Test aktywnego unikania miejsc (APA), skuteczne, wszechstronne i powtarzalne zadanie uczenia się przestrzennego dla myszy

Summary

W tym miejscu przedstawiamy protokół testu aktywnego unikania miejsc, zależnego od hipokampa paradygmatu uczenia się przestrzennego przeznaczonego dla gryzoni. Zmiana kluczowych parametrów pozwala na ponowne badanie zwierząt przed i po zabiegach lub w czasie.

Abstract

Uczenie się przestrzenne zależne od hipokampa u gryzoni zostało przetestowane przy użyciu różnych metod. Należą do nich zadania labiryntu wodnego Morrisa (MWM), labiryntu Y i lokalizacji nowych obiektów (NOL). Niedawno zadanie aktywnego unikania miejsc (APA) zostało opracowane jako alternatywa dla tych bardziej tradycyjnych podejść. W zadaniu APA myszy muszą używać wskazówek przestrzennych umieszczonych wokół obracającej się areny, aby uniknąć stacjonarnej strefy szoku. Ze względu na wiele parametrów, które można dostosować, wykazano, że zadanie APA jest bardzo wszechstronnym podejściem. Nadaje się do stosowania podłużnego i wielokrotnie dla tej samej kohorty myszy. W tym miejscu udostępniamy szczegółowy protokół, aby pomyślnie przeprowadzić zadanie APA. Zwracamy również uwagę na alternatywne podejścia APA, które można wykorzystać do zbadania różnych elementów uczenia się przestrzennego. Opisujemy procesy zbierania i analizy danych. Omówiono krytyczne kroki podczas zadania APA, aby zwiększyć prawdopodobieństwo pomyślnego przeprowadzenia testu. Zadanie APA ma kilka zalet w porównaniu z bardziej tradycyjnymi testami nawigacji przestrzennej. Nadaje się do stosowania u myszy w podeszłym wieku lub z fenotypami choroby, takimi jak choroba Alzheimera. Złożoność zadania można łatwo zmienić, co pozwala na przetestowanie szerokiej gamy szczepów myszy. Co więcej, zadanie APA nadaje się do testowania zwierząt, które przeszły operację lub interwencje eksperymentalne, które mogły wpłynąć na funkcje motoryczne lub nerwowe, takie jak udar lub urazowe uszkodzenie mózgu.

Introduction

Aktywne unikanie miejsc (APA) jest skutecznym narzędziem do testowania uczenia się przestrzennego zależnego od hipokampa u gryzoni 1,2,3,4. Podczas zadania APA zwierzę jest umieszczane na obracającej się arenie i musi używać wskazówek wizualnych, aby zorientować się i uniknąć strefy szoku awersyjnego⁵. Obrót areny zapewnia, że mysz nie jest w stanie użyć idiotycznego podejścia do nawigacji, ani nie można używać znaków zapachowych, ponieważ te wskazówki obracają się na platformie, podczas gdy strefa szoku pozostaje nieruchoma⁵. Zmiana prędkości i kierunku areny, a także lokalizacji strefy szoku i wskazówek wizualnych, pozwala na wielokrotne ponowne testowanie myszy ^6,7,8. APA oferuje kilka wyraźnych zalet w porównaniu z labiryntem wodnym Morrisa (MWM), jednym z najczęściej używanych testów uczenia się przestrzennego. Co ważne, myszy mają awersję do pływania i uważają zadanie MWM za niezwykle stresujące⁹. Co więcej, doniesiono, że starsze myszy unoszą się na wodzie podczas zadania^{MWM 10}, co w wielu przypadkach czyni je nieodpowiednim jako zadanie uczenia się przestrzennego. Co więcej, ponieważ zadanie MWM wymaga ukrytej, zanurzonej platformy, którą myszy mogą zlokalizować podczas testów. Wymaga to, aby woda była nieprzezroczysta, co zwykle osiąga się poprzez dodanie białej farby. Śledzenie i analiza zwierząt podczas zadań behawioralnych wymaga wystarczającego kontrastu między obiektem a otoczeniem, co wyklucza niektóre szczepy myszy, takie jak Swiss lub BALB/c, z testowania w MWM. W zadaniu APA problem ten jest omijany poprzez dodanie czarnego plastiku pod siatką.

Wiele paradygmatów APA zostało zaprojektowanych w celu przetestowania uczenia się przestrzennego, demonstrując jego użyteczność jako skutecznego narzędzia behawioralnego. Na przykład nabywanie, zapamiętywanie i utrwalanie uczenia się przestrzennego odbywa się zazwyczaj poprzez codzienne testowanie zwierząt, które może trwać od 3 do 5 dni 6,7,11,12. Pamięć i uczenie się są określane ilościowo poprzez porównanie liczby wstrząsów otrzymywanych każdego dnia akwizycji. Czas do pierwszego wejścia i maksymalny czas unikania strefy szoku są również ważnymi parametrami, które można wykorzystać do określenia zmian w zdolności uczenia się podczas zadania. Alternatywnie, przestrzenną pamięć roboczą można przetestować, przeprowadzając pojedynczą, 30-minutową sesję^{APA 2,13}, w której uczenie się przestrzenne jest mierzone jako zmiany wewnątrz sesji, porównując wydajność, taką jak liczba wstrząsów, w 5-minutowych przedziałach.

W tym artykule opisujemy zadanie APA i podkreślamy kluczowe cechy, które należy wziąć pod uwagę podczas przeprowadzania tego testu uczenia się przestrzennego.

Protocol

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Uniwersytetu Queensland zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych Australii (numer zgody: QBI/189/15).

1. Konfiguracja pokoju APA

UWAGA: Aparat APA składa się z podwyższonej areny z metalową siatkową podłogą otoczoną przezroczystą okrągłą granicą o wysokości 32 cm. Metalowe pręty są równomiernie rozmieszczone (0,5 cm od siebie) i mają średnicę 0,3 cm.

1. Upewnij się, że aparat APA znajduje się w ramie kamery zamontowanej na suficie. Śledź mysz za pomocą dostępnego na rynku oprogramowania do śledzenia zwierząt.
2. Arena APA zazwyczaj obraca się z prędkością 1 obr./min, a w obracającej się arenie ustawiona jest wstępnie wyznaczona stacjonarna strefa uderzeniowa 60°. Gdy mysz znajdzie się w strefie wstrząsu, zapewnij łagodny wstrząs stopy o natężeniu 0,5 mA (60 Hz, 500 ms).
3. Upewnij się, że lokalizacja strefy wstrząsu pozostaje stała podczas testowania i jest ustawiana elektronicznie w konfiguracji eksperymentalnej. Obrotowa arena przenosi mysz do strefy wstrząsu, chyba że mysz aktywnie się porusza, aby jej uniknąć.
4. Umieść cztery nowatorskie wskazówki wizualne na czterech różnych ścianach pomieszczenia na tej samej wysokości co obrotowa platforma, zwykle w odległości 30-50 cm od areny. Upewnij się, że wskazówki mają neutralne kolory, takie jak czarno-białe symbole lub kształty wydrukowane na papierze A3 i zalaminowane w celu łatwego czyszczenia (Rysunek 1A).
5. Upewnij się, że natężenie światła w pomieszczeniu wynosi od 30 do 70 luksów. Zwiększenie natężenia światła wywołuje zachowania podobne do lęku i ogranicza eksplorację.
6. Przed rozpoczęciem otwórz program Tracker i wybierz zadanie APA.
7. W oknie Options for Tracker 2D (Opcje modułu śledzącego 2D) wybierz kartę Experiment (Eksperyment ). W tym miejscu upewnij się, że wybrano opcję Unikanie umieszczania - Jedna klatka - Tylko pozycja . Umożliwi to skonfigurowanie wymaganych parametrów. Zapisz plik konfiguracyjny i dostosuj go zgodnie z wymaganiami.
8. Na karcie Eksperyment ustaw czas trwania eksperymentu w polu Czas eksperymentu . Typowy czas trwania eksperymentu to 600 s lub 10 minut.
9. Upewnij się, że wybrano opcję Włącz czasomierz . Zmień parametry wstrząsu w regionie timera, jak omówiono powyżej.
10. Wprowadź typowe szczegóły eksperymentu w miejscu przewidzianym w obszarze Ramka pomieszczenia na karcie Eksperyment . Na przykład upewnij się, że domyślna nazwa pliku wyjściowego jest wypełniona datą, prostym identyfikatorem eksperymentalnym i dniem testowania. Zakończ nazwę znakiem podkreślenia "_", aby umożliwić dodanie unikalnego identyfikatora myszy podczas eksperymentu.
11. W obszarze Ramki pomieszczenia znajduje się również zakładka Cele . Kliknij przycisk Edytuj , aby upewnić się, że cała arena znajduje się w obszarze zainteresowania. Następnie wybierz opcję Łuk , aby zapewnić regulowane parametry dla rozmiaru i lokalizacji strefy docelowej wstrząsu (Rysunek 1B).
12. Otwórz kartę Śledzenie , aby dostosować parametry, aby zapewnić pomyślne śledzenie myszy. Pole kontrastu ma opcje Ciemne lub Jasne, aby umożliwić zarówno myszy ciemne (np. C57Bl/6), jak i jasne (np. BALB/c). Tworzy to skuteczny kontrast między tłem a myszami. Używając szczepów myszy albinosów, umieść kawałek czarnego plastiku pod areną, aby umożliwić uzyskanie tego kontrastu (ryc. 2).
13. Ustaw rozmiar myszy i zakresy obszaru w tym regionie. Ustaw te parametry, aby skutecznie rozpoznawać mysz na arenie. Alternatywnie można je ustawić po naciśnięciu przycisku From Calibrator (Z kalibratora ).
14. Wybierz przycisk Z kalibratora , aby upewnić się, że arena znajduje się całkowicie w masce obszaru zainteresowania.
    1. Uruchom arenę w tej zakładce, aby upewnić się, że gdy arena się obróci, arena pozostanie w masce. Ta zakładka ma również kluczowe znaczenie dla wyboru odpowiedniego progu kontrastu. Przesuń czerwoną linię w okienku Próg , aby dostosować próg kontrastu.
       UWAGA: Rysunek 3A przedstawia optymalny wybór progu, o czym świadczy ciągły pomarańczowy obszar i niebieski "X" w miejscu, w którym znajduje się mysz. Słaby próg jest pokazany na rysunku 3B i pokazuje tylko nakrapiane pomarańczowe plamki i brak "X".
15. Użyj zakładki Urządzenia i ustaw kierunek obrotu i prędkość areny za pomocą przycisku prędkości. Wybierz zarówno prędkości dodatnie, jak i ujemne, reprezentujące obroty w prawo i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. Ustaw intensywność wstrząsu w sekcji Bieżące źródło . Najczęstszym ustawieniem dla myszy jest obrót o 1 obr./min i wstrząs 0,5 mA.
16. Zmień sposób i czas dostarczania wstrząsów w zakładce Bieżące źródło .
    1. Upewnij się, że tryb Bieżący jest wybrany na Zależne od śledzenia. Spowoduje to porażenie prądem, gdy mysz znajdzie się w strefie wstrząsu.
    2. Wybierz opcję Czas , aby wywołać wstrząsy w przedziale czasu ustawionym przez użytkownika. Użyj wcześniej nagranych ścieżek, aby zaszokować myszą, wybierając opcję Z pliku. Ma to na celu zapewnienie myszy kontrolnej z jarzmem poddanej identycznej liczbie wstrząsów o tym samym czasie trwania i intensywności, niezależnie od uczenia się przestrzennego.
       UWAGA: Karty Wyjście pliku i Okno umożliwiają zapisywanie danych i plików wideo w określonym katalogu. Przycisk From Image (Z obrazu ) na karcie File Output (Wyjście pliku ) umożliwia również wybranie obszaru zainteresowania w celu przechwycenia całej areny, która ma zostać wybrana.
17. Wycofaj się za kurtynę i rozpocznij próbę. Obecność eksperymentatora w pobliżu wybiegu i wszelki zbędny hałas mogą mieć wpływ na wydajność zwierząt.
18. Upewnij się, że wszelkie dźwięki i zapachy są ograniczone podczas próby, co może stanowić kolejną wskazówkę dla myszy, wpływając na jej wydajność. Przykłady, aby zminimalizować ten problem, obejmują zapewnienie zamkniętego pojemnika na odpady kliniczne, korzystanie z pomieszczeń oddzielonych od hałaśliwych przestrzeni laboratoryjnych oraz dokładne czyszczenie sprzętu między myszami. Naukowcy mogą rozważyć użycie generatora białego szumu do maskowania niepowiązanych dźwięków zewnętrznych.
19. Niech ściółka w klatce domowej pozostanie taka sama przez cały okres testów behawioralnych, ponieważ może to zapewnić nową stymulację i wpłynąć na zachowanie.
20. Aby uniknąć zmian dobowych, przeprowadzaj testy o stałej porze każdego dnia.

2. Przyzwyczajenie do obchodzenia się z eksperymentatorem

1. Dotykaj każdej myszy codziennie przez 30 s do 1 minuty przez co najmniej 2-3 dni przed badaniem. Obchodzenie się ze zwierzętami znacznie zmniejsza stres i zachowania związane z lękiem podczas testów.
2. Używaj tego samego fartucha laboratoryjnego i unikaj używania silnych dezodorantów, wód kolońskich lub perfum podczas habituacji i testów.

3. Przyzwyczajenie do areny APA (1 dzień)

1. Przynieś mysz do przedpokoju lub pokoju testowego w celu przyzwyczajenia. Pozostaw mysz do przyzwyczajenia się na co najmniej 30 minut. Ustaw natężenie światła w przedpokoju lub pomieszczeniu testowym, zanim myszy zostaną przyprowadzone, aby się przyzwyczaić.
2. Skonfiguruj oprogramowanie Tracker.
   1. Utwórz folder specyficzny dla eksperymentu. W zależności od paradygmatu eksperymentalnego, należy mieć osobne foldery dla każdego dnia lub próby. Skonfiguruj konfiguracje eksperymentu zgodnie z powyższym opisem i zapisz te konfiguracje, aby użyć ich w przyszłości.
   2. Przed rozpoczęciem okresu próbnego otwórz zapisaną konfigurację klikając kartę Plik , następnie kliknij symbol Zapisz , dodaj unikalny identyfikator myszy w nowo otwartym oknie i uruchom wersję próbną, naciskając kartę Odtwórz .
3. Przyzwyczaj mysz do aparatu APA, wystawiając ją na działanie obracającej się areny przez 5 minut bez wywoływania wstrząsów.
4. Wyjmij mysz z klatki domowej, podnosząc ją z podstawy ogona i delikatnie kładąc na dłoni w rękawiczce. Przenieś mysz do aparatu APA i umieść ją z dala od strefy wstrząsu, przodem do ściany.
5. Wycofaj się za kurtynę i rozpocznij próbę.
6. Po zakończeniu testów wyjmij mysz i wróć do klatki domowej.
7. Zbierz cały mocz i odchody, a następnie dokładnie wyczyść siatkę 80% (v/v) etanolem.
8. Powtórz kroki 3.4-3.7 dla wszystkich myszy.

4. Szkolenie akwizycyjne z wykorzystaniem APA (1-6 dni)

1. Ustaw oświetlenie w pomieszczeniu na identyczne warunki, jak w dniu przyzwyczajenia.
2. Wprowadź mysz do przedpokoju lub pokoju testowego i pozwól jej się przyzwyczaić przez co najmniej 30 minut.
3. Skonfiguruj oprogramowanie Tracker zgodnie z powyższym opisem.
4. Ustaw czas trwania wersji próbnej.
5. Upewnij się, że źródło prądu jest włączone i ustawione (tj. 0.5 mA).
6. Umieść mysz na arenie z dala od strefy szoku i przodem do ściany.
7. Wycofaj się za kurtynę i rozpocznij próbę, naciskając przycisk odtwarzania . Monitoruj mysz na ekranie komputera i interweniuj w razie potrzeby. Na przykład mysz nie otrzymuje wstrząsów lub wydaje się nadmiernie zestresowana, o czym świadczy nadmierne skakanie lub wokalizowanie.
8. Po zakończeniu testów wyjmij mysz i wróć do klatki domowej.
   UWAGA: Upewnij się, że myszy odbierają wstrząsy i reagują na nie. Myszy reagują na szok, cofając się i wokalizując. Jeśli tak nie jest, mogą nie odczuwać szoku. Może to być spowodowane odchodem na siatce lub nieodpowiednim śledzeniem. Dlatego niezbędne jest czyszczenie siatki po każdej próbie i optymalizacja śledzenia myszy, jak omówiono powyżej.

5. Szkolenie w zakresie akwizycji odwróconej (opcjonalnie, 1-6 dni)

1. W zadaniu odwrócenia przesuń strefę wstrząsu w nowe miejsce, zwykle 180° od poprzedniej pozycji. Oceń zdolność myszy do elastycznego uczenia się lokalizacji nowej strefy szoku. Wskazówki pomieszczenia zazwyczaj nie są zmieniane podczas uczenia się odwróconego.
2. Powtórz kroki 3.4-3.7 dla wszystkich myszy.

6. Próba sondy (opcjonalnie, 1 dzień)

1. W próbie z sondą zmierz czas do pierwszego wejścia i/lub maksymalny czas unikania strefy wstrząsu.
   UWAGA: Wskazuje to na konsolidację pamięci po fazie akwizycji. Dobrze wyszkolona mysz będzie unikać wchodzenia w strefę szoku przez dłuższy czas (>60 sekund), wykazując oznaki uczenia się przestrzennego.
2. Ustaw natężenie światła w pomieszczeniu jak w dniu treningu akwizycyjnego.
3. Przyzwyczaj mysz w pokoju testowym lub przedpokoju przez 30 minut.
4. Skonfiguruj oprogramowanie Tracker.
5. Ustaw czas trwania próby na ten sam czas, co poprzednio przeprowadzony okres testowania (na przykład 10 minut lub 30 minut, w zależności od parametrów próby).
6. Nie należy dostarczać wstrząsów w tej próbie.
7. Umieść mysz po przeciwnej stronie strefy szoku awersyjnego, przodem do ściany.
8. Rozpocznij próbę i wycofaj się za kurtynę.
9. Upewnij się, że mysz jest skutecznie śledzona.
10. Monitoruj mysz na ekranie komputera i zatrzymaj próbę, gdy wejdzie w strefę szoku. Niektórzy badacze wolą kontynuować próbę przez 5 minut, aby sprawdzić, czy mysz nadal wraca do strefy szoku.
11. Delikatnie podnieś mysz i wróć do klatki domowej.
12. Upewnij się, że cały mocz i odchody zostały zebrane, a siatka jest dokładnie oczyszczona 80% (v/v) etanolem.

7. Analiza torów

UWAGA: Wykonanie zadania można osiągnąć za pomocą różnych programów śledzących. Poniżej opisano, w jaki sposób dołączone oprogramowanie jest wykorzystywane do określania wydajności podczas zadania APA. W tym przypadku dane są analizowane za pomocą programu Track Analysis .

1. Aby przeanalizować dane, otwórz program Track Analysis i wybierz Unikanie z menu rozwijanego w oknie głównym.
2. Kliknij Dodaj zadanie , aby przesłać pliki danych zapisane podczas fazy akwizycji w nowym oknie. W polu Nazwa grupy utwórz grupę do przeanalizowania, np. Dzień 1 lub czas analizy.
3. Kliknij katalog wyjściowy, aby wybrać lokalizację, w której mają zostać zapisane analizowane dane.
4. Dodaj pliki do analizy, klikając zakładkę Dodaj pliki i wybierając pliki z dysku lokalnego.
5. Ustaw czas do analizy, klikając zakładkę Ustaw czas . Daje to możliwość zdefiniowania okresu, który będzie analizowany, tj. od 0 do 600 s. Alternatywnie przeanalizuj dane w pojemnikach, tj. 60 s.
6. Po dodaniu wszystkich ścieżek kliknij kartę Analiza i wybierz opcję Uruchom analizę , aby przeanalizować dane. W wyniku analizy powstanie kilka folderów. Dane do analizy będą znajdować się w folderze TBLfiles . Otwórz te pliki danych w arkuszu kalkulacyjnym i wykorzystaj je do dalszej analizy, tj. porównania parami lub powtarzanych pomiarów ANOVA.
   UWAGA: W wyniku analizy powstaną również inne foldery, w tym pliki PS, które będą zawierały jednostronicowy opis myszy podczas testów, pokazujący mapę śladów i miejsca, w których wstrząsy zostały odebrane.

Results

Myszy z nienaruszoną zdolnością uczenia się przestrzennego będą wykazywać zmniejszenie liczby wstrząsów podczas kolejnych prób akwizycji (Figura 4A). Podobnie, maksymalny czas unikania strefy wstrząsu wydłuży się, gdy mysz nauczy się skutecznie opuszczać strefę wstrząsu (Rysunek 4B). Jednak myszy, które nie są w stanie nauczyć się skutecznej strategii unikania, będą wykazywać stałą liczbę wstrząsów dla każdej próby akwizycji (Figura 4A). Często myszy, które nie identyfikują strefy szoku, otrzymują wiele wstrząsów podczas każdego wejścia do strefy. Mapy śladów są przydatne, aby przedstawić przykłady myszy, które uczą się unikać strefy szoku (rysunek 4C) i tych, które nie są w stanie uniknąć strefy szoku (rysunek 4D). W obu przypadkach te mapy śladów reprezentują ostatni dzień pozyskania. Mysz na rysunku 4C otrzymała tylko 2 wstrząsy, reprezentowane przez dwa okręgi. Zauważ również, że mapa śledzenia pokazuje, że mysz spędza większość czasu po przeciwnej stronie strefy szoku, która jest reprezentowana przez czerwony klin. I odwrotnie, mysz na rysunku 4D otrzymała więcej wstrząsów, a mapa śladów ujawnia nieuporządkowany wzór. Przykładami myszy, które nie są w stanie skutecznie nauczyć się unikać strefy szoku, są te, które mają zmniejszoną neurogenezę hipokampa z powodu starszego wieku, jak pokazano na przykładzie 18-miesięcznych myszy (Figura 4A, B- zmodyfikowana z Blackmore i wsp., 2021⁷), chemicznej ablacji niedojrzałych neuronów⁶ lub zmian w hipokampie (patrz Codd i wsp., 2020)⁸.

Ważne jest, aby odróżnić nieudaną próbę spowodowaną tym, że mysz nie uczy się, a awarią w konfiguracji sprzętu. Dwie najczęstsze przyczyny słabych wyników spowodowanych awarią sprzętu to słabe śledzenie myszy (Rysunek 5A) lub brak wstrząsu myszy. Słabe śledzenie może zapobiec porażeniu myszy, gdy znajduje się ona w strefie wstrząsu. Alternatywnie, słabe śledzenie może niedokładnie wywołać szok, gdy mysz nie znajduje się w strefie. W obu przypadkach uniemożliwi to myszowi opracowanie skutecznej strategii unikania. Słabe śledzenie można rozwiązać, dostosowując próg w zakładce "Z kalibratora". Słabe śledzenie jest zwykle definiowane jako ponad 1000 uszkodzonych klatek w ciągu 10 minut i występuje bardzo rzadko. Słabe śledzenie może stać się problemem u starszych myszy, u których może rozwinąć się łysienie. Na doznanie wstrząsu mysz zareaguje albo napięciem, albo czasami wokalizacją. Mysz zazwyczaj porusza się, nawet nieznacznie, i można ją zobaczyć w oprogramowaniu do śledzenia na żywo. Gdy mysz pozostaje idealnie nieruchomo w strefie wstrząsu, zostanie wyświetlona wyraźna linia wstrząsów (Rysunek 5B). Może to być spowodowane tym, że skrzynka amortyzatora nie jest włączona lub odchodem utknął między prętami, zmniejszając amplitudę wstrząsu dostarczanego zwierzęciu.

Rysunek 1: Aparatura APA, pomieszczenie behawioralne i ustawienie strefy wstrząsu. (A) Przykład areny testowej i konfiguracji pomieszczenia. Aparat APA jest podniesiony i umieszczony w centrum pomieszczenia, otoczony nowatorskimi wskazówkami wizualnymi. Czarno-białe wskazówki wizualne są używane na tej samej wysokości co platforma. (B). Funkcja Cel w zakładce Eksperyment pozwala na maskowanie całej areny i tworzenie lokalizacji strefy szoku. W tym przykładzie strefa szoku, reprezentowana przez czerwony klin, została utworzona pod kątem 270°. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Konfiguracja APA dla szczepów myszy albinosów. Arenę APA można skonfigurować dla odmian myszy albinosów, takich jak BALB/c, wybierając opcję Światło na karcie Śledzenie i tworząc czarne tło areny. Mysz albinosa na czarnym tle osiąga wysoki kontrast i zapewnia lepsze śledzenie myszy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Dostosowanie progu śledzenia myszy jest niezbędne. Próg ten musi być odpowiednio dostosowany, aby zapewnić prawidłowe śledzenie zwierząt podczas badania. Próg jest dostosowywany poprzez przesunięcie czerwonej linii w okienku progu na karcie Z kalibratora . (A) Przykład dobrego wyboru progu z ciągłym pomarańczowym obszarem i niebieskim znakiem X na obiekcie. (B) Słaby próg z nakrapianym pomarańczowym kolorem. Słabe śledzenie prowadzi do utraty zwierzęcia na arenie lub zapobiega doznaniu wstrząsu przez mysz, gdy znajduje się w strefie szoku. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Porównanie wydajności między młodymi (10 tygodni) i starszymi (18 miesięcy) myszami na 5-dniowym paradygmacie uczenia się i mapach Trace. (A) 10-tygodniowe myszy otrzymały znacznie mniej wstrząsów w porównaniu z 18-miesięcznymi myszami podczas 5 dni testów; Należy zauważyć, że różnica w liczbie otrzymanych wstrząsów była minimalna w pierwszym dniu testów między grupami, ale młode myszy z nienaruszoną pamięcią nauczyły się unikać wejścia w strefę szoku szybciej niż starsza grupa. (B) Maksymalny czas unikania został obliczony jako maksymalny czas spędzony na unikaniu wstrząsu podczas 10-minutowej próby. Młodsze myszy szybko nauczyły się unikać wchodzenia w strefę szoku w porównaniu ze starszymi myszami, co sugeruje, że młode myszy uczą się skutecznie. (C) Mysz na tej mapie śladów otrzymała tylko dwa wstrząsy, tak jak są one reprezentowane przez dwa okręgi w tej próbie akwizycji. Mysz ta spędzała również więcej czasu na arenie naprzeciwko strefy szoku, która jest reprezentowana przez czerwony klin. (D) Mysz ta otrzymała więcej wstrząsów i spędziła więcej czasu w pobliżu strefy szoku, co sugeruje, że uczenie się przestrzenne nie zostało osiągnięte u tej myszy. Do zbadania istotności wykorzystano dwukierunkową, powtarzaną miarę ANOVA z testami post hoc Bonferroniego. p<0,0001. Panele A i B zostały zmodyfikowane z Blackmore et ^al.7. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Mapy śledzenia dostarczają ważnych informacji dla każdej myszy podczas każdej próby. (A) Zwróć uwagę na linie proste, które są obecne w tym przykładzie śledzenia. Wynika to z tego, że oprogramowanie śledzące nieprawidłowo identyfikuje mysz podczas zadania. (B) Przykład dobrego śledzenia podczas badania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Wizualizacja ścieżek i mapa cieplna w różnych programach do śledzenia zwierząt. Zarówno (A) Program 1, jak i (B) Program 2 wykrywają lokalizację i ruch zwierzęcia w celu utworzenia wykresów śladów w celu wizualnego sprawdzenia, czy zwierzę uczy się zadania lub efektu leczenia eksperymentalnego. Oba programy pokazują identyczne wykresy śladów zwierzęcia, które skutecznie nauczyło się zadania. oraz Można również utworzyć mapę cieplną, która ułatwia identyfikację gorących punktów i grupowanie punktów danych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Podsumowując, test aktywnego unikania miejsc jest skutecznym zadaniem uczenia się przestrzennego, które można zastosować na różnych szczepach myszy i warunkach eksperymentalnych. Zadanie APA pokonuje ograniczenia związane z innymi paradygmatami uczenia się przestrzennego¹⁴, takimi jak MWM, który jest stresujący dla myszy, mierzony poziomem kortyzolu⁹. MWM nie nadaje się również dla starszych myszy, w przypadku których zgłoszono, że unoszą się na wodzie podczas zadania¹⁰. Chociaż inne testy uczenia się przestrzennego, takie jak labirynt Barnesa i test lokalizacji nowych obiektów, są mniej stresujące, są ograniczone przez to, jak często można przeprowadzać powtarzające się testy na tej samej kohorcie myszy. Dlatego główną zaletą zadania APA jest to, że może być używane wielokrotnie, ponieważ kilka parametrów można dostosować w celu zachowania nowości. Rzeczywiście, użyliśmy zadania APA do 5 razy na tej samej kohorcie myszy, aby zbadać efekt ablacji hipokampa i późniejszy efekt ćwiczenia⁸. W każdym przypadku parametry, w tym rotacja areny, strefa szoku i wskazówki przestrzenne, były zmieniane między testami. Było to skuteczne w zapewnieniu, że myszy używały wskazówek nawigacji przestrzennej do ponownego nauczenia się zadania, o czym świadczą zwierzęta kontrolne, zaczynając od dużej liczby wstrząsów, a następnie zmniejszając się w kolejnych dniach testowych dla każdego okresu testowego⁸. Zazwyczaj pod koniec 5-dniowego paradygmatu testowego uważamy, że każde zwierzę, które otrzymało więcej niż 10 wstrząsów w ostatnim dniu lub ma maksymalne unikanie krótsze niż 60 sekund, nie nauczyło się paradygmatu.

Poza możliwością łatwej modyfikacji ustawień w celu umożliwienia wielu rund testów przestrzennych, zadanie APA zapewnia, że myszy muszą korzystać z nawigacji przestrzennej, aby skutecznie uniknąć strefy szoku. Na przykład zwierzęta muszą używać zewnętrznych wskazówek, aby zlokalizować i uniknąć wejścia w stacjonarną strefę wstrząsu poprzez oddalanie się od niej⁵. Ponieważ arena się obraca, zwierzęta nie są w stanie używać idiotycznego podejścia do nawigacji, ani nie mogą używać wskazówek eksteroceptywnych, takich jak zapach, ponieważ te wskazówki obracają się wraz z areną, podczas gdy strefa szoku i wskazówki przestrzenne^{pozostają nieruchome}.

Ważne jest również, aby upewnić się, że myszy są odpowiednio przyzwyczajone do badacza i areny APA. Intensywność wstrząsów stóp również musi być zoptymalizowana, ponieważ zarówno zbyt niska, jak i zbyt wysoka intensywność wstrząsów może zagrozić zdolności myszy do uczenia się i wykonywania zadania⁵. Intensywność wstrząsu jest zwykle ustawiona na 0.5 mA i nie powinna przekraczać 0.7 mA. W przypadku zwierząt, które mają zwiększone zachowania podobne do lęku, rozważ zmniejszenie zarówno intensywności światła, jak i intensywności wstrząsów stóp. Zwiększony niepokój podczas zadania APA może objawiać się nadmiernym skakaniem, niekontrolowanym bieganiem po arenie lub długotrwałym zamrożeniem. Opisany tutaj protokół wykorzystywał intensywność wstrząsu 0,5 mA, taką samą intensywność, która była wcześniej stosowana w przypadku BALB/c, o którym wiadomo, że ma wyższe zachowanie podobne do lęku¹⁵.

W tym miejscu opisujemy oprogramowanie do śledzenia zwierząt dostarczone przez firmę, która dostarczyła używany sprzęt do aktywnego unikania miejsc. Alternatywne oprogramowanie do śledzenia wideo nadaje się również do analizy wydajności behawioralnej. Programy te mogą również dokładnie mierzyć i analizować wydajność myszy podczas zadań APA. Programy te pozwalają na utworzenie kilku stref i lokalizacji w arenie APA w celu oceny zachowania. Ustawienie areny dla APA składa się z jednej trójkątnej strefy szoku, w której mierzona jest liczba wejść, czas do pierwszego wejścia i czas spędzony w strefie szoku. Na arenie można również dodawać dodatkowe strefy. Na przykład możemy dodać strefę centralną lub strefę przeciwną do strefy szoku, aby zmierzyć czas spędzony i odległość przebytą w tych strefach jako strategię zwierzęcą, aby uniknąć strefy awersyjnej. Programy te śledzą środek masy myszy, który jest następnie zapisywany i wyświetlany nad układem odniesienia w celu kontroli wizualnej (Rysunek 6A,B). Na koniec możliwe jest również utworzenie mapy cieplnej gęstości dla wyników indywidualnych i grupowych (rysunek 6C).

Podczas wykonywania zadania APA istnieją potencjalne problemy, którymi należy się zająć. Czasami myszy będą musiały zostać wykluczone z analizy z powodu braku reakcji na strefę szoku. Jak zawsze, wykluczenie powinno być brane pod uwagę tylko wtedy, gdy spełniają wstępnie zdefiniowane warunki odstające, na przykład nie mieszczą się w granicach 2 odchyleń standardowych od średniej. Złożone zadania behawioralne, takie jak APA, zazwyczaj wymagają wysokich wartości N u zwierząt. Sugerujemy przeprowadzenie analizy mocy w celu obliczenia odpowiedniej wielkości próby przed przeprowadzeniem APA. Będzie to zależało od zastosowanego szczepu i grup leczenia. Z doświadczenia wynika, że wartość n wynosząca 10 lub więcej dla każdej grupy zapewnia wystarczającą moc podczas przeprowadzania eksperymentów APA. Głównym problemem związanym z tym zadaniem jest zapewnienie wysokiej jakości śledzenia myszy podczas zadania. Etap przyzwyczajenia zadania powinien być wykorzystany do potwierdzenia, że tak się dzieje. Myszy nie reagują na wstrząsy często z powodu odchodów między prętami siatki. Dlatego ważne jest, aby po każdym zwierzęciu wyczyścić zestaw i usunąć wszelkie odchody lub mocz. Zmniejszy to również stres u zwierząt, które podążają za nimi. Zadanie APA zazwyczaj obejmuje paradygmat 5-dniowy, który może stwarzać pewne ograniczenia w przypadku badań obejmujących interwencje skuteczne krócej niż 5 dni; Jednak pamięć krótkotrwała lub akwizycja uczenia się przestrzennego mogą być nadal oceniane w takich badaniach przy użyciu 30-minutowego, jednosesyjnego podejścia.

Podsumowując, ten artykuł zawiera szczegółowy opis tego, jak skonfigurować i używać paradygmatu aktywnego unikania miejsc do testowania uczenia się przestrzennego myszy. Możliwość zmiany warunków tak, aby można było testować wiele szczepów myszy o różnym kolorze, jest wyraźną przewagą nad innymi, bardziej tradycyjnymi testami przestrzennymi, takimi jak MWM. Co więcej, modyfikacja wielu parametrów pozwala na wielokrotne testowanie, dzięki czemu zmiany w uczeniu się przestrzennym mogą być dokładnie porównywane podczas różnych paradygmatów eksperymentalnych lub podczas fizjologicznego starzenia się. W krótkim czasie wykazano, że test APA jest dokładną i skuteczną alternatywą dla uczenia się przestrzennego zależnego od hipokampa. W przyszłości zadanie APA może być wykorzystane jako wiarygodna metoda oceny interwencji terapeutycznych lub ćwiczeń w zakresie zachowań poznawczych i przestrzennych zarówno u myszy typu dzikiego, jak i transgenicznego.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Źródło prądu stałego CS02	Grupa BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Stany Zjednoczone
Skrzynka kontrolna	Grupa BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Stany Zjednoczone
Ethovision (Ethovision)	Noldus powiedział:	Wersja 16	Wageningen, Holandia
Wstrząsający Scrambler	Grupa BioSignal	N/A	Acton, Massachusetts, Stany Zjednoczone
Analiza ścieżek	Grupa BioSignal	Wersja 2.2	Acton, Massachusetts, Stany Zjednoczone
Program śledzenia	Grupa BioSignal	Wersja: 2.36	Acton, Massachusetts, Stany Zjednoczone