Monitorowanie uczenia się motorycznego małego i asocjacyjnego u myszy za pomocą drabiny Erasmusa

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia protokół, który pozwala na nieinwazyjną i automatyczną ocenę sprawności motorycznej, a także adaptacyjne i asocjacyjne uczenie się motoryczne w przypadku wyzwań, przy użyciu urządzenia zwanego Drabiną Erasmusa. Trudność zadania można dostosować w celu wykrycia upośledzenia motorycznego w zakresie od dużego do subtelnego stopnia.

Streszczenie

Zachowanie jest kształtowane przez działania, a działania wymagają umiejętności motorycznych, takich jak siła, koordynacja i nauka. Żadne z zachowań niezbędnych do podtrzymania życia nie byłoby możliwe bez zdolności do przechodzenia z jednej pozycji do drugiej. Niestety, zdolności motoryczne mogą być zagrożone w wielu chorobach. Dlatego badanie mechanizmów funkcji motorycznych na poziomie komórkowym, molekularnym i obwodowym, a także zrozumienie objawów, przyczyn i progresji zaburzeń motorycznych, ma kluczowe znaczenie dla opracowania skutecznych metod leczenia. W tym celu często wykorzystuje się modele mysie.

Ten artykuł opisuje protokół, który pozwala na monitorowanie różnych aspektów sprawności motorycznej i uczenia się u myszy za pomocą zautomatyzowanego narzędzia o nazwie Erasmus Ladder. Test składa się z dwóch faz: fazy początkowej, w której myszy są szkolone do poruszania się po poziomej drabinie zbudowanej z nieregularnych szczebli ("uczenie się motoryczne"), oraz drugiej fazy, w której na drodze poruszającego się zwierzęcia pojawia się przeszkoda. Zaburzenia mogą być nieoczekiwane ("wyzwanie w uczeniu się motorycznym") lub poprzedzone tonem słuchowym ("asocjacyjne uczenie się motoryczne"). Zadanie jest łatwe do wykonania i jest w pełni wspierane przez zautomatyzowane oprogramowanie.

Ten raport pokazuje, jak różne odczyty z testu, analizowane za pomocą czułych metod statystycznych, pozwalają na dokładne monitorowanie zdolności motorycznych myszy przy użyciu małej kohorty myszy. Sugerujemy, że metoda będzie bardzo czuła do oceny adaptacji motorycznych napędzanych modyfikacjami środowiska, a także subtelnych deficytów motorycznych we wczesnym stadium u zmutowanych myszy z upośledzonymi funkcjami motorycznymi.

Wprowadzenie

Opracowano różne testy do oceny fenotypów motorycznych u myszy. Każdy test dostarcza informacji na temat określonego aspektu zachowania motorycznego¹. Na przykład test w otwartym polu informuje o ogólnej lokomocji i stanie lękowym; badania koordynacji i równowagi przy użyciu rotarod i belki kroczącej; Analiza śladów stóp dotyczy chodu; bieżnia lub koło do biegania podczas wymuszonych lub dobrowolnych ćwiczeń fizycznych; A złożone koło polega na nauce umiejętności motorycznych. Aby przeanalizować fenotypy motoryczne myszy, badacze muszą wykonywać te testy sekwencyjnie, co wiąże się z dużo czasu i wysiłku, a często także z kilkoma kohortami zwierząt. Jeśli informacje znajdują się na poziomie komórkowym lub obwodów, badacz zwykle decyduje się na test, który monitoruje powiązany aspekt i na tej podstawie podąża. Brakuje jednak paradygmatów, które dyskryminują różne aspekty zachowań motorycznych w sposób zautomatyzowany.

Ten artykuł opisuje protokół korzystania z Erasmus Ladder^2,3, systemu, który pozwala na kompleksową ocenę różnych cech motorycznych u myszy. Główne zalety to powtarzalność i czułość metody, a także zdolność do miareczkowania trudności motorycznych i oddzielania deficytów w sprawności motorycznej od upośledzonego asocjacyjnego uczenia się motorycznego. Główny element składa się z poziomej drabiny z naprzemiennie wysokimi (H) i niskimi (L) szczeblami, wyposażonymi w czujniki dotykowe, które wykrywają położenie myszy na drabinie. Drabina wykonana jest z 2 x 37 szczebli (L, 6 mm; H, 12 mm) oddalone od siebie o 15 mm i ustawione naprzemiennie od lewej i prawej z odstępami 30 mm (Rysunek 1A). Szczeble można przesuwać pojedynczo, aby generować różne poziomy trudności, czyli tworzyć przeszkodę (podnosząc wysokie szczeble o 18 mm). W połączeniu z automatycznym systemem rejestracji i kojarzeniem modyfikacji wzorca szczebli z bodźcami sensorycznymi, drabinka Erasmusa przeprowadza testy w zakresie uczenia się motoryki małej i adaptacji sprawności motorycznej w odpowiedzi na wyzwania środowiskowe (pojawienie się wyższego szczebla w celu symulacji przeszkody, bodziec bezwarunkowy [US]) lub skojarzenie z bodźcami sensorycznymi (ton, bodziec warunkowy [CS]). Testowanie obejmuje dwie odrębne fazy, z których każda ocenia poprawę sprawności motorycznej w ciągu 4 dni, podczas których myszy przechodzą sesję 42 kolejnych prób dziennie. W początkowej fazie myszy są szkolone w poruszaniu się po drabinie, aby ocenić "dobre" lub "wykwalifikowane" uczenie się motoryczne. Druga faza składa się z prób przeplatanych, w których na drodze poruszającego się zwierzęcia pojawia się przeszkoda w postaci wyższego szczebla. Zaburzenie może być nieoczekiwane w przypadku oceny "trudnego" uczenia się motorycznego (próby tylko w USA) lub ogłoszone tonem słuchowym w celu oceny "asocjacyjnego" uczenia się motorycznego (próby w parach).

Drabina Erasmusa została opracowana stosunkowo niedawno^2,3. Nie był szeroko stosowany, ponieważ konfiguracja i optymalizacja protokołu wymagała skoncentrowanego wysiłku i została specjalnie zaprojektowana do oceny zależnego od móżdżku uczenia się asocjacyjnego bez szczegółowego badania jego potencjału do ujawniania innych deficytów motorycznych. Do tej pory został potwierdzony pod kątem jego zdolności do ujawniania subtelnych zaburzeń motorycznych związanych z dysfunkcją móżdżku u myszy^3,4,5,6,7,8. Na przykład myszy z nokautem connexin36 (Cx36), u których połączenia szczelinowe są upośledzone w neuronach oliwkowych, wykazują deficyty zapłonu z powodu braku sprzężenia elektrotonicznego, ale fenotyp motoryczny był trudny do określenia. Testy z wykorzystaniem drabiny Erasmusa sugerowały, że rola dolnych neuronów oliwkowych w zadaniu uczenia się motorycznego móżdżku polega na kodowaniu precyzyjnego kodowania czasowego bodźców i ułatwianiu zależnych od uczenia się reakcji na nieoczekiwane zdarzenia^3,4. Mysz z nokautem rybonukleoproteiny 1 (Fmr1) z łamliwym chromosomem X Messenger, model zespołu łamliwego chromosomu X (FXS), wykazuje dobrze znane upośledzenie poznawcze wraz z łagodniejszymi defektami w tworzeniu pamięci proceduralnej. Nokauty Fmr1 nie wykazały znaczących różnic w czasie kroków, błędnych krokach w próbie lub poprawie sprawności motorycznej w porównaniu z sesjami w drabinie Erasmusa, ale nie dostosowały swojego wzorca chodu do nagle pojawiającej się przeszkody w porównaniu z ich rodzeństwem z miotu typu dzikiego (WT), potwierdzając specyficzne deficyty pamięci proceduralnej i asocjacyjnej^3,5. Co więcej, specyficzne dla komórek myszy zmutowane linie z defektami funkcji móżdżku, w tym upośledzoną wydajnością komórek Purkinjego, wzmocnieniem i wyjściem interneuronów warstwy molekularnej lub komórek ziarnistych, wykazywały problemy w koordynacji ruchowej ze zmienionym nabywaniem efektywnych wzorców kroków i liczbą kroków podejmowanych w celu przekroczenia drabiny⁶. Uszkodzenie mózgu u noworodka powoduje deficyty uczenia się móżdżku i dysfunkcję komórek Purkinjego, które można również wykryć za pomocą Erasmus Ladder^7,8.

W tym filmie prezentujemy obszerny przewodnik krok po kroku, który szczegółowo opisuje konfigurację pokoju behawioralnego, protokół testu behawioralnego i późniejszą analizę danych. Ten raport został opracowany tak, aby był dostępny i przyjazny dla użytkownika i został zaprojektowany specjalnie po to, aby pomóc nowicjuszom. Protokół ten zapewnia wgląd w różne fazy treningu motorycznego i oczekiwane wzorce motoryczne, które przyjmują myszy. Wreszcie, w artykule zaproponowano systematyczny przepływ pracy do analizy danych przy użyciu potężnego podejścia regresji nieliniowej, wraz z cennymi zaleceniami i sugestiami dotyczącymi adaptacji i zastosowania protokołu w innych kontekstach badawczych.

Protokół

W obecnym badaniu wykorzystano dorosłe (2-3 miesiące) myszy C57BL/6J obu płci. Zwierzęta trzymano w pomieszczeniach od dwóch do pięciu sztuk w klatce z dostępem ad libitum do pożywienia i wody w jednostce zwierzęcej pod obserwacją i utrzymywano w środowisku o kontrolowanej temperaturze przez 12-godzinny cykl ciemności/światła. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami europejskimi i hiszpańskimi (2010/63/UE; RD 53/2013) i zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki Generalitat Valenciana oraz Komisję ds. Dobrostanu Zwierząt Universidad Miguel Hernández.

1. Konfiguracja pokoju behawioralnego

1. Zarezerwuj pokój do testów behawioralnych każdego dnia o tej samej porze i ustal listę i kolejność myszy, które mają być używane, a także ustalenia dotyczące ich hostingu.
2. Trzymaj myszy eksperymentalne poza pomieszczeniem testowym, aby nie słyszały dźwięków sprężarki powietrza i dźwięków drabiny Erasmusa, gdy nie są testowane.
3. Sprawdź, czy wszystkie elementy systemu Erasmus Ladder są sprawne i gotowe do użycia: router sieciowy, komputer z oprogramowaniem (patrz tabela materiałów), sprężarka powietrza, dwie skrzynki bramkowe oraz drabinka z prawidłowo ustawionymi szczeblami.
4. Dokładnie wyczyść bramki, drabinę i szczeble wodą po każdym zwierzęciu oraz wodą i 70% etanolem na koniec każdego dnia treningowego.

2. Protokół testu behawioralnego

1. Utwórz eksperyment i wprowadź protokół do oprogramowania (rysunek uzupełniający S1).
   1. Włącz oprogramowanie.
   2. Aby utworzyć eksperyment, wybierz pozycję Plik | Nowy eksperyment | Nowy lub Skonfigurowany | Protokół eksperymentu.
      UWAGA: Domyślny protokół, zastosowany w tym badaniu, nosi nazwę EMC i został zaprojektowany w Centrum Medycznym Uniwersytetu Erazma w Rotterdamie.
   3. Nadaj eksperymentowi nazwę i kliknij przycisk OK.
   4. Sprawdź, czy wybrany domyślny protokół EMC składa się z 4 dni sesji bez zakłóceń (42 próby bez zakłóceń dziennie) i 4 dni sesji prowokacyjnych (42 codzienne próby mieszane: niezakłócone, tylko CS (ton), tylko US (przeszkoda), Sparowane (przeszkoda ogłaszana dźwiękiem) (patrz Rysunek 1B). W prawym panelu bocznym sprawdź również sygnał świetlny (maksymalny czas trwania 3 s), sygnał powietrzny (maksymalny czas trwania 45 s) i wiatr w plecy (Tak we wszystkich typach prób), używany do zachęcania myszy do przekroczenia drabiny, a także sygnał dźwiękowy (250 ms, Tak tylko w próbach tylko CS i sparowanych).
   5. Aby utworzyć inny protokół, wybierz pozycję Konfiguracja | Protokół eksperymentu | Nowość | Od podstaw lub skopiuj z protokołu EMC i po prostu go zmodyfikuj, edytując wiersze tabeli związane z liczbą sesji (dni eksperymentu) oraz liczbą i rodzajem prób dziennie.
      UWAGA: Czas odpoczynku, rodzaj i aktywacja sygnałów, czas trwania, intensywność i interwał można również dostosować do pytań eksperymentalnych.
   6. Aby otworzyć listę sesji i nazwać tematy, wybierz kolejno opcje Ustawienia | Lista sesji.
   7. Kliknij Dodaj tematy i zmienne.
   8. Wprowadź każdy konkretny identyfikator myszy, datę urodzenia, płeć, genotyp i odpowiednie kategorie, postępując zgodnie z uporządkowaną listą myszy.
2. Rozpocznij sesję (rysunek uzupełniający S2).
   1. Przed rozpoczęciem sprawdź, czy oprogramowanie jest otwarte, a następnie włącz drabinę.
   2. Sprawdź, czy sprężarka powietrza jest podłączona i włączona.
   3. Aby otworzyć okno Akwizycja, otwórz utworzony eksperyment.
   4. Wybierz opcję Akwizycja | Otwórz akwizycję.
   5. Umieść mysz z identyfikatorem wskazanym przez oprogramowanie w polu bramki startowej (po prawej stronie drabinki).
   6. Wybierz identyfikator myszy, który ma zostać pobrany w pierwszej sesji.
   7. Kliknij Rozpocznij pobieranie.
   8. Naciśnij 3 razy pokrętło menu czerwonej drabiny. Sprawdź, czy sesja rozpoczyna się i automatycznie kontroluje i rejestruje ruchy myszy do końca ostatniej próby sesji.
3. Zakończ sesję.
   1. Sprawdź, czy po zakończeniu 42. próby na wyświetlaczu pojawią się komunikaty Wysyłanie danych i Pozyskane.
   2. Umieść mysz z powrotem w klatce domowej.
   3. Wyczyść drabinę i skrzynki bramek.
   4. Umieść następną mysz i powtórz czynności od kroku 2.2.6.
4. Wykonuj wybrany rodzaj sesji codziennie aż do końca protokołu. Powtarzaj kroki 2.2 i 2.3 każdego dnia zgodnie z wybranym protokołem.
5. Eksportuj dane (rysunek uzupełniający S2).
   1. Aby zwizualizować zarejestrowane dane, wybierz z menu Analiza, Statystyki próbne, Statystyki sesji oraz Statystyka i wykresy grupy.
      UWAGA: Dane można pobrać w formie arkusza kalkulacyjnego z danymi dla poszczególnych badań i średnimi z tych samych typów badań w ramach sesji. Sesje można również filtrować według zmiennych wybranych do konkretnej analizy.
   2. Kliknij przycisk Eksportuj w prawym górnym rogu, wybierając format pliku (arkusz kalkulacyjny) i lokalizację folderu.
   3. Kliknij prawym przyciskiem myszy automatycznie wygenerowane wykresy i wybierz Zapisz do pliku jako *.jpg.

3. Analiza danych

UWAGA: Lista parametrów jest automatycznie mierzona przez Erasmus Ladder na podstawie natychmiastowego zapisu aktywności czujników dotykowych. Do analizy parametry wyjściowe wybrane przez użytkownika są organizowane i przetwarzane w arkuszach kalkulacyjnych. Wraz z wykresami generowanymi przez oprogramowanie, użytkownicy mogą generować wykresy za pomocą wybranego oprogramowania do tworzenia wykresów, aby wizualizować określone zmiany różnych parametrów w sesjach.

1. Wybierz określone parametry, aby przeanalizować podstawową motywację lub stany lękowe, reakcje sensoryczne, sprawność motoryczną i uczenie się motoryczne w ciągu pierwszych 4 dni.
   1. Wybierz i wykreśl parametry kontrolne, w tym czas odpoczynku w polu bramkowym i czas wyjścia z pola bramkowego po okresie odpoczynku w odpowiedzi na sygnały świetlne i powietrzne (Rysunek 2A).
      UWAGA: Czas odpoczynku lub reakcja na sygnały są względnie stałe u myszy WT. Inne parametry, takie jak częstotliwość wyjść, są w zasadzie nieistotne u myszy WT - zwierzęta rzadko opuszczają boks odpoczynku bez wskazówek lub wracają raz do drabiny, co skutkuje częstotliwością wychodzenia równą 1 na próbę. Jeśli zwierzę wyjdzie przed zastosowaniem wskazówek, aktywuje się przepływ powietrza, zmuszając mysz do powrotu do pola bramkowego; Nie jest to liczone jako wersja próbna przez oprogramowanie.
   2. Wybierz i wykreśl czas na drabince po wskazówkach, mierzony jako czas spędzony na przechodzeniu przez drabinę po opuszczeniu pola bramki przez mysz (Rysunek 2B).
      UWAGA: Regresja nieliniowa potęgowa jest solidną metodą oceny uczenia się. Współczynniki Pearsona lub Spearmana (R) będą miarą tego, czy dopasowanie danych jest dobre (wartości R bliskie jeden, gdy zwierzęta uczą się/poprawiają w trakcie sesji; Wartości R bliskie 0 oznaczają, że dane są stałe, a myszy się nie uczą).
   3. Wybierz i wykreśl parametry wzorca krokowego, takie jak procent prób z błędnymi krokami, jako czuły parametr uczenia się (Rysunek 2C).
      1. Zdefiniuj prawidłowy krok jako stopień z wysokiego szczebla na inny wysoki szczebel (H-H), niezależnie od długości stopnia. Typy stopni, które obejmują niższy szczebel, należy traktować jako błędy.
      2. Podziel poprawne kroki i pomyłki na krótkie i długie, kroki w tył i skoki w zależności od długości i kierunkowości kroku między wciśniętymi szczeblami (patrz Rysunek 1A).
2. Wybierz i wykreśl konkretne parametry, aby ocenić zakłócone uczenie motoryczne (badania tylko w USA) i uczenie się asocjacyjne (próby w parach) w ciągu ostatnich 4 dni.
   1. Wybierz i narysuj czas na drabince po wskazówkach (Rysunek 3).
   2. Wybierz i wykreśl procent prób z błędnymi krokami (Rysunek 4A).
   3. Wybierz i wykreśl czasy kroku przed i po perturbacji, zdefiniowane jako różnica precyzji ms między aktywacją szczebli tuż przed (krok kontrolny) i po przeszkodzie (stopień dostosowany) po tej samej stronie drabiny (Rysunek 4B).
      UWAGA: Należy przeprowadzić analizę czasów przed i po perturbacji, aby porównać dane w każdym typie sesji. Parametr mierzy zdolność myszy do przewidywania i pokonywania przeszkód podczas uczenia się asocjacyjnego.
3. Analizuj dane za pomocą dedykowanego oprogramowania statystycznego (np. SigmaPlot). Wykonaj analizę regresji nieliniowej mocy danych zebranych z tego samego typu badania we wszystkich sesjach, aby bardziej efektywnie opisać proces uczenia się i użyj dwukierunkowej ANOVA powtarzanych miar (RM) do porównania typów badań.

Wyniki

Urządzenie, konfiguracja i zastosowany protokół Erasmus Ladder są przedstawione w Rysunek 1. Protokół składa się z czterech sesji bez zakłóceń i czterech sesji prowokacyjnych (42 próby każda). Każda próba to jeden przejazd po drabince między początkowym i końcowym polem bramek. Na początku sesji mysz jest umieszczana w jednym z pól startowych. Po upływie ustawionego czasu 15 ± 5 s (stan "spoczynku") światło jest włączane (wskazówka 1, maksymalnie na 3 s). Następnie stosuje się lekką wskazówk...

Dyskusja

Drabina Erasmusa oferuje wiele korzyści w zakresie oceny fenotypu motorycznego, wykraczające poza obecne podejścia. Testy są łatwe do przeprowadzenia, zautomatyzowane, powtarzalne i pozwalają badaczom oceniać różne aspekty zachowań motorycznych oddzielnie przy użyciu jednej kohorty myszy. W obecnym badaniu odtwarzalność pozwoliła na wygenerowanie solidnych danych na niewielkiej liczbie myszy WT, wykorzystując cechy urządzenia, projekt eksperymentalny i metody analizy. Na przykład, w porównaniu z tradycyjnymi testami chod...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Myszy C57BL/6J (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder	Noldus, Wageningen, Holandia
Oprogramowanie Erasmus Ladder 2.0	Noldus, Wageningen, Holandia
Oprogramowanie Excel	Microsoft
Oprogramowanie Sigmaplot	Systat Software, Inc.