Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Regeneracja mięśni szkieletowych to dynamiczny proces napędzany przez dorosłe komórki macierzyste mięśni i ich potomstwo. Przeważnie w stanie spoczynku w stanie ustalonym, dorosłe komórki macierzyste mięśni aktywują się po urazie mięśni. Po aktywacji rozmnażają się, a większość ich potomstwa różnicuje się, tworząc kompetentne do fuzji komórki mięśniowe, podczas gdy pozostałe odnawiają się, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych. Podczas gdy tożsamość komórek macierzystych mięśni została zdefiniowana ponad dekadę temu, w oparciu o koekspresję markerów powierzchniowych komórek, miogenne komórki progenitorowe zostały zidentyfikowane dopiero niedawno przy użyciu wielowymiarowych podejść jednokomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy metodę cytometrii masowej pojedynczej komórki (cytometria według czasu przelotu [CyTOF]) do analizy komórek macierzystych i komórek progenitorowych w ostrym uszkodzeniu mięśni w celu wyjaśnienia dynamiki komórkowej i molekularnej, która rozwija się podczas regeneracji mięśni. Podejście to opiera się na jednoczesnym wykrywaniu nowych markerów powierzchniowych komórek i kluczowych miogennych czynników transkrypcyjnych, których dynamiczna ekspresja umożliwia identyfikację aktywowanych komórek macierzystych i populacji komórek progenitorowych, które stanowią punkty orientacyjne miogenezy. Co ważne, opisano strategię sortowania opartą na wykrywaniu markerów powierzchniowych komórek CD9 i CD104, umożliwiającą prospektywną izolację komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu dogłębnych badań ich funkcji. Komórki progenitorowe mięśni stanowią krytyczne brakujące ogniwo w badaniu kontroli losu komórek macierzystych mięśni, identyfikacji nowych celów terapeutycznych w chorobach mięśni i opracowywaniu zastosowań terapii komórkowej w medycynie regeneracyjnej. Przedstawione tutaj podejście można zastosować do badania komórek macierzystych i progenitorowych mięśni in vivo w odpowiedzi na zakłócenia, takie jak interwencje farmakologiczne ukierunkowane na określone szlaki sygnałowe. Może być również wykorzystany do badania dynamiki komórek macierzystych i progenitorowych mięśni w zwierzęcych modelach chorób mięśni, pogłębiając naszą wiedzę na temat chorób komórek macierzystych i przyspieszając rozwój terapii.
Wprowadzenie
Mięśnie szkieletowe stanowią największą pod względem masy tkankę w ciele i regulują wiele funkcji, od wzroku po oddychanie, od postawy do ruchu, a także metabolizm1. Dlatego utrzymanie integralności i funkcji mięśni szkieletowych ma kluczowe znaczenie dla zdrowia. Tkanka mięśni szkieletowych, która składa się z ciasno upakowanych wiązek wielojądrowych włókien mięśniowych otoczonych złożoną siecią nerwów i naczyń krwionośnych, wykazuje niezwykły potencjał regeneracyjny1,2.
Głównymi czynnikami regeneracji mięśni szkieletowych są dorosłe komórki macierzyste mięś....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez duńską inspekcję ds. eksperymentów na zwierzętach (protokół nr 2022-15-0201-01293), a doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu w Aarhus. Analgezja (buprenorfina) jest podawana w wodzie pitnej na 24 h przed urazem, aby myszy mogły przyzwyczaić się do jej smaku. Podawanie buprenorfiny w wodzie pitnej jest kontynuowane przez 24 h po urazie. Buprenorfina w wodzie pitnej po wstrzyknięciu noteksyny, wraz z podskórnym (s.c.) wstrzyknięciem buprenorfiny w momencie ostrego urazu mięśni, złagodzi ból związany z urazem. Chociaż zaleca się podanie buprenorfiny drogą s.c. w czasie ostr....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W niniejszej pracy przedstawiamy przegląd konfiguracji eksperymentalnej dla zastosowania tego połączonego podejścia, które obejmuje (i) wielowymiarową analizę CyTOF w czasie po wystąpieniu ostrego urazu wywołanego wstrzyknięciem noteksyny, w celu zbadania dynamiki komórkowej i molekularnej komórek macierzystych i progenitorowych w mięśniach szkieletowych (Rycina 1, schemat górny); oraz (ii) FACS komórek macierzystych i progenitorowych z wykorzystaniem dwóch markerów powierzchniowych, CD9 i C.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Regeneracja mięśni szkieletowych to dynamiczny proces, który opiera się na funkcji dorosłych komórek macierzystych. Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na roli komórek macierzystych mięśni podczas regeneracji, ich potomstwo in vivo było niedostatecznie zbadane, głównie z powodu braku narzędzi do identyfikacji i izolacji tych populacji komórek 15,16,17,18. W tym miejscu p.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Dziękujemy członkom FACS Core Facility na Wydziale Biomedycyny Uniwersytetu w Aarhus za wsparcie techniczne. Dziękujemy Alexandrowi Schmitzowi, kierownikowi Zakładu Cytometrii Masowej w Zakładzie Biomedycyny, za dyskusję i wsparcie. Ilustracje naukowe zostały stworzone przy użyciu Biorender.com. Praca ta została sfinansowana z grantu dla początkujących Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) oraz grantu dla początkujących (0071113) z Fundacji Novo Nordisk dla E.P.
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówka wirówkowa 15 ml | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| Igła 20 G | KDM | KD-fine 900123 | |
| 28 G, strzykawka insulinowa 0,5 mL | 329461 | ||
| 29 G, 0,3 ml | BD | 324702 | |
| Strzykawki 3 ml | Terumo medyczne | MDSS03SE | |
| 40 µ m sitka komórkowe | Fisher Scientific | 11587522 | |
| probówki polipropylenowe 5 mL | Fisher Scientific | 352002 | |
| probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml i mikro 35 &; m sitko do komórek | Falcon | 352235 | |
| strzykawki 5 ml | Terumo medical | SS05LE1 | |
| probówka wirówkowa 50 ml | Fisher Scientific | 05-539-13 | |
| 5-jodo-2-deoksyurydyna (IdU) | Merck | I7125-5g | |
| anty-CD104 FITC (klon: 346-11A) | Biolegend | 123605 | Stock = 0,5 mg/ml |
| anty-CD11b APC-Cy7 (klon: M1/70) | Biolegend | 101226 | Stock = 0,2 mg/ml |
| anty-CD31 APC-Cy7 (klon: 390) | Biolegend | 102440 | Stock = 0,2 mg/ml |
| anty-CD45 APC-Cy7 (klon: 30-F11) | Biolegend | 103116 | Stock = 0,2 mg/ml |
| anty-CD9 APC (klon: KMC8) | ThermoFisher Scientific | 17-0091-82 | Stock = 0,2 mg/ml |
| anty-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (klon: D7) | Biolegend | 108126 | Zapas = 0,2 mg/ml |
| anty-&alfa; 7 integryna PE (klon: R2F2))UBC | AbLab | 67-0010-05 | Stock = 1 mg / mL |
| BD FACS Aria III (4 lasery) instrument | BD Biosciences | N/A | 405, 488, 561 i 633 nm |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma Aldrich | A7030-50G | |
| Buprenorfina 0,3 mg / ml | Ceva | Vnr 054594 | |
| CD104 (klon: 346-11A) | BD Biosciences | 553745 | Dy162; Własna koniugacja |
| CD106/VCAM-1 (klon: 429 MVCAM. a) | Biolegend | 105701 | Er170; Własny sprzężony |
| CD11b (klon: M1/70) | BD Biosciences | 553308 | Nd148; Własna koniugacja |
| CD29/integryny β 1 (klon: 9EG7) | BD Biosciences | 553715 | Tm169; Własny sprzężony |
| CD31 (klon: MEC 13.3) | BD Biosciences | 557355 | Sm154; Własny sprzężony |
| CD34 (klon: RAM34) | BD Biosciences | 551387 | Lu175; Własna koniugacja |
| CD44 (klon: IM7) | BD Biosciences | 550538 | Yb171; Własny koniugowany |
| CD45 (klon: MEC 30-F11) | BD Biosciences | 550539 | Sm147; Własny koniugowany |
| CD9 (klon: KMC8) | Thermo Fisher Scientific | 14-0091-85 | Yb174; Własna koniugacja |
| CD90.2/Thy1.2 (klon: 30-H12) | BD Biosciences | 553009 | Nd144; Własna koniugacja |
| CD98 (klon: H202-141) | BD Biosciences | 557479 | Pr141; Własny sprzężony |
| roztwór do akwizycji komórek/bufor Maxpar CAS | Standard Biotools | 201240 | |
| Interkalator Cell-ID-Iridium | Standard Biotools | 201192B | Interkalator kationowych kwasów nukleinowych |
| Cisplatyna | Merck | P4394 | Pt195 |
| Cisplatyna (dichlorek cis-diaminyplatyny(II)) | Merck | P4394 | |
| Clear 1,5 ml probówka | Fisher Scientific | 11926955 | |
| Kolagenaza, typ II | Worthington Biochemical Corporation | LS004177 | |
| Komora licząca | Merck | BR718620-1EA | |
| CXCR4/SDF1 (klon: 2B11/CXCR4 ) | BD Biosciences | 551852 | Gd158; Własna sprzężona |
| DAPI (1 mg / ml) | BD Biosciences | 564907 | |
| Ciemna probówka 1,5 ml | Fisher Scientific | 15386548 | |
| Dispase II | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | |
| Nożyczki preparacyjne | Fine Science Tools | 14568-09 | |
| DMEM (niska glukoza, z pirogronianem) | Thermo Fisher Scientific | 11885-092 | |
| EDTA (sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego) | Merck | E5134 | Na2EDTA-2H20 |
| EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne (koraliki EQ) | Standardowe bionarzędzia | 201078 | Koraliki kalibracyjne |
| Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, pochodzenie z Brazylii | do 10270106 | Thermo Fisher Scientific | |
| Dumont #5SF | Fine Narzędzia naukowe | 11252-00 | |
| Kleszcze Dumont #7 | Hounisen.com | 1606.3350 | |
| Surowica kozia | Thermo Fisher Scientific | 16210-072 | |
| System Helios CyTOF | Standard Biotools | N/A | |
| Surowica dla koni, inaktywowana termicznie, pochodzenie z Nowej Zelandii | Thermo Fisher Scientific | 26-050-088 | |
| IdU | Merck | I7125 | I127 |
| Iridium-Intercalator | Standard Biotools | 201240 | Ir191/193 |
| Isoflurane/Attane Vet | ScanVet | Vnr 055226 | |
| Methanol | Fisher Scientific | M/3900/17 | |
| Myf5 (klon: C-20) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-302 | Yb173; Własny sprzężony |
| MyoD (klon: 5.8A) | BD Biosciences | 554130 | Dy164; Własny sprzężony |
| MyoG (klon: F5D) | BD Biosciences | 556358 | Gd160; Własnoręcznie sprzężona |
| sterylna jednorazowa butelka Nalgene Rapid-Flow 0,20 μ M PES Filters | Thermo Fisher Scientific | 595-4520 | |
| Notexin | Latoxan | L8104 | Zawieszenie do 50 &mikro; g/ml w sterylnym PBS. Utrzymuj zapasy (np. 50 i mikro; l) przy -20 ° C |
| Mieszanka składników odżywczych F-10 (Ham's) | Thermo Fisher Scientific | 31550031 | |
| pAkt (Klon: D9E) | Standard Biotools | 3152005A | Sm152 |
| Pax7 (Klon: PAX7) | Santa Cruz Biotechnology | Sc-81648 | Eu153; Własna sprzężona |
| penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml) (długopis/paciorkowiec) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Jednostki filtrujące PES 0,20 i mu; M | Fisher Scientific | 15913307 | |
| PES Filtr strzykawkowy | Fisher Scientific | 15206869 | |
| szalka Petriego | Sarstedt | 82.1472.001 | |
| PFA 16% klasy EM | MP Biomedicals | 219998320 | |
| Chlorek potasu (KCl) | Fisher Scientific | 10375810 | |
| Fosforan potasu, monozasadowy, bezwodny (KH2PO4) | Fisher Scientific | 10573181 | |
| pRb (klon: J112-906) | Standardowe narzędzia biologiczne | 3166011A | Er166 |
| kinaza pS6 (klon: N7-548) | Standardowe narzędzia biologiczne | 3172008A | Yb172 |
| Sca-1 (klon: E13-161.7) | BD Biosciences | 553333 | Nd142; Własny sprzężony |
| azydek sodu | Sigma Aldrich | S2002 | |
| Chlorek sodu (NaCl) | Fisher Scientific | 10553515 | |
| Fosforan sodu, dwuzasadowy, siedmiowodny (Na2HPO4-6H2O) | Merck | S9390 | |
| Sterylny roztwór soli fizjologicznej 0,9% | Fresenius | B306414/02 | |
| &alfa; 7 integryna (klon: 3C12) | MBL international | K0046-3 | Ho165; Koniugowane wewnętrznie |
Bibliografia
- Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462(2020).
- Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A. Or....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
