Artykuł metodologiczny

Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa

7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/65980

⸱

15 marca 2024

 ,  , 
1Department of Microbiology and Biotechnology Centre, Faculty of Science, The Maharaja Sayajirao University of Baroda

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz całkowitej liczby sideroforów, pioverdyny i pyocheliny z Pseudomonas aeruginosa.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest znana z produkcji różnorodnych czynników wirulencji, które wywołują infekcje u gospodarza. Jednym z takich mechanizmów jest wymiatanie żelaza poprzez produkcję sideroforów. P. aeruginosa wytwarza dwa różne siderofory: pyochelinę, która ma mniejsze powinowactwo chelatujące żelazo, i pyoverdynę, która ma wyższe powinowactwo chelatujące żelazo. W raporcie tym wykazano, że pyoverdine można bezpośrednio oznaczyć ilościowo z supernatantów bakteryjnych, podczas gdy pyochelin musi być wyekstrahowany z supernatantów przed określeniem ilościowym.

Podstawową metodą jakościowej analizy produkcji sideroforów jest test na płytkach agarowych z sulfonianianem chromu azurolu (CAS). W tym teście uwolnienie barwnika CAS z kompleksu Fe3+-Dye prowadzi do zmiany koloru z niebieskiego na pomarańczowy, co wskazuje na produkcję sideroforu. W celu ilościowego określenia całkowitej liczby sideroforów supernatanty bakteryjne zmieszano w równych proporcjach z barwnikiem CAS na płytce mikromiareczkowej, a następnie przeprowadzono analizę spektrofotometryczną przy długości fali 630 nm. Pioverdynę oznaczono bezpośrednio ilościowo z bakteryjnego supernatantu poprzez zmieszanie jej w równych proporcjach z 50 mM Tris-HCl, a następnie przeprowadzono analizę spektrofotometryczną. Szczyt przy długości fali 380 nm potwierdził obecność pioverdyny. Jeśli chodzi o Pyochelin, bezpośrednie określenie ilościowe z supernatantu bakteryjnego nie było możliwe, więc najpierw trzeba było go wyekstrahować. Późniejsza analiza spektrofotometryczna wykazała obecność pyocheliny, której szczyt przypadł na 313 nm.

Wprowadzenie

Organizmy potrzebują żelaza do wykonywania różnych funkcji życiowych, takich jak transport elektronów i replikacja DNA1. Wiadomo, że Pseudomonas aeruginosa, Gram-ujemny patogen oportunistyczny, posiada różne czynniki wirulencji, które powodują infekcję u gospodarza, wśród których jednym z mechanizmów jest tworzenie sideroforów2. W warunkach zubożenia żelaza P. aeruginosa uwalnia wyspecjalizowane cząsteczki zwane sideroforami, które wygaszają żelazo z otaczającego środowiska. Siderofory chelatują żelazo zewnątrzkomórkowo, a powstały kompleks żelazowo-sideroforowy jest aktywnie transportowany z powrotem do komórki3.

P. aeruginosa jest znany z produkcji dwóch sideroforów, pioverdyny i pyocheliny. Wiadomo, że pioverdyna ma wyższe powinowactwo chelatujące żelazo (1:1), podczas gdy pyochelina ma mniejsze powinowactwo chelatujące żelazo (2:1)4. Pyochelin jest również nazywany drugorzędnym sideroforem, ponieważ ma niższe powinowactwo chelatujące żelazo5. Produkcja i regulacja sideroforów są aktywnie kontrolowane przez systemy Quorum Sensing (QS) w P. aeruginosa6.

Oprócz hartowania żelaza, siderofory są również zaangażowane w regulację czynników wirulencji i odgrywają aktywną rolę w tworzeniu biofilmu7. Siderofory pełnią dodatkowe kluczowe role, w tym udział w sygnalizacji komórkowej, obronę przed stresem oksydacyjnym i ułatwianie interakcji między społecznościami drobnoustrojów8. Siderofory są zazwyczaj klasyfikowane na podstawie określonych grup funkcyjnych, przez które chelatują żelazo. Trzy podstawowe ligandy dwuzębne w tej klasyfikacji to katechol, hydroksymat i α-hydroksy3. Pioweredyny są znakami rozpoznawczymi fluorescencyjnych gatunków Pseudomonas, takich jak P. aeruginosa i P. fluorescens5. Składają się z mieszanego chromoforu fluorescencyjnego w kolorze zielonym sprzężonym z oligopeptydem zawierającym 6-12 aminokwasów. W ich syntezie bierze udział kilka nierybosomalnych syntetaz peptydowych (NRP)9. Cztery geny biorące udział w produkcji i regulacji pioverdyny to pvdL, pvdI, pvdJ i pvdD10. Pioverdyna jest również odpowiedzialna za infekcje i zjadliwość u ssaków11. Zauważono, że P. aeruginosa wytwarza pyochelinę w umiarkowanych warunkach ograniczających żelazo, podczas gdy pyoverdine jest wytwarzany w trudnych warunkach ograniczających żelazo12. Dwa operony biorące udział w produkcji pyochelin to pchDCBA i pchEFGHI13. Należy zauważyć, że w obecności pyocjaniny, pyochelina (katechola) indukuje uszkodzenia oksydacyjne i stany zapalne oraz generuje rodniki hydroksylowe, które są szkodliwe dla tkanek gospodarza11.

Test sulfonianu chromu Azurol (CAS) jest szeroko stosowany ze względu na jego kompleksowość, wysoką czułość i większą wygodę w porównaniu do testów mikrobiologicznych, które, choć czułe, mogą być zbyt szczegółowe14. Test CAS można przeprowadzić na powierzchniach agaru lub w roztworze. Opiera się na zmianie koloru, która następuje, gdy jon żelaza przechodzi z intensywnego niebieskiego kompleksu do pomarańczowego. Test kolorymetryczny CAS określa ilościowo ubytek żelaza w trójskładnikowym kompleksie Fe-CAS-środek powierzchniowo czynny. Ten szczególny kompleks, składający się z metalu, barwnika organicznego i środka powierzchniowo czynnego, ma niebieski kolor i wykazuje pik absorpcji przy 630 nm.

Ten raport przedstawia metodę jakościowego wykrywania produkcji sideroforów, gdzie można wykryć produkcję sideroforów na płytce agarowej. Podano również metodę ilościowego szacowania całkowitej produkcji sideroforu na płytce mikromiareczkowej oraz wykrywania i analizy ilościowej dwóch sideroforów, pioverdyny i pyocheliny, pochodzących z P. aeruginosa.

Protokół

Wszystkie izolaty bakteryjne P. aeruginosa zostały uzyskane z medycznych laboratoriów mikrobiologicznych z Vadodara i Jaipur w Indiach. Wszystkie wybrane izolaty kliniczne były traktowane w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSL2) i podczas eksperymentów zachowano najwyższą ostrożność podczas obchodzenia się z izolatami bakteryjnymi. Szczegóły handlowe dotyczące wszystkich odczynników/roztworów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie barwnika sulfonianu chromu azurolu (CAS) i podłoża agarowego

  1. Przygotuj barwnik CAS (100 ml) o następującym składzie:
    1. Rozpuścić 60 mg CAS w 50 ml wody destylowanej (roztwór 1).
    2. Rozpuścić 2,7 mg FeCl3·6H2O w 10 ml 10 mM HCl (roztwór 2).
    3. Rozpuścić 73 mg bromku Cetrimonium (HDTMA) w 40 ml wody destylowanej (roztwór 3).
    4. Ostrożnie wymieszaj roztwór 1, roztwór 2 i roztwór 3. Przechowuj go w szklanej butelce.
  2. Przygotuj agar CAS, wykonując poniższe czynności:
    1. Dodać 100 ml roztworu soli MM9 do 750 ml wody destylowanej.
    2. Rozpuścić 32,24 g wolnego kwasu piperazyno-N,N'-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES).
    3. Dodaj 15 g agaru agarowego. Autoklaw i pozwól mu ostygnąć.
    4. Do mieszaniny dodać 30 ml jałowego roztworu Casaminokwasu i 10 ml sterylnego 20% roztworu glukozy.
    5. Dodaj 100 ml barwnika CAS, wymieszaj i wlej w aseptycznych warunkach.
      UWAGA: Przygotowanie pożywki MM9, roztworu Casaminokwasu i 8-hydroksychinoliny znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Bufor PIPES jest wrażliwy na pH. Nie rozpuści się, dopóki nie zostanie osiągnięte pH 5,6. Upewnij się, że pH jest stale monitorowane, ponieważ gdy RURY zaczną rozpuszczać się w wodzie, jeszcze bardziej obniży pH. Ekstrakt z Casaminokwasu o tej samej objętości 3% 8-hydroksychinoliny rozpuszczonej w chloroformie. Pozostawić niemieszający się roztwór w temperaturze 4 °C na około 20 minut i ostrożnie zebrać górną fazę roztworu, nie naruszając dolnej fazy.

2. Analiza jakościowa produkcji sideroforów

  1. Ustaw OD600 nm na 0,2 dla 24 h hodowanych kultur P. aeruginosa.
  2. Za pomocą sterylnej drucianej pętli rozprowadź kulturę bakteryjną na płytce agarowej CAS.
  3. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 h.
    UWAGA: Do rozcieńczenia kultury bakteryjnej można użyć pożywki z peptonów lub 0,8% soli fizjologicznej. Jeśli po 24 godzinach nie obserwuje się wzrostu bakterii, należy inkubować płytki CAS przez 48 do 72 godzin.

3. Ilościowe oszacowanie całkowitej liczby sideroforów

  1. Ponownie zaszczepić 24-godzinne kultury P. aeruginosa w pożywce wodnej peptonowej po dostosowaniu OD600 nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  2. Po 48 godzinach odwirować kulturę bakteryjną przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po odwirowaniu dodać 100 μl bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i dodać do niej 100 μl barwnika CAS.
  4. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
  5. Po inkubacji wykonać odczyty spektrofotometryczne przy długości fali 630 nm.
  6. Obliczyć wyniki uzyskane w celu ilościowego określenia całkowitej liczby sideroforów jako procentowej jednostki sideroforu (PSU).
    UWAGA: Zasilacz można obliczyć jako: [(Ar - As)/Ar] x 100
    gdzie, Ar = absorbancja wzorca przy 630 nm, As = absorbancja bezkomórkowego supernatantu próbki. Dla porównania, barwnik CAS powinien być dodany do nieinokulowanych pożywek wodnych peptonowych. Napełnij wszystkie szklane naczynia, takie jak probówki, kolby itp., 6 M HCl przez 2 godziny i spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną, aby usunąć z nich wszelkie ślady żelaza.

4. Ilościowe oszacowanie pioverdyny

  1. Ponownie zaszczepić wyhodowane w ciągu 24 godzin kultury P. aeruginosa w pożywce wodnej peptonowej po dostosowaniu OD600 nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
  2. Po 48 godzinach zmierz OD600 nm wzrostu bakterii, zanim przejdziesz dalej.
  3. Odwirować kulturę bakteryjną przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Po odwirowaniu dodać 100 μl bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i dodać do niej 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0).
  5. Wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy średnicy zewnętrznej405 nm.

5. Ekstrakcja pyochelin i spektrofotometria

  1. Ponownie zaszczepić wyhodowane w ciągu 24 godzin kultury P. aeruginosa w pożywce King's B (plik uzupełniający 1) po dostosowaniu OD600 nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.
  2. Po 24 godzinach pobrać 100 ml kultury i odwirować przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  3. Po odwirowaniu dodać 5 ml 1 M kwasu cytrynowego do supernatantu. Ekstrahować dwukrotnie 50 ml octanu etylu.
  4. Przefiltrować fazę organiczną z siarczanem magnezu przez filtr strzykawkowy. Przefiltrowaną fazę organiczną przechowywać w temperaturze -20 °C.
  5. Wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy 320 nm.
    UWAGA: Ponieważ pyochelin jest bardzo niestabilnym związkiem w temperaturze pokojowej, proces ekstrakcji należy przeprowadzić na lodzie. Do oddzielenia filtra należy użyć sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml. Umieść bawełnę na końcówce strzykawki i dodaj na nią 1 g siarczanu magnezu. Zamocować sterylny filtr strzykawkowy na końcówce strzykawki i zebrać filtrat do sterylnej probówki.

Wyniki

Przed ilościowym oznaczaniem sideroforów z izolatów klinicznych przeprowadzono przesiewową analizę jakościową w celu potwierdzenia ich produkcji. Jakościową detekcję sideroforów z izolatów klinicznych obserwowano poprzez posiew bakterii metodą kreślenia na płytkach z agarem CAS. Do badania wybrano trzy izolaty kliniczne, mianowicie MR1, TL7, J3, oraz szczep referencyjny PAO1. Wszystkie trzy izolaty kliniczne oraz PAO1 wykazały pozytywne wyniki w kierunku produkcji sideroforów, gdzie obecność wyraźnego pomarańczowego halo wokół wzrostu bakterii na niebieskiej powierzchni agaru wskazywała na ich wydzielanie (Rycina 1). Powstanie halo na agarze CAS (Rycina 1) pozwoliło na wstępną ocenę produkcji sideroforów przez izolaty kliniczne. W związku z tym przeprowadzono ilościowe oznaczanie produkcji sideroforów z wykorzystaniem odczynnika CAS i pożywek płynnych.

Ilościowe oznaczenie całkowitej zawartości sideroforów przeprowadzono bezpośrednio w supernatantcie pozbawionym komórek. Po inkubacji zaobserwowano zmianę barwy, w której kolor żółty wskazywał na usunięcie barwnika CAS z kompleksu Fe. W tym przypadku jako kontrolę wykorzystano barwnik CAS z niezaszczepioną pożywką wzrostową, co przyjęto do obliczeń poziomu sideroforów. Nie stwierdzono istotnych różnic w całkowitej produkcji sideroforów w izolatach MR1 i TL7, natomiast w izolacie J3 odnotowano istotnie wyższą całkowitą produkcję sideroforów w porównaniu do szczepu PAO1 (Rysunek 2).

Następnie przeprowadzono oznaczanie ilości pyowerdyny bezpośrednio z supernatantów wolnych od komórek. Pyowerdyny są uwalniane do środowiska komórkowego, dlatego do ich oznaczania wykorzystano supernatant wolny od komórek. Wykonano również skanowanie w zakresie UV za pomocą spektrofotometru, w którym pik przy 380 nm potwierdził obecność pyowerdyny (Rycina 3A). Odczyty spektrofotometryczne wykonano przy 405 nm, a wyniki zinterpretowano jako OD405/OD600 nm. Wszystkie izolaty wykazały produkcję pyowerdyny, przy czym izolaty MR1 i J3 wykazały znacznie niższą ilość pyowerdyny w porównaniu do PAO1, natomiast w przypadku TL7 nie zaobserwowano istotnych różnic (Rycina 3B).

Pioczeliny nie można bezpośrednio ilościowo określić w nadsączu wolnym od komórek. Ekstrakcja pioczeliny z 1 mL nadsączu wolnego od komórek nie była możliwa, dlatego wyekstrahowano ją ze 100 mL nadsączu wolnego od komórek. Próbkę zakwaszono 1 M kwasem cytrynowym. Ze względu na wysoką niestabilność pioczeliny, proces ekstrakcji przeprowadzano w lodzie. Detekcję pioczeliny wykonano poprzez skanowanie w zakresie UV od 300 do 600 nm, gdzie pik przy OD320 nm potwierdził obecność pioczeliny (Rysunek 4A). Ilościowe oznaczenie pioczeliny przeprowadzono za pomocą pomiarów spektrofotometrycznych przy OD320 nm. Obliczenia wykonano, dzieląc OD320/OD600. Izolaty MR1, TL7 i J3 wykazały znacznie wyższą produkcję pioczeliny w porównaniu z izolatem referencyjnym PAO1 (Rysunek 4B).

Przeprowadzono porównawczą analizę produkcji sideroforów w różnych pożywkach bakteryjnych, aby sprawdzić całkowitą ilość wytworzonych sideroforów w zależności od zastosowanego medium. Wybrano cztery różne pożywki: bulion Luria, pożywkę King's B oraz wodę peptonową, które poddano ekstrakcji 3% 8-hydroksychinoliną, a jako grupę kontrolną wybrano nieekstrahowany bulion Luria. Nie stwierdzono istotnych różnic w produkcji sideroforów pomiędzy ekstrahowanym bulionem Luria, pożywką King's B a wodą peptonową, natomiast istotna różnica została odnotowana w przypadku produkcji sideroforów w nieekstrahowanym bulionie Luria.

Wzrost bakterii na płytkach z agarem; wyniki eksperymentu mikrobiologicznego dla szczepów PAO1, MR1, TL7, J3.
Rycina 1: Produkcja sideroforów na agarze CAS. Wzrost P. aeruginosa na płytkach z agarem CAS; kultury hodowane przez 24 h naniesiono punktowo na płytki z agarem CAS i inkubowano w 30 °C przez 24 h. Obecność sideroforów jest sygnalizowana przez pomarańczową otoczkę wokół kolonii bakterii (PAO1, MR1, TL7 i J3). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wykres słupkowy porównujący produkcję sideroforów w różnych izolatach; zaznaczono istotność statystyczną.
Rysunek 2: Całkowita produkcja sideroforów. Oceniono całkowitą produkcję sideroforów dla szczepu PAO1 oraz trzech izolatów klinicznych (MR1, TL7 i J3). Do płytki mikrotitracyjnej z 96 dołkami dodano 100 µL nadsączu bezkomórkowego (z kultur PAO1, MR1, TL7 i J3 hodowanych przez 24 h w bulionie peptone water), a następnie dodano do niego 100 µL barwnika CAS. W celu oceny istotności statystycznej przeprowadzono jednoczynnikową analizę wariancji (one-way ANOVA). Słupki błędów reprezentują ± odchylenie standardowe (SD) z trzech powtórzeń biologicznych. * odpowiada p < 0,05; ns odpowiada p > 0,05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Widma absorpcyjne pyowerdyny i wykres słupkowy; absorpcja UV-Vis, ilościowe oznaczanie pyowerdyny, analiza.
Rysunek 3: Produkcja pyowerdyny. Produkcja pyowerdyny przez szczep PAO1 P. aeruginosa oraz izolaty kliniczne (MR1, TL7 i J3) oceniona po 24 h wzrostu w pożywce z wodą peptonową. Kultury bakteryjne odwirowano, a 100 µL nadianadkładu wolnego od komórek naniesiono na płytkę mikrotitracyjną z 96 dołkami. Następnie dodano do nich 100 µL 50 mM Tris-HCl (pH 8.0). Detekcję pyowerdyny przeprowadzono za pomocą spektrofotometrii UV w zakresie od 350 nm do 600 nm. Analiza spektrometryczna produkcji pyowerdyny przy 380 nm (A). Ilościowe oznaczanie produkcji pyowerdyny (B). Słupki błędu wskazują błąd standardowy średniej z trzech powtórzeń eksperymentu. Słupki błędu reprezentują ± SD między trzema powtórzeniami biologicznymi. **** odpowiada p < 0.0001, ** odpowiada p < 0.01, a ns odpowiada p > 0.05 na podstawie testu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza pyocheliny; widma UV-Vis (A) i wykres słupkowy ilościowy (B) dla izolatów PAO1, MR1, TL7, J3.
Rysunek 4: Produkcja pyocheliny. Produkcja pyocheliny przez szczep PAO1 (użyty jako referencyjny) oraz izolaty kliniczne (MR1, TL7 i J3) z zastosowaniem ekstrakcji octanem etylu i siarczanem magnezu. Analiza spektrofotometryczna w zakresie od 230 nm do 400 nm (A). Ilościowe oznaczenie pyocheliny (B). Dla każdego izolatu przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty. Słupki błędów reprezentują ± SD pomiędzy trzema powtórzeniami biologicznymi. *** odpowiada p < 0.001 na podstawie jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina uzupełniająca 1: Porównanie produkcji sideroforów w różnych pożywkach bakteryjnych. Całkowita produkcja sideroforów w czterech różnych pożywkach, spośród których wybrano pożywkę King's B, wodę peptonową oraz bulion Luria, które zostały poddane ekstrakcji 3% 8-hydroksychinoliną w celu usunięcia śladowych ilości żelaza, oraz bulion Luria (nieekstrahowany). Ekstrakcję 3% 8-hydroksychinoliną przeprowadzono poprzez dodanie do pożywek równoległej objętości 3% 8-hydroksychinoliny. Słupki błędu reprezentują ± SD dla trzech powtórzeń biologicznych. **odpowiada p < 0,001, a ns odpowiada p > 0,5 na podstawie testu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA.Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Plik uzupełniający 1: Składy pożywek użytych w niniejszym badaniu.Kliknij tutaj, aby wyświetlić plik.

Dyskusja

Protokół ten umożliwia naukowcom ilościowe określenie całkowitej liczby sideroforów i dwóch różnych sideroforów P. aeruginosa, a mianowicie pyoverdiny i pyocheliny, z supernatantu bezkomórkowego bakterii. W teście na płytkach agarowych CAS barwnik CAS i jony Fe3+ tworzą kompleks. Kiedy bakterie wytwarzają siderofory, wygaszają jony Fe3 + z kompleksu CAS-Fe3 +, co prowadzi do zmiany koloru wokół wzrostu bakterii. Ta zmiana powoduje powstanie wyraźnej pomarańczowej aureoli wokół wzrostu bakterii14,15. Chociaż bakterie mogą być bezpośrednio smugowane na płytkach agarowych CAS, może to mieć wpływ na ogólne wyniki. Smugowanie dużej liczby komórek bakteryjnych może stworzyć szeroką pomarańczową aureolę wokół wzrostu bakterii, podczas gdy użycie mniejszej liczby komórek bakteryjnych może skutkować wąską, czystą strefą. Aby temu zaradzić, przebadaliśmy jednolitą liczbę komórek bakteryjnych, dostosowując OD600. Wybredne bakterie mogą wykazać wyniki w ciągu 24 godzin, podczas gdy wolno rosnące bakterie mogą potrzebować więcej niż 72 godzin, aby wykazać produkcję sideroforu.

Do ilościowego oznaczania całkowitej liczby sideroforów początkowo zastosowano klasyczną spektroskopię, która wymaga znacznej objętości supernatantu do wykrywania sideroforów, co czyni ją niepraktyczną. Kwantyfikacja całkowitych sideroforów jest obecnie przeprowadzana przy użyciu 96-dołkowej płytki ze zmodyfikowanym testem CAS. Takie podejście zaowocowało zmniejszeniem zużycia odczynników, supernatantu bakteryjnego, czasu i zwiększoną dokładnością w porównaniu z tradycyjnymi metodami spektroskopowymi16. Inne badania wykazały również stosowanie płytek do mikromiareczkowania jako metody oszczędzającej czas i bardziej efektywnej17. Kwantyfikacja całkowitej liczby sideroforów za pomocą płytki do mikromiareczkowania okazała się skutecznym podejściem. W tym badaniu do badania wybrano 48-godzinne kultury bakterii hodowane w pożywkach wolnych od żelaza. Przeprowadzono również badanie porównawcze w celu oceny produkcji sideroforów w różnych pożywkach wzrostowych, takich jak bulion Luria, bulion Luria (ekstrahowany 3% 8-hydroksychinoliną), pożywka King's B (ekstrahowana 3% 8-hydroksychinoliną) i pożywka peptonowa (ekstrahowana 3% 8-hydroksychinoliną). Zaobserwowano, że pożywki wodne peptonowe wykazywały największą ilość produkcji sideroforu, a co za tym idzie, wybrano je do dalszych eksperymentów. Wykres przedstawiający produkcję sideroforów w różnych pożywkach wzrostowych znajduje się na rysunku uzupełniającym 1.

Pioverdyna może być wykryta i oznaczona ilościowo za pomocą odczytów spektrofluorymetrycznych, ale wiadomo, że tylko pioverdina wykazuje fluorescencję. Pioverdyna w kompleksie z jonami Fe3+ nie wykazuje fluorescencji18,19. Do wykrywania i oznaczania ilościowego pioverdyny wybrano do badań 48-godzinne kultury bakterii. Wiadomo, że P. aeruginosa wytwarza pyochelin w początkowych warunkach głodu żelaza i przechodzi na produkcję pioverdyny po ekspozycji na ciężkie warunki stresu żelazowego. Wykazano, że pioverdyna może chelatować inne kationy metaliczne, takie jak aluminium, gal, mangan i chrom, ale tylko żelazo jest z powodzeniem transportowane do błony komórkowej19.

Podobnie jak w przypadku syderoforów całkowitych i pioverdyny, pyocheliny nie można bezpośrednio oznaczyć ilościowo z bezkomórkowego supernatantu i należy ją ekstrahować przy użyciu dichlorometanu20. Dichlorometan nie miesza się z bezkomórkowym supernatantem i tworzy oddzielną warstwę na dnie. W tym badaniu przetestowano różne pożywki, w tym bulion Luria, wodę peptonową i pożywkę z kwasami Casamino, ale znaczną ilość pyocheliny uzyskano z pożywki King's B. Podczas gdy Hoegy i in. używali pożywek CAA w swoim protokole, zmodyfikowaliśmy je za pomocą pożywki King's B, ponieważ pożywki CAA nie wspierały wzrostu bakterii21. Metodę zmodyfikowano następnie poprzez ekstrakcję pożywki za pomocą 8-hydroksychinoliny w celu usunięcia wszelkich pozostałości żelaza z pożywki, tworząc pożywkę z niedoborem żelaza. Ponadto stwierdzono, że czas inkubacji znacząco wpływa na produkcję ropocheliny. Dumas i wsp. wykazali, że P. aeruginosa przechodzi z produkcji pyocheliny na pyoverdine w warunkach ciężkiego ograniczenia żelaza12. W tym badaniu ekstrakcję i detekcję pyocheliny przeprowadzono z 24-godzinnych kultur bakteryjnych, ponieważ pyochelina nie została wykryta w 48-godzinnych hodowlach. Objętość supernatantu wpływa również na wykrywanie ropocheliny, dlatego do ekstrakcji użyto 100 ml bezkomórkowego supernatantu. Co więcej, produkcja pyocheliny była znacznie wyższa w izolatach MR1, TL7 i J3, prawdopodobnie z powodu szczepów bakteryjnych, które nie są w stanie wytwarzać pyoverdyny, mimo że mają silne chelatory żelaza22.

Ji i in. wprowadzili nowatorskie i czułe podejście do kwantyfikacji pyochelin, weryfikując je za pomocą LC/MS/MS. Jednak metoda ta miała zastosowanie tylko do izolatów P. aeruginosa z plwociny pacjentów z mukowiscydozą. LC/MS/MS, będąc kosztowną konfiguracją, może nie być przystępna cenowo dla większości laboratoriów23. Visaggio i in. opracowali bioluminescencyjny bioczujnik oparty na całych komórkach, który umożliwia szybką, czułą i jednoetapową kwantyfikację pyocheliny. Niemniej jednak metoda ta nie może zapewnić ilościowego określenia całkowitej zawartości sideroforów i pioverdyny24.

Systemy wychwytu żelaza przez siderofor mogą mieć zastosowanie przeciwdrobnoustrojowe w dostarczaniu leków dla bakterii wielolekoopornych, ponieważ odgrywają kluczową rolę w przeżywalności i zjadliwości bakterii. Takie podejście może zaoferować nowy sposób zwalczania bakterii wielolekoopornych25. Leki, które nie mogą przeniknąć przez błonę komórkową bakterii, mogą być połączone z sideroforem, a powstały kompleks Fe-siderofor może być transportowany wewnątrz błony bakteryjnej26.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie z DBT - Biotechnology Teaching Program, DBT - BUILDER Program i FIST. MR dziękuje za stypendium otrzymane od SHODH. HP dziękuje za stypendium otrzymane od CSIR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Agar Agar, typ IHIMEDIAGRM666
8-hydroksychinolinaLoba Chemie4151
Casamino AcidSRL Chemicals68806
Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)HIMEDIARM4867-100G
ChloroformMerck1070242521
Chrome sulfonian azuroluHIMEDIARM336-10G
Kwas cytrynowyMerck100241
Monohydrat dekstrozyMerck108342
DichlorometanMerck107020
Sześciowodny chlorek żelazaHIMEDIAGRM6353
Szklane kolbyBorosil5100021
Szklane probówkiBorosil9820U05
Kwas solnySDFCL20125
King's medium B baseHIMEDIAM1544-500G
M9 Minimalne sole średnieHIMEDIAG013-500G
Siarczan magnezu Qualigens10034
MultiskanGOThermo Scientific51119200
Pepton Typ I, BakteriologicznyHIMEDIARM667-500G
RURY kwas wolnyMP Biomedicals190257
Diwodorofosforan potasuMerck1048731000
Pepton ProteoseHIMEDIARM005-500G
Spektrofotometr UV-Vis Shimadzu2072310058
Sigma LaborzentrifugeSigma-Aldrich3-18K
Chlorek soduQualigens15915
Spektrofotometr UV

Bibliografia

  1. Wang, J., Pontopolous, K. Regulation of iron cellulatar metabolism. Biochemical Journal. 434 (3), 365-381 (2011).
  2. Schalk, I., Perraud, Q. Pseudomonas aeruginosa and its multiple strategies to access iron. Environmental Microbiology. 25 (4), 811-831 (2022).
  3. Ghssein, G., Ezzeddine, Z. A review of Pseudomonas aeruginosa metallophores: Pyoverdine, pyochelin and pseudopaline. Biology. 11 (12), 1711(2022).
  4. Sanchez-Jimenez, A., Marcos-Torres, F. J., Llamas, M. A. Mechanisms of iron homeostasis in pseudomonas aeruginosa and emerging therapeutics directed to disrupt this vital process. Microbial Biotechnology. 16 (7), 1475-1491 (2023).
  5. Dingemans, P., Cornelis, J. Pseudomonas aeruginosa adapts its iron uptake strategies in function of the type of infections. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4 (11), (2013).
  6. Lin, J., Cheng, J., Shen, X. The pseudomonas quinolone signal (pqs): Not just for quorum sensing anymore. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 8 (7), 1-9 (2018).
  7. Sass, G., et al. Intermicrobial interaction: Aspergillus fumigatus siderophores protect against competition by pseudomonas aeruginosa. PLoS ONE. 14 (5), 1-19 (2019).
  8. Dao, K. -H. T., Hamer, K. E., Clark, C. L., Harshman, L. G. Pyoverdine production by pseudomonas aeruginosa exposed to metals or an oxidative stress agent. Ecological Applications. 9 (2), 441-448 (1999).
  9. Visca, P., Imperi, F., Lamont, I. L. Pyoverdine siderophores: From biogenesis to biosignificance. Trends in Microbiology. 15 (1), 22-30 (2007).
  10. Ackerley, D. F., Caradoc-Davies, T. T., Lamont, I. L. Substrate specificity of the nonribosomal peptide synthetase pvdd from pseudomonas aeruginosa. Journal of Bacteriology. 185 (9), 2848-2855 (2003).
  11. Geum-Jae-Jeong,, et al. Pseudomonas aeruginosa virulence attenuation by inhibiting siderophore functions. Applied Microbiology and Biotechnology. 107 (4), 1019-1038 (2023).
  12. Dumas, Z., Ross-Gillespie, A., Kummerli, R. Switching between apparently redundant iron-uptake mechanisms benefits bacteria in changeable environments. Biological Sciences. 280 (1764), 20131055(2013).
  13. Gaille, C., Reimmann, C., Haas, D. Isochorismate synthase (pcha), the first and rate-limiting enzyme in salicylate biosynthesis of pseudomonas aeruginosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (19), 16893-16898 (2003).
  14. Schwyn, B., Neilands, J. B. Universal chemical assay for the detection and determination of siderophores. Analytical Biochemistry. 160 (1), 47-56 (1987).
  15. Louden, B. C., Haarmann, D., Lynne, A. M. Use of blue agar cas assay for siderophore detection. Journal of Microbiology & Biology Education. 12 (1), 51-53 (2011).
  16. Arora, N. K., Verma, M. Modified microplate method for rapid and efficient estimation of siderophore produced by bacteria. 3 Biotech. 7 (381), 1-9 (2017).
  17. Frac, M., Gryta, A., Oszust, K., Kotowicz, N. Fast and accurate microplate method (biolog mt2) for detection of fusarium fungicides resistance/sensitivity. Frontiers in Microbiology. 7 (4), 1-16 (2016).
  18. Cezard, C., Farvacques, N., Sonnet, P. Chemistry and biology of pyoverdines, pseudomonas primary siderophores. Current Medicinal Chemistry. 22 (2), 165-186 (2015).
  19. Braud, A., Hoegy, F., Jezequel, K., Lebeau, T., Schalk, I. J. New insights into the metal specificity of the pseudomonas aeruginosa pyoverdine-iron uptake pathway. Environmental Microbiology. 11 (5), 1079-1091 (2009).
  20. Brandel, J., et al. a siderophore of pseudomonas aeruginosa: Physicochemical characterization of the iron(iii), copper (ii) and zinc (ii) complexes. Dalton Transactions. 41 (9), 2820-2834 (2012).
  21. Hoegy, F., Mislin, G. L. A., Schalk, I. J. Pseudomonas methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1149, (2014).
  22. Cunrath, O., et al. The pathogen pseudomonas aeruginosa optimizes the production of the siderophore pyochelin upon environmental challenges. Metallomics. 12 (12), 2108-2120 (2020).
  23. Ji, A. J., et al. A novel and sensitive LC/MS/MS method for quantification of pyochelin in human sputum samples from cystic fibrosis patients. Biomarkers & Applications. 4 (1), 135(2019).
  24. Visaggio, D., et al. A highly sensitive luminescent biosensor for the microvolumetric detection of the pseudomonas aeruginosa siderophore pyochelin. ACS Sensors. 6 (9), 3273-3283 (2021).
  25. Miethke, M., Marahiel, M. A. Siderophore-bases iron acquisition and pathogen control. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 71 (3), 443-451 (2007).
  26. Il, J. M. R., Lin, Y. -M., Lu, Y., Miller, M. J. Studies and syntheses of siderophores, microbial iron chelators, and analogs as potential drug delivery agents. Current Medicinal Chemistry. 7 (2), 159-197 (2000).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilo ci pyoverdynyekstrakcja pyochelinytest na pod o u CAS agaranaliza spektrofotometrycznasupernatant wolny od kom rekczynniki wirulencjiwychwytywanie elazap ytka mikrotitracyjna
Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.