Artykuł metodologiczny

Zautomatyzowane cięcie wibratomiczne tkanki płucnej zatopionej w agarozie do multipleksowego obrazowania fluorescencyjnego

DOI:

10.3791/65943

⸱

6 października 2023

 ,  , 
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 2Department of Clinical Sciences, Lund University, 3Lund Stem Cell Centre, Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation, Skåne University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowaliśmy technikę przetwarzania tkanek wykorzystującą wibratomę i tkankę płucną zatopioną agarozą do generowania skrawków płuc, co pozwala na uzyskanie obrazów architektury płuc w wysokiej rozdzielczości. Zastosowaliśmy barwienie immunofluorescencyjne, aby obserwować przestrzenną ekspresję białek przy użyciu specyficznych markerów strukturalnych płuc.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ze względu na swoją wrodzoną kruchość strukturalną, płuco jest uważane za jedną z trudniejszych tkanek do przetworzenia pod mikroskop. Aby dodać wsparcie strukturalne do cięcia, kawałki tkanki płucnej są zwykle zanurzane w parafinie lub związku OCT i cięte odpowiednio za pomocą mikrotomu lub kriostatu. Nowsza technika, znana jako precyzyjnie cięte plastry płuc, dodaje strukturalne wsparcie świeżej tkance płucnej poprzez infiltrację agarozy i zapewnia platformę do utrzymania pierwotnej tkanki płucnej w hodowli. Jednak ze względu na maskowanie epitopów i zniekształcenia tkanek, żadna z tych technik nie nadaje się odpowiednio do opracowania powtarzalnych zaawansowanych odczytów obrazowania świetlnego, które byłyby kompatybilne dla wielu przeciwciał i gatunków.

W tym celu opracowaliśmy proces przetwarzania tkanek, który wykorzystuje osadzanie agarozy w stałej tkance płucnej, w połączeniu z automatycznym cięciem wibratomem. Ułatwiło to generowanie skrawków płuc o grubości od 200 μm do 70 μm w płucach myszy, świń i ludzi, które nie wymagają pobierania antygenu i stanowią najmniej "przetworzoną" wersję natywnej izolowanej tkanki. Korzystając z tych wycinków, ujawniamy odczyt obrazowania multipleksowego, który jest w stanie generować obrazy o wysokiej rozdzielczości, których przestrzenną ekspresję białek można wykorzystać do ilościowego określenia i lepszego zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw uszkodzenia i regeneracji płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Plastry tkanki płucnej ex vivo są szeroko stosowane w badaniach nad chorobami płuc1. Obecne złote standardy, szczególnie w klinicznych i translacyjnych badaniach na dużych zwierzętach, wykorzystują barwienie hematoksyliną i eozyną w połączeniu z mikroskopią jasnego pola i oceną opartą na obserwatorach do oceny i oceny dysfunkcji płuc2,3. Chociaż nadal jest to cenna technika, wykazuje ograniczenia pod względem rozdzielczości przestrzennej i liczby znaczników, które można obrazować jednocześnie. Co więcej, tkanka płucna musi zostać poddana intensywnemu płukaniu na bazie rozpuszczalnika, co powoduje odwodnienie, skurczenie i ponowne uwodnienie tkanki przed jej ostatecznym obrazowaniem 4. Proces ten jest nie tylko czasochłonny, ale także nieprzyjazny dla środowiska, maskuje epitopy białek i może wywoływać zmiany strukturalne w tkance5,6,7,8. Jednak w przypadku tkanki płucnej zatapianie w parafinie przed sekcją było konieczne ze względu na kruchość strukturalną płuc. W przeciwieństwie do tego, narządy stałe, takie jak mózg, mogą być cięte za pomocą wibrującego mikrotomu (wibratomu), zarówno w tkankach stałych, jak i świeżych9,10,11,12.

Aby umożliwić sekcję wibratomu w tkance płucnej, ustanowiono metodę określaną jako precyzyjnie wycinane plastry płuc (PCLS), gdzie agaroza o niskiej temperaturze topnienia jest wstrzykiwana do świeżej tkanki płucnej przez drogi oddechowe lub naczynia krwionośne i pozostawiana do zestalenia13,14. Agaroza w drogach oddechowych zapewnia wystarczające wsparcie strukturalne, aby umożliwić sekcję wibratomową9,14. U gryzoni jest to łatwe do osiągnięcia, ponieważ agaroza może być wstrzykiwana przez tchawicę; Jednak w tkankach świńskich i ludzkich znalezienie odpowiedniej drogi oddechowej/naczynia w obrębie danej biopsji może być trudne15,16. Co więcej, nawet jeśli taka droga oddechowa/naczynie jest zlokalizowane, zwykle potrzebna jest znaczna siła do wstrzyknięcia agarozy, co może wpływać na późniejszą morfologię płuc17.

Aby sprostać wyzwaniom związanym z zatapianiem/sekcją/barwieniem parafiny oraz przepływem pracy PCLS, stworzyliśmy nowy potok przetwarzania dla utrwalonej tkanki płucnej. Ten przepływ pracy pozwala na użycie wibratomu do cięcia, może wytwarzać cieńsze plastry niż w PCLS i daje warstwy, które nie wymagają pobierania antygenu do multipleksowego obrazowania fluorescencyjnego. Metoda ta oferuje sposób "najmniejszego przetwarzania" w celu wygenerowania wycinków płuc, które można wykorzystać w zaawansowanej mikroskopii świetlnej. Co więcej, odczyty obrazowe mogą być wykorzystane do zademonstrowania relacji przestrzennych komórek i struktur anatomicznych w tkance płucnej poprzez uchwycenie objętościowej architektury tkanki18,19,20,21. W tym artykule opisano protokół generowania tych skrawków płuc i zademonstrowano barwienia multipleksowe zastosowane do każdej z tych tkanek oraz sposób, w jaki te zaawansowane dane obrazowania można wykorzystać do kwantyfikacji.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mysie płuca zostały podarowane przez badaczy korzystających z innych układów narządów w celu utrzymania zasady 3R. Wszystkie procedury na świniach zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą europejską 2010/63/UE i zostały zatwierdzone przez Komitet Etyczny ds. Badań na Zwierzętach w Malmö-Lund (Dnr 5.8.18-05527/2019) i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CODEX Szwedzkiej Rady ds. Badań Naukowych. Zgoda na wykorzystanie próbek pobranych od ludzi została wydana przez Szwedzką Krajową Komisję Etyczną (Dnr 2020-07115 i Dnr 2020-01864). Szczegółowe informacje na temat wszystkich materiałów i instrumentów użytych w tym protokole można znaleźć w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie roztworów i materiałów

  1. Utrwal tkankę płucną w 4% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Następnie przenieś tkankę płucną do stożkowej rurki o pojemności 50 ml wypełnionej solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) zawierającą 0,01% azydku sodu.
  2. Przygotować 3% (w/v) roztwór agarozy, rozpuszczając 1,5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml sterylnego PBS. Przygotuj plastikowy kubek, cienkie kleszczyki i sterylne nożyczki.
  3. Podgrzej agarozę w kuchence mikrofalowej, aż się zagotuje, a następnie schłodzić ją do 42 °C w łaźni wodnej. Przechowuj agarozę w postaci płynnej, przechowując ją w łaźni wodnej do momentu użycia do momentu, gdy będzie gotowa do użycia.
    UWAGA: Podczas podgrzewania agarozy obserwuj kuchenkę mikrofalową, aż zacznie wrzeć, aby się nie przelała. Zwykle zajmuje to około 1,5 minuty.

2. Tkanka płucna zanurzona w agarozie

  1. Pobrać biopsję płuca z azydku PBS i ostrożnie wypreparować płaty płuc za pomocą cienkich kleszczy i sterylnych nożyczek. Pokrój płat płuca na mniejsze bloki.
    UWAGA: Chociaż możliwe jest cięcie z opłucną, jej grube wiązki elastyny mogą utrudniać cięcie ostrzem wibratomowym. Dlatego zalecamy jego usunięcie, jeśli nie jest to konieczne.
  2. Przetnij plastikowy kubek przez środek i dodaj niewielką ilość agarozy na jego dno. Umieścić pokrywkę ze stożkowej probówki o pojemności 50 ml (bez brzegu) na powierzchni agarozy i przechowywać filiżankę w temperaturze 4 °C przez 5 minut, aby agaroza zastygła do późniejszego użycia.
  3. Wyjmij plastikowy kubek z lodówki o temperaturze 4 °C, dodaj około 1 ml płynnej agarozy na pokrywkę, a następnie delikatnie umieść blok tkanki płucnej na pokrywce. Pozostaw agarozę na 2-3 minuty do częściowego zestalenia się w temperaturze pokojowej. Następnie powoli wlej płynną agarozę na tkankę płucną, aż zostanie całkowicie zanurzona.
  4. Wstaw do lodówki w temperaturze 4 °C na około 15 minut, aż agaroza zastygnie. Następnie ostrożnie użyj ostrego ostrza, aby usunąć dodatkową agarozę otaczającą tkankę płucną, pozostawiając jednolitą warstwę o grubości około 5 mm wokół tkanki (Rysunek 1).

3. Wycinanie skrawków tkanki płucnej

  1. Aby przygotować tkankę płucną do cięcia, przymocuj każdy blok tkanki do dysku próbki wibratomu za pomocą super kleju. Następnie napełnij tackę buforową wibratomu PBS i umieść lód w otaczającej łaźni lodowej. Na koniec ostrożnie zainstaluj dysk z próbką w tacy buforowej.
  2. Pokrój tkankę płucną za pomocą wibratomu z następującymi ustawieniami: grubość: 200 μm, częstotliwość: 100 Hz, amplituda ostrza: 1,3 mm i prędkość posudnia ostrza 0,02-0,03 mm/s, która zależy od sztywności tkanki.
    UWAGA: Cięcie jest możliwe do grubości 70 μm, jeśli prędkość ostrza zostanie zmniejszona do 0,01 mm/s. Niektóre wibratory (np. Leica V1200s) umożliwiają automatyzację cięcia poprzez ustawienie okna cięcia.
  3. Aby zebrać skrawki, delikatnie przenieś plasterek tkanki, nabierając go szczoteczką z tacki wibratomu do 24-dołkowej płytki wypełnionej 0,01% azydkiem w PBS. Na koniec zakonserwuj plastry płuc w temperaturze 4 °C.

4. Barwienie immunologiczne elastyny, CD31, HTII-280 i SMA

  1. Przepuszczalność i zablokowanie (1% albuminy surowicy bydlęcej + 0,5% Tritonu + 5% normalnej surowicy koziej) tkanki w temperaturze 4 °C pod delikatnym wstrząsem przez 45 min.
  2. Rozcieńczyć przeciwciała pierwszorzędowe (SMA 1:500; elastyna 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) w PBS, dodać 300 μl do każdego dołka i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C pod delikatnym wstrząsaniem.
  3. Nie dotykając plastra i nie usuwając przeciwciał pierwotnych końcówką pipety, przemyć 3 x 20 min (400 μl) PBS.
  4. Rozcieńczyć przeciwciała drugorzędowe (1:1000) w PBS, dodać 300 μl do każdego dołka i inkubować w temperaturze 4 °C pod delikatnym wstrząsem przez 90 minut.
  5. Usunąć przeciwciała drugorzędowe za pomocą końcówki pipety, dodać 4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI) (1:1000) i lektynę-488 pomidora (1:500) przez 30 minut inkubacji i myć przez 3 x 10 minut PBS.
  6. Umieść trzy krople podłoża montażowego na szkiełku, zamontuj szkiełko nakrywkowe i przystąp do obrazowania.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proces generowania wycinków tkanki płucnej składa się z kilku kluczowych etapów, w tym przygotowania, osadzania i krojenia. Roztwór agarozy (3% (w/v) sporządza się przez rozpuszczenie 1,5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml sterylnego PBS. Potrzebne materiały eksploatacyjne to plastikowy kubek, pokrywka ze stożkowej rurki o pojemności 50 ml (zdjęta krawędź), kleszcze i nożyczki. Tkanka płucna jest starannie wycinana na mniejsze bloki za pomocą cienkich kleszczy i sterylnych nożyczek (Rysunek 1A,B). Następnie, aby osadzić bloki tkanki płucnej, dno kubka wypełnia się niewielką ilością agarozy, na powierzchni agarozy umieszcza się pokrywkę, a kubek przechowuje się w temperaturze 4 °C przez 5 minut (Rysunek 1C). Do pokrywki dodaje się około 1 ml płynnej agarozy, a blok tkanki płucnej umieszcza się na pokrywce. Agarozę pozostawia się na 2-3 minuty do częściowego zestalenia w temperaturze pokojowej (Rysunek 1D). Gdy blok płucny zostanie przytrzymany na miejscu przez częściowo zestaloną agarozę, płynna agaroza jest następnie wlewana do kubka, aż blok tkanki płucnej zostanie całkowicie zanurzony. Jest on przechowywany w temperaturze 4 °C przez 15 minut (Rysunek 1E,F). Osadzenie agarozy o niskiej temperaturze topnienia zapewnia niezbędne wsparcie i sztywność tkance płucnej, co pomaga zachować jej pierwotną architekturę podczas procesu krojenia. Ostre ostrze służy do usuwania nadmiaru agarozy otaczającej tkankę płucną. Wokół tkanki pozostawia się jednolitą warstwę o grubości około 5 mm (Rysunek 1G). Wycięty blok tkanki płucnej jest następnie ostrożnie przyklejany do uchwytu na tkankę (Rysunek 1H). Tacka buforowa wibratomu jest wypełniona PBS, lód jest umieszczany w otaczającej łaźni lodowej, a dysk próbki jest instalowany w tacy buforowej (Rysunek 1I). Parametry cięcia wibratomowego ustawione na panelu to: grubość plastra: 200 μm; częstotliwość: 100 Hz; amplituda ostrza: 1,3mm; prędkość posuwu ostrza: 0,02-0,03 mm/s, która zależy od sztywności tkanki (Rysunek 1J). Na koniec barwienie przeprowadza się na swobodnie pływających plastrach (Rysunek 1K-M).

Barwienie immunofluorescencyjne przeprowadzono w 200 μm sekcjach każdego gatunku dla aktyny mięśni gładkich (SMA, marker komórek mięśni gładkich i miofibroblastów), elastyny (białka macierzy zewnątrzkomórkowej) i lektyny Lycopersicon Esculentum (LEA), która wiąże się z komórkami nabłonka oskrzelowo-pęcherzykowego. Płuco jest strukturalnie niejednorodną tkanką i jako taka różnicowa dystrybucja SMA i elastyny jest obserwowana w strukturach, w tym w przewodach pęcherzykowych, naczyniach krwionośnych, oskrzelkach wewnątrzpłucnych i pęcherzykach płucnych u myszy, świń i ludzi (Figura 2A-L). Odwzorowanie w wysokiej rozdzielczości objętości oskrzelika o wielkości 20 μm pokazuje, jak drobne struktury w płucach mogą być badane na poziomie półtrójwymiarowym (film uzupełniający S1). Jako przykład ilościowy, wykorzystując śledzenie obrazu, pokazujemy, jak różni się rozmiar pęcherzyków płucnych między próbkami (n = 20 pęcherzyków płucnych) (Rysunek 2L, M).

Aby pokazać, jak możliwe jest ilościowe wykorzystanie tych zaawansowanych danych obrazowych, porównaliśmy rozmieszczenie komórek pneumocytów typu 2 (TII) w ludzkiej tkance płucnej od dorosłego i niemowlęcia. Specyficzne dla człowieka przeciwciało pęcherzyków płucnych typu 2, HTII-280, ma silne powinowactwo do powierzchni ludzkich komórek typu 2 (Figura 3A-F). Komórki te można dalej oglądać w trójwymiarowej przestrzeni pojedynczego zębodołu za pomocą obrazowania wolumetrycznego (Dodatkowe wideo S2). Aby określić ilościowo liczbę TII między próbkami dorosłych i niemowląt, przetworzyliśmy liczbę HTII-280 w 10 losowych polach widzenia (fov). Pomiędzy tymi próbkami, próbka niemowlęcia dała znacznie wyższą liczbę komórek TII (Rysunek 3G). Jednak próbka niemowlęcia wykazywała również znacznie większe pokrycie rusztowaniem niż osoba dorosła, co może wyjaśniać wyższą liczbę komórek (Ryc. 3H). Aby to uwzględnić, następnie oceniliśmy liczbę TII na podstawie pokrycia rusztowania, jako komórek na mm2 tkanki, które nadal utrzymywały znacznie wyższą liczbę TII w próbce niemowlęcia (Rysunek 3I). W związku z tym wyższa liczba TII w próbce niemowlęcia nie wynika ze zwiększonego pokrycia rusztowania i podkreśla znaczenie oceny rozmieszczenia komórek w płucach na podstawie obszaru rusztowania, a nie ogólnego pola widzenia.

figure-results-1
Rysunek 1: Protokół cięcia plastrów tkanki płucnej. (A) Roztwory i materiały: 3% (w/v) roztwór agarozy otrzymany przez rozpuszczenie 1,5 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 50 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem; plastikowy kubek; pokrywkę ze stożkowej probówki o pojemności 50 ml; kleszcze i nożyczki. (B) Tkanki płucne zostały wycięte za pomocą cienkich kleszczy i sterylnych nożyczek. (C) Napełnij dno kubka niewielką ilością agarozy i umieść pokrywkę na powierzchni agarozy; następnie przechowywać w temperaturze 4 °C przez 5 minut. (D) Powoli dodawać 1-2 ml płynnej agarozy do pokrywki, ostrożnie umieszczać kawałek tkanki płucnej na pokrywce i przechowywać go w temperaturze 4 °C przez 2 minuty. (E,F) Wlej płynną agarozę do kubka, aż fragment tkanki płucnej zostanie całkowicie zanurzony, przechowywać w temperaturze 4 °C przez 15 minut, a następnie delikatnie rozbić plastikowy kubek. (G) Za pomocą ostrego ostrza usuń nadmiar agarozy otaczającej tkankę płucną, pozostawiając jednolitą warstwę o grubości około 5 mm wokół tkanki. (H) Wycięty blok tkanki płucnej jest następnie ostrożnie przyklejany do uchwytu tkanki. (I) Napełnij tackę buforową wibratomu PBS, umieść lód w otaczającej łaźni lodowej i zainstaluj krążek z próbką w tacy buforowej. (J) Ustawić parametry cięcia na panelu wibratomu; grubość warstwy: 200 μm, częstotliwość: 100 Hz, amplituda noża: 1,3 mm, i prędkość posuwu ostrza 0,02-0,04 mm/s. (K-M) Reprezentatywne obrazy swobodnie pływającego plastra nadal zanurzonego w agarozie i gotowego do barwienia immunofluorescencyjnego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Immunofluorescencyjne obrazy struktury płuc u człowieka, świni i myszy. (A-L) Reprezentatywne obrazy przewodu pęcherzykowego, naczynia krwionośnego, oskrzelików i pęcherzyków płucnych w wycinkach tkanki płucnej odpowiednio od myszy, świni i człowieka. SMA (pokazane na zielono) jest markerem komórek mięśni gładkich i obserwuje się je w ścianach naczyniowych i oskrzelowych tkanki płucnej. Elastyna (pokazana na czerwono) stanowi część macierzy zewnątrzkomórkowej płuc. (M) Kwantyfikacja wielkości pęcherzyków płucnych poprzez wybór 20 losowych pozycji na każdym wycinku tkanki płucnej zarówno dla próbek ludzkich, świńskich, jak i mysich. Histogramy wykorzystano do zilustrowania rozkładu wielkości wyrostka zębodołowego w każdej grupie. Podziałka = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Test Kruskalla-Wallisa. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Skróty: DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol; LEA = lektyna Lycopersicon Esculentum; SMA = aktyna mięśni gładkich; ms = mysz; HMN = człowiek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3. Dystrybucja pneumocytów typu 2 w próbkach od ludzi dorosłych i niemowląt. Panie przewodniczący, panie i panowie! Reprezentatywne obrazy tkanki płucnej człowieka dorosłego i niemowlęcia wybarwionej pod kątem HTII-280 (pokazane na czerwono), CD31 (pokazane na zielono) i LEA (pokazane na szaro). (C,D) Reprezentatywne obrazy dorosłego i niemowlęcia człowieka pokazujące samą dystrybucję pneumocytów typu 2. (E,F) Reprezentatywne obrazy pojedynczej pneumocytu typu 2 w rozdzielczości pojedynczej komórki z próbek płuc dorosłych i niemowląt. (G) Kwantyfikacja liczby pneumocytów typu 2 w próbkach od dorosłych i niemowląt. (H) Kwantyfikacja pokrycia powierzchni rusztowania tkanki płucnej (% w porównaniu z powietrzem) w próbkach od dorosłych i niemowląt. (I) Oznaczanie ilościowe stężenia pneumocytu typu 2 namm2 tkanki w próbkach pobranych od dorosłych i niemowląt. Podziałka = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 fov na próbkę. Niesparowany test t lub test Manna-Whitneya. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Skróty: DAPI = 4', 6-diamidyn-2-fenyloindol; LEA = lektyna Lycopersicon Esculentum; HTII = ludzkie komórki typu II; CD31 = Cząsteczka adhezji komórek śródbłonka płytek krwi-1 / klaster różnicowania 31; FOV = pole widzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dodatkowe wideo S1: Wideo z objętością 20 μm obrazowania pojedynczej drogi oddechowej świni barwionej przy użyciu DAPI, LEA, SMA i elastyny, pokazujące widok w wysokiej rozdzielczości struktury elementów ścian dróg oddechowych. Skróty: DAPI = 4′,6-diamidyn-2-fenyloindol; LEA = lektyna Lycopersicon Esculentum; SMA = aktyna mięśni gładkich. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowe wideo S2: Wideo z objętością obrazowania 30 μm pojedynczego pęcherzyka płucnego wybarwionego przy użyciu DAPI, LEA i HTII-280 pokazujące rozkład pneumocytów typu 2 w całej strukturze. Skróty: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenyloindol; LEA = lektyna Lycopersicon Esculentum; SMA = aktyna mięśni gładkich. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole przedstawiamy ulepszoną metodę generowania skrawków płuc opartą na wibratomie. W porównaniu z technikami przetwarzania opartymi na parafinie metoda ta jest bardziej opłacalna, efektywna czasowo i bardziej przyjazna dla środowiska22. Co więcej, metoda ta pomaga zachować integralność strukturalną wycinków tkanki płucnej i pozwala na zaawansowane obrazowanie immunofluorescencyjne bez konieczności pobierania antygenu. Jednak podczas naszych eksperymentów znaleźliśmy również pewne ograniczenia w tym przepływie pracy. Chore płuca mogą zakłócać proces cięcia z powodu zniszczenia tkanek spowodowanego zmianami patologicznymi. Podczas używania wibratomu do cięcia, niedrożność dróg oddechowych i ciężka zwłóknieniowa tkanka płucna mogą utrudniać działanie ostrza, co utrudnia proces krojenia tych tkanek. Można to jednak przezwyciężyć, zmniejszając prędkość ostrza i podpierając tkankę drobnym pędzlem. Podobne wyzwania wynikają z pogrubienia opłucnej, które jest częstym skutkiem zapalenia opłucnej, przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP) i idiopatycznego włóknienia płuc (IPF)23,24,25. Jeśli opłucna nie jest przedmiotem eksperymentu, zalecamy jej usunięcie przed sekcją lub przez odizolowanie objętości płuc od opłucnej. Jeśli opłucna jest konieczna, można ją pokroić za pomocą podobnej manipulacji jak powyżej, obejmującej wolniejsze prędkości ostrza i podparcie krojenia za pomocą cienkiej szczotki.

Podczas gdy precyzyjnie wycięte plastry płuc mogą zachować trójwymiarową architekturę i natywne środowisko płuc26, ważne jest, aby pamiętać, że generowanie PCLS jest złożonym i czasochłonnym procesem. Powodzenie generowania wycinków tkanki płucnej w dużej mierze zależy od skuteczności wypełnienia agarozą, na którą z kolei wpływa obecność nienaruszonej opłucnej i żywotnych miejsc iniekcji w uzyskanej tkance. Jest to łatwe do osiągnięcia u gryzoni, ponieważ agaroza może być łatwo wprowadzana przez tchawicę do nienaruszonych płuc 27,28,29. Jednak w badaniach na dużych zwierzętach biopsje pobierane w ramach eksperymentu są zazwyczaj z dystalnych segmentów płuc, które nie mają wystarczająco dużych dróg oddechowych, aby kaniulować30,31. Tak więc, zamiast wstrzykiwać agarozę do oskrzeli lub naczyń krwionośnych, stosujemy tę metodę, w której tkanka płucna, niezależnie od gatunku pochodzenia lub objętości próbki, jest osadzana w agarozie o niskiej temperaturze topnienia w celu wytworzenia wycinków tkanki płucnej. Takie podejście jest technicznie łatwiejsze i ma na celu zminimalizowanie uszkodzeń tkanek w jak największym stopniu. Opierając się na naszym doświadczeniu, metoda ta wykazała wyższą skuteczność i łatwość w generowaniu skrawków tkanki płucnej. Skutecznie zachowuje morfologię pęcherzyków płucnych i jest szczególnie odpowiedni do cięcia tkanki płucnej, umożliwiając generowanie powtarzalnego obrazowania fluorescencyjnego multipleksowego o wysokiej rozdzielczości.

W tym badaniu demonstrujemy ponadto dwie kwantyfikacje oparte na próbie dla wygenerowanych danych obrazowych. W pierwszym z nich wykorzystano śledzenie obrazu w celu oceny różnic w wielkości pęcherzyków płucnych w próbkach gatunków. Nic dziwnego, że pęcherzyki płucne myszy były najmniejsze, podczas gdy pęcherzyki płucne świń i ludzi były podobnej wielkości, co podkreśla, że świnie są interesującym modelem translacyjnym do badań nad płucami.

W drugiej kwantyfikacji porównaliśmy rozkład HTII między próbką płuc osoby dorosłej i niemowlęcia. Pneumocyty typu 2 odgrywają istotną rolę w budowie dystalnego nabłonka płuc. Ta unikalna zdolność TII przyczynia się do naprawy i regeneracji nabłonka wyrostka zębodołowego32. W płucach zdrowego dorosłego człowieka TII stanowią około 15% całej populacji komórek, podczas gdy ich pokrycie powierzchni pęcherzyków płucnych szacuje się na około 5%33. HTII-280 jest powszechnie uznanym markerem specyficznym dla płuc do badania rozwoju i odpowiedzi komórek nabłonka pęcherzyków płucnych na uraz i jest specyficznie zlokalizowany na wierzchołkowych błonach plazmatycznych TII. W eksperymencie dorosłą tkankę uzyskano od pacjenta dawcy, który zmarł z powodu krwotoku śródmózgowego i miał współistniejące uszkodzenie płuc, podczas gdy próbka niemowlęcia pochodziła ze śmiertelności związanej z uduszeniem. Nasze odkrycia wskazują, że ekspresja HTII-280 była znacznie niższa w próbce płuc osoby dorosłej niż w próbce niemowlęcej. Co ciekawe, podczas gdy HTII-280 ulega ekspresji w większości HTII, na jego ekspresję może mieć również wpływ jakość tkanek i jest ona znacznie zmniejszona w uszkodzonej tkance płucnej człowieka34. Starzejące się tkanki płuc wykazują znaczny spadek liczby i aktywności wydzielniczej TII w porównaniu z młodymi tkankami, a osoby starsze wykazują znacznie niższą proliferację, wydzielanie i aktywność antyapoptotyczną TII w porównaniu z tymi młodymi tkankami35. W związku z tym, identyfikacja i wykrycie białka na powierzchni komórki specyficznego dla ludzkich TII może pomóc w ocenie ciężkości uszkodzenia płuc i ocenie podejść terapeutycznych mających na celu poprawę naprawy płuc36,37. W związku z tym, korzystając z tego potoku, bardzo interesujące byłoby przeprowadzenie badań TII pęcherzyków płucnych w większych kohortach ludzi o zdrowiu i chorobie.

Podsumowując, protokół ten przedstawia szybsze i łatwiejsze podejście do cięcia tkanki płucnej. Metoda ta zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania, cięcia i barwienia tkanki płucnej, zapewniając zachowanie nienaruszonej struktury tkanki płucnej. Optymalizuje model do badania zarówno zdrowej, jak i chorej architektury płuc, co prowadzi do poprawy wydajności eksperymentalnej. Ogólnie rzecz biorąc, badanie to wprowadza obiecujące podejście do badania złożonej biologii przestrzennej w patofizjologii tkanki płucnej u różnych gatunków, co może pomóc w lepszym zrozumieniu mechanizmów molekularnych odgrywających rolę w chorobach i naprawach.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za fundusze otrzymane od Fundacji Medycyny Molekularnej Wallenberga i Centrum Komórek Macierzystych Uniwersytetu w Lund oraz dziękują Centrum Bioobrazowania Uniwersytetu w Lund (LBIC) za dostęp do aparatu Nikon A1RHD.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
24-dołkowe wkładki do hodowli tkankowychSARSTEDT83.3932.300
4% paraformaldehydSOLVECO6095714
4', 6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)Thermo Fisher scientificD1306
50 mL probówka Falcon  SARSTEDT2045221
Klaster różnicowania 31 (CD31)Abcamab28364
Mikroskop konfokalny NikonA1R HD25
ElastynaAbcamab23747
Szkiełko nakrywkowe Epredia X1000 ThermoFisher scientific10318963
Szkiełka adhezyjne Epredia SuperFrost Plus ThermoFisher scientific10149870
KleszczeAESCULAPFB395R
Koza przeciw myszom 647 Invitrogen A21235
Koza anty-królik 568Invitrogen A11011
Komórki ludzkie typu IITerrace BiotechTB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Medium montażoweThermo Fisher scientificE41473
Niska temperatura żelowania AgarozaSigma-Aldrich1003467046
Lycopersicon Esculentum lektynaThermo Fisher scientific2531965
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Thermo Fisher scientific50-100-8798
Kubek plastikowykontorsgiganten885221
NożyczkiSTILLE101-8380-18
Aktyna mięśni gładkichAbcamab5694
Azydek soduSigma-AldrichK54329188239
Super klejLOCTITE2721643
Wibracyjny mikrotomLeicaVT1200S

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493(2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815(2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376(2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2(2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36(2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889(2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348(2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016(2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970(2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465(2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392(2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566(2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Zatapianie w agarozieskrawki tkanki p ucnejbarwienie immunofluorescencyjneprzestrzenna ekspresja bia ekmikroskopia arkusza wiat amodel transplantacji p ucodblokowanie antygen wpneumocyty typu drugiego

Powiązane artykuły