Artykuł metodologiczny

Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa

DOI:

10.3791/65980

⸱

15 marca 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół dostarcza zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz całkowitej liczby sideroforów, pioverdyny i pyocheliny z Pseudomonas aeruginosa.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest znana z produkcji różnorodnych czynników wirulencji, które wywołują infekcje u gospodarza. Jednym z takich mechanizmów jest wymiatanie żelaza poprzez produkcję sideroforów. P. aeruginosa wytwarza dwa różne siderofory: pyochelinę, która ma mniejsze powinowactwo chelatujące żelazo, i pyoverdynę, która ma wyższe powinowactwo chelatujące żelazo. W raporcie tym wykazano, że pyoverdine można bezpośrednio oznaczyć ilościowo z supernatantów bakteryjnych, podczas gdy pyochelin musi być wyekstrahowany z supernatantów przed określeniem ilościowym.

Podstawową metodą jakościowej analizy produkcji sideroforów jest test na płytkach agarowych z sulfonianianem chromu azurolu (CAS). W tym teście uwolnienie barwnika CAS z kompleksu Fe3+-Dye prowadzi do zmiany koloru z niebieskiego na pomarańczowy, co wskazuje na produkcję sideroforu. W celu ilościowego określenia całkowitej liczby sideroforów supernatanty bakteryjne zmieszano w równych proporcjach z barwnikiem CAS na płytce mikromiareczkowej, a następnie przeprowadzono analizę spektrofotometryczną przy długości fali 630 nm. Pioverdynę oznaczono bezpośrednio ilościowo z bakteryjnego supernatantu poprzez zmieszanie jej w równych proporcjach z 50 mM Tris-HCl, a następnie przeprowadzono analizę spektrofotometryczną. Szczyt przy długości fali 380 nm potwierdził obecność pioverdyny. Jeśli chodzi o Pyochelin, bezpośrednie określenie ilościowe z supernatantu bakteryjnego nie było możliwe, więc najpierw trzeba było go wyekstrahować. Późniejsza analiza spektrofotometryczna wykazała obecność pyocheliny, której szczyt przypadł na 313 nm.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Organizmy potrzebują żelaza do wykonywania różnych funkcji życiowych, takich jak transport elektronów i replikacja DNA1. Wiadomo, że Pseudomonas aeruginosa, Gram-ujemny patogen oportunistyczny, posiada różne czynniki wirulencji, które powodują infekcję u gospodarza, wśród których jednym z mechanizmów jest tworzenie sideroforów2. W warunkach zubożenia żelaza P. aeruginosa uwalnia wyspecjalizowane cząsteczki zwane sideroforami, które wygaszają żelazo z otaczającego środowiska. Siderofory chelatują żelazo zewnątrzkomórkowo, a powstały kompleks żelazowo-sideroforowy jest aktywnie transportowany z powrotem do komórki3.

P. aeruginosa jest znany z produkcji dwóch sideroforów, pioverdyny i pyocheliny. Wiadomo, że pioverdyna ma wyższe powinowactwo chelatujące żelazo (1:1), podczas gdy pyochelina ma mniejsze powinowactwo chelatujące żelazo (2:1)4. Pyochelin jest również nazywany drugorzędnym sideroforem, ponieważ ma niższe powinowactwo chelatujące żelazo5. Produkcja i regulacja sideroforów są aktywnie kontrolowane przez systemy Quorum Sensing (QS) w P. aeruginosa6.

Oprócz hartowania żelaza, siderofory są również zaangażowane w regulację czynników wirulencji i odgrywają aktywną rolę w tworzeniu biofilmu7. Siderofory pełnią dodatkowe kluczowe role, w tym udział w sygnalizacji komórkowej, obronę przed stresem oksydacyjnym i ułatwianie interakcji między społecznościami drobnoustrojów8. Siderofory są zazwyczaj klasyfikowane na podstawie określonych grup funkcyjnych, przez które chelatują żelazo. Trzy podstawowe ligandy dwuzębne w tej klasyfikacji to katechol, hydroksymat i α-hydroksy3. Pioweredyny są znakami rozpoznawczymi fluorescencyjnych gatunków Pseudomonas, takich jak P. aeruginosa i P. fluorescens5. Składają się z mieszanego chromoforu fluorescencyjnego w kolorze zielonym sprzężonym z oligopeptydem zawierającym 6-12 aminokwasów. W ich syntezie bierze udział kilka nierybosomalnych syntetaz peptydowych (NRP)9. Cztery geny biorące udział w produkcji i regulacji pioverdyny to pvdL, pvdI, pvdJ i pvdD10. Pioverdyna jest również odpowiedzialna za infekcje i zjadliwość u ssaków11. Zauważono, że P. aeruginosa wytwarza pyochelinę w umiarkowanych warunkach ograniczających żelazo, podczas gdy pyoverdine jest wytwarzany w trudnych warunkach ograniczających żelazo12. Dwa operony biorące udział w produkcji pyochelin to pchDCBA i pchEFGHI13. Należy zauważyć, że w obecności pyocjaniny, pyochelina (katechola) indukuje uszkodzenia oksydacyjne i stany zapalne oraz generuje rodniki hydroksylowe, które są szkodliwe dla tkanek gospodarza11.

Test sulfonianu chromu Azurol (CAS) jest szeroko stosowany ze względu na jego kompleksowość, wysoką czułość i większą wygodę w porównaniu do testów mikrobiologicznych, które, choć czułe, mogą być zbyt szczegółowe14. Test CAS można przeprowadzić na powierzchniach agaru lub w roztworze. Opiera się na zmianie koloru, która następuje, gdy jon żelaza przechodzi z intensywnego niebieskiego kompleksu do pomarańczowego. Test kolorymetryczny CAS określa ilościowo ubytek żelaza w trójskładnikowym kompleksie Fe-CAS-środek powierzchniowo czynny. Ten szczególny kompleks, składający się z metalu, barwnika organicznego i środka powierzchniowo czynnego, ma niebieski kolor i wykazuje pik absorpcji przy 630 nm.

Ten raport przedstawia metodę jakościowego wykrywania produkcji sideroforów, gdzie można wykryć produkcję sideroforów na płytce agarowej. Podano również metodę ilościowego szacowania całkowitej produkcji sideroforu na płytce mikromiareczkowej oraz wykrywania i analizy ilościowej dwóch sideroforów, pioverdyny i pyocheliny, pochodzących z P. aeruginosa.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie izolaty bakteryjne P. aeruginosa zostały uzyskane z medycznych laboratoriów mikrobiologicznych z Vadodara i Jaipur w Indiach. Wszystkie wybrane izolaty kliniczne były traktowane w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSL2) i podczas eksperymentów zachowano najwyższą ostrożność podczas obchodzenia się z izolatami bakteryjnymi. Szczegóły handlowe dotyczące wszystkich odczynników/roztworów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie barwnika sulfonianu chromu azurolu (CAS) i podłoża agarowego

  1. Przygotuj barwnik CAS (100 ml) o następującym składzie:
    1. Rozpuścić 60 mg CAS w 50 ml wody destylowanej (roztwór 1).
    2. Rozpuścić 2,7 mg FeCl3·6H2O w 10 ml 10 mM HCl (roztwór 2).
    3. Rozpuścić 73 mg bromku Cetrimonium (HDTMA) w 40 ml wody destylowanej (roztwór 3).
    4. Ostrożnie wymieszaj roztwór 1, roztwór 2 i roztwór 3. Przechowuj go w szklanej butelce.
  2. Przygotuj agar CAS, wykonując poniższe czynności:
    1. Dodać 100 ml roztworu soli MM9 do 750 ml wody destylowanej.
    2. Rozpuścić 32,24 g wolnego kwasu piperazyno-N,N'-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES).
    3. Dodaj 15 g agaru agarowego. Autoklaw i pozwól mu ostygnąć.
    4. Do mieszaniny dodać 30 ml jałowego roztworu Casaminokwasu i 10 ml sterylnego 20% roztworu glukozy.
    5. Dodaj 100 ml barwnika CAS, wymieszaj i wlej w aseptycznych warunkach.
      UWAGA: Przygotowanie pożywki MM9, roztworu Casaminokwasu i 8-hydroksychinoliny znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Bufor PIPES jest wrażliwy na pH. Nie rozpuści się, dopóki nie zostanie osiągnięte pH 5,6. Upewnij się, że pH jest stale monitorowane, ponieważ gdy RURY zaczną rozpuszczać się w wodzie, jeszcze bardziej obniży pH. Ekstrakt z Casaminokwasu o tej samej objętości 3% 8-hydroksychinoliny rozpuszczonej w chloroformie. Pozostawić niemieszający się roztwór w temperaturze 4 °C na około 20 minut i ostrożnie zebrać górną fazę roztworu, nie naruszając dolnej fazy.

2. Analiza jakościowa produkcji sideroforów

  1. Ustaw OD600 nm na 0,2 dla 24 h hodowanych kultur P. aeruginosa.
  2. Za pomocą sterylnej drucianej pętli rozprowadź kulturę bakteryjną na płytce agarowej CAS.
  3. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 h.
    UWAGA: Do rozcieńczenia kultury bakteryjnej można użyć pożywki z peptonów lub 0,8% soli fizjologicznej. Jeśli po 24 godzinach nie obserwuje się wzrostu bakterii, należy inkubować płytki CAS przez 48 do 72 godzin.

3. Ilościowe oszacowanie całkowitej liczby sideroforów

  1. Ponownie zaszczepić 24-godzinne kultury P. aeruginosa w pożywce wodnej peptonowej po dostosowaniu OD600 nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  2. Po 48 godzinach odwirować kulturę bakteryjną przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po odwirowaniu dodać 100 μl bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i dodać do niej 100 μl barwnika CAS.
  4. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  5. Po inkubacji wykonać odczyty spektrofotometryczne przy długości fali 630 nm.
  6. Obliczyć wyniki uzyskane w celu ilościowego określenia całkowitej liczby sideroforów jako procentowej jednostki sideroforu (PSU).
    UWAGA: Zasilacz można obliczyć jako: [(Ar - As)/Ar] x 100
    gdzie, Ar = absorbancja wzorca przy 630 nm, As = absorbancja bezkomórkowego supernatantu próbki. Dla porównania, barwnik CAS powinien być dodany do nieinokulowanych pożywek wodnych peptonowych. Napełnij wszystkie szklane naczynia, takie jak probówki, kolby itp., 6 M HCl przez 2 godziny i spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną, aby usunąć z nich wszelkie ślady żelaza.

4. Ilościowe oszacowanie pioverdyny

  1. Ponownie zaszczepić wyhodowane w ciągu 24 godzin kultury P. aeruginosa w pożywce wodnej peptonowej po dostosowaniu OD600 nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  2. Po 48 godzinach zmierz OD600 nm wzrostu bakterii, zanim przejdziesz dalej.
  3. Odwirować kulturę bakteryjną przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Po odwirowaniu dodać 100 μl bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i dodać do niej 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0).
  5. Wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy średnicy zewnętrznej405 nm.

5. Ekstrakcja pyochelin i spektrofotometria

  1. Ponownie zaszczepić wyhodowane w ciągu 24 godzin kultury P. aeruginosa w pożywce King's B (plik uzupełniający 1) po dostosowaniu OD600 nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.
  2. Po 24 godzinach pobrać 100 ml kultury i odwirować przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po odwirowaniu dodać 5 ml 1 M kwasu cytrynowego do supernatantu. Ekstrahować dwukrotnie 50 ml octanu etylu.
  4. Przefiltrować fazę organiczną z siarczanem magnezu przez filtr strzykawkowy. Przefiltrowaną fazę organiczną przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy 320 nm.
    UWAGA: Ponieważ pyochelin jest bardzo niestabilnym związkiem w temperaturze pokojowej, proces ekstrakcji należy przeprowadzić na lodzie. Do oddzielenia filtra należy użyć sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml. Umieść bawełnę na końcówce strzykawki i dodaj na nią 1 g siarczanu magnezu. Zamocować sterylny filtr strzykawkowy na końcówce strzykawki i zebrać filtrat do sterylnej probówki.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przed kwantyfikacją sideroforów z izolatów klinicznych przeprowadzono jakościowe badanie przesiewowe produkcji sideroforów, aby zapewnić produkcję sideroforów. Jakościowe wykrywanie sideroforów z izolatów klinicznych obserwowano za pomocą smug bakterii na płytkach agarowych CAS. Do badania wybrano trzy izolaty kliniczne, a mianowicie MR1, TL7, J3 oraz PAO1 (szczep referencyjny). Wszystkie trzy izolaty kliniczne i PAO1 wykazały pozytywne wyniki w produkcji sideroforu, gdzie wyraźna pomarańczowa aureola wokół wzrostu bakterii na powierzchni niebieskiego agaru wskazywała na dodatnią produkcję sideroforu (Ryc. 1). Tworzenie się halo na agarze CAS (Ryc. 1) dało przybliżone oszacowanie produkcji sideroforu przez izolaty kliniczne. W związku z tym przeprowadzono ilościowe oszacowanie produkcji sideroforów przy użyciu odczynnika CAS i pożywek płynnych.

Całkowita kwantyfikacja sideroforu została przeprowadzona bezpośrednio z bezkomórkowego supernatantu. Po inkubacji zaobserwowano zmianę koloru, gdzie żółty kolor wskazywał na usunięcie barwnika CAS z kompleksu Fe. W tym przypadku jako kontrolę użyto barwnika CAS z nieinokulowanymi pożywkami wzrostowymi, które zostały wykorzystane do obliczenia sideroforów. Nie stwierdzono istotnej różnicy w całkowitej produkcji sideroforów w izolatach MR1 i TL7, podczas gdy całkowita produkcja sideroforu w J3 była znacząca w porównaniu z PAO1 (Figura 2).

Następnie, przeprowadzono kwantyfikację pioverdyny bezpośrednio z supernatantów bezkomórkowych. Pioverdyny są uwalniane w środowisku komórkowym, więc do ilościowego oznaczania pioverdyny użyto bezkomórkowego supernatantu. Wykonano również skanowanie zakresu UV za pomocą spektrofotometru, gdzie pik przy 380 nm potwierdził obecność pioverdyny (Ryc. 3A). Odczyty spektrofotometryczne wykonano przy długości fali 405 nm, a wyniki zinterpretowano jako OD405/OD600 nm. Wszystkie izolaty wykazały produkcję pioverdyny, przy czym izolaty MR1 i J3 wykazywały znacznie niższą produkcję pioverdyny w porównaniu z PAO1, podczas gdy nie zaobserwowano znaczącej różnicy dla TL7 (Figura 3B).

Pyochelin nie może być bezpośrednio oznaczony ilościowo z bezkomórkowego supernatantu. Nie było możliwe wyekstrahowanie pyocheliny z 1 ml bezkomórkowego supernatantu, więc wyekstrahowano ją ze 100 ml bezkomórkowego supernatantu. Zakwaszono go 1 M kwasem cytrynowym. Ponieważ pyochelin jest związkiem wysoce niestabilnym, proces ekstrakcji przeprowadzono na lodzie. Wykrywanie Pyochelin przeprowadzono poprzez przeprowadzenie skanowania zakresu UV z zakresu od 300 do 600 nm, gdzie szczyt przy OD320 nm potwierdził obecność pyochelin (Rysunek 4A). Kwantyfikacja Pyochelin przeprowadzono poprzez wykonanie odczytów spektrofotometrycznych przy OD320 nm. Obliczenia wykonano dzieląc OD320/OD600. Izolaty MR1, TL7 i J3 wykazały znacznie wyższą produkcję pyocheliny w porównaniu z referencyjnym izolatem PAO1 (Rysunek 4B).

Przeprowadzono porównawczą produkcję sideroforów w różnych pożywkach bakteryjnych, aby sprawdzić całkowitą ilość sideroforów wytwarzanych w różnych pożywkach wzrostowych. Wybrano cztery różne podłoża, w których bulion Luria, pożywka King's B i woda peptonowa zostały wyekstrahowane 3% 8-hydroksychinoliną, a do badania wybrano nieekstrahowany bulion Luria. Nie stwierdzono istotnej różnicy między produkcją sideroforów w ekstrahowanym bulionie Luria, pożywce King's B i pożywce wodnej peptonowej, natomiast istotną różnicę zaobserwowano w produkcji sideroforu w nieekstrahowanym bulionie Luria.

figure-results-1
Rysunek 1: Produkcja sideroforów na agarze CAS. Wzrost P. aeruginosa na płytkach agarowych CAS z kultur hodowanych w ciągu 24 godzin zauważono na płytkach agarowych CAS i inkubowano w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Obecność sideroforu jest sygnalizowana przez pomarańczową aureolę wokół kolonii bakterii (PAO1, MR1, TL7 i J3). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Całkowita produkcja sideroforów. Całkowitą produkcję sideroforu oceniano dla PAO1 i trzech izolatów klinicznych (MR1, TL7 i J3). 100 μl bezkomórkowego supernatantu (PAO1, MR1, TL7 i J3 hodowanych przez 24 godziny w bulionie peptonowym) dodano do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania, a następnie dodano do niej 100 μl barwnika CAS. Jednoczynnikowy test ANOVA przeprowadzono dla istotności statystycznej. Słupki błędów reprezentują ±odchylenie standardowe (SD) między trzema kontrpróbami biologicznymi. *odpowiada p < 0,05; ns odpowiada p > 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Produkcja pioverdyny. Produkcja pioverdyny szczepu PAO1 P. aeruginosa i izolatów klinicznych (MR1, TL7 i J3) oceniana po 24 godzinach wzrostu w pożywkach peptonowych. Kultury bakteryjne odwirowano, a 100 μl bezkomórkowego supernatantu dodano do 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania. Następnie dodano do niego 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0). Detekcję pioverdyny przeprowadzono za pomocą spektrofotometrii UV w zakresie od 350 nm do 600 nm. Analiza spektrometryczna przy 380 nm produkcji pioverdyny (A). Kwantyfikacja produkcji pioverdyny (B). Słupki błędów wskazują błąd standardowy w stosunku do średniej z trzech eksperymentów. Słupki błędów reprezentują ± SD między trzema kontrpróbami biologicznymi. odpowiada p < 0,0001, **odpowiada p < 0,01, a ns odpowiada p > 0,05 na podstawie jednoczynnikowego testu ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Produkcja Pyochelin. Produkcja PAO1 (stosowanego jako odniesienie) i izolatów klinicznych (MR1, TL7 i J3) przy użyciu ekstrakcji octanem etylu i siarczanem magnezu. Analiza spektrofotometryczna w zakresie od 230 nm do 400 nm (A). Oznaczanie ilościowe pyocheliny (B). Dla każdego izolatu przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty. Słupki błędów reprezentują ± SD między trzema kontrpróbami biologicznymi. odpowiada p < 0,001 na podstawie jednostronnego testu ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Uzupełniający Rysunek 1: Porównawcza produkcja sideroforów w różnych pożywkach bakteryjnych. Całkowita produkcja sideroforów w czterech różnych pożywkach wzrostowych, w których wybrano pożywkę King's B, pożywkę wodną peptonową i bulion Luria z 3% 8-hydroksychinoliną, aby usunąć z niej śladowe ilości żelaza, a bulion Luria (nieekstrahowany) wybrano. Ekstrakcję 3% 8-hydroksychinoliną przeprowadzono przez dodanie równej objętości 3% 8-hydroksychinoliny do pożywki. Słupki błędów reprezentują ± SD między trzema kontrpróbami biologicznymi. **odpowiada p < 0,001, a ns odpowiada p > 0,5 na podstawie testu jednoczynnikowej ANOVA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Plik uzupełniający 1: Receptury medialne wykorzystane w niniejszym badaniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten umożliwia naukowcom ilościowe określenie całkowitej liczby sideroforów i dwóch różnych sideroforów P. aeruginosa, a mianowicie pyoverdiny i pyocheliny, z supernatantu bezkomórkowego bakterii. W teście na płytkach agarowych CAS barwnik CAS i jony Fe3+ tworzą kompleks. Kiedy bakterie wytwarzają siderofory, wygaszają jony Fe3 + z kompleksu CAS-Fe3 +, co prowadzi do zmiany koloru wokół wzrostu bakterii. Ta zmiana powoduje powstanie wyraźnej pomarańczowej aureoli wokół wzrostu bakterii14,15. Chociaż bakterie mogą być bezpośrednio smugowane na płytkach agarowych CAS, może to mieć wpływ na ogólne wyniki. Smugowanie dużej liczby komórek bakteryjnych może stworzyć szeroką pomarańczową aureolę wokół wzrostu bakterii, podczas gdy użycie mniejszej liczby komórek bakteryjnych może skutkować wąską, czystą strefą. Aby temu zaradzić, przebadaliśmy jednolitą liczbę komórek bakteryjnych, dostosowując OD600. Wybredne bakterie mogą wykazać wyniki w ciągu 24 godzin, podczas gdy wolno rosnące bakterie mogą potrzebować więcej niż 72 godzin, aby wykazać produkcję sideroforu.

Do ilościowego oznaczania całkowitej liczby sideroforów początkowo zastosowano klasyczną spektroskopię, która wymaga znacznej objętości supernatantu do wykrywania sideroforów, co czyni ją niepraktyczną. Kwantyfikacja całkowitych sideroforów jest obecnie przeprowadzana przy użyciu 96-dołkowej płytki ze zmodyfikowanym testem CAS. Takie podejście zaowocowało zmniejszeniem zużycia odczynników, supernatantu bakteryjnego, czasu i zwiększoną dokładnością w porównaniu z tradycyjnymi metodami spektroskopowymi16. Inne badania wykazały również stosowanie płytek do mikromiareczkowania jako metody oszczędzającej czas i bardziej efektywnej17. Kwantyfikacja całkowitej liczby sideroforów za pomocą płytki do mikromiareczkowania okazała się skutecznym podejściem. W tym badaniu do badania wybrano 48-godzinne kultury bakterii hodowane w pożywkach wolnych od żelaza. Przeprowadzono również badanie porównawcze w celu oceny produkcji sideroforów w różnych pożywkach wzrostowych, takich jak bulion Luria, bulion Luria (ekstrahowany 3% 8-hydroksychinoliną), pożywka King's B (ekstrahowana 3% 8-hydroksychinoliną) i pożywka peptonowa (ekstrahowana 3% 8-hydroksychinoliną). Zaobserwowano, że pożywki wodne peptonowe wykazywały największą ilość produkcji sideroforu, a co za tym idzie, wybrano je do dalszych eksperymentów. Wykres przedstawiający produkcję sideroforów w różnych pożywkach wzrostowych znajduje się na rysunku uzupełniającym 1.

Pioverdyna może być wykryta i oznaczona ilościowo za pomocą odczytów spektrofluorymetrycznych, ale wiadomo, że tylko pioverdina wykazuje fluorescencję. Pioverdyna w kompleksie z jonami Fe3+ nie wykazuje fluorescencji18,19. Do wykrywania i oznaczania ilościowego pioverdyny wybrano do badań 48-godzinne kultury bakterii. Wiadomo, że P. aeruginosa wytwarza pyochelin w początkowych warunkach głodu żelaza i przechodzi na produkcję pioverdyny po ekspozycji na ciężkie warunki stresu żelazowego. Wykazano, że pioverdyna może chelatować inne kationy metaliczne, takie jak aluminium, gal, mangan i chrom, ale tylko żelazo jest z powodzeniem transportowane do błony komórkowej19.

Podobnie jak w przypadku syderoforów całkowitych i pioverdyny, pyocheliny nie można bezpośrednio oznaczyć ilościowo z bezkomórkowego supernatantu i należy ją ekstrahować przy użyciu dichlorometanu20. Dichlorometan nie miesza się z bezkomórkowym supernatantem i tworzy oddzielną warstwę na dnie. W tym badaniu przetestowano różne pożywki, w tym bulion Luria, wodę peptonową i pożywkę z kwasami Casamino, ale znaczną ilość pyocheliny uzyskano z pożywki King's B. Podczas gdy Hoegy i in. używali pożywek CAA w swoim protokole, zmodyfikowaliśmy je za pomocą pożywki King's B, ponieważ pożywki CAA nie wspierały wzrostu bakterii21. Metodę zmodyfikowano następnie poprzez ekstrakcję pożywki za pomocą 8-hydroksychinoliny w celu usunięcia wszelkich pozostałości żelaza z pożywki, tworząc pożywkę z niedoborem żelaza. Ponadto stwierdzono, że czas inkubacji znacząco wpływa na produkcję ropocheliny. Dumas i wsp. wykazali, że P. aeruginosa przechodzi z produkcji pyocheliny na pyoverdine w warunkach ciężkiego ograniczenia żelaza12. W tym badaniu ekstrakcję i detekcję pyocheliny przeprowadzono z 24-godzinnych kultur bakteryjnych, ponieważ pyochelina nie została wykryta w 48-godzinnych hodowlach. Objętość supernatantu wpływa również na wykrywanie ropocheliny, dlatego do ekstrakcji użyto 100 ml bezkomórkowego supernatantu. Co więcej, produkcja pyocheliny była znacznie wyższa w izolatach MR1, TL7 i J3, prawdopodobnie z powodu szczepów bakteryjnych, które nie są w stanie wytwarzać pyoverdyny, mimo że mają silne chelatory żelaza22.

Ji i in. wprowadzili nowatorskie i czułe podejście do kwantyfikacji pyochelin, weryfikując je za pomocą LC/MS/MS. Jednak metoda ta miała zastosowanie tylko do izolatów P. aeruginosa z plwociny pacjentów z mukowiscydozą. LC/MS/MS, będąc kosztowną konfiguracją, może nie być przystępna cenowo dla większości laboratoriów23. Visaggio i in. opracowali bioluminescencyjny bioczujnik oparty na całych komórkach, który umożliwia szybką, czułą i jednoetapową kwantyfikację pyocheliny. Niemniej jednak metoda ta nie może zapewnić ilościowego określenia całkowitej zawartości sideroforów i pioverdyny24.

Systemy wychwytu żelaza przez siderofor mogą mieć zastosowanie przeciwdrobnoustrojowe w dostarczaniu leków dla bakterii wielolekoopornych, ponieważ odgrywają kluczową rolę w przeżywalności i zjadliwości bakterii. Takie podejście może zaoferować nowy sposób zwalczania bakterii wielolekoopornych25. Leki, które nie mogą przeniknąć przez błonę komórkową bakterii, mogą być połączone z sideroforem, a powstały kompleks Fe-siderofor może być transportowany wewnątrz błony bakteryjnej26.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy dziękują za finansowanie z DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program i FIST. MR dziękuje za stypendium otrzymane od SHODH. HP dziękuje za stypendium otrzymane od CSIR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar Agar, typ IHIMEDIAGRM666
8-hydroksychinolinaLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome sulfonian azuroluHIMEDIARM336-10G
Kwas cytrynowyMerck100241
Monohydrat dekstrozyMerck108342
DichlorometanMerck107020
Sześciowodny chlorek żelazaHIMEDIAGRM6353
Szklane kolbyBorosil5100021
Szklane probówkiBorosil9820U05
Kwas solnySDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimalne sole średnieHIMEDIAG013-500G
Siarczan magnezu Qualigens10034
MultiskanGOThermo Scientific51119200
Pepton Typ I, BakteriologicznyHIMEDIARM667-500G
RURY kwas wolnyMP Biomedicals190257
Diwodorofosforan potasuMerck1048731000
Pepton ProteoseHIMEDIARM005-500G
Spektrofotometr UV-Vis Shimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Chlorek soduQualigens15915
Spektrofotometr UV

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Oznaczanie ilo ci pyoverdynyekstrakcja pyochelinytest na pod o u CAS agaranaliza spektrofotometrycznasupernatant wolny od kom rekczynniki wirulencjiwychwytywanie elazap ytka mikrotitracyjna

Powiązane artykuły