Artykuł metodologiczny

Identyfikacja i analiza progenitorów miogennych in vivo podczas ostrego uszkodzenia mięśni szkieletowych za pomocą wysokowymiarowej cytometrii masowej pojedynczej komórki

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65944

⸱

1 grudnia 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biomedicine, Aarhus University, 2Aarhus Institute of Advanced Studies, Aarhus University

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiony tutaj protokół umożliwia identyfikację i wielowymiarową analizę komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą jednokomórkowej cytometrii masowej oraz ich oczyszczanie przez FACS w celu dogłębnych badań ich funkcji. Podejście to można zastosować do badania dynamiki regeneracji w modelach chorobowych i testowania skuteczności interwencji farmakologicznych.

Streszczenie

Regeneracja mięśni szkieletowych to dynamiczny proces napędzany przez dorosłe komórki macierzyste mięśni i ich potomstwo. Przeważnie w stanie spoczynku w stanie ustalonym, dorosłe komórki macierzyste mięśni aktywują się po urazie mięśni. Po aktywacji rozmnażają się, a większość ich potomstwa różnicuje się, tworząc kompetentne do fuzji komórki mięśniowe, podczas gdy pozostałe odnawiają się, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych. Podczas gdy tożsamość komórek macierzystych mięśni została zdefiniowana ponad dekadę temu, w oparciu o koekspresję markerów powierzchniowych komórek, miogenne komórki progenitorowe zostały zidentyfikowane dopiero niedawno przy użyciu wielowymiarowych podejść jednokomórkowych. W tym miejscu przedstawiamy metodę cytometrii masowej pojedynczej komórki (cytometria według czasu przelotu [CyTOF]) do analizy komórek macierzystych i komórek progenitorowych w ostrym uszkodzeniu mięśni w celu wyjaśnienia dynamiki komórkowej i molekularnej, która rozwija się podczas regeneracji mięśni. Podejście to opiera się na jednoczesnym wykrywaniu nowych markerów powierzchniowych komórek i kluczowych miogennych czynników transkrypcyjnych, których dynamiczna ekspresja umożliwia identyfikację aktywowanych komórek macierzystych i populacji komórek progenitorowych, które stanowią punkty orientacyjne miogenezy. Co ważne, opisano strategię sortowania opartą na wykrywaniu markerów powierzchniowych komórek CD9 i CD104, umożliwiającą prospektywną izolację komórek macierzystych i progenitorowych mięśni za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) w celu dogłębnych badań ich funkcji. Komórki progenitorowe mięśni stanowią krytyczne brakujące ogniwo w badaniu kontroli losu komórek macierzystych mięśni, identyfikacji nowych celów terapeutycznych w chorobach mięśni i opracowywaniu zastosowań terapii komórkowej w medycynie regeneracyjnej. Przedstawione tutaj podejście można zastosować do badania komórek macierzystych i progenitorowych mięśni in vivo w odpowiedzi na zakłócenia, takie jak interwencje farmakologiczne ukierunkowane na określone szlaki sygnałowe. Może być również wykorzystany do badania dynamiki komórek macierzystych i progenitorowych mięśni w zwierzęcych modelach chorób mięśni, pogłębiając naszą wiedzę na temat chorób komórek macierzystych i przyspieszając rozwój terapii.

Wprowadzenie

Mięśnie szkieletowe stanowią największą pod względem masy tkankę w ciele i regulują wiele funkcji, od wzroku po oddychanie, od postawy do ruchu, a także metabolizm1. Dlatego utrzymanie integralności i funkcji mięśni szkieletowych ma kluczowe znaczenie dla zdrowia. Tkanka mięśni szkieletowych, która składa się z ciasno upakowanych wiązek wielojądrowych włókien mięśniowych otoczonych złożoną siecią nerwów i naczyń krwionośnych, wykazuje niezwykły potencjał regeneracyjny1,2.

Głównymi czynnikami regeneracji mięśni szkieletowych są dorosłe komórki macierzyste mięśni (MuSC). Znane również jako komórki satelitarne, ze względu na ich unikalne położenie anatomiczne w sąsiedztwie błony plazmatycznej włókna mięśniowego i poniżej blaszki podstawnej, zostały po raz pierwszy zidentyfikowane w 1961 roku3. MuSC wyrażają unikalny marker molekularny, sparowany czynnik transkrypcyjny pole 7 (Pax7)4. Przeważnie w stanie spoczynku u zdrowych osób dorosłych, aktywują się po uszkodzeniu mięśni i namnażają się, dając początek potomstwu, które (i) różnicuje się w kompetentne do fuzji komórki mięśniowe, które tworzą nowe włókna mięśniowe w celu naprawy uszkodzeń mięśni lub (ii) odnawiają się samoczynnie, aby uzupełnić pulę komórek macierzystych5.

Na poziomie komórkowym i molekularnym proces regeneracji jest dość dynamiczny i obejmuje przejścia między stanami komórkowymi, charakteryzujące się skoordynowaną ekspresją kluczowych miogennych czynników transkrypcyjnych, znanych również jako miogenne czynniki regulacyjne (MRF)6,7. Wcześniejsze badania rozwojowe in vivo, eksperymenty ze śledzeniem linii i prace nad hodowlami komórkowymi z użyciem mioblastów wykazały, że sekwencyjna ekspresja tych czynników transkrypcyjnych napędza miogenezę, przy czym czynnik miogenny 5 (Myf5) ulega ekspresji po aktywacji, ekspresja różnicowania miogennego 1 (MyoD1) oznacza zaangażowanie w program miogenny, a ekspresja miogeniny (MyoG) oznacza różnicowanie8,9,10,11,12,13,14. Pomimo tej wiedzy i odkrycia markerów powierzchniowych komórek do oczyszczania MuSC, brakuje strategii i narzędzi do identyfikacji i izolowania dyskretnych populacji wzdłuż ścieżki różnicowania miogennego oraz rozwiązywania progresji miogennej in vivo15,16,17,18.

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę, opartą na niedawno opublikowanych badaniach, która umożliwia identyfikację komórek macierzystych i progenitorowych w mięśniach szkieletowych oraz analizę ich dynamiki komórkowej, molekularnej i proliferacji w kontekście ostrego uszkodzenia mięśni19. Podejście to opiera się na cytometrii masowej pojedynczej komórki (znanej również jako cytometria czasu lotu [CyTOF]) w celu jednoczesnego wykrywania kluczowych markerów powierzchniowych komórek (integrynaα 7, CD9, CD44, CD98 i CD104), wewnątrzkomórkowych miogennych czynników transkrypcyjnych (Pax7, Myf5, MyoD i MyoG) oraz analogu nukleozydu (5-jodo-2′-deoksyurydyna, IdU), w celu monitorowania komórek w fazie S19, 20,21,22,23. Co więcej, w protokole przedstawiono strategię opartą na wykrywaniu dwóch markerów powierzchniowych komórek, CD9 i CD104, w celu oczyszczenia tych populacji komórek poprzez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS), umożliwiając w ten sposób przyszłe dogłębne badania ich funkcji w kontekście urazów i chorób mięśni. Podczas gdy pierwotne mioblasty były szeroko stosowane w przeszłości do badania późnych etapów różnicowania miogennego in vitro, nie wiadomo, czy podsumowują one stan molekularny komórek progenitorowych mięśni znalezionych in vivo24,25,26,27,28,29,30. Produkcja mioblastów jest pracochłonna i czasochłonna, a stan molekularny tej pierwotnej kultury zmienia się szybko podczas pasażu31. W związku z tym świeżo wyizolowane miogenne komórki progenitorowe oczyszczone tą metodą zapewnią bardziej fizjologiczny system do badania miogenezy i wpływu manipulacji genetycznych lub farmakologicznych ex vivo.

Przedstawiony tutaj protokół może być zastosowany do rozwiązywania różnych pytań badawczych, na przykład do badania dynamiki kompartmentu miogennego in vivo w zwierzęcych modelach chorób mięśni, w odpowiedzi na ostre manipulacje genetyczne lub interwencje farmakologiczne, pogłębiając w ten sposób nasze zrozumienie dysfunkcji komórek macierzystych mięśni w różnych kontekstach biologicznych i ułatwiając rozwój nowych interwencji terapeutycznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedury z udziałem zwierząt zostały zatwierdzone przez duńską inspekcję ds. eksperymentów na zwierzętach (protokół nr 2022-15-0201-01293), a doświadczenia przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu w Aarhus. Analgezja (buprenorfina) jest podawana w wodzie pitnej na 24 h przed urazem, aby myszy mogły przyzwyczaić się do jej smaku. Podawanie buprenorfiny w wodzie pitnej jest kontynuowane przez 24 h po urazie. Buprenorfina w wodzie pitnej po wstrzyknięciu noteksyny, wraz z podskórnym (s.c.) wstrzyknięciem buprenorfiny w momencie ostrego urazu mięśni, złagodzi ból związany z urazem. Chociaż zaleca się podanie buprenorfiny drogą s.c. w czasie ostrego urazu mięśni, a następnie podawanie jej w wodzie pitnej, podawanie buprenorfiny w wodzie pitnej przed urazem jest opcjonalne. Badacze muszą jednak przestrzegać standardów i wytycznych dotyczących dobrostanu zwierząt ustanowionych przez odpowiednią agencję regulacyjną.

UWAGA: W przypadku eksperymentów z zakresu cytometrii masowej pojedynczych komórek (CyTOF) w uszkodzonych mięśniach kończyn tylnych, należy rozpocząć od sekcji 1: Analgezja w wodzie 24 h przed uszkodzeniem mięśnia aż do 24 h po uszkodzeniu. W celu sortowania komórek macierzystych i progenitorowych mięśni u nieuszkodzonych myszy, należy wykonać sekcje 5 i 6: Eutanazja + Disekcja i dysocjacja mięśni szkieletowych, a następnie przejść do sekcji 11: Barwienie przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforami do FACS. Przegląd schematu doświadczalnego i protokołu przedstawiono na Rysunku 1.

1. Analgezja w wodzie na 24 h przed urazem mięśnia aż do 24 h po urazie

  1. Do ciemnej butelki do pojenia lub butelki owiniętej folią aluminiową dodać 3 mL buprenorfiny (0,3 mg/mL) i dopełnić do 100 mL wodą filtrowaną, aby uzyskać stężenie końcowe 0,009 mg/mL na 24 h przed urazem. Zamocować butelkę do klatki myszy.
  2. Usunąć butelkę z wodą 24 h po urazie i ponownie podłączyć klatkę myszy do systemu zaworów pojenia.

2. Przygotowanie do procedury ostrego urazu

UWAGA: Należy użyć 70% etanolu do dezynfekcji blatu roboczego, zestawu stożka nosowego oraz komory indukcyjnej.

  1. Przygotuj probówkę 1,5 mL z rozcieńczoną noteksyną w PBS (5 µg/mL). Rozcieńcz buprenorfinę (0,3 mg/mL) w sterylnej 0,9% soli fizjologicznej do stężenia 0,015 mg/mL w chronionej przed światłem probówce 1,5 mL. Przechowuj w lodzie. Przygotuj strzykawki insulinowe do iniekcji buprenorfiny (28 G, 0,5 mL) oraz noteksyny (29 G, 0,3 mL).
  2. Skonfiguruj jednostki anestezjologiczne oparte na izofluranie:
    1. Do znieczulenia w komorze indukcyjnej zastosuj 3% izofluran przy przepływie 1,5 L/min (50% O2, 50% powietrza atmosferycznego).
    2. Do podtrzymania znieczulenia z wykorzystaniem maski nosowej zastosuj 1,5% izofluran przy przepływie 0,6 L/min (50% O2, 50% powietrza atmosferycznego).

3. Ostre uszkodzenie poprzez wstrzyknięcie noteksyny

OSTRZEŻENIE: Noteksyna posiada aktywność fosfolipazy A2 i jest głównym składnikiem jadu australijskiego węża tygrysia (Notechis scutatus), a jej dożylna dawka LD50 u myszy wynosi 5–17 mg noteksyny/kg32,33. W niniejszym protokole do mięśnia piszczelowego przedniego (TA) każdej kończyny tylnej wstrzykuje się 10 µL noteksyny o stężeniu 5 mg/mL, a do mięśnia brzuchatego łydki (GA) każdej kończyny tylnej wstrzykuje się dwukrotnie (po jednej raz do każdej głowy mięśnia) 15 µL noteksyny o stężeniu 5 mg/mL. Ważne jest, aby prawidłowo wykonywać zastrzyki domięśniowe (i.m.), aby ograniczyć uszkodzenia, oraz często sprawdzać stan wstrzykniętych zwierząt, aby zapewnić im minimalny poziom bólu.

  1. Podaj znieczulenie myszy w komorze indukcyjnej (3% izofluranu). Gdy mysz straci przytomność, obniż stężenie izofluranu w komorze do 1,5%.
  2. Zważ i indywidualnie oznakuj myszy zgodnie z zatwierdzonymi procedurami instytucjonalnymi. Przy użyciu maski nosowej ogol kończyny tylne trymerem, a następnie przenieś zwierzę z powrotem do komory indukcyjnej.
  3. Oblicz objętość buprenorfiny dla każdej myszy: Wzór na obliczenie objętości, równanie wyznaczające Vol (µL) na podstawie masy z przeliczeniem masy.
  4. Wymieszaj roztwór noteksyny, pipetując go w górę i w dół. Przygotuj 2 strzykawki insulinowe (29 G, 0,3 mL) z 10 µL roztworu noteksyny (5 µg/mL) do wstrzykiwań w mięsień TA oraz 4 strzykawki insulinowe z 15 µL roztworu noteksyny (5 µg/mL) do wstrzykiwań w mięsień GA.
    UWAGA: Mięsień piszczelowy przedni (TA) znajduje się po stronie przedniej podudzia myszy, rozciągając się od kolana do kostki. Mięsień brzuchaty łydki (GA) to mięsień dwugłowy znajdujący się z tyłu podudzia, powierzchownie względem mięśnia płaszczowatego. Biegnie on od swoich dwóch głów (przyśrodkowej i bocznej) nieco powyżej kolana aż do pięty, obejmując łącznie trzy stawy (kolanowy, skokowy i podskokowy).
  5. Wykonaj wstrzyknięcia domięśniowe
    1. Wstrzyknięcie w TA (łącznie 2 wstrzyknięcia)
      1. Umieść mysz w pozycji na plecach pod maską nosową i zdezynfekuj miejsce wstrzyknięcia sterylnymi gazikami nasączonymi alkoholem (70% etanolu lub izopropanolu). Wprowadź igłę ściętą w dół do brzuszca mięśnia TA (dystalnie w stosunku do połowy brzuszca) pod kątem 30°. Przesuń igłę wzdłuż mięśnia, równolegle do kości piszczelowej, aż dotrzesz do środkowej części brzuszca TA. Wstrzyknij noteksynę powoli i w sposób ciągły, pozostawiając igłę w miejscu przez 10 s przed jej wyjęciem. Nie wprowadzaj igły zbyt głęboko na początku (aby uniknąć wstrzyknięcia noteksyny poniżej mięśnia TA do mięśnia prostownika palców długiego) oraz nie przesuwaj jej zbyt daleko proksymalnie (aby uniknąć wstrzyknięcia zbyt blisko kolana).
    2. Wstrzyknięcie w GA (łącznie 4 wstrzyknięcia)
      1. Wprowadź igłę ściętą w dół pod kątem ok. 45° w środkową część brzuszca bocznej głowy mięśnia GA. Wstrzyknij noteksynę powoli i w sposób ciągły, pozostawiając igłę w miejscu przez 10 s przed jej wyjęciem. Obróć kończynę tylną i wstrzyknij noteksynę w głowę przyśrodkową mięśnia GA w opisany wyżej sposób. Należy uważać, aby nie wprowadzić igły zbyt głęboko.
  6. Odwróć mysz i wstrzyknij buprenorfinę podskórnie (s.c.) za pomocą strzykawki insulinowej (28 G, 0,5 mL). Przenieś mysz do pustej klatki regeneracyjnej na płycie grzewczej. Tylko połowa dna klatki powinna znajdować się nad płytą grzewczą, aby umożliwić myszy termoregulację podczas wybudzania34. Powtórz kroki 3.3–3.6 dla pozostałych myszy.
  7. Gdy mysz w klatce regeneracyjnej całkowicie się obudzi, przenieś ją z powrotem do oryginalnej klatki. Wróć do stajni i uzupełnij mokrą karmę. Usuń butelkę z buprenorfiną 24 h po wstrzyknięciu.
  8. Monitoruj myszy przez 6 h po wstrzyknięciu noteksyny, a następnie co 12 h przez 2 dni pod kątem oznak bólu, upośledzonej mobilności i zmniejszonego spożycia pokarmu35,36.

4. Iniekcja 5-jodo-2’-deoksyurydyny

OSTRZEŻENIE: 5-jodo-2’-deoksyurydyna (IdU) jest podejrzana o wywoływanie wad genetycznych oraz uszkadzanie płodności lub płodu. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS). Podczas pracy należy stosować środki ochrony osobistej. Podczas odważania proszku IdU należy używać dygestorium. Materiały, które miały kontakt z IdU, należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.

UWAGA: Oznaczanie IdU in vivo jest stosowane do monitorowania podziałów komórkowych w czasie trwania urazu, ponieważ IdU, analog jodowanej tymidyny, wbudowuje się do DNA komórek w fazie S. IdU wstrzykuje się drogą dostryczynową (i.p.) w dawce 20 mg/kg masy ciała na 8 h przed uśmierceniem myszy.

  1. Użyj sonikatora w temperaturze 37 °C, aby przygotować roztwór zapasu IdU o stężeniu 2 mg/mL w sterylnym PBS. IdU jest światłoczułe; należy go użyć w tym samym dniu lub zamrozić w temperaturze -20 °C na maksymalnie 3 miesiące. W przypadku użycia zamrożonego IdU: rozmrozić, wymieszać w vortexie, odwirować przy 10 000 x g przez 30 s i wykorzystać nadfiltr do poniższych iniekcji.
  2. Zanurz mysz w narkozie w komorze indukcyjnej (3% izofluranu). Odnotuj oznaczenia uszne, zważ myszy i oblicz objętość roztworu IdU: Równanie obliczania objętości w mikrogramach; wzór: (masa(g) x 20μg/g)/(2μg/μL)=Vol(μL).
  3. Wykonaj iniekcję d.o. (dojellyną), używając strzykawki insulinowej (28 G, 0,5 mL), a następnie przenieś mysz do pustej klatki rekonwalescencyjnej na płycie grzejnej. Po przebudzeniu przenieś mysz z powrotem do oryginalnej klatki. Powtórz kroki 4.2–4.3 dla pozostałych myszy i zwróć je do stajni.

5. Eutanazja

UWAGA: Składy buforów znajdują się w Tabeli 1. Przygotować medium do płukania (Nutrient mixture F-10 (Ham's), 10% surowicy końskiej, 1x Pen/Strep) i przefiltrować przez membranę z polietersulfonu (PES) do pojemnika polistyrenowego. Przygotować bufor do dysocjacji (medium do płukania uzupełnione o 650 U/mL Collagenase, Type II) i przechowywać w lodzie. Pomiary w cytometrii masowej CyTOF są bardzo wrażliwe na zanieczyszczenia. Z tego powodu podczas przetwarzania próbek niezbędne jest stosowanie odczynników o najwyższej czystości analitycznej. Aby zapobiec zanieczyszczeniom metalami, zaleca się stosowanie sterylnych wyrobów plastikowych oraz nowej szklanej aparatury, która nie była myta detergentem, ponieważ wiele mydeł laboratoryjnych zawiera wysokie stężenia baru. Do przygotowania odczynników zaleca się stosowanie dwukrotnie filtrowanej, destylowanej wody dejonizowanej. Roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) jest przygotowywany wewnętrznie. Roztwory stokowe 10x należy rozcieńczyć do 1x, a następnie przefiltrować 1x PBS przez filtry 0,2 μm. 1x PBS należy przefiltrować ponownie na początku każdego eksperymentu. Narzędzi do sekcji nie wolno myć detergentem ze względu na obecność baru.

  1. Przygotować wagę, pojemnik oraz urządzenie do anestezji z izofluranem wraz z komorą indukcyjną. Zdezynfekować odpowiednie narzędzia do sekcji.
  2. Przygotować i opisać probówki 50 mL dla każdej myszy, wypełniając je 5 mL buforem do dysocjacji, oraz przygotować płytkę Petriego. Bufor do dysocjacji przechowywać w lodzie.
  3. Zanurzyć mysz w narkozie w komorze indukcyjnej (3% izofluranu, zwiększyć do 5% po utracie przytomności), a następnie przeprowadzić zwichnięcie szyi.

6. Disekcja i dysocjacja mięśni szkieletowych

  1. Wypreparuj mięśnie TA i GA z obu kończyn tylnych i przenieś je na pokrywkę szalki Petriego. Za pomocą nożyczek rozdrobnij tkankę na małe kawałki (~1 mm3). Przenieś do probówki 50 mL zawierającej 5 mL lodowatego buforu do dysocjacji. Przechowuj w lodzie.
  2. Powtórz procedurę eutanazji (krok 5.3) oraz procedurę wypreparowania i dysocjacji mięśni szkieletowych (krok 6.1), aż do przetworzenia wszystkich myszy.
  3. Podgrzej wstępnie wszystkie probówki z próbkami w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C (2 min), a następnie inkubuj przez 45 min z rotacją w inkubatorze (37 °C).
  4. Wymieszaj w wortexie i przemyj, dodając 10 mL medium płuczącego. Odwiruj (380 x g, 10 min, temperatura pokojowa [RT]) i odessij nadmiar cieczy do poziomu 4 mL.
  5. Dodaj 0,5 mL kolagenazy (1000 U/mL) i 0,5 mL dispazy (11 U/mL). Wymieszaj w wortexie i inkubuj przez 20 min z rotacją w temperaturze 37 °C (np. w inkubatorze). Odwiruj (380 x g, 1 min, RT) i resuspenduj za pomocą pipety 5 mL.
  6. Umieść sitka do komórek 40 µm w probówkach 50 mL i zwilż je wstępnie 5 mL medium płuczącego. Odessij i wypuść zawiesinę komórkową 10 razy, używając strzykawki 5 mL z igłą 20 G. Przefiltruj przez wstępnie zwilżone sitko 40 µm. Przemyj probówkę 50 mL za pomocą 10 mL medium płuczącego, przenieś zawartość na sitko 40 µm i odwiruj zawiesinę komórkową (380 x g, 10 min, 4 °C).

7. Barwienie żywe/martwe z zastosowaniem cisplatyny i fiksacją w paraformaldehydzie

OSTRZEŻENIE: Cisplatyna i paraformaldehyd (PFA) są rakotwórcze. Przed rozpoczęciem pracy należy zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS). Paraformaldehyd (PFA; 16%) drażni skórę, oczy i drogi oddechowe. Należy stosować środki ochrony osobistej i pracować z tymi substancjami pod wyciągiem. Podczas fiksacji komórek końcowe stężenie PFA wyniesie 1,6%. Należy podjąć odpowiednie środki ostrożności, a odpady utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami.

UWAGA: Przygotować zimne (4 °C) i ciepłe (37 °C) DMEM bez surowicy. Przygotować DMEM uzupełniony o 10% FBS, przefiltrować przez membranę PES do pojemnika polistyrenowego i przechowywać w lodzie. Przygotować PBS oraz pożywkę do barwienia komórek (CSM; PBS, 0,5% BSA, 0,02% azydku sodu) w szklanej butelce przeznaczonej do CyTOF i przefiltrować przez membranę PES. CSM można przechowywać w temperaturze 4 °C do 6 miesięcy.

  1. Odssać nadsącz, uderzyć w probówkę w celu rozbicia osadu i resuspender w 1 ml zimnej pożywki DMEM bez surowicy. Policzyć komórki i dostosować ich zagęszczenie do poziomu 1 x 106 komórek/ml w DMEM bez surowicy.
  2. Dodać roztwór zapasowy cisplatyny (25 mM) do stężenia końcowego wynoszącego 25 µMMieszaj w wibratorze (vortex) przez 10 s, a następnie inkubuj przez dokładnie 1 min (reakcja jest bardzo wrażliwa na czas). Przerwij reakcję, dodając lodowate medium DMEM z dodatkiem 10% FBS (trzykrotność objętości próbki), i przechowuj na lodzie. Odwiruj (380 x g, 10 min, 4 °C), odessać supernatant i dokładnie resuspendować osad (do 10 x 106 komórek/ml w CSM). Przesączyć zawiesinę przez 35 µm sitko do komórek
  3. Utrwal suspensję komórkową, dodając przefiltrowany roztwór zapasu PFA (16%), i wymieszaj poprzez pipetowanie (czynność należy wykonywać pod wyciągiem), aby uzyskać końcowe stężenie PFA (1,6%) (np. dodać 100 µL 16% PFA do 900 µL zawiesiny komórkowej). Mieszaj w wirówce typu vortex przez 30 s, inkubuj przez 10 min na lodzie, a następnie przemyj dwukrotnie 2 ml CSM poprzez wirowanie (800 x g, 5 min, temp. pokojowa).
    UWAGA: Na tym etapie próbki mogą zostać zamrożone szokowo na suchym lodzie i przechowywane w temperaturze -80 °C lub użyte bezpośrednio do barwienia przeciwciałem. Jeśli komórki mają zostać zamrożone, należy przenieść je do probówek polipropylenowych o pojemności 5 ml, ponieważ polistyren może pękać w niskich temperaturach. W przypadku użycia do barwienia świeżo utrwalonych komórek należy przejść do kroku 8.2.

8. Barwienie przeciwciałami sprzężonymi z metalami

OSTRZEŻENIE: Metanol (MeOH) jest wysoce łatwopalny i działa żrąco na drogi oddechowe. Przed użyciem zapoznaj się z kartą charakterystyki substancji (SDS). Stosuj środki ochrony osobistej i pracuj z tą substancją pod wyciągiem. Odpady utylizuj zgodnie z lokalnymi przepisami.

UWAGA: Listę przeciwciał (Ab) skierowanych przeciwko markerom powierzchniowym i wewnątrzkomórkowym można znaleźć w Tabeli 2.

Koniugacja przeciwciał: Większość przeciwciał użytych w tym protokole została skoniugowana wewnętrznie, ponieważ nie były one dostępne komercyjnie. Protokoły koniugacji przeciwciał z metalami zostały opublikowane wcześniej, a zestawy do koniugacji są obecnie dostępne w sprzedaży37,38. Immunoglobuliny klasy G (IgG) są kompatybilne z dostępnymi protokołami koniugacji. Bardzo ważne jest, aby formulacja przeciwciał stosowana do koniugacji z metalami była wolna od białek nośnikowych zawierających cysteinę (np. albuminy surowicy bydlęcej (BSA)), które mogą obniżyć wydajność koniugacji poprzez konkurowanie o wolne grupy maleimidowe polimeru oraz mogą zakłócać oznaczanie ilościowe przeciwciał skoniugowanych z metalem. Zawartość cysteiny w żelatynie jest znacznie niższa niż w BSA. Zaleca się jednak, aby w przypadku, gdy formulacja przeciwciał zawiera białka nośnikowe, zostały one usunięte przed koniugacją. Obecnie istnieje możliwość zamówienia od producenta przeciwciał wolnych od BSA i żelatyny. Małocząsteczkowe konserwanty (np. azotek sodu, glicerol i trehaloza) są kompatybilne z protokołami koniugacji z metalami37,38.

Miareczkowanie przeciwciał: Po każdym sprzężeniu z metalem należy przeprowadzić miareczkowanie przeciwciał w celu wyznaczenia optymalnego stężenia przeciwciał, które zapewni maksymalny stosunek sygnału do szumu. W celu miareczkowania przeciwciał należy wykonać 6-stopniowe dwukrotne rozcieńczenie seryjne i przeprowadzić barwienie zarówno próbek znanych z ekspresji (np. komórek mięśniowych, kontroli pozytywnych), jak i tych pozbawionych (kontroli negatywnych) analizowanego białka19,21,37,38.

Przygotuj świeży roztwór roboczy Cell-ID Intercalator-Ir (roztwór zapasowy = 500 μM; roztwór intercalator-ir), rozcieńczając roztwór zapasowy do stężenia 0,1 μM w PBS/1,6% PFA.

  1. rozmrozić zamrożone próbki przez 5 min w RT i odwirować (800 x g, 1 min, RT). Przemyć 2 mL CSM poprzez wirowanie (800 x g, 5 min, RT). 
  2. Przygotować 2,5x mieszaninę do barwienia przeciwciałami (Ab) powierzchniowymi w CSM. Odessać nadsącz do poziomu ~60 µL i dokładnie resuspendować osad. Zbarwić komórki, dodając 40 µL mieszaniny do barwienia Ab powierzchniowych i inkubując przez 1 h w RT. 
  3. Wstrząsać próbkami co 20 min w celu wymieszania. Przemyć dwukrotnie 1 mL CSM poprzez wirowanie (800 x g, 5 min, RT). Odessać nadsącz i wstrząsnąć osadem. 
    UWAGA: Jeśli barwienie wewnątrzkomórkowe nie jest wymagane, permeabilizacja metanolem nie jest konieczna. Jeśli jednak przeprowadzane jest tylko barwienie powierzchniowe, roztwór interkalatora-ir musi zostać rozcieńczony w buforze zawierającym środek permeabilizujący (np. bufor Maxpar fix and perm), aby przeniknąć przez błonę jądrową. Przejść do kroku 8.5 i rozcieńczyć Cell-ID Intercalator-Ir w buforze zawierającym środek permeabilizujący i 1,6% PFA. W przeciwnym razie kontynuować barwienie wewnątrzkomórkowe opisane poniżej.
    OSTROŻNIE: Iryd jest substancją niebezpieczną i należy zachować środki ostrożności podczas obchodzenia się z nim. Iryd jest łatwopalny i działa drażniąco na oczy/skórę. Należy unikać tworzenia i wdychania pyłów lub oparów. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Jednakże, mieszanina roztworu interkalatora-ir jest dostarczana w stężeniu <1% w wodzie, co zgodnie z globalnie zharmonizowanym systemem (GHS) klasyfikacji i oznakowania chemikaliów jest uznawane za bezpieczne. Przed użyciem należy zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS) firmy Standard Biotools. Podczas pracy należy stosować osobiste środki ochrony indywidualnej. Materiały, które miały kontakt z roztworem interkalatora-ir, należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.
  4. Aby przeprowadzić permeabilizację komórek, dodać kroplami 0,5 mL lodowatego MeOH podczas mieszania w wortexie. Inkubować przez 15 min na lodzie pod wyciągiem. Odwirować (800 x g, 5 min, RT), a następnie przemyć dwukrotnie 1 mL CSM poprzez wirowanie (800 x g, 5 min, RT). Po ostatnim przemyciu odessać nadsącz do poziomu ~60 µL i dokładnie resuspendować osad.
  5. Przygotować 2,5x mieszaninę do barwienia przeciwciałami (Ab) wewnątrzkomórkowymi w CSM. Zbarwić komórki, dodając 40 µL mieszaniny do barwienia Ab wewnątrzkomórkowych i inkubując przez 1 h w RT. Wstrząsać próbkami co 20 min w celu wymieszania.
  6. Przemyć dwukrotnie 1 mL CSM poprzez wirowanie (800 x g, 5 min, RT). Odessać nadsącz i wstrząsnąć osadem. Resuspendować próbki w 0,5 mL roztworu interkalatora-irydowego (Tabela 1) i wymieszać w wortexie. Inkubować próbki przez 1 h w RT lub przez noc (O/N) w 4 °C (patrz uwaga poniżej).
    UWAGA: Próbki mogą być przechowywane w roztworze interkalatora-irydowego w 4 °C do 48 h. Protokół barwienia zastosowany w tej pracy został opracowany w oparciu o pionierskie prace laboratorium Nolana{C}23. Różni się on od protokołów Standard Biotools tym, że (i) do przemywania i barwienia stosowane są bufory przygotowane wewnętrznie, (ii) komórki są utrwalane przed barwieniem powierzchniowym oraz (iii) komórki są permeabilizowane metanolem do barwienia wewnątrzkomórkowego przeciwko czynnikom transkrypcyjnym lub cząsteczkom sygnałowym. Badacze opracowujący nowy protokół muszą dokładnie przetestować kompatybilność swojego panelu przeciwciał z metanolem jako środkiem permeabilizującym. Przy dodawaniu nowych przeciwciał do panelu zaleca się sprawdzenie specyficzności przeciwciał za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem próbek kontrolnych dodatnich i ujemnych przed koniugacją z metalem i miareczkowaniem.

9. Przygotowanie próbek do załadunku do cytometru masowego

UWAGA: Osady komórkowe w buforze CAS są bardzo luźne (Tabela materiałów). Podczas płukania buforem CAS nie odsysaj cieczy do całkowitej suchości. Zamiast tego pozostaw objętość resztkową, zgodnie z opisem poniżej.

  1. Wymieszać w wirówce typu vortex i odwirować (800 x g, 10 min, temp. pokojowa) próbki. Odlać nadsącz (utylizować jako odpad zawierający PFA) i wymieszać w wstrząsarku vortex.
  2. Przemyć 1 ml CSM poprzez wirowanie (800 x g, 10 min, temp. pokojowa). Odessać nadsącz i zawiesić osad poprzez delikatne uderzanie w dno probówki.
  3. Przemyć 1 ml buforu CAS poprzez wirowanie (800 x g, 10 min, temp. pokojowa). Odessać do poziomu ~200 µLWymieszać w wstrząsarce wirowej i dodać 1 ml buforu CAS. Wyjąć 5 µL alikwot do zliczenia komórek. Wirować (800 x g, 10 min, temp. pokoj.), a następnie ostrożnie odessać do ≤50 µLNie naruszać osadu.
  4. Resuspendować osad do stężenia 1–2 x 106 komórek/ml w buforze CAS i dodać kuleczki kalibracyjne (1x; Tabela materiałów) do stężenia końcowego 0,1x (np. dodać 100 µL kulek kalibracyjnych 1x do 900 µL zawiesiny komórkowej). 
  5. Wprowadź próbkę do cytometru masowego i zbierz dane, stosując szybkość przepływu na poziomie 400–500 komórek/s.
  6. Przeprowadź normalizację danych z plików FCS, korzystając z oprogramowania CyTOF lub wcześniej opracowanych narzędzi do normalizacji39.
    UWAGA: Obsługa cytometrów masowych CyTOF jest specyficzna dla danego urządzenia40,41Zaleca się zapoznanie z instrukcją obsługi CyTOF przed rozpoczęciem pracy. Kule kalibracyjne to standardowe polistyrenowe kule normalizacyjne z zatopionymi metalami, zawierające znane stężenia izotopów metali: ceru (140/142Ce), europu (151/153Eu), holmu (165Ho) i lutetu (175/176Lu). Kule kalibracyjne umożliwiają kontrolę czułości urządzenia, która może zmieniać się w czasie, przede wszystkim z powodu gromadzenia się materiału biologicznego oraz wahań w jonizacji plazmy.

10. Analiza danych CyTOF

UWAGA: W celu przeprowadzenia dalszych analiz, znormalizowane pliki FCS można analizować lokalnie lub przesłać do rozwiązań programistycznych w chmurze, takich jak Cytobank, Cell Engine, OMIQ lub FCS Express42.

  1. W razie potrzeby połącz poszczególne pliki FCS dla każdej próbki w jeden plik.
  2. Zidentyfikuj pojedyncze komórki poprzez bramkowanie zdarzeń pozytywnych dla irydu-interkalatora, co umożliwia odróżnienie pojedynczych komórek jądrzastych od debris lub dubletów.
  3. Wyznacz bramkę dla żywych komórek, wybierając zdarzenia negatywne dla cisplatyny. Cisplatyna wiąże się kowalencyjnie z białkami komórkowymi i znakuje komórki obumierające i martwe z uszkodzonymi błonami w większym stopniu niż komórki żywe43.
  4. Wyznacz bramkę dla populacji docelowej, na przykład przedziału miogennego (Live/CD45-/CD31-/Sca1-/α7integrin+/CD9+) (Rycina 2A) i określ względną proporcję komórek macierzystych i progenitorowych. Podejście to wymaga uprzedniej wiedzy na temat ekspresji markerów powierzchniowych lub wewnątrzkomórkowych w celu zdefiniowania poszczególnych populacji.
  5. Aby przeprowadzić analizę wielowymiarową, która umożliwi identyfikację wcześniej niezidentyfikowanych rzadkich podzbiorów komórek w złożonej populacji, wyeksportuj populację docelową i zastosuj algorytmy klasteryzacji opracowane specjalnie do analizy danych CyTOF44.
    UWAGA: W poprzednich pracach zastosowano algorytm X-shift, który wykorzystuje ważoną estymację gęstości k-najbliższych sąsiadów (kNN-DE) w przestrzeni wielowymiarowej do przeprowadzania nienadzorowanej klasteryzacji w oparciu o zdefiniowane parametry19. Wykazano, że X-shift jest wysoce skuteczny w identyfikowaniu rzadkich populacji komórek45.
  6. Do analizy X-shift pobierz pakiet oprogramowania vortex (ze strony GitHub laboratorium Nolana [https://github.com/nolanlab/vortex]) oraz Java 64-bit46. Instrukcje znajdują się tutaj: https://github.com/nolanlab/vortex/wiki/Getting-Started.
  7. Prześlij wyeksportowane populacje komórek do lokalnej bazy danych i zdefiniuj parametry klasteryzacji. Wśród parametrów definiowanych przez użytkownika znajdują się (i) markery użyte do klasteryzacji, (ii) zakres wartości k (np. od 5 do 150) oraz (iii) liczba etapów klasteryzacji.
    UWAGA: W poprzednich pracach jako markery klasteryzacji zastosowano kombinację markerów powierzchniowych znanych z ekspresji w komórkach macierzystych mięśni, nowych markerów powierzchniowych zidentyfikowanych w wysokoprzepustowym screeningu cytometrycznym komórek mięśniowych i mioblastów oraz miogennych czynników transkrypcyjnych (TFs) znanych z definiowania różnych etapów miogenezy. Podejście to umożliwiło identyfikację dwóch markerów powierzchniowych, CD9 i CD104, których wzorzec koekspresji odróżnia wcześniej niezidentyfikowane populacje komórek progenitorowych19. Staranny dobór markerów klasteryzacji pozwoli badaczowi odpowiedzieć na konkretne pytania badawcze. Na przykład, jeśli pożądana jest identyfikacja i analiza w czasie podzbiorów komórek dzielących się, zaleca się uwzględnienie IdU jako jednego z markerów klasteryzacji. X-shift może przeprowadzać klasteryzację dla wielu wartości k i automatycznie identyfikować, poprzez obliczenie „punktu łokcia” (elbow point), wartość k, która skutkuje optymalną liczbą klastrów, zapobiegając tym samym niedostatecznej klasteryzacji lub nadmiernej fragmentacji. Zaleca się obliczyć punkt łokcia i zastosować analizę klasteryzacji zdefiniowaną przez optymalną wartość k do wizualizacji danych i dalszych zastosowań.
  8. Aby zwizualizować relacje przestrzenne między populacjami komórek w klastrach X-shift, wykonaj układ sterowany siłami (force-directed layout), który wygeneruje mapę 2D, gdzie odległość między klastrami wskazuje ich podobieństwo w ekspresji markerów w wielowymiarowej przestrzeni fenotypowej. Poprzez kolorowanie mapy za pomocą jednego markera na raz, możliwe jest odkrywanie nowych populacji komórek i śledzenie ich dynamiki. Zaleca się późniejszą kwantyfikację poprzez ręczne bramkowanie w oprogramowaniu takim jak Cytobank i Cell Engine.
  9. Przeprowadź analizę mapy ciepła (heatmap), aby określić dynamiczną ekspresję wielu białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych w całym przebiegu czasowym i ujawnić nowe trendy.
    UWAGA: Podczas przeprowadzania analizy przebiegu czasowego po urazie możliwe jest wspólne klastrowanie danych ze wszystkich punktów czasowych w celu wygenerowania mapy regeneracji. Dodatkowo taką mapę można podzielić na poszczególne punkty czasowe, aby śledzić komórkową i molekularną dynamikę regeneracji w czasie19.

11. Barwienie przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami do analizy FACS

UWAGA: Komórki wykorzystywane do kontroli niebarwionych, jednobarwnych oraz kontroli fluorescence minus one (FMO) mogą pochodzić z zestawu mięśni TA i GA od dodatkowej myszy, jeśli jest ona dostępna. Alternatywnie można wypreparować mięsień czworogłowy uda (przedni mięsień uda) i poddać go trawieniu w celu uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek, postępując zgodnie z tą samą procedurą, co w przypadku powyższego zestawu TA+GA, a następnie wykorzystać je jako kontrole. Przygotować bufor FACS (PBS, 2,5% surowicy koziej, 2 mM EDTA), przefiltrować go przez membranę PES do pojemnika polistyrenowego i przechowywać w lodzie. Bufor FACS można przechowywać w temperaturze 4 °C do 1 miesiąca. Listę przeciwciał wykorzystywanych do analizy FACS znajduje się w Tabeli 3.

  1. Przygotować mieszaninę lineage. Barwić każdą kontrolę w 50 µL (zawierających ok. 3–5 x 105 komórek). Obliczyć ilość potrzebnej mieszaniny lineage. Przygotować nadwyżkę objętościową rzędu 20%–30%. Stężenie zapasowe przeciwciał użytych do mieszaniny lineage wynosi 0,2 mg/mL.
    1. Do probówki 0,5 mL dodać przeciwciała anti-CD45 APC-Cy7, anti-CD31 APC-Cy7, anti-Sca1 APC-Cy7 oraz anti-CD11b APC-Cy7, aby osiągnąć końcowe stężenia odpowiednio 1 µg/mL, 2,5 µg/mL, 2,5 µg/mL i 0,63 µg/mL.
  2. Przygotować mieszaninę all-stain. Barwić każdą próbkę all-stained w 500 µL (zawierających ok. 3–5 x 106 komórek). Przygotować 10% nadwyżkę objętościową mieszaniny all-stain.
    1. Do probówki 1,5 mL dodać przeciwciała z mieszaniny lineage (jak powyżej) + przeciwciała anti-α7 integrin PE, anti-CD9 APC oraz anti-CD104 FITC, aby osiągnąć końcowe stężenia odpowiednio 2 µg/mL, 1,2 µg/mL i 3 µg/mL.
  3. Przygotować bufor FACS + DAPI: do 10 mL buforu FACS dodać 1 µL DAPI (stężenie zapasowe = 1 mg/mL), aby uzyskać końcowe stężenie DAPI 100 ng/mL.
    OSTROŻNIE: DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) jest klasyfikowany jako potencjalny drażniacz skóry i dróg oddechowych. Jednak roztwór DAPI o stężeniu <1% jest uważany za bezpieczny zgodnie z GHS. Przed użyciem zapoznać się z kartą charakterystyki (SDS). Podczas pracy należy stosować środki ochrony osobistej. Materiały, które miały kontakt z DAPI, należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami bezpieczeństwa.
  4. Resuspendować komórki z sekcji 6: Disekcja i dysocjacja mięśni szkieletowych:
    1. W przypadku próbek all-stained resuspendować zestawy TA i GA z jednej myszy w 500 µL buforu FACS i przenieść do probówek 15 mL do barwienia.
    2. W przypadku kontroli użyć zestawów TA i GA lub zestawów z mięśnia czworogłowego. Jeśli do kontroli używana jest 1 mysz, resuspendować komórki w 750 µL buforu FACS. W przypadku wielu myszy resuspendować każdy zestaw TA i GA lub zestaw z mięśnia czworogłowego w 500 µL buforu FACS i połączyć zestawy w jedną próbkę 1 mL, pobierając frakcję z każdej próbki. Dodać 50 µL komórek kontrolnych (3–5 x 105 komórek) do polipropylenowych probówek 5 mL do barwienia.
  5. Barwić zgodnie z opisem w Tabeli 4 przez 45 min w temperaturze 4 °C w ciemności.
  6. Przemyć próbki all-stained, dodając 5 mL buforu FACS. Przemyć kontrole, dodając 1 mL buforu FACS, a następnie odwirować (380 x g, 10 min, 4 °C).
  7. Resuspendować próbki all-stained w 1 mL buforu FACS + DAPI. Resuspendować kontrole w 300 µL buforu FACS z dodatkiem DAPI lub bez.
  8. Przechowywać komórki w temperaturze 4 °C w ciemności do czasu sortowania na cytometrze przepływowym z 4 laserami (405 nm, 488 nm, 561 nm, 633 nm).
  9. Analizować kontrole i próbki na sorterze i stworzyć bramki sortowania za pomocą odpowiedniego oprogramowania. Dla kontroli niebarwionych/jednokolorowych oraz kontroli FMO zarejestrować odpowiednio 1 x 104 i 0,3–1 x 105 zdarzeń. Dla próbek all-stained zarejestrować do 1 x 106 zdarzeń. Posortować wszystkie próbki all-stained lub tyle, ile jest wymagane do dalszych analiz. W przypadku użytego tutaj cytometru przepływowego (FACSAria III) sortować w Trybie Purity (Purity Mode) przy użyciu dyszy 70 mm.
  10. Strategię bramkowania przedstawiono na Rysunku 4.
    1. Użyć kontroli niebarwionych i jednokolorowych do ustawienia napięcia dla wszystkich detektorów.
    2. Użyć kontroli jednokolorowych do skonfigurowania macierzy kompensacji.
    3. Użyć kontroli FMO do ustalenia bramek sortowania.
  11. Wyodrębnione populacje komórek macierzystych i progenitorowych mięśni sortować do schłodzonego do lodu buforu FACS.
  12. Odwirować populacje komórek (380 x g, 10 min, 4 °C). Resuspendować w odpowiednim buforze, policzyć i kontynuować dalsze analizy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiamy przegląd konfiguracji eksperymentalnej dla zastosowania tego połączonego podejścia, które obejmuje (i) wielowymiarową analizę CyTOF w czasie po wystąpieniu ostrego urazu wywołanego wstrzyknięciem noteksyny, w celu zbadania dynamiki komórkowej i molekularnej komórek macierzystych i progenitorowych w mięśniach szkieletowych (Rycina 1, schemat górny); oraz (ii) FACS komórek macierzystych i progenitorowych z wykorzystaniem dwóch markerów powierzchniowych, CD9 i C...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Regeneracja mięśni szkieletowych to dynamiczny proces, który opiera się na funkcji dorosłych komórek macierzystych. Podczas gdy wcześniejsze badania koncentrowały się na roli komórek macierzystych mięśni podczas regeneracji, ich potomstwo in vivo było niedostatecznie zbadane, głównie z powodu braku narzędzi do identyfikacji i izolacji tych populacji komórek 15,16,17,18. W tym miejscu p...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy członkom FACS Core Facility na Wydziale Biomedycyny Uniwersytetu w Aarhus za wsparcie techniczne. Dziękujemy Alexandrowi Schmitzowi, kierownikowi Zakładu Cytometrii Masowej w Zakładzie Biomedycyny, za dyskusję i wsparcie. Ilustracje naukowe zostały stworzone przy użyciu Biorender.com. Praca ta została sfinansowana z grantu dla początkujących Aarhus Universitets Forskningsfond (AUFF) oraz grantu dla początkujących (0071113) z Fundacji Novo Nordisk dla E.P.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówka wirówkowa 15 mlFisher Scientific07-200-886
Igła 20 GKDMKD-fine 900123
28 G, strzykawka insulinowa 0,5 mL 329461
29 G, 0,3 mlBD324702
Strzykawki 3 mlTerumo medyczneMDSS03SE
40 µ m sitka komórkoweFisher Scientific11587522
probówki polipropylenowe 5 mL Fisher Scientific352002
probówki z polistyrenu o pojemności 5 ml i mikro 35 &; m sitko do komórekFalcon352235
strzykawki 5 mlTerumo medicalSS05LE1
probówka wirówkowa 50 mlFisher Scientific05-539-13
5-jodo-2-deoksyurydyna (IdU)MerckI7125-5g
anty-CD104 FITC (klon: 346-11A)Biolegend123605Stock = 0,5 mg/ml
anty-CD11b APC-Cy7 (klon: M1/70)Biolegend101226Stock = 0,2 mg/ml
anty-CD31 APC-Cy7 (klon: 390)Biolegend102440Stock = 0,2 mg/ml
anty-CD45 APC-Cy7 (klon: 30-F11)Biolegend103116Stock = 0,2 mg/ml
anty-CD9 APC (klon: KMC8)ThermoFisher Scientific17-0091-82Stock = 0,2 mg/ml
anty-Sca1 (Ly6A/E) APC-Cy7 (klon: D7)Biolegend108126Zapas = 0,2 mg/ml
anty-&alfa; 7 integryna PE (klon: R2F2))UBCAbLab67-0010-05Stock = 1 mg / mL
BD FACS Aria III (4 lasery) instrumentBD BiosciencesN/A405, 488, 561 i 633 nm
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA7030-50G
Buprenorfina 0,3 mg / mlCevaVnr 054594
CD104 (klon: 346-11A)BD Biosciences553745Dy162; Własna koniugacja
CD106/VCAM-1 (klon: 429 MVCAM. a)Biolegend105701Er170; Własny sprzężony
CD11b (klon: M1/70)BD Biosciences553308Nd148; Własna koniugacja
CD29/integryny β 1 (klon: 9EG7)BD Biosciences553715Tm169; Własny sprzężony
CD31 (klon: MEC 13.3)BD Biosciences557355Sm154; Własny sprzężony
CD34 (klon: RAM34)BD Biosciences551387Lu175; Własna koniugacja
CD44 (klon: IM7)BD Biosciences550538Yb171; Własny koniugowany
CD45 (klon: MEC 30-F11)BD Biosciences550539Sm147; Własny koniugowany
CD9 (klon: KMC8)Thermo Fisher Scientific14-0091-85Yb174; Własna koniugacja
CD90.2/Thy1.2 (klon: 30-H12)BD Biosciences553009Nd144; Własna koniugacja
CD98 (klon: H202-141)BD Biosciences557479Pr141; Własny sprzężony
roztwór do akwizycji komórek/bufor Maxpar CASStandard Biotools201240
Interkalator Cell-ID-IridiumStandard Biotools201192BInterkalator kationowych kwasów nukleinowych
CisplatynaMerckP4394Pt195
Cisplatyna (dichlorek cis-diaminyplatyny(II))MerckP4394
Clear 1,5 ml probówkaFisher Scientific11926955
Kolagenaza, typ IIWorthington Biochemical CorporationLS004177
Komora liczącaMerckBR718620-1EA
CXCR4/SDF1 (klon: 2B11/CXCR4 )BD Biosciences551852Gd158; Własna sprzężona
DAPI (1 mg / ml)BD Biosciences564907
Ciemna probówka 1,5 mlFisher Scientific15386548
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Nożyczki preparacyjneFine Science Tools14568-09
DMEM (niska glukoza, z pirogronianem)Thermo Fisher Scientific11885-092
EDTA (sól disodowa kwasu etylenodiaminotetraoctowego)MerckE5134Na2EDTA-2H20
EQ Czteroelementowe koraliki kalibracyjne (koraliki EQ)Standardowe bionarzędzia201078Koraliki kalibracyjne
Surowica bydlęca płodu, kwalifikowana, pochodzenie z Brazyliido 10270106Thermo Fisher Scientific
Dumont #5SFFine Narzędzia naukowe11252-00
Kleszcze Dumont #7Hounisen.com1606.3350
Surowica koziaThermo Fisher Scientific16210-072
System Helios CyTOFStandard BiotoolsN/A
Surowica dla koni, inaktywowana termicznie, pochodzenie z Nowej ZelandiiThermo Fisher Scientific26-050-088
IdUMerckI7125I127
Iridium-IntercalatorStandard Biotools201240Ir191/193
Isoflurane/Attane VetScanVetVnr 055226
MethanolFisher ScientificM/3900/17
Myf5 (klon: C-20)Santa Cruz BiotechnologySc-302Yb173; Własny sprzężony
MyoD (klon: 5.8A)BD Biosciences554130Dy164; Własny sprzężony
MyoG (klon: F5D)BD Biosciences556358Gd160; Własnoręcznie sprzężona
sterylna jednorazowa butelka Nalgene Rapid-Flow 0,20 μ M PES FiltersThermo Fisher Scientific595-4520
NotexinLatoxanL8104Zawieszenie do 50 &mikro; g/ml w sterylnym PBS. Utrzymuj zapasy (np. 50 i mikro; l) przy -20 ° C
Mieszanka składników odżywczych F-10 (Ham's)Thermo Fisher Scientific31550031
pAkt (Klon: D9E)Standard Biotools3152005ASm152
Pax7 (Klon: PAX7)Santa Cruz BiotechnologySc-81648Eu153; Własna sprzężona
penicylina-streptomycyna (10 000 U/ml) (długopis/paciorkowiec)Thermo Fisher Scientific15140122
Jednostki filtrujące PES 0,20 i mu; MFisher Scientific15913307
PES Filtr strzykawkowyFisher Scientific15206869
szalka PetriegoSarstedt82.1472.001
PFA 16% klasy EMMP Biomedicals219998320
Chlorek potasu (KCl)Fisher Scientific10375810
Fosforan potasu, monozasadowy,  bezwodny (KH2PO4)Fisher Scientific10573181
pRb (klon: J112-906)Standardowe narzędzia biologiczne3166011AEr166
kinaza pS6 (klon: N7-548)Standardowe narzędzia biologiczne3172008AYb172
Sca-1 (klon: E13-161.7)BD Biosciences553333Nd142; Własny sprzężony
azydek soduSigma AldrichS2002
Chlorek sodu (NaCl)Fisher Scientific10553515
Fosforan sodu, dwuzasadowy, siedmiowodny (Na2HPO4-6H2O)MerckS9390
Sterylny roztwór soli fizjologicznej 0,9%FreseniusB306414/02
&alfa; 7 integryna (klon: 3C12)MBL internationalK0046-3Ho165; Koniugowane wewnętrznie
Strzykawka insulinowa BD Kleszcze

Bibliografia

  1. Mukund, K., Subramaniam, S. Skeletal muscle: A review of molecular structure and function in health and disease. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 12 (1), e1462(2020).
  2. Feige, P., Brun, C. E., Ritso, M., Rudnicki, M. A. Orienting muscle stem cells for regeneration in homeostasis, aging, and disease. Cell Stem Cell. 23 (5), 653-664 (2018).
  3. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J Biophys Biochem Cytol. 9 (2), 493-495 (1961).
  4. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102 (6), 777-786 (2000).
  5. Fuchs, E., Blau, H. M. Tissue stem cells: Architects of their niches. Cell Stem Cell. 27 (4), 532-556 (2020).
  6. Hernández-hernández, J. M., et al. The myogenic regulatory factors, determinants of muscle development, cell identity and regeneration. Semin Cell Dev Biol. 72, 10-18 (2017).
  7. Zammit, P. S. Function of the myogenic regulatory factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in skeletal muscle, satellite cells and regenerative myogenesis. Semin Cell Dev Biol. 72, 19-32 (2017).
  8. Sabourin, L. A. The molecular regulation of myogenesis. Clin Genet. 57 (1), 16-25 (2000).
  9. Cooper, R. N., et al. In vivo satellite cell activation via Myf5 and MyoD in regenerating mouse skeletal muscle. J Cell Sci. 112 (17), 2895-2901 (1999).
  10. Rudnicki, M. A., Jaenisch, R. The MyoD family of transcription factors and skeletal myogenesis. Bioessays. 17 (3), 203-209 (1995).
  11. Braun, T., Arnold, H. H. Inactivation of Myf-6 and Myf-5 genes in mice leads to alterations in skeletal muscle development. EMBO J. 14 (6), 1176-1186 (1995).
  12. Yablonka-Reuveni, Z. Development and postnatal regulation of adult myoblasts. Microsc Res Tech. 30 (5), 366-380 (1995).
  13. Braun, T., et al. MyoD expression marks the onset of skeletal myogenesis in Myf-5 mutant mice. Development. 120 (11), 3083-3092 (1994).
  14. Rudnicki, M. A., et al. MyoD or Myf-5 is required for the formation of skeletal muscle. Cell. 75 (7), 1351-1359 (1993).
  15. Montarras, D., et al. Developmental biology: Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
  16. Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells. Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).
  17. Cerletti, M., et al. Highly efficient, functional engraftment of skeletal muscle stem cells in dystrophic muscles. Cell. 134 (1), 37-47 (2008).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Porpiglia, E., et al. High-resolution myogenic lineage mapping by single-cell mass cytometry. Nat Cell Biol. 19 (5), 558-567 (2017).
  20. Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry Part A. 81 (7), 552-566 (2012).
  21. Hartmann, F. J., et al. Mass Cytometry: Methods and Protocols. , Springer, Humana. New York, NY. (2019).
  22. Devine, R. D., Behbehani, G. K. Use of the pyrimidine analog, 5-iodo-2'-deoxyuridine (IdU) with cell cycle markers to establish cell cycle phases in a mass cytometry platform. J Vis Exp. (176), e60556(2021).
  23. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  24. Nag, A. C., Foster, J. D. Myogenesis in adult mammalian skeletal muscle in vitro. J Anat. 132, Pt 1 1-18 (1981).
  25. Le Moigne, A., et al. Characterization of myogenesis from adult satellite cells cultured in vitro). Int J Dev Biol. 34, 171-180 (1990).
  26. Yablonka-Reuveni, Z. Development and postnatal regulation of adult myoblasts. Microsc Res Tech. 30 (5), 366-380 (1995).
  27. Chu, C., Cogswell, J., Kohtz, D. S. MyoD functions as a transcriptional repressor in proliferating myoblasts. J Biol Chem. 272 (6), 3145-3148 (1997).
  28. Shah, B., Hyde-Dunn, J., Jones, G. E. Proliferation of murine myoblasts as measured by bromodeoxyuridine incorporation. Methods in Mol Biol. 75, 349-355 (1997).
  29. Springer, M. L., Blau, H. M. High-efficiency retroviral infection of primary myoblasts. Somat Cell Mol Genet. 23 (3), 203-209 (1997).
  30. Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).
  31. Springer, M. L., Rando, T. A., Blau, H. M. Gene delivery to muscle. Curr Protoc Hum Genet. , Chapter 13, Unit13.4 (2002).
  32. Cull-Candy, S. G., Fohlman, J., Gustavsson, D., Lullmann-Rauch, R., Thesleff, S. The effects of taipoxin and notexin on the function and fine structure of the murine neuromuscular junction. Neuroscience. 1 (3), 175-180 (1976).
  33. Francis, B., John, T. R., Seebart, C., Kaiser, I. I. New toxins from the venom of the common tiger snake (Notechis scutatus scutatus). Toxicon. 29 (1), 85-96 (1991).
  34. Navarro, K. L., Huss, M., Smith, J. C., Sharp, P., Marx, J. O., Pacharinsak, C. Mouse Anesthesia: The Art and Science. ILAR Journal. 62, Issue 1-2, 2021 238-273 (2021).
  35. Langford, D., Bailey, A., Chanda, M., et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse. Nat Methods. 7, 447-449 (2010).
  36. Matsumiya, L. C., Sorge, R. E., Sotocinal, S. G., Tabaka, J. M., Wieskopf, J. S., Zaloum, A., King, O. D., Mogil, J. S. Using the Mouse Grimace Scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012 (1), PMID: 22330867; PMCID: PMC3276965 42-49 (2012).
  37. Gonzalez, V. D., et al. High-grade serous ovarian tumor cells modulate NK cell function to create an immune-tolerant microenvironment. Cell Rep. 36 (9), 109632(2021).
  38. Delgado-Gonzalez, A., et al. Measuring trogocytosis between ovarian tumor and natural killer cells. STAR Protoc. 3 (2), 101425(2022).
  39. Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).
  40. Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. (69), e4398(2012).
  41. McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. Sample preparation for mass cytometry analysis. J Vis Exp. (122), e54394(2017).
  42. Kotecha, N., Krutzik, P. O., Irish, J. M. Web-based analysis and publication of flow cytometry experiments. Curr Protoc Cytom. , Chapter 10., Uni10.17 (2010).
  43. Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).
  44. Kimball, A. K., et al. A beginner's guide to analyzing and visualizing mass cytometry data. J Immunol. 200 (1), 3-22 (2018).
  45. Weber, L. M., Robinson, M. D. Comparison of clustering methods for high-dimensional single-cell flow and mass cytometry data. Cytometry Part A. 89 (12), 1084-1096 (2016).
  46. Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. Automated mapping of phenotype space with single-cell data. Nat Methods. 13 (6), 493-496 (2016).
  47. Ornatsky, O. I., et al. Study of cell antigens and intracellular DNA by identification of element-containing labels and metallointercalators using inductively coupled plasma mass spectrometry. Anal Chem. 80 (7), 2539-2547 (2008).
  48. Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nat Commun. 12 (1), 692(2021).
  49. de Morree, A., et al. Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (43), E8996-E9005 (2017).
  50. Luo, D., et al. Deltex2 represses MyoD expression and inhibits myogenic differentiation by acting as a negative regulator of Jmjd1c. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (15), E3071-E3080 (2017).
  51. Wersto, R. P., et al. Doublet discrimination in DNA cell-cycle analysis. Cytometry. 46 (5), 296-306 (2001).
  52. Porpiglia, E., Blau, H. M. Plasticity of muscle stem cells in homeostasis and aging. Curr Opin Genet Dev. 77, 101999(2022).
  53. Porpiglia, E., et al. Elevated CD47 is a hallmark of dysfunctional aged muscle stem cells that can be targeted to augment regeneration. Cell Stem Cell. 29 (12), e1658 1653-1668 (2022).
  54. Brunet, A., Goodell, M. A., Rando, T. A. Ageing and rejuvenation of tissue stem cells and their niches. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (1), 45-62 (2022).
  55. Danielli, S. G., et al. Single-cell profiling of alveolar rhabdomyosarcoma reveals RAS pathway inhibitors as cell-fate hijackers with therapeutic relevance. Sci Adv. 9 (6), eade9238 (2023).
  56. de Morree, A., Rando, T. A. Regulation of adult stem cell quiescence and its functions in the maintenance of tissue integrity. Nat Rev Mol Cell Biol. 24 (5), 334-354 (2023).
  57. Yucel, N., et al. Glucose metabolism drives histone acetylation landscape transitions that dictate muscle stem cell glucose metabolism drives histone acetylation landscape transitions that dictate muscle stem cell function. Cell Rep. 27 (13), 3939-3955 (2019).
  58. Tierney, M. T., Sacco, A. Inducing and evaluating skeletal muscle injury by notexin and barium chloride. Methods Mol Biol. 1460, 53-60 (2016).
  59. Hardy, D., et al. Comparative study of injury models for studying muscle regeneration in mice. PLoS One. 11 (1), e0147198(2016).
  60. Call, J. A., Lowe, D. A. Eccentric contraction-induced muscle injury: Reproducible, quantitative, physiological models to impair skeletal muscle's capacity to generate force. Methods Mol Biol. 1460, 3-18 (2016).
  61. Garry, G. A., Antony, M. L., Garry, D. J. Cardiotoxin Induced Injury and Skeletal Muscle Regeneration. Methods Mol Biol. 1460, 61-71 (2016).
  62. Le, G., Lowe, D. A., Kyba, M. Freeze injury of the tibialis anterior muscle. Methods Mol Biol. 1460, 33-41 (2016).
  63. Borok, M., et al. Progressive and coordinated mobilization of the skeletal muscle niche throughout tissue repair revealed by single-cell proteomic analysis. Cells. 10 (4), 744(2021).
  64. Petrilli, L. L., et al. High-dimensional single-cell quantitative profiling of skeletal muscle cell population dynamics during regeneration. Cells. 9 (7), 1723(2020).
  65. Giordani, L., et al. High-dimensional single-cell cartography reveals novel skeletal muscle-resident cell populations. Mol Cell. 74 (3), e606 609-621 (2019).
  66. Hartmann, F. J., et al. Scalable conjugation and characterization of immunoglobulins with stable mass isotope reporters for single-cell mass cytometry analysis. Methods Mol Biol. 1989, 55-81 (2019).
  67. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., de Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. (190), e64557(2022).
  68. Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Intracellular phospho-protein staining techniques for flow cytometry: monitoring single cell signaling events. Cytometry A. 55 (2), 61-70 (2003).
  69. Bodenmiller, B., et al. Multiplexed mass cytometry profiling of cellular states perturbed by small-molecule regulators. Nat Biotechnol. 30 (9), 858-867 (2012).
  70. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Curr Protoc Immunol. , Chapter 8 11-20 (2012).
  71. Krutzik, P. O., Clutter, M. R., Nolan, G. P. Coordinate analysis of murine immune cell surface markers and intracellular phosphoproteins by flow cytometry. J Immunol. 175 (4), 2357-2365 (2005).
  72. Krutzik, P. O., Irish, J. M., Nolan, G. P., Perez, O. D. Analysis of protein phosphorylation and cellular signaling events by flow cytometry: techniques and clinical applications. Clin Immunol. 110 (3), 206-221 (2004).
  73. Han, G., Spitzer, M. H., Bendall, S. C., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Metal-isotope-tagged monoclonal antibodies for high-dimensional mass cytometry. Nat Protoc. 13 (10), 2121-2148 (2018).
  74. Chevrier, S., et al. Compensation of signal spillover in suspension and imaging mass cytometry. Cell Syst. 6 (5), e5 612-620 (2018).
  75. Bjornson, Z. B., Nolan, G. P., Fantl, W. J. Single-cell mass cytometry for analysis of immune system functional states. Curr Opin Immunol. 25 (4), 484-494 (2013).
  76. Kalina, T., Lundsten, K., Engel, P. Relevance of antibody validation for flow cytometry. Cytometry A. 97 (2), 126-136 (2020).
  77. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J Immunol Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  78. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  79. Tung, J. W., Parks, D. R., Moore, W. A., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. New approaches to fluorescence compensation and visualization of FACS data. Clin Immunol. 110 (3), 277-283 (2004).
  80. Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eur J Immunol. 51 (12), 2708-3145 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

miogeniczne kom rki progenitorowemi niowe kom rki macierzystecytometria pojedynczych kom rekmarkery powierzchniowe kom rekregeneracja mi niprzej cie mi dzy stanami kom rkowymisortowanie aktywowane fluorescencjalgorytmy klastrowania

Powiązane artykuły