Artykuł metodologiczny

Wszechstronna, behawioralna metoda badania wpływu hormonów tarczycy na funkcjonowanie móżdżku

DOI:

10.3791/65940

⸱

6 października 2023

 ,  , 
1Department of Integrative Physiology, Gunma University Graduate School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy protokół dla opracowanego ostatnio wszechstronnego testu zachowania, testu belki drabiny. Test ten ma tę zaletę, że wykrywa subtelną ataksję móżdżkową spowodowaną defektem działania hormonów tarczycy w ośrodkowym układzie nerwowym w porównaniu z konwencjonalnymi testami behawioralnymi oceniającymi sprawność motoryczną.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Działanie hormonu tarczycy (TH) jest niezbędne podczas rozwoju ośrodkowego układu nerwowego, w tym móżdżku. W przypadku niedoboru TH we wczesnym okresie życia, takiego jak wrodzona niedoczynność tarczycy, pacjenci wykazują zaburzenia neurologiczne, takie jak opóźnienie poznawcze i deficyty motoryczne. Istnieją różne badania z wykorzystaniem modeli mysich z niedoborem TH specyficznym dla tkanek lub komórek, aby zbadać rolę TH w móżdżku. W porównaniu z uogólnionymi wrodzonymi wadami tarczycy, myszy z niedoborem TH specyficznym dla komórek móżdżku wykazują łagodniejsze i subtelniejsze cechy ataksji, co utrudnia ocenę funkcji motorycznych przy użyciu konwencjonalnych testów, takich jak test rotarod.

Ze względu na potrzebę alternatywnego narzędzia do oceny funkcji motorycznych w modelach zwierzęcych związanych z TH, opracowaliśmy wszechstronną metodę behawioralną zwaną "testem belki drabinkowej", w której możemy projektować różne testy drabinkowe w zależności od nasilenia ataksji u modelowych myszy. Wykorzystaliśmy transgeniczne myszy eksprymujące dominująco-ujemny receptor TH, specyficznie w komórce Purkinjego móżdżku, jedynym neuronie wyjściowym w korze móżdżku modulującym wydajność motoryczną. Nowo zbudowany test belki drabinkowej z powodzeniem wykrył znaczne upośledzenie sprawności motorycznej u myszy transgenicznych na wyższym poziomie w porównaniu z testem rotarodowym. Zakłócenie uczenia się motorycznego wykryto również w teście belki drabinkowej, ale nie w teście rotarodowym. Protokół z tym nowatorskim aparatem behawioralnym może być zastosowany do innych modeli zwierzęcych, które mogą wykazywać łagodny fenotyp ataksji w celu zbadania subtelnych zmian w funkcji móżdżku.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hormon tarczycy (TH) jest niezbędny do rozwoju mózgu1. W szczególności jego rola w móżdżku jest krytyczna, ponieważ niedobór TH we wczesnym okresie życia powoduje nieprawidłowy rozwój móżdżku1,2. Na przykład w wrodzonej niedoczynności tarczycy pacjenci wykazują szereg opóźnień neurologicznych, w tym deficyty poznawcze i motoryczne3. Aby odkryć rolę TH w rozwoju funkcjonalnym móżdżku, niektóre badania ograniczyły niedobór TH w sposób specyficzny dla komórek móżdżku4. Jednak w porównaniu z uogólnionymi wrodzonymi hamulcami tarczycy, u których wszystkie tkanki i komórki są dotknięte niedoborem TH, takie modele specyficzne dla móżdżku wykazują tak subtelną ataksję, że konwencjonalne testy behawioralne, takie jak testy rotarod, odcisk stopy i równoważnica, ledwo wykrywają różnice. Dlatego, aby w pełni zbadać wpływ TH na funkcję móżdżku, potrzebne jest nowe narzędzie do oceny, aby wykryć subtelną zmianę w koordynacji ruchowej myszy modelowych.

Test rotarod jest najpowszechniejszym narzędziem do oceny koordynacji ruchowej, pierwotnie opracowanym przez Dunhama i Miya5, a później zastosowanym do wersji przyspieszającej przez Jonesa i Robertsa6. Opóźnienie przed upadkiem z obracającego się pręta jest interpretowane jako test koordynacji ruchowej, a jego prostota i zwięzłość sprawiają, że jest powszechnie stosowany wśród badaczy behawioralnych badających funkcje motoryczne7. Jednak łatwość użycia tego testu jest mieczem obosiecznym. Ponieważ pręt obraca się automatycznie, myszy mogą przylegać do obracającego się pręta i pozostawać na nim bez ruchu. Co więcej, myszy mogą chcieć spaść, zamiast balansować na obracającym się pręcie. W obu przypadkach ważność i wiarygodność testu są wątpliwe w ocenie "czystej koordynacji ruchowej"7. Innymi słowy, nie jest dokładnie ukierunkowany na funkcję móżdżku i obejmuje inne czynniki, takie jak siła mięśni do chwytania.

Zamiast konwencjonalnych narzędzi do oceny koordynacji ruchowej, prezentujemy tutaj nowatorski test zachowania zwany "testem belki drabinowej", który został niedawno opracowany w naszym laboratorium. Test chodzenia po drabinie poziomej został zaprojektowany w celu oceny złożonych zdolności motorycznych związanych z móżdżkiem: przewidywanie sprzężenia zwrotnego i integracja ruchu8. Urządzenie testowe składało się z czterech kawałków pleksi z otworami (Rysunek 1)". Cztery płyty zostały połączone równolegle za pomocą i patyczków włożonych w otwory w płytach. Dwie zewnętrzne płyty zostały użyte do stabilizacji urządzenia, a dwie wewnętrzne płyty zostały użyte do zaprojektowania różnych rodzajów szczebli drabiny (Rysunek 2C)". Szerokość szczebla została dostosowana w zależności od wielkości zwierzęcia, aby zminimalizować ruch zwierząt do tyłu (Rysunek 2B). Odległość od punktu startowego do bramki wynosiła 110 cm. Urządzenie znajdowało się 60 cm nad ławką, a pod urządzeniem umieszczono poduszkę bezpieczeństwa (Rysunek 2A). Ciemna komnata została umieszczona w pobliżu bramki, aby zmotywować zwierzęta do poruszania się w kierunku celu (Rysunek 2A).

Zbadaliśmy wpływ TH na rozwój funkcjonalny móżdżku, używając transgenicznych myszy wykazujących ekspresję dominująco-ujemnego receptora TH (TR) w móżdżkowych komórkach Purkinjego (myszy Mf-1/FVB). Zarówno w testach rotarod, jak i drabinkowych zaobserwowaliśmy fenotyp ataksji móżdżku u myszy Mf-1 / FVB; jednak test belki drabinkowej zdołał wykryć bardziej znaczące różnice niż test Rotarod (Rysunek 3)". Ponadto zdolność uczenia się motorycznego może być dokładniej oceniona w teście belki drabinkowej (Rysunek 3B,C)". Jako tło komórkowe takiego fenotypu behawioralnego, indukcja długotrwałej depresji (LTD) została zahamowana, a zamiast tego długoterminowe wzmocnienie (LTP) zostało wywołane po stymulacji indukcyjnej LTD w komórkach Purkinjego Mf-1 / FVB9. LTD jest niezbędny do koordynacji ruchowej i uczenia się motorycznego w móżdżku10. Wiele badań wykazało deficyty motoryczne i hamowanie LTD u myszy z nokautem lub mutacją kluczowych genów regulatorowych funkcji móżdżku, jednak żadne badania nigdy nie wykazały indukcji LTP po stymulacji indukcyjnej LTD11,12. Podsumowując, zjawisko to może być unikalne dla myszy Mf-1 / FVB lub myszy z niedoborem TH (to samo zjawisko zaobserwowano u myszy z niedoczynnością tarczycy u dorosłych), co sugeruje, że TH reguluje funkcję móżdżku inaczej niż inne kluczowe białka. Jeśli tak, jest prawdopodobne, że myszy z nieprawidłowym działaniem TH nie wykazują ataksji móżdżkowej w taki sam sposób, jak inne myszy modelowe. To ponownie podkreśla potrzebę specyficznej metody oceny wpływu TH na funkcję móżdżku. W artykule przedstawiono nowatorski protokół do badania wpływu TH na funkcję móżdżku przy użyciu nowo zbudowanego testu belki drabinkowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół eksperymentów na zwierzętach w obecnym badaniu został zatwierdzony przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Eksperymentów Uniwersytetu Gunma. Wszystkie procedury związane z opieką i leczeniem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z japońską ustawą o dobrostanie zwierząt i zarządzaniu nimi oraz wytycznymi dotyczącymi prawidłowego przeprowadzania doświadczeń na zwierzętach wydanymi przez Radę Naukową Japonii. Rysunek montażowy aparatu można znaleźć w Rysunek 1.

1. Ustawienie drabiny

  1. Test drabiny poziomej (Rysunek 2C po lewej)
    1. Włóż aluminiowe patyczki (o średnicy 2 mm) w otwory w ściankach pleksi.
      UWAGA: Odstęp między nimi różni się w zależności od wielkości ciała w zależności od szczepu lub płci badanej myszy (patrz Tabela 1).
    2. Dostosuj szerokość szczebli drabiny, poszerzając lub zwężając odległość ścianek z pleksi.
      UWAGA: Szerokość może się różnić w zależności od wielkości ciała w zależności od szczepu lub płci badanej myszy (patrz Tabela 1).
  2. Test drabiny zygzakowatej (Rysunek 2C po prawej)
    1. Włóż aluminiowe patyczki (o średnicy 2 mm) do co trzeciego otworu w kierunku poziomym i pionowym na ściankach z pleksi.
      UWAGA: Odstęp między interwałami różni się w zależności od wielkości ciała w zależności od szczepu lub płci badanej myszy (patrz Tabela 1).
    2. Dostosuj szerokość szczebli drabiny, poszerzając lub zwężając odległość ścianek z pleksi.
      UWAGA: Szerokość może się różnić w zależności od wielkości ciała, odmiany lub płci badanej myszy (patrz Tabela 1).
    3. Umieść ciemną komorę w miejscu docelowym.
    4. Dla bezpieczeństwa umieść poduszkę (może być wykonana z plastikowej torby wypchanej materiałami buforowymi) 30 cm poniżej drabiny.

2. Przyzwyczajenie (Dzień 0)

UWAGA: Zaleca się poświęcenie co najmniej 1 dnia na przyzwyczajenie myszy do ustawienia drabiny.

  1. Umieść mysz na krawędzi drabiny (punkt początkowy).
  2. Za pomocą podmuchu powietrza zachęć mysz do poruszania się do przodu po szczeblu drabiny.
  3. Powtarzaj, aż mysz przyzwyczai się do chodzenia po szczeblach drabiny.

3. Pomiar wydajności silnika

  1. Umieść mysz na krawędzi drabiny (punkt początkowy).
  2. Zapisz czas do przejścia przez drabinę i liczbę poślizgnięć stóp, gdy myszy nie potrafią postawić łap lub ślizgają się po umieszczeniu na aluminiowych patyczkach (patrz Rysunek 2D). Jeśli to możliwe, nagraj wideo, aby później sprawdzić błędy.
  3. Po 15 minutach powtórz pomiar (4-5 prób dziennie).
  4. Powtarzaj eksperyment przez 3-4 dni, aby ocenić uczenie się motoryczne.

4. Analiza

  1. Oblicz średnią wartość czasu i poślizgnięć stóp w ciągu dnia.
  2. Porównaj średnią wartość między grupami.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W teście rotaroda, myszy Mf-1/FVB wykazały znaczny spadek opóźnienia do wypadania z obracającego się pręta przez 3 kolejne dni w porównaniu do myszy typu dzikiego, co wskazuje na upośledzoną koordynację ruchową (Rysunek 3A). Jednak jeśli chodzi o wyniki wewnątrzgrupowe, myszy Mf-1 / FVB znacznie poprawiły swoje wyniki od dnia 1 do dnia 3, co sugeruje zachowanie uczenia się motorycznego (Rysunek 3A).

Zarów...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasz projekt opierał się na wcześniejszych badaniach przeprowadzonych przez Metza i Whishawa, którzy poinformowali o użyteczności "testu chodzenia po drabinie"13,14. Zaprojektowali test chodzenia po drabinie, aby ocenić umiejętności chodzenia i zmierzyć zarówno ułożenie kończyn przednich, jak i tylnych, kroki i koordynację między kończynami, wymagając od zwierząt przejścia od punktu początkowego do celu po drabinie poziomej13,14...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki KAKENHI (granty nr 18H03379 dla N.K., 21K15340 dla I.A. i 22J11280 dla A.N.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Air puffDAISO
Aluminiowe kijeCAINZo średnicy 2 mm, liczba patyczków może się różnić w zależności od konstrukcji drabiny. Do zbudowania drabiny poziomej (odstęp 4 cm) może być potrzebnych około 30 patyków.
BlutackBostik
PlexiCAINZ110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 części każda
 CAINZ (KAINZ)

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
  2. Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
  3. Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17(2010).
  4. Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
  5. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  6. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  7. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342(2022).
  8. Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
  9. Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119(2022).
  10. Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  11. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  12. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
  13. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  14. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
  15. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50(2015).
  16. Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
  17. Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118(2021).
  18. Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010(2022).
  19. Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
  20. Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Thyroid HormoneCerebellar FunctionLadder Beam TestMotor PerformanceBehavioral AnalysisPurkinje CellsMotor CoordinationTransgenic MiceAtaxic PhenotypeRotarod Test

Powiązane artykuły