Mikroglej jest uważany za jedne z najbardziej wszechstronnych komórek w organizmie, zdolne do adaptacji morfologicznej i funkcjonalnej. Ich heterogeniczność i wielofunkcyjność umożliwiają utrzymanie homeostazy mózgu, a jednocześnie są powiązane z różnymi patologiami neurologicznymi. Tutaj opisano technikę oczyszczania mikrogleju rdzenia kręgowego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybkie i skuteczne wzbogacenie mikrogleju rdzenia kręgowego myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Kręgosłup definiuje kręgowca i kształtuje kanał kręgowy, jamę, która otacza i chroni rdzeń kręgowy. Prawidłowy rozwój i funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego ssaków zależy w znacznym stopniu od aktywności rezydujących makrofagów znanych jako mikroglej. Mikroglej wykazuje niejednorodność i wielofunkcyjność, umożliwiając wyraźną ekspresję i zachowanie genów w rdzeniu kręgowym i mózgu. Liczne badania dotyczyły funkcji mikrogleju mózgowego, szczegółowo opisując metody oczyszczania. Jednak oczyszczanie mikrogleju z rdzenia kręgowego u myszy nie ma wyczerpującego opisu. W przeciwieństwie do tego, wykorzystanie wysoce oczyszczonej kolagenazy, w przeciwieństwie do nierafinowanego ekstraktu, nie ma raportowania w tkankach ośrodkowego układu nerwowego. W tym badaniu kręgosłup i rdzeń kręgowy zostały wycięte od 8-10 tygodniowych myszy C57BL / 6. Późniejsze trawienie wykorzystywało wysoce oczyszczoną kolagenazę, a oczyszczanie mikrogleju wykorzystywało gradient gęstości. Komórki poddano barwieniu w celu cytometrii przepływowej, oceniając żywotność i czystość poprzez barwienie CD11b i CD45. Wyniki wykazały średnią żywotność na poziomie 80% i średnią czystość na poziomie 95%. Podsumowując, manipulacja mikroglejem myszy obejmowała trawienie za pomocą wysoce oczyszczonej kolagenazy, a następnie gradientu gęstości. Podejście to skutecznie doprowadziło do powstania znacznych populacji mikrogleju rdzenia kręgowego.
Wprowadzenie
Cechą charakterystyczną kręgowców jest kręgosłup lub kręgosłup, w którym struna grzbietowa została zastąpiona sekwencją segmentowanych kości zwanych kręgami, przedzielonych krążkami międzykręgowymi. Ten ciąg materiału kostnego kształtuje kanał kręgowy, jamę, która otacza i chroni rdzeń kręgowy1. W rodzaju Rodentia kręgosłup jest zwykle tworzony przez siedem kręgów szyjnych, trzynaście kręgów piersiowych, sześć kręgów lędźwiowych i zmienną liczbę kręgów ogonowych2,3. Długość rdzenia kręgowego jest podobna do długości kręgosłupa, a końcowe filum jest strukturą nienerwową, która zakotwicza rdzeń kręgowy w kości krzyżowej. Dodatkowo włókna nerwowe wychodzą przez otwór międzykręgowy1.
Rozwój i prawidłowe funkcjonowanie ośrodkowego układu nerwowego u ssaków zależy krytycznie od aktywności makrofagów rezydujących w układzie nerwowym, zwanych mikroglejem4. Chociaż mikroglej był początkowo opisywany jako fagocyty rezydujące w mózgu, ostatnie badania przypisały tym komórkom wiele dynamicznych funkcji5,6. Wielkość mikrogleju waha się od 7 do 10 μm w homeostazie; Są uważane za jedne z najbardziej wszechstronnych komórek w organizmie i mogą przystosować się morfologicznie i funkcjonalnie do stale zmieniającego się środowiska7. Komórki te wykazują wysoką heterogeniczność zarówno w stadium embrionalnym, jak i dorosłym8,9, podczas gdy w stadium dorosłym wykazują również złożoną niejednorodność funkcjonalną w oparciu o ich kontekst czasoprzestrzenny10. Heterogeniczność i wielorakość funkcji mikrogleju pozwala na zróżnicowaną ekspresję i zachowanie genów w rdzeniu kręgowym i mózgu. Wykazano, że ekspresja CD11b, CD45, CD86 i CCR9 jest wyższa w rdzeniu kręgowym w porównaniu z brain8,9.
Istnieje wiele protokołów do izolacji mikrogleju mózgowego11,12; jednak istnieje tylko kilka dla mikrogleju rdzenia kręgowego13,14. Optymalizacja metody oczyszczania mikrogleju z rdzenia kręgowego ułatwia rozwój wielu badań ukierunkowanych na odkrycie fizjologii mikrogleju. Protokół ten ma na celu opisanie prostej i wysoce powtarzalnej ekstrakcji rdzenia kręgowego myszy oraz oczyszczania mikrogleju (Rysunek 1).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z oficjalnym meksykańskim standardem NOM-062-ZOO-1999 oraz przewodnikiem dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Zgodę na przeprowadzenie badania uzyskano od Komisji ds. Badań, Etyki i Bezpieczeństwa Biologicznego Szpitala Dziecięcego w Meksyku (HIM/2023/006) oraz Komisji ds. Badań i Bioetyki Szpitala Ogólnego w Meksyku Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Trzy myszy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni zostały pozyskane ze Szpitala Dziecięcego w Meksyku, gdzie były hodowane w odizolowanych warunkach w wentylowanych stojakach, zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami i ich użytkowania.
1. Przygotowanie materiałów i odczynników
- Podgrzej PBS bez Ca2+ i Mg2+, a także zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS) do 37 °C.
- Uzupełnij roztwór HBSS o 100 μg/ml liberazy i 4 μg/ml DNazy (HBSS-LD). Upewnij się, że roztwór utrzymuje fizjologiczne pH 7.4,
UWAGA: Konieczne będzie 1 ml roztworu roboczego na rdzeń kręgowy. - Przygotować izotoniczny 90% roztwór do wirowania w gradicynie gęstości (dostępny w handlu, patrz tabela materiałów) i ogrzać go do temperatury 37 °C.
- Przygotować bufor barwiący, łącząc 5% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (FBS) z PBS i przechowywać mieszaninę na lodzie.
- Wstępnie podgrzej Dulbecco's Modified Eagle's Średnio-wysoki poziom glukozy (1 g / L) (DMEM) do 37 °C.
- Uzupełnij pożywkę DMEM 10% FBS, 2 mM L-glutaminy, 200 U/ml penicyliny, 200 μg/ml streptomycyny i 500 pg/ml amfoterycyny B (patrz Tabela materiałów) w celu przygotowania DMEM-S.
2. Sekcja i przygotowanie rdzenia kręgowego
- Poddać mysz eutanazji z dootrzewnowym przedawkowaniem pentobarbitalu w dawce 150 mg/kg. Wysterylizuj klatkę piersiową i plecy myszy za pomocą 70% etanolu.
UWAGA: Upewnij się, że eutanazja zakończyła się sukcesem przed przystąpieniem do sekcji myszy. - Ogol odcinek piersiowo-lędźwiowy i przymocuj kończyny do deski preparacyjnej za pomocą taśmy klejącej.
- Za pomocą skalpela wykonaj ostrożne nacięcie wzdłuż grzbietowej linii środkowej od okolicy potylicznej do krzyżowej (Ryc. 2).
- Za pomocą stereoskopowego mikroskopu chirurgicznego wypreparuj warstwami, aż dotrzesz do odcinka lędźwiowego kręgosłupa i zidentyfikuj ostatni łuk żebrowy.
UWAGA: 13 łuków żebrowych jest połączonych przegubowo w kręgach piersiowych; po rozcięciu stają się widoczne ponad kręgiem L1 classebra2. - Określ ostatni kręg szyjny i kość krzyżową, a następnie wykonaj cięcie, aby oddzielić kręgosłup (Rysunek 2).
- Za pomocą kleszczy preparacyjnych wykonaj laminektomię grzbietową kręgów w celu ekstrakcji rdzenia kręgowego (Rysunek 3A-D).
UWAGA: Z wyjątkiem pierwszych dwóch kręgów szyjnych (atlasu i osi), wszystkie ruchome kręgi mają wspólną konstrukcję morfologiczną w różnych obszarach (szyjnym, piersiowym lub lędźwiowym). Każdy typowy ruchomy kręg ma cylindryczny trzon kręgu na jego przednim końcu. Z tyłu ciała przymocowany jest łuk kostny znany jako łuk kręgowy (łuk nerwowy), składający się z blaszek i wyrostków kolczystych. Pomiędzy tymi strukturami znajduje się otwór kręgowy15. - Usuń nerwy wyłaniające się przez otwory (korzenie grzbietowe i brzuszne), które tworzą obwodowy układ nerwowy i mogą zawierać naciekające makrofagi (Rysunek 3D).
UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania pia mater lub opon mózgowych, ponieważ podłoże o gradiencie gęstości skutecznie eliminuje zanieczyszczające astrocyty. Dodatkowo zachowanie opon mózgowych skraca czas oczyszczania i zwiększa żywotność.
3. Trawienie tkanek i izolacja mikrogleju
- Umieść rdzeń kręgowy na desce sekcyjnej i za pomocą nożyczek Vannas pokrój rdzeń kręgowy na 2 mm kawałki, uzyskując średnio 10 kawałków.
- Przenieś odcinki rdzenia kręgowego do mikroprobówki płaskodennej o pojemności 2 ml (Rysunek 3E, F).
- Dodać 1 ml roztworu roboczego HBSS-LD (krok 1.2). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 25 minut, energicznie wirując co 5 minut.
- Przepuść zawartość każdego trawienia przez sitko o wielkości 40 μm, a następnie dodaj 7 ml HBSS z 2% FBS, aby zneutralizować trawienie.
- Rozdrobnić pozostałą tkankę za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 1 ml. Odwirować zawiesinę w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przez 5 minut w temperaturze 220 x g, 4 °C.
- Odrzucić supernatant za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml i ponownie zawiesić osad w 2 ml HBSS z 2% FBS w stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Połącz z 2 ml 90% pożywki o gradientzie gęstości izotonicznej. Wirować przez 25 min przy 160 x g, 18 °C.
UWAGA: Używaj powolnego przyspieszania i unikaj używania hamulca. - Użyj pipety transferowej, aby pobrać granicę faz i przenieść ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przemyć komórki 10 ml PBS i wirować przez 5 minut w temperaturze 220 x g, 4 °C.
- Ponownie zawiesić komórki w DMEM-S (krok 1.6) i przechowywać je na lodzie.
4. Określanie czystości/żywotności
- Do ilościowego oznaczania żywotnych komórek za pomocą komory hemocytometru należy zastosować 0,4% barwienie błękitem trypanowym (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Średnio jedna mysz dostarcza 4-6 milionów komórek. - Aby określić ilościowo żywotne komórki za pomocą cytometru przepływowego, należy zastosować dostępne na rynku barwienie barwnikiem fluorescencyjnym reagującym z aminą (patrz tabela materiałów).
- Przenieś 1 milion komórek do probówki okrągłodennej (FACS) z polistyrenu o pojemności 5 ml. Rozcieńczyć barwnik fluorescencyjny PBS w stosunku 1:1000 (tworząc roztwór roboczy o żywotności).
- Próbki inkubować z roztworem żywotności w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Przemyć komórki dwukrotnie lodowatym PBS. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl buforu barwiącego (krok 1.4).
- Zablokować komórki za pomocą 2,4G2 anty-FcRIII/I (patrz tabela materiałów) w lodowatym buforze barwiącym na 15 minut w temperaturze 4 °C.
- Sformułować koktajl barwienia przeciwciał, dodając znakowane fluorescencyjnie przeciwciała monoklonalne CD45-PerCP i CD11b-eFluor 450 do buforu barwiącego (w rozcieńczeniu 1:300) (patrz Tabela materiałów).
UWAGA: Chociaż obie techniki są dostępne, wybierz tę, która najlepiej pasuje do kolejnego protokołu. - Inkubować próbki z koktajlem barwiącym przeciwciała w ciemności w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Dwukrotnie przemyć komórki lodowatym buforem barwiącym. Ponownie zawiesić komórki w 400 μl buforu barwiącego.
- Zbierz 250 000 zdarzeń na cytometrze przepływowym, zgodnie ze strategią bramkowania w kroku 6 (Rysunek 4).
5. Barwienie immunofluorescencyjne
- Umieścić wstępnie obrobione szkiełko nakrywkowe w dołku na płytce 6-dołkowej.
UWAGA: W celu leczenia szkiełek nakrywkowych należy umieścić je na szalce Petriego z 500 μl roztworu L-polilizyny (0,01 mg/ml, patrz Tabela Materiałów) i inkubować przez 1 godzinę. Następnie umyj je trzy razy wodą destylowaną i pozostaw do wyschnięcia. - Wysiewaj 200 000 komórek na traktowane szkiełko nakrywkowe za pomocą 500 μl roztworu DMEM-S. Inkubować przez 24 godziny.
- Usuń szkiełka nakrywkowe i utrwal komórki za pomocą 3,7% paraformaldehydu (PFA) przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie lodowatym PBS.
- Przepuszczalność komórek za pomocą 0,2% Triton X-100 w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie zimnym PBS. Zablokuj komórki 0,2% BSA w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Rozcieńczyć przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencją (w rozcieńczeniu 1:300, patrz tabela materiałów) w roztworze blokującym i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełka nakrywkowe trzykrotnie lodowatym PBS.
- Nałóż na szkiełko podłoże montażowe zawierające DAPI, a następnie uszczelnij je szkiełkiem nakrywkowym.
UWAGA: Preparaty można natychmiast analizować za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego lub można je przechowywać do 3 miesięcy w temperaturze -20°C.
6. Strategia bramkowania dla mikrogleju rdzenia kręgowego
- Wygeneruj wykres punktowy i ustal bramkę do izolacji żywotnych komórek na podstawie barwienia żywotności i pustego kanału fluorescencyjnego16. Wyklucz komórki niezdolne do życia.
- Utwórz kolejny wykres, wykorzystując parametry rozproszenia do przodu i z boku, aby wyeliminować zanieczyszczenia16.
- Opracuj dodatkowy wykres punktowy i przeanalizuj ekspresję CD11b i CD45 w celu rozróżnienia mikrogleju.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Z wykorzystaniem tkanki rdzenia kręgowego myszy przeprowadzono trawienie enzymatyczne przy użyciu mieszaniny silnie wzbogaconej w kolagenazę i termolizynę. Uzyskaną strawioną tkankę przepuszczono przez filtr 40 µm w celu usunięcia niestrawionego materiału. Zebrane komórki wzbogacono za pomocą gradientu gęstości Percoll, z 90% w części dolnej i 45% w części górnej. Komórki wzbogacone w mikroglej znajdujące się na granicy faz barwiono przeciwciałami CD45 i CD11b, a następnie poddano analizie cytometrycznej (
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowano liczne protokoły do badania mikrogleju ze względu na ich znaczenie w homeostazie mózgu. W tych metodach mikroglej jest zwykle pozyskiwany z półkul mózgowych embrionalnych lub nowonarodzonych szczurów i myszy17. Ograniczona liczba badań dotyczyła oczyszczania mikrogleju z rdzenia kręgowego dorosłych myszy13,14. Techniki te obejmują trawienie enzymatyczne przy użyciu kolagenazy i/lub papainy wraz z DNAzą, często w połączeniu z sep...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty ze stypendium przyznanego przez Narodową Radę Nauki i Technologii (CONACYT) (702361). Autorzy potwierdzają ukończenie studiów doktoranckich w zakresie nauk biologiczno-chemicznych w Krajowej Szkole Nauk Biologicznych Narodowego Instytutu Politechnicznego.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Probówki zbiorcze 15 ml | Corning, USA | 430790 | |
| Mikroprobówki 2 ml | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anty-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 70% etanolu | |||
| Antybiotyk-Antybiotyk Przeciwgrzybicze (penicylina, streptomycyna, amfoterycyna b) | Gibco, Stany Zjednoczone | 15240062 | |
| Przeciwciało CD11b eFluor 450 przeciw myszom | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Przeciwciało CD45 PerCP przeciw myszy | BioLegend, USA | 103130 | |
| Zrównoważony roztwór soli (PBS) bez wapnia i magnezu | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Sitko do niebieskich komórek 40 μ m | Corning, Stany Zjednoczone | 352340 | |
| Costar 6-dołkowy przezroczysty nieleczony | Corning, USA | CLS3736 | |
| Szkiełka nakrywkowe | |||
| Cyfrowe ogrzewanie Wytrząsanie Sucha kąpiel | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Kleszcze preparacyjne do mikrochirurgii | FT firmy DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´ s Zmodyfikowany orzeł i ostry; s Średnio-wysoki poziom glukozy (DMEM) | Merck, Stany Zjednoczone | D6429 | |
| Golarka | |||
| rurka FACS | Thermo, USA | 352058 | |
| Płodowa surowica bydlęca (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Cytometr przepływowy Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank' s Zrównoważony roztwór soli | Merck, Stany Zjednoczone | H2387 | |
| L-glutamina | Corning, Stany Zjednoczone | ||
| Liberase TM | Roche, Stany Zjednoczone | 5401119001 | |
| Komora Neubauera Komory liczące Chiny | 1103 | ||
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, Stany Zjednoczone | 17089101 | wirowanie w gradiacji gęstości |
| Roztwór poli-L-lizyny | Merck, USA | P8920 | |
| Skalpel nr 25 | HERGOM, Meksyk | Probówki | |
| Snaplock 2 ml | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Mikroskop stereoskopowy | Velab, Meksyk | HG927831 | |
| Proste nożyczki chirurgiczne (10 cm) | HERGOM, Meksyk | ||
| Nożyczki proste Vannas | HERGOM, Meksyk | ||
| Triton X100 | Merck, Stany Zjednoczone | X100 | |
| Błękit trypanowy Bejca 0,4% | Merck, Stany Zjednoczone | 15250-061 | |
| Mieszalnik wirowy | DLAB, Chiny | 8031102000 | |
| Zestaw do naprawy żywotności Zombie Aqua | BioLegend, USA | 423102 | barwienie barwnikiem fluorescencyjnym reagującym z aminami |
Bibliografia
- Schröder,, Moser,, Huggenberger, Neuroanatomy of the Mouse. , Springer, Switzerland. 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, First ed, Springer. 205(2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504(2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
