Wykrywanie i oznaczanie ilościowe mono-ramnolipidów i di-ramnolipidów wytwarzanych przez Pseudomonas aeruginosa

Podsumowanie

Pseudomonas aeruginosa wytwarza biosurfaktanty ramnolipidowe. Chromatografia cienkowarstwowa wykrywa i określa proporcję mono- i di-ramnolipidów wytwarzanych przez każdy szczep. Kwantyfikacja całkowitych ramnolipidów polega na ocenie ekwiwalentów ramnozy obecnych w tych biosurfaktantach wyekstrahowanych z supernatantów hodowlanych metodą orcinolu.

Streszczenie

Bakteria środowiskowa Pseudomonas aeruginosa jest oportunistycznym patogenem o wysokiej oporności na antybiotyki, który stanowi zagrożenie dla zdrowia. Bakteria ta wytwarza wysoki poziom biosurfaktantów znanych jako ramnolipidy (RL), które są cząsteczkami o znacznej wartości biotechnologicznej, ale są również związane z cechami wirulencji. W związku z tym wykrywanie i oznaczanie ilościowe RL może być przydatne zarówno w zastosowaniach biotechnologicznych, jak i w biomedycznych projektach badawczych. W tym artykule demonstrujemy krok po kroku technikę wykrywania wytwarzania dwóch form RL wytwarzanych przez P. aeruginosa za pomocą chromatografii cienkowarstwowej (TLC): mono-ramnolipidów (mRL), cząsteczek utworzonych przez dimer kwasów tłuszczowych (głównie C10-C10) połączonych z jedną grupą ramnozy, oraz di-ramnolipidów (dRL), cząsteczek utworzonych przez podobny dimer kwasu tłuszczowego połączony z dwoma ugrupowaniami ramnozy. Dodatkowo przedstawiamy metodę pomiaru całkowitej ilości RL w oparciu o kwaśną hydrolizę tych biosurfaktantów wyekstrahowanych z supernatantu kultury P. aeruginosa, a następnie wykrywanie stężenia ramnozy, która reaguje z orcynolem. Połączenie obu technik można wykorzystać do oszacowania przybliżonego stężenia mRL i dRL wytwarzanych przez określony szczep, czego przykładem są szczepy typu PAO1 (filogrupa 1), PA14 (filogrupa 2) i PA7 (filogrupa 3).

Wprowadzenie

Pseudomonas aeruginosa jest bakterią środowiskową i oportunistycznym patogenem, który budzi duże obawy ze względu na wytwarzanie cech związanych ze zjadliwością i wysoką odporność na antybiotyki1^,2. Charakterystycznym metabolitem wtórnym wytwarzanym przez tę bakterię jest biosurfaktant RL, który jest wytwarzany w sposób skoordynowany z kilkoma cechami związanymi ze zjadliwością, takimi jak piocyjanina fenazynowa, antybiotyk o aktywności redoks i elastaza proteaza³. Właściwości tensjoaktywne i emulgujące RL zostały wykorzystane w różnych zastosowaniach przemysłowych i są obecnie skomercjalizowane⁴.

Większość szczepów P. aeruginosa, należących do filogrup 1 i 2, wytwarza dwa typy RL: mRL, który składa się z jednej grupy ramnozy połączonej z dimerem kwasu tłuszczowego głównie o 10 atomach węgla, oraz dRL, który zawiera dodatkowe ugrupowanie ramnozy połączone z pierwszym rhamnozą⁴ (zobacz Rysunek 1). Doniesiono jednak, że dwie pomniejsze filogrupy P. aeruginosa (grupy 3 i 5) wytwarzają tylko mRL^5,6. Te dwa typy RL zawierają mieszaninę dimerów kwasów tłuszczowych, które, jak wspomniano, są głównie C10-C10, ale wytwarzane są również mniejsze proporcje cząsteczek zawierających dimery C12-C10, C12-C12 i C10-C12:1. Opisano charakterystykę kongenerów RL wytwarzanych przez różne szczepy przy użyciu HPLC MS/MS: ^7,8. Metody opisane w tej pracy mogą jedynie rozróżnić mRL i dRL, ale nie mogą być stosowane do charakterystyki kongenerów RL.

P. aeruginosa i niektóre gatunki Burkholderia są naturalnymi producentami RL⁹, ale ta pierwsza bakteria jest najbardziej wydajnym producentem. Jednak komercyjnie stosowany RL jest obecnie wytwarzany w pochodnych Pseudomonas putida KT2440 eksprymujących geny P. aeruginosa, aby uniknąć stosowania tego oportunistycznego patogenu^10,11. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe RL wytwarzanego przez P. aeruginosa ma ogromne znaczenie dla badania mechanizmów molekularnych zaangażowanych w ekspresję cech związanych ze zjadliwością¹², w charakterystyce szczepów należących do kladów 3 lub 5¹³, oraz dla konstruowania pochodnych P. aeruginosa, które nadprodukują te biosurfaktanty, jednocześnie zmniejszając zjadliwość¹⁴. Wytwarzanie biosurfaktantów przez różne mikroorganizmy zostało wykryte na podstawie pewnych ogólnych cech tych związków, takich jak metoda zapadania się lub indeks emulgacji¹⁵, ale metody te nie są ani dokładne, ani specyficzne¹⁶.

Tutaj opisujemy protokół wykrywania mRL i dRL za pomocą płynnej ekstrakcji całkowitego RL z supernatantów kulturowych różnych szczepów typu P. aeruginosa i separacji obu typów RL za pomocą TLC. W tej metodzie RL wyekstrahowany z supernatantu hodowli jest rozdzielany przez ich różnicową rozpuszczalność w rozpuszczalnikach stosowanych do TLC, powodując różnicową migrację na płytce żelu krzemionkowego. W związku z tym mRL mają szybszą migrację niż dRL i można je wykryć jako oddzielne miejsca, gdy płytki są suszone i barwione α-naftolem.

Opisana tutaj metoda wykrywania mRL i dRL przez TLC opiera się na wcześniej opublikowanym artykule¹⁷, który jest łatwy do wykonania i nie wymaga drogiego sprzętu. Ta metoda była przydatna do wykrywania RL w różnych izolatach P. aeruginosa¹³ przy użyciu odpowiednich kontroli, takich jak mutant pochodzący z P. aeruginosa, który nie jest w stanie wytworzyć RL. Nie jest to jednak preferowana metoda charakteryzowania nowych biosurfaktantów wytwarzanych przez bakterie inne niż Pseudomonas aeruginosa ze względu na brak swoistości.

Dodatkowo, przedstawiono metodę ilościowego oznaczania ekwiwalentów ramnozy całkowitego RL wyekstrahowanego z supernatantu kultury P. aeruginosa. Metoda ta określa ilościowo te biosurfaktanty w oparciu o reakcję orcyny z cukrami redukcyjnymi, w wyniku czego otrzymujemy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 421 nm, jak opisano wcześniej¹⁸. Ponieważ reakcja z orcynolem nie jest specyficzna dla ramnozy, ważne jest, aby przeprowadzić tę metodę z RL wyekstrahowanym z supernatantu hodowli, który nie zawiera znacznych ilości innych cząsteczek zawierających cukier, takich jak lipopolisacharydy (LPS). Zakwaszona mieszanina chloroformu/metanolu jest tutaj używana do płynnej ekstrakcji RL¹⁸, ale można również użyć octanu etylu, a ekstrakcja do fazy stałej (SPE) daje bardzo dobre wyniki¹⁹. Opisana tutaj metoda orcynowa nie wymaga wyrafinowanego sprzętu i może zapewnić wiarygodne wyniki, jeśli zostanie wykonana ze szczególną starannością w przygotowaniu analizowanych próbek, jak wspomniano. Aby zapewnić prawidłowe przygotowanie próbki, ważne jest, aby uwzględnić mutanta Pseudomonas aeruginosa rhlA, który nie jest w stanie wytworzyć RL²⁰ oraz wykonać trzy powtórzenia biologiczne i trzy techniczne dla każdego oznaczenia.

W literaturze pojawiły się znaczące kontrowersje^16,21dotyczące oznaczania RL metodą orcinolu, przy czym niektóre badania sugerują, że produkcja RL jest przeszacowana i że test nie ma specyficzności dla ramnozy, potencjalnie wykrywając inne cukry. Pokazujemy jednak tutaj, że opisane metody mogą być dokładne i specyficzne w odpowiednich warunkach. Ponadto, w celu porównania z procedurami opisanymi w tym artykule, wykorzystujemy detekcję UPLC-MS/MS wzorca dRL i wykazujemy, że podobne wyniki uzyskuje się metodą orcinol. Szczegółowy protokół ilościowego oznaczania RL przy użyciu tej metody znajduje się w pliku uzupełniającym 1.

Te protokoły są zilustrowane przy użyciu szczepów typu PAO1 (filogrupa 1), PA14 (filogrupa 2) i PA7 (filogrupa 3). Szczepy te zostały wybrane, ponieważ są dobrze scharakteryzowane i wytwarzają różne profile RL.

Protokół

Ta procedura jest schematycznie opisana na rysunku uzupełniającym 1. Odczynniki i sprzęt używany do badania są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Wykrywanie mRL i dRL w supernatantach hodowlanych P. aeruginosa za pomocą TLC

1. Zacznij od odwirowanego bulionu interesującego szczepu P. aeruginosa, uprawianego w płynnym podłożu przez 24 godziny (aby osiągnąć stacjonarną fazę wzrostu, w której wytwarzany jest RL). Zazwyczaj kultury te zawierają 1 x 10⁹ bakterii na ml.
2. Dostosuj pH kultury do 2 za pomocą stężonego HCl.
3. Umieścić 5 ml zakwaszonego supernatantu hodowli w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml i dodać 5 ml mieszaniny chloroformu: metanol w stosunku 2:1.
4. Mieszaj probówkę przez odwrócenie trzy razy, za każdym razem przez 10 s, i pozostaw probówkę bez odwrócenia na 2 minuty między każdym mieszaniem.
5. Pozostawić probówkę bez mieszania na około 3 godziny, aż obie fazy zostaną oddzielone, lub odwirować probówkę przez 10 minut w temperaturze 3 000 x g w temperaturze 4 °C.
6. Przenieś fazę organiczną (dolna warstwa) do czystej probówki i pozostaw probówkę w okapie ekstrakcyjnym do momentu wyschnięcia.
7. Powtórzyć proces, zaczynając od kroku 1.3, umieszczając fazę organiczną z drugiego chloroformu: ekstrakcji metanolem do probówki, która została użyta w pierwszej ekstrakcji.
8. Odparować fazę organiczną, aż pozostanie 1 ml lub 1,5 ml. Przenieś tę objętość do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odparuj rozpuszczalnik do sucha przez noc.
9. Dodać 50 μl metanolu do wysuszonej probówki w celu ponownego zawieszenia RL.
10. Przeprowadzić chromatografię cienkowarstwową na płytkach z żelem krzemionkowym.
    UWAGA: Rozmiar płytki TLC należy przyciąć zgodnie z liczbą próbek, które będą analizowane. Każdą próbkę należy nanieść na odległość 1,5 cm, a punkt aplikacji powinien znajdować się 1 cm od krawędzi płytki (narysuj poziomą linię ołówkiem).
11. Nanieść 5 μl każdej próbki za pomocą mikropipety o pojemności 10 μl.
12. Faza ciekła TLC składa się z mieszaniny chloroformu: metanol: kwas octowy w proporcji 65:15:2. Aby przygotować 35 ml tej mieszaniny, zmieszaj 26 ml chloroformu, 6 ml metanolu i 0,8 ml 20% roztworu podstawowego kwasu octowego. Wymieszać te rozpuszczalniki i umieścić je w zamkniętej komorze TLC na co najmniej 10 minut przed rozpoczęciem chromatografii, tak aby atmosfera była nasycona lotnymi rozpuszczalnikami.
13. Umieścić płytkę TLC w komorze, unikając kontaktu z punktem, w którym nałożono próbki.
14. Zamknąć komorę i pozostawić TLC do momentu, gdy rozpuszczalnik osiągnie 1 cm przed krawędzią płytki. W tym momencie wyjmij płytkę i pozostaw ją do wyschnięcia (można zastosować przepływ powietrza, aby przyspieszyć proces).
15. Przygotować roztwór α-naftolu, rozpuszczając 5 g tego związku w 33 ml etanolu. Po rozpuszczeniu dodaj 127,5 ml etanolu, 12,6 ml wody i 20,5 ml zimnego_H2SO4.
16. W celu wykrycia obecności mRL i dRL należy rozpylić roztwór α-naftolu na płytkę w okapie ekstrakcyjnym i umieścić spryskaną płytkę w suszarce w temperaturze 85 °C na kilka minut, aż pojawi się różowawy ślad RL.
17. Użyj obrazu TLC, aby obliczyć proporcję mono- i di-RL obecnych w każdej próbce za pomocą oprogramowania, które wykrywa gęstość każdej plamki.

2. Kwantyfikacja całkowitej ilości RL mierząca ekwiwalenty ramnozy obecne w biosurfaktancie

1. Umieścić 1,2 ml kultury w fazie stacjonarnej (hodowanej przez 24 godziny) w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i wirować przez 3 minuty przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant w czystej probówce.
2. Przenieść 333 μl do czystej probówki (wykonać ten krok trzykrotnie) i dodać 1 ml eteru.
3. Energicznie mieszaj w wirze przez 30 sekund. Powtórz tę procedurę z jedną rurką na raz.
4. Wirować przez 2 minuty przy 3 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać fazę organiczną (faza górna), przenieść ją do czystej probówki i pozostawić otwartą w okapie ekstrakcyjnym do momentu wyschnięcia.
5. Powtórzyć ekstrakcję eterem zgodnie z opisem w kroku 2.2. Powtórz kroki 2.3 i 2.4.
6. Po całkowitym wysuszeniu dodaj 1 ml wody do każdej probówki. Pozostaw probówki na 12 godzin, aby RL mógł się nawodnić, a następnie energicznie wymieszaj w wirze.
7. Umieścić czystą kolbę w lodzie na 5 minut (ponieważ jest to reakcja egzotermiczna). Przygotować roztwór 60% H_2SO4 (chronić kolbę przed światłem).
8. W czystej probówce przygotuj 1,6% roztwór orcyny w wodzie destylowanej. Aby przygotować odczynnik orcyny, zmieszaj 4,4 ml 60% roztworu H_2SO4 z 0,6 ml 1,6% roztworu orcyny.
9. Obliczyć końcową objętość potrzebnego odczynnika orcyny. Dodać 900 μl tego odczynnika do każdej próbki i do każdego stężenia krzywej kalibracyjnej, stosując różne stężenia ramnozy (zazwyczaj stosuje się 9 stężeń ramnozy w zakresie od 1 μg/ml do 9 μg/ml) i jedno ze 100 μl wody, upewniając się, że wszystkie są wykonywane w trzech powtórzeniach.
10. Dodać 100 μl każdej próbki RL do 900 μl odczynnika orcyny w szklanej probówce i wymieszać oba roztwory.
11. Inkubować przez 30 minut w łaźni wodnej podgrzanej do temperatury 80 °C.
12. Pozwól rurkom ostygnąć do temperatury pokojowej.
13. Odczytać absorbancję próbek i krzywą kalibracyjną przy długości fali 421 nm za pomocą ogniwa kwarcowego.
14. Obliczyć stężenie ramnozy w każdej próbce, interpolując absorbancję na krzywej kalibracyjnej i biorąc pod uwagę objętość użytą do oznaczenia.
15. Aby obliczyć stężenie μM, podziel stężenie uzyskane w μg/ml przez 182,2 (masa cząsteczkowa ramnozy) i pomnóż przez 1000.

Wyniki

W niniejszym artykule wykorzystano trzy różne szczepy typowe P. aeruginosa reprezentujące trzy filogrupy, z których każda charakteryzuje się różnym poziomem produkcji RL oraz różnymi proporcjami mRL i dRL. Szczepy te obejmują PAO1 (izolat z rany z Australii, 1955²²), PA14 (izolat roślinny z USA, 1977²³), oraz PA7 (izolat kliniczny z Argentyny, 2010²⁴). Jako kontrolę negatywną zastosowano szczep PAO1 rhlA wykorzystano mutant, który nie jest z...

Dyskusja

Najdokładniejszą metodą wykrywania i ilościowego oznaczania RL jest HPLC sprzężona ze spektrometrią mas (MS)^7,8,27; Wymaga to jednak specjalistycznego i drogiego sprzętu, który może nie być dostępny dla wielu badaczy. Opisane tutaj metody mogą być rutynowo wykonywane przy użyciu podstawowych materiałów i sprzętu laboratoryjnego w celu wykrywania i szacowania stężeń RL, ale mają pewne ograniczenia, w szczególności ich niedokładno...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
KWAS OCTOWY	J.T. BAKER	9508-02
WIRÓWKA			Do probówek do wirowania 1,5 ml i  50
mL CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
ETER DO PIECA
	J.T. BAKER	9244-02
SZKLANA PIPETA	SIGMA-ALDRICH
KWAS SOLNY	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RAMNOZA MONOHYDRAT	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRAT	SIGMA-ALDRICH	O1875
Bulion			Tris HCL (0,12 M), Chlorek potasu ( 0,02 M) Chlorek amonu (0,02 M),  Pepton (1%), pH 7,4    Autoklawowane. Dodaj  Glukoza (5%) i siarczan magnezu (0,0016M)
KOMÓRKA KWARCOWA (KUWETA)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
PROSTOKĄTNY TLC ROZWIJAJĄCY ZBIORNIK	FISHER SCIENTIFIC
RAMNOLIPIDY	SPEKTROFOTOMETR
OPRYSKIWACZ	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
KWAS SIARKOWY	JT BAKER	9681-02
TES PROBÓWKI 5mL	CORNING	352002
TLC ŻEL KRZEMIONKOWY 60 F254	MERCK	1.05554.0001
			> 80 ° Z

SUSZĄCEGO CLS706510 PPGAS K4161801020 SIGMA-ALDRICH R-90 VIS ŁAŹNIA WODNA