Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Egzocytoza akrosomów (AE), w której pojedynczy pęcherzyk egzocytotyczny plemnika łączy się z błoną plazmatyczną, jest złożonym, zależnym od wapnia procesem niezbędnym do zapłodnienia. Jednak nasza wiedza na temat tego, w jaki sposób sygnalizacja wapniowa reguluje AE, jest nadal niekompletna. W szczególności wzajemne oddziaływanie między wewnątrzakrosomalną dynamiką wapnia a etapami pośrednimi prowadzącymi do AE nie jest dobrze zdefiniowane. W tym miejscu opisujemy metodę, która zapewnia przestrzenny i czasowy wgląd w dynamikę wapnia akrosomalnego i ich związek z fuzją błonową i późniejszą egzocytozą pęcherzyka akrosomowego. Metoda wykorzystuje nowatorską transgeniczną mysz z ekspresją czujnika egzocytozy ukierunkowanego na akrosomy (AcroSensE). Czujnik łączy genetycznie kodowany wskaźnik wapnia (GCaMP) połączony z mCherry. To białko fuzyjne zostało specjalnie zaprojektowane, aby umożliwić jednoczesną obserwację akrosomalnej dynamiki wapnia i zdarzeń fuzji błonowej. Monitorowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i AE w żywych plemnikach AcroSensE odbywa się dzięki połączeniu obrazowania z dużą liczbą klatek na sekundę i systemu dostarczania stymulantu, który może być ukierunkowany na pojedyncze plemniki. Protokół ten zawiera również kilka przykładów podstawowych metod ilościowego określania i analizy surowych danych. Ponieważ model AcroSensE jest kodowany genetycznie, jego znaczenie naukowe można zwiększyć dzięki wykorzystaniu łatwo dostępnych narzędzi genetycznych, takich jak krzyżowanie z innymi modelami genetycznymi myszy lub metody oparte na edycji genów (CRISPR). Dzięki tej strategii można rozwiązać rolę dodatkowych szlaków sygnałowych w kapacytacji plemników i zapłodnieniu. Podsumowując, opisana tutaj metoda stanowi wygodne i skuteczne narzędzie do badania dynamiki wapnia w określonym przedziale subkomórkowym - akrosomie plemników - oraz w jaki sposób ta dynamika reguluje etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.
Wprowadzenie
Plemniki nabywają zdolność do zapłodnienia podczas procesu zwanego capacitation1. Jednym z punktów końcowych tego procesu jest to, że plemniki nabywają zdolność do przechodzenia AE. Dane zebrane w ciągu dwóch dekad potwierdzają obecność złożonego, wieloetapowego modelu AE w nasieniu ssaków (podsumowane w2,3). Jednak badanie AE w żywych plemnikach jest wyzwaniem, a obecnie dostępne metody monitorowania tego procesu z odpowiednią rozdzielczością są kłopotliwe i wymagają wielu etapów przygotowania4, ograniczają się do wykrycia końcowego etapu AE (np. przy użyciu PNA....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Cornell (#2002-0095). Do niniejszego badania użyto myszy AcroSensE w wieku 8-10 tygodni2. Prośby o informacje na temat dostępności myszy AcroSensE można kierować do autora korespondencyjnego.
1. Pobieranie i mycie nasienia
- Zbierz plemniki ogona najądrza (więcej szczegółów na temat tej procedury znajduje się w11) od myszy AcroSensE. Pozostawić 15-minutową procedurę wypływania w 3,5 cm naczyniu ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Rycina 2 przedstawia uproszczoną ilustrację ukazującą sekwencję zmian fluorescencji oczekiwanych po skutecznej stymulacji plemników. Górny panel Ryciny 2 ilustruje zmiany w intensywności fluorescencji GCaMP3, gdzie sygnał jest początkowo słaby (bazowe stężenia wapnia w akrozomie są niższe niż KD GCaMP3), a po wejściu jonów wapnia via pory fuzyjne jasność fluorescencji wzrasta. Ostatecznie, podczas AE następuje utrata sygnału z powodu dyfuzji i utraty se.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym artykule opisano metodę opartą na mikroskopii, która wykorzystuje nowo wygenerowany model myszy AcroSensE do monitorowania pojedynczych komórek w czasie rzeczywistym i analizy zależności między dynamiką wapnia w akrosomach a etapami pośrednimi prowadzącymi do AE. Wraz z łatwo dostępnymi podejściami genetycznymi, takimi jak krzyżowanie z innymi modelami genetycznymi myszy lub edycja genów, ten model i metoda zapewniają potężny system do badania roli różnych składników i szlaków, które biorą udział w szlakach sygnało.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Żaden z autorów nie ma konfliktu interesów, który mógłby zgłosić w związku z tą pracą.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez granty National Institutes of Health R01-HD093827 i R03-HD090304 (A.J.T).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 100x obiektyw olejowy | Olympus Japan | ||
| Sigma | C0926 | ||
| Szalka nakrywkowa 35 mm, grubość 1,5 MatTek | Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 ml rurka okrągłodenna | Falcon | 352054 | |
| Kapilarnie ze szkła borokrzemianowego | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Mikroskop konfokalny | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glukoza | Sigma | G7528 | |
| Końcówka z podziałką | TipOne, Stany Zjednoczone Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Kwas mlekowy | Sigma | G5889 | |
| Systemy inkubacji mikroskopu żywego komórek | TOKAI HIT Shizuoka, Japonia | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Ściągacz do mikropipet | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastikowa pipeta transferowa | Marka rybacka | 13-711-6M | |
| Poli-D-lizyna | Sigma | P7280 | |
| Kwas pirogronowy | Sigma | 107360 | |
| System dostarczania pojedynczych komórek | Parker, Hauppauge, Nowy Jork | Picospritzer III |
Bibliografia
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal c....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
