Monitorowanie uczenia się motorycznego małego i asocjacyjnego u myszy za pomocą drabiny Erasmusa

Opracowano różne testy do oceny fenotypów motorycznych u myszy. Każdy test dostarcza informacji na temat określonego aspektu zachowania motorycznego¹. Na przykład test w otwartym polu informuje o ogólnej lokomocji i stanie lękowym; badania koordynacji i równowagi przy użyciu rotarod i belki kroczącej; Analiza śladów stóp dotyczy chodu; bieżnia lub koło do biegania podczas wymuszonych lub dobrowolnych ćwiczeń fizycznych; A złożone koło polega na nauce umiejętności motorycznych. Aby przeanalizować fenotypy motoryczne myszy, badacze muszą wykonywać te testy sekwencyjnie, co wiąże się z dużo czasu i wysiłku, a często także z kilkoma kohortami zwierząt. Jeśli informacje znajdują się na poziomie komórkowym lub obwodów, badacz zwykle decyduje się na test, który monitoruje powiązany aspekt i na tej podstawie podąża. Brakuje jednak paradygmatów, które dyskryminują różne aspekty zachowań motorycznych w sposób zautomatyzowany.

Ten artykuł opisuje protokół korzystania z Erasmus Ladder^2,3, systemu, który pozwala na kompleksową ocenę różnych cech motorycznych u myszy. Główne zalety to powtarzalność i czułość metody, a także zdolność do miareczkowania trudności motorycznych i oddzielania deficytów w sprawności motorycznej od upośledzonego asocjacyjnego uczenia się motorycznego. Główny element składa się z poziomej drabiny z naprzemiennie wysokimi (H) i niskimi (L) szczeblami, wyposażonymi w czujniki dotykowe, które wykrywają położenie myszy na drabinie. Drabina wykonana jest z 2 x 37 szczebli (L, 6 mm; H, 12 mm) oddalone od siebie o 15 mm i ustawione naprzemiennie od lewej i prawej z odstępami 30 mm (Rysunek 1A). Szczeble można przesuwać pojedynczo, aby generować różne poziomy trudności, czyli tworzyć przeszkodę (podnosząc wysokie szczeble o 18 mm). W połączeniu z automatycznym systemem rejestracji i kojarzeniem modyfikacji wzorca szczebli z bodźcami sensorycznymi, drabinka Erasmusa przeprowadza testy w zakresie uczenia się motoryki małej i adaptacji sprawności motorycznej w odpowiedzi na wyzwania środowiskowe (pojawienie się wyższego szczebla w celu symulacji przeszkody, bodziec bezwarunkowy [US]) lub skojarzenie z bodźcami sensorycznymi (ton, bodziec warunkowy [CS]). Testowanie obejmuje dwie odrębne fazy, z których każda ocenia poprawę sprawności motorycznej w ciągu 4 dni, podczas których myszy przechodzą sesję 42 kolejnych prób dziennie. W początkowej fazie myszy są szkolone w poruszaniu się po drabinie, aby ocenić "dobre" lub "wykwalifikowane" uczenie się motoryczne. Druga faza składa się z prób przeplatanych, w których na drodze poruszającego się zwierzęcia pojawia się przeszkoda w postaci wyższego szczebla. Zaburzenie może być nieoczekiwane w przypadku oceny "trudnego" uczenia się motorycznego (próby tylko w USA) lub ogłoszone tonem słuchowym w celu oceny "asocjacyjnego" uczenia się motorycznego (próby w parach).

Drabina Erasmusa została opracowana stosunkowo niedawno^2,3. Nie był szeroko stosowany, ponieważ konfiguracja i optymalizacja protokołu wymagała skoncentrowanego wysiłku i została specjalnie zaprojektowana do oceny zależnego od móżdżku uczenia się asocjacyjnego bez szczegółowego badania jego potencjału do ujawniania innych deficytów motorycznych. Do tej pory został potwierdzony pod kątem jego zdolności do ujawniania subtelnych zaburzeń motorycznych związanych z dysfunkcją móżdżku u myszy^3,4,5,6,7,8. Na przykład myszy z nokautem connexin36 (Cx36), u których połączenia szczelinowe są upośledzone w neuronach oliwkowych, wykazują deficyty zapłonu z powodu braku sprzężenia elektrotonicznego, ale fenotyp motoryczny był trudny do określenia. Testy z wykorzystaniem drabiny Erasmusa sugerowały, że rola dolnych neuronów oliwkowych w zadaniu uczenia się motorycznego móżdżku polega na kodowaniu precyzyjnego kodowania czasowego bodźców i ułatwianiu zależnych od uczenia się reakcji na nieoczekiwane zdarzenia^3,4. Mysz z nokautem rybonukleoproteiny 1 (Fmr1) z łamliwym chromosomem X Messenger, model zespołu łamliwego chromosomu X (FXS), wykazuje dobrze znane upośledzenie poznawcze wraz z łagodniejszymi defektami w tworzeniu pamięci proceduralnej. Nokauty Fmr1 nie wykazały znaczących różnic w czasie kroków, błędnych krokach w próbie lub poprawie sprawności motorycznej w porównaniu z sesjami w drabinie Erasmusa, ale nie dostosowały swojego wzorca chodu do nagle pojawiającej się przeszkody w porównaniu z ich rodzeństwem z miotu typu dzikiego (WT), potwierdzając specyficzne deficyty pamięci proceduralnej i asocjacyjnej^3,5. Co więcej, specyficzne dla komórek myszy zmutowane linie z defektami funkcji móżdżku, w tym upośledzoną wydajnością komórek Purkinjego, wzmocnieniem i wyjściem interneuronów warstwy molekularnej lub komórek ziarnistych, wykazywały problemy w koordynacji ruchowej ze zmienionym nabywaniem efektywnych wzorców kroków i liczbą kroków podejmowanych w celu przekroczenia drabiny⁶. Uszkodzenie mózgu u noworodka powoduje deficyty uczenia się móżdżku i dysfunkcję komórek Purkinjego, które można również wykryć za pomocą Erasmus Ladder^7,8.

W tym filmie prezentujemy obszerny przewodnik krok po kroku, który szczegółowo opisuje konfigurację pokoju behawioralnego, protokół testu behawioralnego i późniejszą analizę danych. Ten raport został opracowany tak, aby był dostępny i przyjazny dla użytkownika i został zaprojektowany specjalnie po to, aby pomóc nowicjuszom. Protokół ten zapewnia wgląd w różne fazy treningu motorycznego i oczekiwane wzorce motoryczne, które przyjmują myszy. Wreszcie, w artykule zaproponowano systematyczny przepływ pracy do analizy danych przy użyciu potężnego podejścia regresji nieliniowej, wraz z cennymi zaleceniami i sugestiami dotyczącymi adaptacji i zastosowania protokołu w innych kontekstach badawczych.

W obecnym badaniu wykorzystano dorosłe (2-3 miesiące) myszy C57BL/6J obu płci. Zwierzęta trzymano w pomieszczeniach od dwóch do pięciu sztuk w klatce z dostępem ad libitum do pożywienia i wody w jednostce zwierzęcej pod obserwacją i utrzymywano w środowisku o kontrolowanej temperaturze przez 12-godzinny cykl ciemności/światła. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami europejskimi i hiszpańskimi (2010/63/UE; RD 53/2013) i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Generalitat Valenciana oraz Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt Universidad Miguel Hernández.

1. Konfiguracja pokoju behawioralnego

1. Zarezerwuj pokój do testów behawioralnych każdego dnia o tej samej porze i ustal listę i kolejność myszy, które mają być używane, a także ustalenia dotyczące ich hostingu.
2. Trzymaj myszy eksperymentalne poza pomieszczeniem testowym, aby nie słyszały dźwięków sprężarki powietrza i dźwięków drabiny Erasmusa, gdy nie są testowane.
3. Sprawdź, czy wszystkie elementy systemu Erasmus Ladder są sprawne i gotowe do użycia: router sieciowy, komputer z oprogramowaniem (patrz tabela materiałów), sprężarka powietrza, dwie skrzynki bramkowe oraz drabinka z prawidłowo ustawionymi szczeblami.
4. Dokładnie wyczyść bramki, drabinę i szczeble wodą po każdym zwierzęciu oraz wodą i 70% etanolem na koniec każdego dnia treningowego.

2. Protokół testu behawioralnego

1. Utwórz eksperyment i wprowadź protokół do oprogramowania (rysunek uzupełniający S1).
   1. Włącz oprogramowanie.
   2. Aby utworzyć eksperyment, wybierz pozycję Plik | Nowy eksperyment | Nowy lub Skonfigurowany | Protokół eksperymentu.
      UWAGA: Domyślny protokół, zastosowany w tym badaniu, nosi nazwę EMC i został zaprojektowany w Centrum Medycznym Uniwersytetu Erazma w Rotterdamie.
   3. Nadaj eksperymentowi nazwę i kliknij przycisk OK.
   4. Sprawdź, czy wybrany domyślny protokół EMC składa się z 4 dni sesji bez zakłóceń (42 próby bez zakłóceń dziennie) i 4 dni sesji prowokacyjnych (42 codzienne próby mieszane: niezakłócone, tylko CS (ton), tylko US (przeszkoda), Sparowane (przeszkoda ogłaszana dźwiękiem) (patrz Rysunek 1B). W prawym panelu bocznym sprawdź również sygnał świetlny (maksymalny czas trwania 3 s), sygnał powietrzny (maksymalny czas trwania 45 s) i wiatr w plecy (Tak we wszystkich typach prób), używany do zachęcania myszy do przekroczenia drabiny, a także sygnał dźwiękowy (250 ms, Tak tylko w próbach tylko CS i sparowanych).
   5. Aby utworzyć inny protokół, wybierz pozycję Konfiguracja | Protokół eksperymentu | Nowość | Od podstaw lub skopiuj z protokołu EMC i po prostu go zmodyfikuj, edytując wiersze tabeli związane z liczbą sesji (dni eksperymentu) oraz liczbą i rodzajem prób dziennie.
      UWAGA: Czas odpoczynku, rodzaj i aktywacja sygnałów, czas trwania, intensywność i interwał można również dostosować do pytań eksperymentalnych.
   6. Aby otworzyć listę sesji i nazwać tematy, wybierz kolejno opcje Ustawienia | Lista sesji.
   7. Kliknij Dodaj tematy i zmienne.
   8. Wprowadź każdy konkretny identyfikator myszy, datę urodzenia, płeć, genotyp i odpowiednie kategorie, postępując zgodnie z uporządkowaną listą myszy.
2. Rozpocznij sesję (rysunek uzupełniający S2).
   1. Przed rozpoczęciem sprawdź, czy oprogramowanie jest otwarte, a następnie włącz drabinę.
   2. Sprawdź, czy sprężarka powietrza jest podłączona i włączona.
   3. Aby otworzyć okno Akwizycja, otwórz utworzony eksperyment.
   4. Wybierz opcję Akwizycja | Otwórz akwizycję.
   5. Umieść mysz z identyfikatorem wskazanym przez oprogramowanie w polu bramki startowej (po prawej stronie drabinki).
   6. Wybierz identyfikator myszy, który ma zostać pobrany w pierwszej sesji.
   7. Kliknij Rozpocznij pobieranie.
   8. Naciśnij 3 razy pokrętło menu czerwonej drabiny. Sprawdź, czy sesja rozpoczyna się i automatycznie kontroluje i rejestruje ruchy myszy do końca ostatniej próby sesji.
3. Zakończ sesję.
   1. Sprawdź, czy po zakończeniu 42. próby na wyświetlaczu pojawią się komunikaty Wysyłanie danych i Pozyskane.
   2. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
   3. Wyczyść drabinę i skrzynki bramek.
   4. Umieść następną mysz i powtórz czynności od kroku 2.2.6.
4. Wykonuj wybrany rodzaj sesji codziennie aż do końca protokołu. Powtarzaj kroki 2.2 i 2.3 każdego dnia zgodnie z wybranym protokołem.
5. Eksportuj dane (rysunek uzupełniający S2).
   1. Aby zwizualizować zarejestrowane dane, wybierz z menu Analiza, Statystyki próbne, Statystyki sesji oraz Statystyka i wykresy grupy.
      UWAGA: Dane można pobrać w formie arkusza kalkulacyjnego z danymi dla poszczególnych badań i średnimi z tych samych typów badań w ramach sesji. Sesje można również filtrować według zmiennych wybranych do konkretnej analizy.
   2. Kliknij przycisk Eksportuj w prawym górnym rogu, wybierając format pliku (arkusz kalkulacyjny) i lokalizację folderu.
   3. Kliknij prawym przyciskiem myszy automatycznie wygenerowane wykresy i wybierz Zapisz do pliku jako *.jpg.

3. Analiza danych

UWAGA: Lista parametrów jest automatycznie mierzona przez Erasmus Ladder na podstawie natychmiastowego zapisu aktywności czujników dotykowych. Do analizy parametry wyjściowe wybrane przez użytkownika są organizowane i przetwarzane w arkuszach kalkulacyjnych. Wraz z wykresami generowanymi przez oprogramowanie, użytkownicy mogą generować wykresy za pomocą wybranego oprogramowania do tworzenia wykresów, aby wizualizować określone zmiany różnych parametrów w sesjach.

1. Wybierz określone parametry, aby przeanalizować podstawową motywację lub stany lękowe, reakcje sensoryczne, sprawność motoryczną i uczenie się motoryczne w ciągu pierwszych 4 dni.
   1. Wybierz i wykreśl parametry kontrolne, w tym czas odpoczynku w polu bramkowym i czas wyjścia z pola bramkowego po okresie odpoczynku w odpowiedzi na sygnały świetlne i powietrzne (Rysunek 2A).
      UWAGA: Czas odpoczynku lub reakcja na sygnały są względnie stałe u myszy WT. Inne parametry, takie jak częstotliwość wyjść, są w zasadzie nieistotne u myszy WT - zwierzęta rzadko opuszczają boks odpoczynku bez wskazówek lub wracają raz do drabiny, co skutkuje częstotliwością wychodzenia równą 1 na próbę. Jeśli zwierzę wyjdzie przed zastosowaniem wskazówek, aktywuje się przepływ powietrza, zmuszając mysz do powrotu do pola bramkowego; Nie jest to liczone jako wersja próbna przez oprogramowanie.
   2. Wybierz i wykreśl czas na drabince po wskazówkach, mierzony jako czas spędzony na przechodzeniu przez drabinę po opuszczeniu pola bramki przez mysz (Rysunek 2B).
      UWAGA: Regresja nieliniowa potęgowa jest solidną metodą oceny uczenia się. Współczynniki Pearsona lub Spearmana (R) będą miarą tego, czy dopasowanie danych jest dobre (wartości R bliskie jeden, gdy zwierzęta uczą się/poprawiają w trakcie sesji; Wartości R bliskie 0 oznaczają, że dane są stałe, a myszy się nie uczą).
   3. Wybierz i wykreśl parametry wzorca krokowego, takie jak procent prób z błędnymi krokami, jako czuły parametr uczenia się (Rysunek 2C).
      1. Zdefiniuj prawidłowy krok jako stopień z wysokiego szczebla na inny wysoki szczebel (H-H), niezależnie od długości stopnia. Typy stopni, które obejmują niższy szczebel, należy traktować jako błędy.
      2. Podziel poprawne kroki i pomyłki na krótkie i długie, kroki w tył i skoki w zależności od długości i kierunkowości kroku między wciśniętymi szczeblami (patrz Rysunek 1A).
2. Wybierz i wykreśl konkretne parametry, aby ocenić zakłócone uczenie motoryczne (badania tylko w USA) i uczenie się asocjacyjne (próby w parach) w ciągu ostatnich 4 dni.
   1. Wybierz i narysuj czas na drabince po wskazówkach (Rysunek 3).
   2. Wybierz i wykreśl procent prób z błędnymi krokami (Rysunek 4A).
   3. Wybierz i wykreśl czasy kroku przed i po perturbacji, zdefiniowane jako różnica precyzji ms między aktywacją szczebli tuż przed (krok kontrolny) i po przeszkodzie (stopień dostosowany) po tej samej stronie drabiny (Rysunek 4B).
      UWAGA: Należy przeprowadzić analizę czasów przed i po perturbacji, aby porównać dane w każdym typie sesji. Parametr mierzy zdolność myszy do przewidywania i pokonywania przeszkód podczas uczenia się asocjacyjnego.
3. Analizuj dane za pomocą dedykowanego oprogramowania statystycznego (np. SigmaPlot). Wykonaj analizę regresji nieliniowej mocy danych zebranych z tego samego typu badania we wszystkich sesjach, aby bardziej efektywnie opisać proces uczenia się i użyj dwukierunkowej ANOVA powtarzanych miar (RM) do porównania typów badań.

Urządzenie, konfiguracja i zastosowany protokół Erasmus Ladder są przedstawione w Rysunek 1. Protokół składa się z czterech sesji bez zakłóceń i czterech sesji prowokacyjnych (42 próby każda). Każda próba to jeden przejazd po drabince między początkowym i końcowym polem bramek. Na początku sesji mysz jest umieszczana w jednym z pól startowych. Po upływie ustawionego czasu 15 ± 5 s (stan "spoczynku") światło jest włączane (wskazówka 1, maksymalnie na 3 s). Następnie stosuje się lekką wskazówkę powietrzną (wskazówka 2, maksymalnie 45 s), aby zachęcić myszy do opuszczenia pudełka i przejścia na przeciwległy koniec. Czas reakcji na sygnał powietrzny może się różnić w zależności od myszy i sesji i może być używany jako parametr do porównywania stanów motywacji lub lęku między grupami. Nowa próba jest rozpoczynana natychmiast po tym, jak mysz dotrze do pola końcowego celu.

U myszy WT nie zaobserwowano różnic w czasie odpoczynku i czasie reakcji na sygnał świetlny w dniach 1-4, ale czas reakcji na sygnał powietrzny nieznacznie się zmniejszył między dniem 1 a 2 (Rysunek 2A). Pomiary czasu do przejścia przez drabinę dały znaczącą krzywą uczenia się od 1 do 4 dni, którą można było dopasować do krzywej regresji mocy (R = 0,50, *p = 0,047, Rysunek 2B). Kluczowym parametrem określającym czas potrzebny na przejście przez drabinę jest występowanie pomyłek w krokach. Wraz ze skróceniem czasu na drabinie, liczba prób, w których myszy popełniały błędy, zmniejszyła się w trakcie niezakłóconych sesji, ponieważ myszy nauczyły się chodzić po wyższych szczeblach (stopnie H-H) i unikać niższych, co było bardziej efektywnym wzorcem przekraczania drabiny (R = 0,90, ***p < 0,0001, Rysunek 2C).

Od 5 do 8 dnia, myszy były poddawane sesjom wyzwań, w których wprowadzano nieoczekiwaną przeszkodę (USA) (jeden szczebel jest losowo podnoszony o 18 mm ponad powierzchnię schodka). W niektórych próbach ton (CS, 90 dB, 15 kHz ton trwający 250 ms) jest prezentowany 250 ms przed perturbacją amerykańską (patrz Rysunek 1B).

Wraz z rozpoczęciem sesji wyzwań w dniu 5, zwierzęta potrzebowały więcej czasu na przejście przez drabinę podczas prób tylko w USA z powodu nieprzewidzianego wprowadzenia przeszkody (dzień 4: 5.01 s; Rysunek 2B; dzień 5: 7,84 s; Rysunek 3; sparowany test t,*p < 0,039). Wydajność myszy poprawiła się od 5 do 8 dni, co dało znaczną krzywą uczenia się w sesjach tylko w Stanach Zjednoczonych (R = 0,50, *p = 0,045, Rysunek 3, pomarańczowy). W próbach uczenia się asocjacyjnego, w których przeszkoda była sparowana z dźwiękiem, zwierzęta wykonywały codzienne sesje znacznie szybciej w porównaniu z próbami tylko w USA (R = 0,63, Rysunek 3, fioletowy; dwukierunkowy RM ANOVA, *p = 0,028). Wreszcie, w próbach kontrolnych, w których ton był prezentowany samodzielnie (tylko CS), odnotowano znaczącą krzywą uczenia się, która przypominała sesje bez zakłóceń (R = 0,82, ***p < 0,001, Rysunek 3, niebieski).

Analiza wzorców kroków dostarczyła dodatkowego potwierdzenia i zwiększonej czułości w wykrywaniu różnic między próbami tylko amerykańskimi a próbami asocjacyjnymi. Rysunek 4A pokazuje, jak odsetek prób z błędami pozostał stały we wszystkich badaniach tylko w USA (R = 0,01, p = 0,90, pomarańczowy), podczas gdy znaczny spadek prób z błędnymi krokami zaobserwowano podczas sparowanych sesji (R = 0,61, *p = 0,01, fioletowy). Rysunek 4B pokazuje znaczącą różnicę między czasami kroku przed i po perturbacji w próbach tylko w USA (dwukierunkowe RM ANOVA, *p = 0,05), ale nie w próbach sparowanych, gdzie myszy uczyły się szybciej pokonywać przeszkodę. Wszystkie badane zmienne i zastosowane testy statystyczne przedstawiono w tabeli uzupełniającej S1.

Rysunek 1: System, protokół i parametry. (A) Drabina Erasmusa składa się z poziomej drabiny otoczonej dwoma polami bramkowymi. Kreskówka przedstawia drabinę z naprzemiennie wysokimi i niskimi szczeblami oraz zapisanymi głównymi parametrami, w tym typami kroków (normalne kroki, wypełniona linia; lub błędne kroki, linia przerywana) oraz czas kroku przed i po perturbacji zdefiniowany jako czas, w którym mysz potrzebuje pokonać przeszkodę (bodziec bezwarunkowy; wyższy szczebel) ogłaszany lub nie przez sygnał dźwiękowy (bodziec warunkowy). (B) Protokół składa się z czterech sesji bez zakłóceń i czterech sesji prowokacyjnych (jedna sesja/dzień, 42 próby/sesja), które pozwalają na oddzielną analizę uczenia się motorycznego (niezakłóconego i tylko CS na niebiesko), kwestionowanego uczenia się motorycznego (tylko US, na pomarańczowo) i asocjacyjnego uczenia się motorycznego (sparowane CS + US, na fioletowo). Skróty: H = wysoki; L = niski; CS = bodziec warunkowy; US = bodziec bezwarunkowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Sprawność motoryczna myszy WT podczas niezakłóconych sesji. (A) Czas odpoczynku w polu bramkowym (stały, 15 s), czas reakcji na sygnały: światło (stałe, 3 s) i powietrze (zmienne); w ciągu 1-4 dni niezakłóconych sesji. (B) Czas na przejście przez drabinę po sygnale (światło i powietrze) podczas niezakłóconych sesji. (C) Odsetek prób w każdej sesji bez zakłóceń, w których zwierzę pominęło krok. Do zbadania postępów w nauce wykorzystano analizę regresji mocy (R = 0,50: *p = 0,047, R = 0,90 ***p < 0,0001, odpowiednio, n = 4 myszy). Skrót: WT = typ dziki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Wydajność myszy WT podczas sesji wyzwań. Średni czas na drabince po wskazówkach w dniach 5-8 dla prób tylko w USA (pomarańczowy), sparowanych (fioletowy) i tylko CS (jasnoniebieski). Do zbadania postępów w nauce wykorzystano analizę regresji nieliniowej mocy (*p = 0,047, **p = 0,0093, ***p < 0,001, n=4 myszy). Dwukierunkowa ANOVA RM do porównania typów badań (*p = 0,028, **p = 0,008, n=4 myszy, dwa samce i dwie samice, średnia ± SEM). Skróty: CS = bodziec warunkowy; US = bodziec bezwarunkowy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Zmiany we wzorcach kroków myszy podczas sesji wyzwań. (A) Procent prób na sesję, w których zwierzę pominęło krok podczas sesji tylko w USA i w parach. Do zbadania procesu uczenia się wykorzystano analizę regresji mocy (*p = 0,013) oraz dwukierunkową ANOVA RM do porównania typów prób (*p = 0,032, n = 4 myszy). (B) Czas kroku przed i po perturbacji (s) w sesjach tylko w USA i sparowanych podczas sesji. Dwukierunkowe powtarzane pomiary ANOVA, *p < 0,05, n = 4 myszy, dwa samce i dwie samice, średnia ± SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający S1: Interfejs oprogramowania: jak stworzyć eksperyment i wybrać protokół. Zrzuty ekranu z oprogramowania ilustrujące przepływ pracy opisany w kroku 2.1 protokołu, obejmujące kroki od 2.1.4 do 2.1.8. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S2: Interfejs oprogramowania: jak rozpocząć sesję i wyeksportować dane. Zrzuty ekranu z oprogramowania ilustrujące przebieg pracy opisany w krokach protokołu 2.2 i 2.5, obejmujący kroki od 2.2.4 do 2.2.7 i od 2.5.1 do 2.5.3. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S1: Tabela statystyczna. Opis wszystkich badanych zmiennych i zastosowanych testów statystycznych, podany w Rysunek 2B,C, Rysunek 3, oraz Rysunek 4A,B. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.