Z