Analiza jakościowa i ilościowa produkcji sideroforów z Pseudomonas aeruginosa

Podsumowanie

Ten protokół dostarcza zarówno jakościowych, jak i ilościowych analiz całkowitej liczby sideroforów, pioverdyny i pyocheliny z Pseudomonas aeruginosa.

Streszczenie

Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) jest znana z produkcji różnorodnych czynników wirulencji, które wywołują infekcje u gospodarza. Jednym z takich mechanizmów jest wymiatanie żelaza poprzez produkcję sideroforów. P. aeruginosa wytwarza dwa różne siderofory: pyochelinę, która ma mniejsze powinowactwo chelatujące żelazo, i pyoverdynę, która ma wyższe powinowactwo chelatujące żelazo. W raporcie tym wykazano, że pyoverdine można bezpośrednio oznaczyć ilościowo z supernatantów bakteryjnych, podczas gdy pyochelin musi być wyekstrahowany z supernatantów przed określeniem ilościowym.

Podstawową metodą jakościowej analizy produkcji sideroforów jest test na płytkach agarowych z sulfonianianem chromu azurolu (CAS). W tym teście uwolnienie barwnika CAS z kompleksu Fe³⁺-Dye prowadzi do zmiany koloru z niebieskiego na pomarańczowy, co wskazuje na produkcję sideroforu. W celu ilościowego określenia całkowitej liczby sideroforów supernatanty bakteryjne zmieszano w równych proporcjach z barwnikiem CAS na płytce mikromiareczkowej, a następnie przeprowadzono analizę spektrofotometryczną przy długości fali 630 nm. Pioverdynę oznaczono bezpośrednio ilościowo z bakteryjnego supernatantu poprzez zmieszanie jej w równych proporcjach z 50 mM Tris-HCl, a następnie przeprowadzono analizę spektrofotometryczną. Szczyt przy długości fali 380 nm potwierdził obecność pioverdyny. Jeśli chodzi o Pyochelin, bezpośrednie określenie ilościowe z supernatantu bakteryjnego nie było możliwe, więc najpierw trzeba było go wyekstrahować. Późniejsza analiza spektrofotometryczna wykazała obecność pyocheliny, której szczyt przypadł na 313 nm.

Wprowadzenie

Organizmy potrzebują żelaza do wykonywania różnych funkcji życiowych, takich jak transport elektronów i replikacja DNA¹. Wiadomo, że Pseudomonas aeruginosa, Gram-ujemny patogen oportunistyczny, posiada różne czynniki wirulencji, które powodują infekcję u gospodarza, wśród których jednym z mechanizmów jest tworzenie sideroforów². W warunkach zubożenia żelaza P. aeruginosa uwalnia wyspecjalizowane cząsteczki zwane sideroforami, które wygaszają żelazo z otaczającego środowiska. Siderofory chelatują żelazo zewnątrzkomórkowo, a powstały kompleks żelazowo-sideroforowy jest aktywnie transportowany z powrotem do komórki³.

P. aeruginosa jest znany z produkcji dwóch sideroforów, pioverdyny i pyocheliny. Wiadomo, że pioverdyna ma wyższe powinowactwo chelatujące żelazo (1:1), podczas gdy pyochelina ma mniejsze powinowactwo chelatujące żelazo (2:1)⁴. Pyochelin jest również nazywany drugorzędnym sideroforem, ponieważ ma niższe powinowactwo chelatujące żelazo⁵. Produkcja i regulacja sideroforów są aktywnie kontrolowane przez systemy Quorum Sensing (QS) w P. aeruginosa⁶.

Oprócz hartowania żelaza, siderofory są również zaangażowane w regulację czynników wirulencji i odgrywają aktywną rolę w tworzeniu biofilmu⁷. Siderofory pełnią dodatkowe kluczowe role, w tym udział w sygnalizacji komórkowej, obronę przed stresem oksydacyjnym i ułatwianie interakcji między społecznościami drobnoustrojów⁸. Siderofory są zazwyczaj klasyfikowane na podstawie określonych grup funkcyjnych, przez które chelatują żelazo. Trzy podstawowe ligandy dwuzębne w tej klasyfikacji to katechol, hydroksymat i α-hydroksy3. Pioweredyny są znakami rozpoznawczymi fluorescencyjnych gatunków Pseudomonas, takich jak P. aeruginosa i P. fluorescens⁵. Składają się z mieszanego chromoforu fluorescencyjnego w kolorze zielonym sprzężonym z oligopeptydem zawierającym 6-12 aminokwasów. W ich syntezie bierze udział kilka nierybosomalnych syntetaz peptydowych (NRP)⁹. Cztery geny biorące udział w produkcji i regulacji pioverdyny to pvdL, pvdI, pvdJ i pvdD¹⁰. Pioverdyna jest również odpowiedzialna za infekcje i zjadliwość u ssaków¹¹. Zauważono, że P. aeruginosa wytwarza pyochelinę w umiarkowanych warunkach ograniczających żelazo, podczas gdy pyoverdine jest wytwarzany w trudnych warunkach ograniczających żelazo¹². Dwa operony biorące udział w produkcji pyochelin to pchDCBA i pchEFGHI¹³. Należy zauważyć, że w obecności pyocjaniny, pyochelina (katechola) indukuje uszkodzenia oksydacyjne i stany zapalne oraz generuje rodniki hydroksylowe, które są szkodliwe dla tkanek gospodarza¹¹.

Test sulfonianu chromu Azurol (CAS) jest szeroko stosowany ze względu na jego kompleksowość, wysoką czułość i większą wygodę w porównaniu do testów mikrobiologicznych, które, choć czułe, mogą być zbyt szczegółowe¹⁴. Test CAS można przeprowadzić na powierzchniach agaru lub w roztworze. Opiera się na zmianie koloru, która następuje, gdy jon żelaza przechodzi z intensywnego niebieskiego kompleksu do pomarańczowego. Test kolorymetryczny CAS określa ilościowo ubytek żelaza w trójskładnikowym kompleksie Fe-CAS-środek powierzchniowo czynny. Ten szczególny kompleks, składający się z metalu, barwnika organicznego i środka powierzchniowo czynnego, ma niebieski kolor i wykazuje pik absorpcji przy 630 nm.

Ten raport przedstawia metodę jakościowego wykrywania produkcji sideroforów, gdzie można wykryć produkcję sideroforów na płytce agarowej. Podano również metodę ilościowego szacowania całkowitej produkcji sideroforu na płytce mikromiareczkowej oraz wykrywania i analizy ilościowej dwóch sideroforów, pioverdyny i pyocheliny, pochodzących z P. aeruginosa.

Protokół

Wszystkie izolaty bakteryjne P. aeruginosa zostały uzyskane z medycznych laboratoriów mikrobiologicznych z Vadodara i Jaipur w Indiach. Wszystkie wybrane izolaty kliniczne były traktowane w Gabinecie Bezpieczeństwa Biologicznego (BSL2) i podczas eksperymentów zachowano najwyższą ostrożność podczas obchodzenia się z izolatami bakteryjnymi. Szczegóły handlowe dotyczące wszystkich odczynników/roztworów znajdują się w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie barwnika sulfonianu chromu azurolu (CAS) i podłoża agarowego

1. Przygotuj barwnik CAS (100 ml) o następującym składzie:
   1. Rozpuścić 60 mg CAS w 50 ml wody destylowanej (roztwór 1).
   2. Rozpuścić 2,7 mg FeCl₃·6H₂O w 10 ml 10 mM HCl (roztwór 2).
   3. Rozpuścić 73 mg bromku Cetrimonium (HDTMA) w 40 ml wody destylowanej (roztwór 3).
   4. Ostrożnie wymieszaj roztwór 1, roztwór 2 i roztwór 3. Przechowuj go w szklanej butelce.
2. Przygotuj agar CAS, wykonując poniższe czynności:
   1. Dodać 100 ml roztworu soli MM9 do 750 ml wody destylowanej.
   2. Rozpuścić 32,24 g wolnego kwasu piperazyno-N,N'-bis(kwas 2-etanosulfonowy) (PIPES).
   3. Dodaj 15 g agaru agarowego. Autoklaw i pozwól mu ostygnąć.
   4. Do mieszaniny dodać 30 ml jałowego roztworu Casaminokwasu i 10 ml sterylnego 20% roztworu glukozy.
   5. Dodaj 100 ml barwnika CAS, wymieszaj i wlej w aseptycznych warunkach.
      UWAGA: Przygotowanie pożywki MM9, roztworu Casaminokwasu i 8-hydroksychinoliny znajduje się w pliku uzupełniającym 1. Bufor PIPES jest wrażliwy na pH. Nie rozpuści się, dopóki nie zostanie osiągnięte pH 5,6. Upewnij się, że pH jest stale monitorowane, ponieważ gdy RURY zaczną rozpuszczać się w wodzie, jeszcze bardziej obniży pH. Ekstrakt z Casaminokwasu o tej samej objętości 3% 8-hydroksychinoliny rozpuszczonej w chloroformie. Pozostawić niemieszający się roztwór w temperaturze 4 °C na około 20 minut i ostrożnie zebrać górną fazę roztworu, nie naruszając dolnej fazy.

2. Analiza jakościowa produkcji sideroforów

1. Ustaw OD₆₀₀ nm na 0,2 dla 24 h hodowanych kultur P. aeruginosa.
2. Za pomocą sterylnej drucianej pętli rozprowadź kulturę bakteryjną na płytce agarowej CAS.
3. Inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 h.
   UWAGA: Do rozcieńczenia kultury bakteryjnej można użyć pożywki z peptonów lub 0,8% soli fizjologicznej. Jeśli po 24 godzinach nie obserwuje się wzrostu bakterii, należy inkubować płytki CAS przez 48 do 72 godzin.

3. Ilościowe oszacowanie całkowitej liczby sideroforów

1. Ponownie zaszczepić 24-godzinne kultury P. aeruginosa w pożywce wodnej peptonowej po dostosowaniu OD₆₀₀ nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
2. Po 48 godzinach odwirować kulturę bakteryjną przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Po odwirowaniu dodać 100 μl bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i dodać do niej 100 μl barwnika CAS.
4. Przykryj płytkę folią aluminiową i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 minut.
5. Po inkubacji wykonać odczyty spektrofotometryczne przy długości fali 630 nm.
6. Obliczyć wyniki uzyskane w celu ilościowego określenia całkowitej liczby sideroforów jako procentowej jednostki sideroforu (PSU).
   UWAGA: Zasilacz można obliczyć jako: [(A_r - A_s)/A_r] x 100
   gdzie, A_r = absorbancja wzorca przy 630 nm, A_s = absorbancja bezkomórkowego supernatantu próbki. Dla porównania, barwnik CAS powinien być dodany do nieinokulowanych pożywek wodnych peptonowych. Napełnij wszystkie szklane naczynia, takie jak probówki, kolby itp., 6 M HCl przez 2 godziny i spłucz je dwukrotnie wodą destylowaną, aby usunąć z nich wszelkie ślady żelaza.

4. Ilościowe oszacowanie pioverdyny

1. Ponownie zaszczepić wyhodowane w ciągu 24 godzin kultury P. aeruginosa w pożywce wodnej peptonowej po dostosowaniu OD₆₀₀ nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 48 godzin.
2. Po 48 godzinach zmierz OD₆₀₀ nm wzrostu bakterii, zanim przejdziesz dalej.
3. Odwirować kulturę bakteryjną przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
4. Po odwirowaniu dodać 100 μl bezkomórkowego supernatantu do 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej i dodać do niej 100 μl 50 mM Tris-HCl (pH 8,0).
5. Wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy średnicy zewnętrznej₄₀₅ nm.

5. Ekstrakcja pyochelin i spektrofotometria

1. Ponownie zaszczepić wyhodowane w ciągu 24 godzin kultury P. aeruginosa w pożywce King's B (plik uzupełniający 1) po dostosowaniu OD₆₀₀ nm do 0,25 i inkubować w temperaturze 30 °C przez 24 godziny.
2. Po 24 godzinach pobrać 100 ml kultury i odwirować przy 4650 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Po odwirowaniu dodać 5 ml 1 M kwasu cytrynowego do supernatantu. Ekstrahować dwukrotnie 50 ml octanu etylu.
4. Przefiltrować fazę organiczną z siarczanem magnezu przez filtr strzykawkowy. Przefiltrowaną fazę organiczną przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Wykonaj odczyty spektrofotometryczne przy 320 nm.
   UWAGA: Ponieważ pyochelin jest bardzo niestabilnym związkiem w temperaturze pokojowej, proces ekstrakcji należy przeprowadzić na lodzie. Do oddzielenia filtra należy użyć sterylnej strzykawki o pojemności 50 ml. Umieść bawełnę na końcówce strzykawki i dodaj na nią 1 g siarczanu magnezu. Zamocować sterylny filtr strzykawkowy na końcówce strzykawki i zebrać filtrat do sterylnej probówki.

Wyniki

Przed ilościowym oznaczaniem sideroforów z izolatów klinicznych przeprowadzono przesiewową analizę jakościową w celu potwierdzenia ich produkcji. Jakościową detekcję sideroforów z izolatów klinicznych obserwowano poprzez posiew bakterii metodą kreślenia na płytkach z agarem CAS. Do badania wybrano trzy izolaty kliniczne, mianowicie MR1, TL7, J3, oraz szczep referencyjny PAO1. Wszystkie trzy izolaty kliniczne oraz PAO1 wykazały pozytywne wyniki w kierunku produkcji sideroforów, gdzie obecn...

Dyskusja

Protokół ten umożliwia naukowcom ilościowe określenie całkowitej liczby sideroforów i dwóch różnych sideroforów P. aeruginosa, a mianowicie pyoverdiny i pyocheliny, z supernatantu bezkomórkowego bakterii. W teście na płytkach agarowych CAS barwnik CAS i jony Fe³⁺ tworzą kompleks. Kiedy bakterie wytwarzają siderofory, wygaszają jony Fe^{3 +} z kompleksu CAS-Fe^{3 +}, co prowadzi do zmiany koloru wokół wzrostu bakterii. Ta zmiana powoduje powstanie wyraźnej pomarańczowej aureoli wokół wz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar Agar, typ I	HIMEDIA	GRM666
8-hydroksychinolina	Loba Chemie	4151
Casamino Acid	SRL Chemicals	68806
Bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB)	HIMEDIA	RM4867-100G
Chloroform	Merck	1070242521
Chrome sulfonian azurolu	HIMEDIA	RM336-10G
Kwas cytrynowy	Merck	100241
Monohydrat dekstrozy	Merck	108342
Dichlorometan	Merck	107020
Sześciowodny chlorek żelaza	HIMEDIA	GRM6353
Szklane kolby	Borosil	5100021
Szklane probówki	Borosil	9820U05
Kwas solny	SDFCL	20125
King's medium B base	HIMEDIA	M1544-500G
M9 Minimalne sole średnie	HIMEDIA	G013-500G
Siarczan magnezu	Qualigens	10034
MultiskanGO	Thermo Scientific	51119200
Pepton Typ I, Bakteriologiczny	HIMEDIA	RM667-500G
RURY kwas wolny	MP Biomedicals	190257
Diwodorofosforan potasu	Merck	1048731000
Pepton Proteose	HIMEDIA	RM005-500G
Spektrofotometr UV-Vis Shimadzu		2072310058
Sigma Laborzentrifuge	Sigma-Aldrich	3-18K
Chlorek sodu	Qualigens	15915

Spektrofotometr UV