Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

Tino Stauber; Maja Wolleb; Jess G. Snedeker

doi:10.3791/65987

Artykuł metodologiczny

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

DOI:

10.3791/65987

⸱

22 marca 2024

Tino Stauber¹^,² , Maja Wolleb¹^,² , Jess G. Snedeker¹^,²

¹Department of Orthopedics, Balgrist, University Hospital Zurich, University of Zurich, ²Department of Health Sciences and Technology, Institute for Biomechanics, ETH Zurich

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy system modeli assembloid, który naśladuje przesłuch komórkowy ścięgien między tkanką rdzenia ścięgna nośnego a zewnętrznym przedziałem zawierającym populacje komórek aktywowane przez chorobę i uraz. Jako ważny przypadek użycia pokazujemy, w jaki sposób system może zostać wykorzystany do badania istotnej z chorobą aktywacji zewnętrznych komórek śródbłonka.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ścięgna umożliwiają poruszanie się, przenosząc siły mięśniowe na kości. Opierają się na twardym rdzeniu ścięgna składającym się z włókien kolagenowych i populacji komórek zrębu. Ten nośny rdzeń jest otoczony, odżywiany i naprawiany przez warstwę tkanki maziowej przypominającą tkankę składającą się z zewnętrznego przedziału ścięgna. Pomimo tej wyrafinowanej konstrukcji, urazy ścięgien są powszechne, a leczenie kliniczne nadal opiera się na fizjoterapii i chirurgii. Ograniczenia dostępnych eksperymentalnych systemów modelowych spowolniły rozwój nowych terapii modyfikujących przebieg choroby i schematów klinicznych zapobiegających nawrotom.

Badania in vivo na ludziach ograniczają się do porównywania zdrowych ścięgien z uszkodzonymi lub uszkodzonymi tkankami pobranymi podczas operacji naprawczej i nie pozwalają na badanie podłużne podstawowej choroby ścięgien. Modele zwierzęce in vivo mają również istotne ograniczenia w zakresie nieprzejrzystej złożoności fizjologicznej, obciążenia etycznego zwierząt oraz dużych kosztów ekonomicznych związanych z ich wykorzystaniem. Co więcej, modele zwierzęce in vivo słabo nadają się do systematycznego sondowania leków i wielokomórkowych, wielotkankowych szlaków interakcji. Prostsze systemy modelowe in vitro również okazały się niewystarczające. Jednym z głównych powodów jest brak odpowiedniego odtworzenia trójwymiarowego obciążenia mechanicznego niezbędnego do sensownego badania komórek ścięgien i ich funkcji.

Nowy system modeli 3D prezentowany tutaj łagodzi niektóre z tych problemów, wykorzystując eksplantaty rdzenia ścięgna mysiego ogona. Co ważne, te eksplantaty są łatwo dostępne w dużych ilościach z jednej myszy, zachowują wzorce ładowania 3D in situ na poziomie komórkowym i charakteryzują się macierzą zewnątrzkomórkową podobną do in vivo. W tym protokole podano instrukcje krok po kroku, jak wzmocnić eksplantaty rdzenia ścięgna hydrożelami kolagenowymi wypełnionymi komórkami śródbłonka pochodzącymi z mięśni, fibroblastami pochodzącymi ze ścięgien i makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego w celu zastąpienia populacji komórek aktywowanych chorobą i urazem w zewnętrznym przedziale ścięgna. Pokazano, w jaki sposób powstałe w ten sposób można wyzwać powstałe zespoły ścięgien mechanicznie lub za pomocą zdefiniowanych bodźców mikrośrodowiskowych w celu zbadania pojawiających się wielokomórkowych przesłuchów podczas choroby i urazu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W swojej funkcji przenoszenia sił mięśniowych na kości w celu umożliwienia ruchu, ścięgna są narażone na jedne z najbardziej ekstremalnych obciążeń mechanicznych występujących w ludzkim ciele¹^,²^,³. Ze względu na starzenie się społeczeństw, rosnące rozpowszechnienie otyłości i rosnącą popularność wymagających mechanicznie aktywności sportowych, przewiduje się, że częstość występowania chorób i urazów ścięgien wzrośnie w krajach rozwiniętych⁴^,5^,⁶. Opracowanie nowatorskich, opartych na dowodach naukowych i modyfikujących przebieg choroby schematów leczenia w celu przeciwdziałania temu wzrostowi było utrudnione przez ograniczenia obecnie dostępnych systemów modelowych¹^,⁷^,⁸.

Idealnie, modele naprawy chorób i urazów pozwoliłyby badać, jak docelowy organ przetwarza zdefiniowany zestaw parametrów wejściowych (imitujących czynniki wywołujące chorobę, Tabela 1) na mierzalne parametry wyjściowe (reprezentujące cechy charakterystyczne choroby, Tabela 2), jednocześnie kontrolując czynniki zakłócające. Badania z wykorzystaniem takich systemów modelowych byłyby następnie w stanie zidentyfikować (pato-)fizjologiczne procesy leżące u podstaw choroby i naprawy urazów oraz zdobyć wiedzę, którą można by wykorzystać do zapobiegania lub zmniejszania cech charakterystycznych chorób i urazów w klinikach. Stosując tę zasadę do ścięgien, użyteczny system modelowy powinien podsumować centralne części odpowiedzi ścięgna in vivo na chorobę i uraz, które obejmują następujące cechy charakterystyczne: mikrouszkodzenia, zapalenie, neowaskularyzacja, hiperkomórkowość, przyspieszony obrót macierzy i decompartmentalizacja9^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Korzystając z tych cech rozpoznawczych jako podstawy, można wywnioskować następujące wymagania dotyczące udanego systemu modelowego naprawy chorób ścięgien i urazów.

Hipotetyczne przeciążenie mechaniczne jest głównym czynnikiem w patogenezie urazów ścięgien i chorób, a zatem jest powszechnie stosowanym eksperymentalnym podejściem do tworzenia mikrouszkodzeń¹⁶. Kontrolowana obciążalność mechaniczna jest zatem podstawowym warunkiem wstępnym dla modeli naprawy chorób ścięgien i urazów. Idealnie byłoby, gdyby system modelu umożliwiał trzy główne tryby: pojedynczy załadunek rozciągający do uszkodzenia, załadunek zmęczeniowy i rozładunek⁸^,¹⁷^,¹⁸. Po odkształceniu mechanicznym komórki rezydujące w tkance doświadczają złożonej kombinacji sił rozciągających, sił ścinających (spowodowanych przesuwaniem się włókien kolagenowych otaczających komórki) i sił ściskających występujących podczas rozładunku lub w pobliżu przyczepu ścięgnistego¹⁹^,²⁰. Systemy modeli powinny jak najwierniej odtwarzać te złożone wzorce ładowania.

Alternatywnym sposobem na wprowadzenie mikrouszkodzeń matrycy jest wykorzystanie stresorów biochemicznych, które naśladują ogólnoustrojowe predyspozycje do chorób i urazów ścięgien, takich jak (pro)zapalne cytokiny, stres oksydacyjny lub wysokie stężenia glukozy²¹^,²²^,²³. W związku z tym kontrolowane mikrośrodowisko niszowe jest korzystne dla systemu modelowego naprawy chorób ścięgien i urazów.

Częstym warunkiem wstępnym dla systemów modelowych, które są w stanie podsumować stan zapalny, neowaskularyzację i hiperkomórkowość, jest selektywna obecność populacji komórek, które napędzają te procesy²⁴. W przypadku procesów zapalnych populacje te obejmują neutrofile, limfocyty T i makrofagi, podczas gdy komórki śródbłonka i perycyty byłyby potrzebne do badania neowaskularyzacji²⁵^,²⁶^,²⁷^,²⁸^,²⁹. Fibroblasty ścięgien są nie tylko niezbędne do naprawy ścięgien, ale jako komórki proliferacyjne i migrujące są również częściowo odpowiedzialne za lokalną hiperkomórkowość obserwowaną w chorobie ścięgien³⁰^,³¹^,³²^,³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶.

Oprócz zmian w populacjach komórek rezydentnych, skład macierzy ścięgien zmienia się również w chorobach i urazach ścięgien7^,³⁷^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰. Aby przedstawić właściwe sygnały mikrośrodowiskowe istotne dla choroby, systemy modelowe powinny być w stanie zintegrować skład macierzy zewnątrzkomórkowej dopasowany do docelowego etapu choroby lub urazu, na przykład poprzez umożliwienie odpowiednich proporcjonalnych kombinacji kolagenu-1, kolagenu-3 i fibronektyny komórkowej⁴¹.

Podział zdrowych ścięgien na rdzeń ścięgna i zewnętrzne przedziały (tj. endotenon, epitenon i paratenon) jest kluczowy dla ich funkcji i często zaburzony w chorych lub uszkodzonych ścięgnach^1,⁴²^,⁴³^,⁴⁴^,⁴⁵^,⁴⁶^,⁴⁷. Włączenie podziału ścięgien 3D do systemów modeli ścięgien jest zatem nie tylko niezbędne do dokładniejszego symulowania procesów leżących u podstaw de- i re-compartmentalizacji, ale także pomaga w ustaleniu prawidłowych gradientów czasoprzestrzennych cytokin i składników odżywczych⁴⁸^,⁴⁹.

Wreszcie, modułowość jest kolejnym kluczowym atutem systemów modelowych, pozwalającym badaczom na połączenie prawidłowego względnego udziału i wzajemnych oddziaływań między wcześniej opisanymi stresorami podczas badanych procesów⁸^,¹⁷.

Oprócz wyboru optymalnych metod wejściowych, ważnym krokiem jest możliwość mierzenia, obserwowania i śledzenia zmian w wyniku. Właściwości mechaniczne układu modelowego (tj. długość obszaru zbieżności, liniowy moduł sprężystości, maksymalne odkształcenie rozciągające, maksymalne naprężenie rozciągające, wytrzymałość zmęczeniowa i relaksacja naprężeń) są tutaj kluczowe, ponieważ charakteryzują główną funkcję ścięgna⁵⁰^,⁵¹^,⁵². Aby powiązać te zmiany funkcjonalne ze zmianami na poziomie tkanki, ważne jest, aby umożliwić metody wykrywania uszkodzeń macierzy strukturalnej (kolagenu) oraz śledzenia proliferacji i rekrutacji populacji komórek istotnych dla chorób i napraw³⁰^,⁵³^,⁵⁴^,⁵⁵^,⁵⁶^,⁵⁷^,⁵⁸^,⁵⁹^,⁶⁰.

Aby badać powstające przesłuchy komórka-komórka i matryca komórkowa, powinno być w stanie wyizolować lub oznaczyć białka w odpowiednich ilościach do kwantyfikacji (np. ELISA, proteomika, immunohistochemia, cytometria przepływowa)¹⁴^,²¹^,⁶¹^,⁶². Powinna być również możliwa analiza ekspresji genów specyficzna dla populacji lub przynajmniej przedziału (tj. sortowanie komórek aktywowane fluorescencją [FACS], sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki/masowej oraz ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (RT-qPCR))²¹^,²⁴^,²⁷^,⁶³. System modelowy powinien umożliwiać pomiar jak największej liczby wyżej wymienionych parametrów wyjściowych na tej samej próbce i na wielu próbkach w sposób wystarczająco szybki, aby odblokować badania o wysokiej przepustowości.

Wśród obecnie dostępnych systemów modelowych do badania chorób ścięgien u ludzi i naprawy urazów, ludzkie ciało jest oczywiście najbardziej reprezentatywne. Jest również najmniej kompatybilny z interwencją eksperymentalną. Podczas gdy pacjenci z ostrymi urazami ścięgien są obficie dostępni do badań klinicznych, pacjenci z wczesną tendinopatią (najczęstszą chorobą ścięgien) są w dużej mierze bezobjawowi i często pozostają klinicznie niewykryci, dopóki nie pojawią się poważniejsze zmiany¹⁴^,⁶⁴^,⁶⁵. To sprawia, że trudno jest wskazać krytyczny moment, w którym dochodzi do wykolejenia homeostazy ścięgien i mechanizmy stojące za tym wykolejeniem¹⁶^,⁶⁶^,⁶⁷^,⁶⁸^,⁶⁹. Ponadto pobieranie biopsji ze zdrowych ścięgien jest wyzwaniem etycznym, ponieważ może skutkować trwałym uszkodzeniem. Pozostałości ścięgna ścięgna podkolanowego po operacji rekonstrukcji więzadła krzyżowego przedniego są często używane jako zdrowa kontrola, ale prawdopodobnie różnią się funkcją, właściwościami mechanicznymi, populacjami komórek i składem macierzy w porównaniu z stożkiem rotatorów, ścięgnami Achillesa i ścięgnami rzepki często dotkniętymi chorobami i urazami ścięgien⁷⁰^,⁷¹^,⁷²^,⁷³.

Modele zwierzęce in vivo są bardziej dostępne i łatwiejsze w obsłudze, ale ich użycie nakłada znaczne obciążenie etyczne na zwierzęta i koszty ekonomiczne dla badaczy. Ponadto większość popularnych zwierząt modelowych albo nie rozwija zmian tendinopatycznych spontanicznie (tj. szczury, myszy, króliki), albo brakuje im starterów i genetycznie zmodyfikowanych szczepów niezbędnych do śledzenia wielokomórkowych szlaków komunikacyjnych zaangażowanych w to (tj. konie, króliki).

Proste systemy modeli 2D in vitro znajdują się po drugiej stronie spektrum złożoności/wykonalności i lepiej pozwalają na kontrolowane, efektywne czasowo badanie specyficznych szlaków komunikacji międzykomórkowej w odpowiedzi na bardziej kontrolowany zestaw wyzwalaczy8^,⁷⁴. Jednak te uproszczone systemy często nie są w stanie podsumować wielowymiarowego obciążenia mechanicznego (tj. rozciągania, ściskania i ścinania), które ma kluczowe znaczenie dla funkcjonalności ścięgien. Ponadto (zbyt) wysoka sztywność plastiku do hodowli tkankowych ma tendencję do zastępowania wszelkich wskazówek matrycy dostarczanych przez powłoki mające naśladować stan choroby będący przedmiotem zainteresowania⁷⁵^,⁷⁶.

Aby przezwyciężyć tę wadę, opracowano coraz bardziej wyrafinowane systemy modeli 3D oparte na inżynierii tkankowej, które zapewniają ładowalną matrycę, której skład może być przynajmniej częściowo dopasowany do pożądanego stanu choroby⁷⁷^,⁷⁸^,⁷⁹. Mimo to systemy te nie tylko mają trudności z dokładnym odtworzeniem złożonych kompozycji macierzy zewnątrzkomórkowej in vivo i wzorców obciążenia komórkowego, ale generalnie brakuje im długoterminowej obciążalności i interfejsów kompartmentowych wymaganych do badania międzyprzedziałowych szlaków komunikacyjnych, które koordynują choroby ścięgien i naprawę urazów⁴⁸^,⁴⁹^,⁸⁰.

Systemy modeli eksplantacji ścięgien ex vivo mają wyraźną zaletę wbudowanej kompozycji matrycy podobnej do in vivo, która składa się z nisz okołokomórkowych, barier międzykompartmentowych, a także czasoprzestrzennych gradientów cytokin/składników odżywczych i podsumowuje złożone wzorce obciążenia po rozciągnięciu⁸. W wyniku zależnych od wielkości limitów dyfuzji składników odżywczych, eksplantaty z większych modeli zwierzęcych (tj. koni) są trudne do utrzymania przy życiu w długoterminowych badaniach chorób ścięgien i naprawy urazów⁸¹^,⁸²^,⁸³. Tymczasem mniejsze eksplantaty z gatunków mysich (tj. ścięgno Achillesa, ścięgno rzepki) są trudne do powtarzalnego zaciskania i mechanicznego obciążania. Ich rozmiar ogranicza również ilość materiału, który można zebrać do odczytów na poziomie komórki, białka i genów bez łączenia próbek i zmniejszania przepustowości. W tym sensie pęczki ścięgien mysiego ogona oferują potencjał do odblokowania wysokoprzepustowych badań nad chorobami ścięgien i naprawą urazów, ponieważ są one łatwo dostępne w dużych ilościach z jednej myszy, zachowują złożony skład macierzy okołokomórkowej in vivo i rekapitulują wzorce obciążenia komórkowego. Jednak podczas procesu ekstrakcji tracą większość swojego zewnętrznego przedziału, a w nim znajdują się populacje naczyniowe, immunologiczne i fibroblasty, które są obecnie uważane za napędzające choroby ścięgien i ich naprawę⁸^,¹⁸.

Aby wypełnić tę lukę, opracowano system modelowy łączący zalety eksplantatów rdzeniowych pochodzących z mysich ścięgien ogonowych z zaletami systemów modelowych opartych na hydrożelu 3D. Ten system modelowy składa się z naładowanego komórkami (kolagen-1) hydrożelu odlewanego wokół eksplantatów ścięgna ogonowego⁸⁴^,⁸⁵. W tym artykule szczegółowo przedstawiono niezbędne etapy produkcji wraz z przydatnymi odczytami, które można uzyskać przez kokulturę eksplantatów rdzeniowych (przedział wewnętrzny) w hydrożelu kolagenowym typu 1 obciążonym komórkami śródbłonka (przedział zewnętrzny).

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez odpowiedzialne władze (numery licencji Kantonu Zurych ZH104-18 i ZH058-21). Przegląd znajduje się w Rysunek 1.

1. Izolacja elementów zespołu ścięgien od 12-15 tygodniowych myszy (tj. B6/J-Rj)

Poddaj myszy eutanazji poprzez uduszenie wywołane gazem CO₂. Aby zmaksymalizować wydajność, nie przetwarzaj więcej niż 3 myszy na raz i przystąp do izolacji komórek natychmiast po eutanazji.
Zapewnić śmierć przez obustronną indukcję odmy opłucnowej.
Wysterylizuj skórę myszy 80% etanolem i przenieś mysz do sterylnego kaptura bezpieczeństwa biologicznego.
Odizoluj eksplantaty rdzenia ścięgna ogonowego.
1. Użyj skalpela (nr 21), aby oddzielić ogon od myszy, przecinając go u podstawy.
2. Zaczynając od czubka ogona, chwyć go pęsetą i poruszaj, aby złamać skórę. Następnie delikatnie odciągnij pęsetę od ogona, aby odsłonić eksplantaty rdzenia ścięgna.
3. Umieść eksplantaty rdzenia ścięgna w standardowej pożywce hodowlanej (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 1% aminokwasów endogennych) i oddziel je od oderwanej części ogonowej za pomocą świeżego ostrza skalpela (nr 21).
4. Powtarzać kroki 1.4.2 i 1.4.3 do momentu, gdy cały ogon zostanie przetworzony, a eksplantaty ścięgien staną się krótsze niż 25 mm.
5. Pokrój izolowane eksplantaty rdzenia na kawałki o długości 25 mm za pomocą świeżego ostrza skalpela (nr 21).
6. Zmierz średnią średnicę rdzenia eksplantatów za pomocą mikroskopu świetlnego podłączonego do oprogramowania do analizy obrazu za pomocą dołączanej cyfrowej kamery z mocowaniem C.
  1. Użyj wskaż i kliknij, aby wybrać narzędzie do pomiaru linii po prawej stronie.
  2. Zmierz średnicę eksplantatu w trzech różnych miejscach i oblicz ich średnią średnicę.
  3. Aby ułatwić późniejsze zaciskanie i testowanie mechaniczne, należy stosować tylko eksplantaty rdzeniowe o średniej średnicy większej niż 100 μm.
7. Rozładunek połączony z ekspozycją na standardowe warunki hodowli (37 °C, 20%_O2, suplementacja surowicy) zmienia ekspresję genów w ciągu 6 godzin po izolacji i powoduje degradację w ciągu 7 dni²¹. Aby rozpocząć od stanu quasi-homeostatycznego, wyprodukuj asembloidy ścięgien i rozpocznij eksperymenty natychmiast po izolacji rdzenia ścięgna.
8. W zależności od konfiguracji eksperymentalnej, jako grupa kontrolna wymagane są zdewitalizowane eksplantaty rdzenia ścięgna. Aby zdewitalizować eksplantaty rdzenia ścięgien, zamroź je w małym pojemniku wypełnionym ciekłym azotem przez 5 s za pomocą pęsety, a następnie rozmrażaj je przez 5 s w temperaturze pokojowej (RT). Powtórz ten cykl zamrażania i rozmrażania 3 razy i przejdź do kroku 4 ("Zaciskanie eksplantatów rdzenia").
  UWAGA: Ciekły azot może powodować zimne oparzenia, uduszenie i kruchość wielu zwykłych materiałów. Używaj wyłącznie pojemników przeznaczonych na płyny o niskiej temperaturze i noś odzież ochronną (tj. osłonę twarzy, odpowiednie rękawice, obuwie zamknięte).
Wyizoluj fibroblasty ścięgien.
1. Użyj skalpela (nr 21), aby wykonać poprzeczne nacięcie na środku stopy myszy. Wykonaj dwa nacięcia prostopadłe do stopy wzdłuż boków tylnych nóg i do bioder od każdego końca tego nacięcia.
2. Za pomocą pęsety przymocuj wycięty płat skóry u stopy i oderwij skórę pokrywającą mięśnie łydek. Podczas izolowania komórek śródbłonka od tej samej myszy usuń zamiast tego całą skórę.
3. Oddziel ścięgno Achillesa od kości piętowej świeżym ostrzem skalpela (nr 21). Przymocuj luźny koniec ścięgna Achillesa za pomocą pęsety i oddziel drugi koniec od mięśnia brzuchatego łydki.
4. Umyj ścięgno Achillesa raz w PBS i użyj skalpela (nr 21), aby usunąć całą pozostałą tkankę mięśniową, aż pozostanie tylko biała tkanka ścięgna. Jeśli komórki śródbłonka są izolowane od tej samej myszy, pozostaw ścięgno Achillesa w PBS i kontynuuj krok 1.6. pierwszy.
5. Połączyć ścięgna Achillesa jednego zwierzęcia w plastikowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 10 ml pożywki do trawienia ścięgien (DMEM/F12 + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 2 mg/ml kolagenazy 1) i trawić przez 6-8 godzin w temperaturze 37 °C przy powolnym, stałym mieszaniu przy użyciu wytrząsarki orbitalnej o niskiej prędkości przy 15 obr./min.
6. Odwirować strawiony roztwór ścięgien przy 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, odessać supernatant i ponownie zawiesić w 8 ml standardowej pożywki hodowlanej (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 1% aminokwasów endogennych) i posiewać w kolbie hodowlanej T25 w normalnych warunkach hodowli (37 °C, 20 %_O2) przez 7 dni bez zmiany pożywki. Następnie zmieniaj nośnik raz w tygodniu.
7. Podziel komórki przy 80% zbiegu do kolby hodowlanej T150 (1:6). Zamrozić komórki podczas przechodzenia 2 w 2 ml sterylnego, przefiltrowanego podłoża do zamrażania (70% DMEM/F12 + 20% FBS + 10% DMSO) rozprowadzonego do dwóch krioprobówek o pojemności 1,5 ml i utrzymywać je w temperaturze -80 °C do dalszego użycia. Użyj trypsyny, aby usunąć komórki z plastikowej kultury tkankowej.
Wyizoluj komórki śródbłonka pochodzące z mięśni.
1. Jeśli fibroblasty ścięgien nie są izolowane od tej samej myszy, zacznij od kroków 1.5.1 i 1.5.2.
2. Użyj nożyczek, aby oddzielić tylne nogi od ciała, przecinając staw biodrowy.
3. Umyj tylne nogi raz w zimnym PBS (~ 4 °C), usuń mięśnie (mięsień czworogłowy uda, prostownik palca długiego, płaszczkowaty i brzuchaty łydki) za pomocą skalpela (nr 21) i umieść mięśnie na szalce Petriego na lodzie.
4. Użyj świeżego ostrza skalpela (nr 21), aby zmielić tkankę mięśniową na kawałki mniejsze niż 1 mm³, trzymając szalkę Petriego na lodzie.
5. Zbierz zmieloną tkankę mięśniową z obu tylnych nóg do plastikowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 12,5 ml pożywki do trawienia mięśni (PBS + 2 mg / ml kolagenazy IV + 2 mg / ml dyspazy II + 2 mM CaCl₂).
6. Umieść plastikową rurkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut. Energicznie wstrząśnij roztworem i umieść go z powrotem na kolejne 10 minut. Powtarzaj, aż roztwór będzie wydawał się jednorodny i pozostaną tylko (białe) kawałki ścięgna i powięzi (ok. 4 x 10 min). W międzyczasie kontynuuj izolację fibroblastów ścięgien lub izolację makrofagów.
7. Dodaj 12,5 ml zimnego PBS + 10% FBS do plastikowej tuby, aby zatrzymać trawienie.
8. Użyj zasilanego bateryjnie uchwytu na pipety wyposażonego w pipetę o pojemności 50 ml, aby zassać zawiesinę z plastikowej rurki. Wyposaż plastikową rurkę w sitko komórkowe 400 μm i przefiltruj zawiesinę, aby usunąć zanieczyszczenia. Powtórz proces z sitkiem o wielkości 100 μm.
9. Przefiltrowaną zawiesinę odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić w 10 ml zimnego PBS + 10% FBS i ponownie odwirować.
10. Zawiesić w 8 ml pożywki do hodowli śródbłonka (mieszanina 1:1 DMEM/F12 i zestawu endopan 3 + 10 U/ml heparyny + 20% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 30 mg/ml suplementu wzrostu śródbłonka) uzupełnionej puromycyną (4 mg / ml) w celu selekcji populacji.
11. Komórki jednej myszy należy rozsiać w jednej kolbie hodowlanej T25, która została wcześniej pokryta 2 ml sterylnego 0,2% roztworu żelatyny przez 2 godziny w temperaturze 37 °C, a następnie wysuszona przez noc w temperaturze pokojowej po usunięciu nadmiaru roztworu. Przygotować kolby na dzień przed izolacją.
12. Po 24 godzinach w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 20%_O2) usunąć pożywkę z suplementem puromycyny, przemyć przyłączone komórki raz PBS i wyhodować je w 8 ml pożywki do hodowli śródbłonka.
13. Przejść komórki w stosunku 1:5 przy 80% zbiegu do kolb pokrytych żelatyną i używać ich w eksperymentach do P2. Użyj roztworu do odrywania komórek innego niż trypsyna (tabela materiałów), aby usunąć komórki z plastikowej hodowli tkankowej i nie zamrażać ich.
Wyizoluj makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego.
1. Jeśli fibroblasty ścięgien lub komórki śródbłonka nie są izolowane od tej samej myszy, najpierw wykonaj kroki 1.5.1, 1.5.2, 1.6.2 i 1.6.3.
2. Po usunięciu skóry, ścięgna i tkanek mięśniowych, umyj resztki kości (kość udową i piszczelową) raz w zimnym PBS (~4 °C).
3. Umieść kości w świeżym, zimnym PBS (~ 4 °C) i za pomocą skalpela (nr 21) stopniowo odcinaj nasady, aż do odsłonięcia szpiku kostnego. Pojawia się jako czerwona kropka po obu stronach kości.
4. Wyposażyć strzykawkę w igłę do wstrzykiwań o wymiarach 0,4 mm x 25 mm (G27) i wypełnić ją 10 ml pożywki do hodowli makrofagów (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 1% aminokwasów endogennych).
5. Trzymać jedną kość po drugiej nad plastikową probówką o pojemności 50 ml, wprowadzić igłę do wstrzykiwań na głębokość około 1 mm w odsłonięty szpik kostny na górze i wypłukać szpik kostny, opróżniając strzykawkę. Wypłukany szpik kostny po zawieszeniu w pożywce wygląda jak czerwonawa struktura przypominająca rurkę.
6. Rozpuścić szpik kostny, delikatnie pipetując go kilkakrotnie w górę i w dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Za pomocą zasilanego bateryjnie uchwytu na pipety wyposażonego w pipetę o pojemności 50 ml przefiltrować zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 100 μm z powrotem do plastikowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować ją przy ciśnieniu 350 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
7. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 10 ml buforze do lizy czerwonych krwinek (RBC) i ponownie odwirować przy 350 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
8. Zawiesić osad w 5 ml pożywki do hodowli makrofagów (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 1% aminokwasów endogennych) i wysiać go na nietraktowane szalki Petriego o średnicy 100 mm (5-8 x 10,⁶ komórek na szalkę).
9. Po 4 godzinach dodać 5 ml pożywki do hodowli makrofagów uzupełnionej czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów o stężeniu 40 ng/ml (m-CSF) do pożywki do hodowli komórkowej bez m-CSF (mieszanina 1:1), aby uzyskać końcowe stężenie 20 ng/ml m-CSF.
10. Po 6 dniach użyj komórek w eksperymentach lub zamroź je do czasu dalszego użycia. Użyj roztworu do odrywania komórek innego niż trypsyna (tabela materiałów), aby usunąć komórki z plastikowej hodowli tkankowej.
  UWAGA: Po odizolowaniu komórki nie rozszerzają się już. Opisane tutaj metody izolacji komórek działają również u myszy i szczurów spoza wskazanego przedziału wiekowego.
Aby zweryfikować fenotyp izolowanych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej, należy przejść do kroku 6.3.4.

2. Izolacja kolagenu od szczurów rasy Wistar lub Sprague-Dawley

Postępuj zgodnie z protokołem izolacji opisanym szczegółowo w innym miejscu⁸⁶. Działa również na myszach, choć ze znacznie niższą wydajnością.
Oznaczyć stężenie otrzymanego roztworu za pomocą testu hydroksyproliny, ocenić czystość za pomocą SDS i przechowywać roztwór w temperaturze 4 °C do czasu użycia w eksperymentach.

3. Produkcja komponentów systemu hodowli

Wydrukuj w 3D uchwyty zacisków, stację montażową i formy komory.
1. Załaduj załączony plik .stl (plik uzupełniający 1) dla uchwytów zaciskowych, stacji montażowej i form komorowych do oprogramowania do krojenia. Aby dostosować numery obiektów zgodnie z wymaganiami, użyj opcji wskaż i kliknij, aby wybrać obiekty, a następnie skopiuj i wklej, aby je pomnożyć.
2. Naciśnij Eksportuj G-code (Ctrl-R), aby wygenerować G-code, a następnie wyeksportuj go (Ctrl-G).
3. Załaduj G-code do drukarki 3D.
4. Do procesu drukowania używaj niebarwionych, biokompatybilnych filamentów (np. kwasu polimlekowego).
5. Wytnij gwinty 3 mm w otworach uchwytu zaciskowego, który będzie przenosił, za pomocą obcinaka do gwintów (plik uzupełniający 2 i plik uzupełniający 3, otwory 1 i 3).
6. Umieść kołki ustalające ze stali nierdzewnej w otworze z tyłu clamp uchwyt (Dodatkowy file 2 i Dodatkowy file 3, otwór 4).
7. Sterylizuj clamp uchwyty i stację montażową światłem UV przez co najmniej 1 godzinę przed użyciem. Nie używaj ponownie drukowanych w 3D uchwytów zaciskowych.
8. Alternatywnie, wyprodukuj uchwyty zaciskowe i stację montażową z polieteroimidem, korzystając z załączonych planów (plik uzupełniający 2, plik uzupełniający 3 i plik uzupełniający 4), który jest droższy, ale umożliwia lepsze metody sterylizacji (tj. autoklawowanie) i wielokrotne użycie.
Odlew komory za pomocą form wydrukowanych w 3D.
1. Wypełnij foremki komory silikonem.
2. Odgazować silikon w komorze próżniowej (90 mbar) przez 30 minut.
3. Pozostawić roztwór do polimeryzacji w temperaturze pokojowej przez noc lub na płycie grzejnej w temperaturze 70 °C przez 1 godzinę, w zależności od odporności cieplnej włókien użytych do form.
4. Ostrożnie wyjmij spolimeryzowane komory z form i odetnij zbędny silikon skalpelem (nr 21).
5. OPCJONALNIE: Jeśli asembloidy, a tym samym otaczające je komory, mają być obciążone mechanicznie, należy wzmocnić otwory w komorach silikonowych pustymi rurkami wykonanymi ze stali nierdzewnej.
Obrobić metalowe zaciski ze stali nierdzewnej, korzystając z załączonego planu (plik uzupełniający 5).
Przed każdym użyciem umyj zaciski ze stali nierdzewnej, uchwyty zaciskowe z polieteroimidu, i silikonową komorę.
1. Sonikować przez 10 minut w 80% etanolu (EtOH) i 20% wodzie z odwróconej osmozy (ROW).
2. Sonikować przez 10 minut w 50% EtOH i 50% izopropanolu.
3. Spłucz 3x za pomocą ROW.
4. Sonikować przez 10 minut w 0,5% alkalicznym koncentracie czyszczącym (tj. 3 ml w 600 ml ROW).
5. Sonikować przez 10 minut w 0,5% alkalicznym koncentracie czyszczącym.
6. Pozostawić w 0,5% alkalicznym koncentracie czyszczącym wstrząsając przez 1 h 50 min.
7. Spłucz 3x za pomocą ROW.
8. Sonikuj przez 10 minut z rzędu.
9. Wysuszyć komponenty na powietrzu i sterylizować je w autoklawie.

4. Zaciskanie eksplantatów rdzenia

Umieść pasujące uchwyty zaciskowe razem z jednym metalowym zaciskiem każdy ze stacji montażowej.
Umieść mokre autoklawizowane kawałki papieru (4 mm x 25 mm) na metalowych zaciskach, a następnie przetnij papier wzdłuż wewnętrznych granic zacisków za pomocą skalpela (nr 21). Odetnij 2 dodatkowe, mniejsze kawałki papieru (4 mm x 1,5 mm) z innego kawałka papieru i utrzymuj je w stanie mokrym.
Za pomocą spiczastej pęsety umieść 8 eksplantatów rdzeniowych na papierze między metalowymi zaciskami, tak aby ich końce znajdowały się na metalowych zaciskach.
Przykryj końce eksplantatów rdzenia przygotowanymi mniejszymi kawałkami papieru (4 mm x 1,5 mm), a następnie umieść na nich metalowe zaciski. Użyj śrubokręta i małych (M3 x 6 mm), aby zamocować eksplantaty rdzenia między metalowymi zaciskami a clamp uchwyt.
Ostrożnie przenieś zaciśnięte eksplantaty rdzeniowe do silikonowych komór hodowlanych i napełnij te komory 2 ml standardowej pożywki do hodowli komórkowych (DMEM/F12 + 10% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 1% aminokwasów endogennych).
OPCJONALNIE: Jeśli zespoły/otaczające komory mają być obciążone mechanicznie, zamocuj je za pomocą dodatkowych (M3 x 16 mm) w otworze 3 (Plik uzupełniający 2 i Plik uzupełniający 3, otwór 3).

5. Przygotowanie i odlewanie hydrożelu kolagenowego

Usunąć komórki docelowe z tworzywa sztucznego do hodowli tkankowej za pomocą roztworu do odrywania komórek, odwirować je przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 1 ml standardowej pożywki hodowlanej.
Dla jednego asembloidu wymagane jest 10 μL PBS (20x), 1,28 μL 1 M NaOH (125x), 8,72 μL podwójnie destylowanej wody (ddH₂O, 23x), 80 μL kolagenu-1 (2,5x lub 1,6 mg/ml final) i 100 μL (2x) standardowej pożywki hodowlanej (dla asembloidów rdzeniowych // bezkomórkowych) lub zawiesiny komórek. Przygotuj te składniki w dwóch oddzielnych roztworach i wymieszaj je tylko bezpośrednio przed odlewem.
1. Rozwiązanie sieciujące: Połącz PBS, NaOH, ddH₂0 i zawiesinę komórek do 12 asembloidów (+10% marginesu bezpieczeństwa) w roztwór sieciujący i przechowuj go w plastikowej tubie o pojemności 15 ml na lodzie. Dostosuj stężenie zawiesiny komórkowej, aby osiągnąć następujące stężenia końcowe po zmieszaniu dwóch roztworów: 250 000 komórek/ml fibroblastów ścięgien, 500 000 komórek/ml komórek śródbłonka pochodzących z mięśni lub 370 000 komórek/ml makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego.
2. Roztwór kolagenu-1: Zbierz roztwór kolagenu-1 wymagany dla maksymalnie 12 asembloidów (+10% marginesu bezpieczeństwa) w innej plastikowej tubie o pojemności 15 ml i trzymaj ją na lodzie.
Gdy roztwór sieciujący i roztwór kolagenu-1 są gotowe na lodzie, odessać pożywkę do hodowli komórkowych z komór hodowlanych zawierających zaciśnięte eksplantaty rdzeniowe.
Dodaj roztwór kolagenu-1 do roztworu sieciującego za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i wymieszaj oba roztwory, szybko pipetując w górę i w dół, nie tworząc pęcherzyków. Przykryj poszczególne eksplantaty rdzeni ścięgien 200 μl zmieszanego roztworu, pipetując go do rowków przewidzianych przez komory silikonowe.
Pozostawić hydrożele do polimeryzacji przez 50 minut w temperaturze 37 °C.
Ostrożnie napełnij silikonowe komory hodowlane 1,5 ml odpowiedniej pożywki do kohodowli, pipetując ją w rogach komór.
1. W przypadku kohodowli rdzenia / fibroblastów wypełnij DMEM / F12, 10% FBS, 1% aminokwasów endogennych, 1% penicyliny / streptomycyny, 1% amfoterycyny, 200 μM kwasu L-askorbinowego, 20 ng / ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów.
2. W przypadku kohodowli rdzenia // makrofagów wypełnij DMEM / F12, 10% FBS, 1% aminokwasów endogennych, 1% penicyliny / streptomycyny, 1% amfoterycyny, 200 μM kwasu L-askorbinowego, 20 ng / ml czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów.
3. W przypadku kohodowli komórek rdzenia // śródbłonka należy wypełnić mieszaniną 1:1 DMEM/F12 i zestawu endopan 3 + 10 U/ml heparyny + 20% FBS + 1% penicyliny/streptomycyny + 1% amfoterycyny + 30 mg / ml suplementu wzrostu śródbłonka.
Hodowla asembloidów w warunkach hodowli odpowiednich dla hipotezy. Na przykład, aby naśladować środowisko niszowe przypominające zmiany chorobowe, należy je hodować w temperaturze 37 °C i 20%_O2. Zmień pożywkę hodowlaną dwa razy w ciągu 1 tygodnia. Aby zapobiec infekcjom, umieść komory na dużej szalce Petriego lub sterylnym pudełku przed umieszczeniem ich w inkubatorze.
UWAGA: Czas hodowli zależy od hipotezy i konfiguracji współkultury. Na przykład asembloidy rdzeniowe // fibroblastów w niszowym środowisku przypominającym zmiany stają się mechanicznie niestabilne po około 3 tygodniach.

6. Dostępne metody odczytu

Wykonaj mikroskopię fluorescencyjną, w tym testy żywotności i morfologii.
1. Ogólnie rzecz biorąc, asembloidy mogą być obrazowane jako pełne montowania. W tym celu należy usunąć zespoły z zacisków, przecinając je nożyczkami w pobliżu zacisków i przenosząc na płytkę 12-dołkową.
2. Umyj asembloidy raz za pomocą PBS.
3. Jeżeli przeprowadzana jest analiza żywotności, wybarwić każdy asembloid 100 μl 4 x 10⁻⁶ M homodimeru etydyny w PBS (EthD-1) przez 20 minut w temperaturze 37 °C w ciemności.
4. Umyj asembloidy 3x PBS, a następnie utrwal je 500 μl 4% formaldehydu każdy przez 20 minut w temperaturze RT.
  UWAGA: 4% formaldehyd ma działanie alergizujące, rakotwórcze i mutagenne, działa toksycznie na rozrodczość i może powodować toksyczność rozwojową (reprotoksyczną) lub uszkodzenie narządów. Nosić odzież ochronną i rękawice, okulary ochronne oraz maskę lub inną ochronę dróg oddechowych.
5. Umyj asembloidy 3x za pomocą PBS i kontynuuj zgodnie z wybranym protokołem barwienia. Wybór barwień został opisany wcześniej⁸⁴^,⁸⁵.
  UWAGA: Unikaj barwień wykorzystujących fluorofory o długości fali emisji zbliżonej do długości fali kolagenu (około 480 nm).
Zgodnie z instrukcjami producenta należy przeprowadzić izolację RNA specyficzną dla przedziału w celu RT-qPCR lub sekwencjonowania RNA całego genomu.
1. Usuń zespoły z zacisków za pomocą nożyczek.
2. OPCJONALNIE: Użyj pęsety, aby oddzielić eksplantaty rdzenia od zewnętrznej komory hydrożelowej.
3. Pula 20-24 20 mm eksplantatów rdzeniowych lub 2 hydrożeli kolagenowych obciążonych komórkami, aby wyizolować wystarczającą ilość RNA.
4. Użyj 1 ml zimnego trizolu i zakłóceń mechanicznych (np. kulek metalowych lub mielenia kriogenicznego), aby zniszczyć macierz zewnątrzkomórkową połączonych eksplantatów rdzenia lub połączonych hydrożeli kolagenowych.
  UWAGA: Toksyczność doustna, skórna i inhalacyjna. Działa drażniąco na skórę i oczy. Przechowywać wyłącznie w rękawiczkach i w komorze bezpieczeństwa chemicznego.
5. Kontynuuj izolację RNA z lizatu komórkowego przy użyciu standardowych zestawów do ekstrakcji RNA, jak opisano wcześniej lub zgodnie z opisem w instrukcjach producenta⁸⁴^,⁸⁵.
Cytometria przepływowa specyficzna dla kompartmentu.
1. Usuń zespoły z zacisków za pomocą nożyczek.
2. OPCJONALNIE: Użyj pęsety, aby oddzielić eksplantaty rdzenia od zewnętrznej komory hydrożelowej.
3. Trawić komory w 1 ml PBS z kolagenazą I (3 mg/ml) i dypazą II (4 mg/ml) przez 4 godziny w temperaturze 37 °C przy stałym mieszaniu.
4. Odwirować przefermentowany roztwór o sile 500 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odessać supernatant.
5. Zawiesić osad w 100 μl buforu FACS (1% FBS w PBS) zawierającym wybrane przeciwciała sprzężone z fluoroforem. Wybór działających przeciwciał sprzężonych z fluoroforem został opisany wcześniej⁸⁴^,⁸⁵.
6. Inkubować roztwór barwiący przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Rozcieńczyć roztwór barwiący w 1,4 ml buforu FACS i odwirować go przez 5 minut przy 500 x g w suchej temperaturze względnej.
8. Zawiesić osad w 350 μl buforu FACS i przefiltrować roztwór przez nasadkę sitka z nylonowej siatki 100 μm przed analizą za pomocą wybranego cytometru przepływowego zgodnie z instrukcjami producenta.
Przeanalizować supernatant.
1. Zastąp pożywkę do kokultury pożywką bez surowicy na 3 dni przed pobraniem sklarowanego sklarantu.
2. Wykonaj natychmiastową i opóźnioną analizę wzbogaconego, nierozcieńczonego supernatantu za pomocą testów immunoenzymatycznych (ELISA) i zestawów do wykrywania w skali mezo (MSD). W celu opóźnionej analizy należy przechowywać supernatant w plastikowych probówkach o pojemności 1,5 ml w temperaturze -80 °C.
Oceń właściwości mechaniczne asembloidu.
1. Użyj specjalnie zaprojektowanego urządzenia do rozciągania, aby przyłożyć siły mechaniczne i zmierzyć właściwości mechaniczne²². Kołki ustalające ze stali nierdzewnej i ze stali nierdzewnej sprawiają, że zaciski można przymocować również do innych urządzeń rozciągających.
2. Ponieważ właściwości mechaniczne eksplantatu są w dużej mierze determinowane przez właściwości osadzonego eksplantatu rdzenia ¹⁸, zmierz właściwości mechaniczne eksplantatu rdzenia przed zatopieniem go w hydrożelu, aby zmniejszyć ryzyko zniszczenia świeżo odlanego hydrożelu w procesie pomiaru.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Izolacja komponentu (Rysunek 1 i Rysunek 2)
Przed wykorzystaniem eksplantatów rdzeniowych i populacji komórek w kokulturze asembloidowej, składniki te należy sprawdzić pod mikroskopem (Rysunek 1). Eksplantaty rdzeniowe powinny mieć jednolitą średnicę (100-200 μm) i nie mieć widocznych załamań ani zmarszczek. Komórki śródbłonka powinny mieć wydłużony kształt w kontakcie z innymi komórkami, czego nie mają, gdy są wysiewane w zbyt niskiej gęstości ze względu na niską początkową wydajność izolacji. W tym przypadku komórki śródbłonka przybierają bardziej okrągły kształt z rozszerzeniami cytoszkieletu i proliferują znacznie wolniej. Podziel je 1:5 po 7-10 dniach. Fibroblasty ścięgien wyizolowane ze ścięgien Achillesa przyjmują bardziej okrągłą morfologię w porównaniu z ich ludzkimi odpowiednikami w ciągu 1-2 pasaży (10-14 dni każdy), gdy zostały podzielone 1:6. Makrofagi są znacznie mniejsze niż fibroblasty czy komórki śródbłonka i nie namnażają się po izolacji. W zależności od partii ich kształt może wahać się od piramidalnego do okrągłego.

Fenotypy składników komórkowych zostały zweryfikowane za pomocą cytometrii przepływowej. Sprzężone przeciwciało CD31 zastosowano jako marker komórek śródbłonka (Figura 2A). Ustalając próg fluorescencji na podstawie niebarwionej próbki kontrolnej (szarej), 90,1% komórek śródbłonka pasażu 1 (P1) i 48,7% komórek śródbłonka pasażu 2 (P2) zidentyfikowano jako CD31-dodatnie. Do scharakteryzowania fibroblastów ścięgien użyto genetycznie zmodyfikowanej linii myszy z koekspresją markera fibroblastów ścięgien Scleraxis wraz z zielonym białkiem fluorescencyjnym (ScxGFP) i sprzężonym przeciwciałem CD146 (Rysunek 2B) < sup class = "xref" >35^,⁶⁰. Po jednym pasażu (P1) 37,3% fibroblastów było ScxGFP⁺CD146^-, 0,2% było ScxGFP⁺CD146⁺, 4,3% było ScxGFP-CD146⁺, a 58% było ScxGFP-CD146^-. Po dwóch pasażach (P2) odsetek komórek ScxGFP⁺CD146^- zmniejszył się do 27,6%, ^{odsetek komórek} ScxGFP⁺CD146+ wzrósł do 6,9%, ^{odsetek komórek} ScxGFP-CD146+ wzrósł do 10,6%, a odsetek komórek ScxGFP-CD146^- spadł do 54,9%. Aby zidentyfikować i scharakteryzować makrofagi, zastosowano przeciwciało F4 / 80 w połączeniu z przeciwciałami CD86 i CD206 (Figura 2C). Po izolacji i hodowli 96,4% komórek pochodzących ze szpiku kostnego było F4/80-dodatnich. Wśród tych komórek F4 / 80-dodatnich 8,6% to CD206 ⁺ CD86^-, 23,6% to CD206 ⁺ CD86 ⁺, 28,3% to CD206-CD86 ⁺, a 39,4% to CD206-CD86^-. Szybkość sieciowania kolagenu może się różnić w zależności od partii i należy ją przetestować przed rozpoczęciem eksperymentów.

Assembloid appearance (Rysunek 3)
W warunkach hodowli podobnych do zmian chorobowych (36 °C, 20% O₂) eksplant rdzenia pozostał mechanicznie rozciągliwy, nie zmienił wyglądu i nadal był wizualnie odróżnialny i fizycznie oddzielany od otaczającego hydrożelu przez co najmniej 21 dni (Rysunek 3A,B). Otaczający hydrożel był z czasem zagęszczany, a prędkość zagęszczania zależała od populacji komórek w nim zasianych. Fibroblasty wywodzące się ze ścięgna Achillesa kurczyły się najszybciej otaczający je hydrożel i robiły to promieniowo, gdy znajdowały się w hydrożelu odlewanym wokół eksplantatu rdzenia i we wszystkich kierunkach, gdy nie (Rysunek 3B, C). Początkowo bezkomórkowe hydrożele umieszczone wokół rdzenia eksplantatu również się zagęszczały. Skurcz ten był prawdopodobnie spowodowany migracją komórek z eksplantatu rdzenia, co wskazuje na dynamiczny interfejs międzyprzedziałowy. Ponieważ bezkomórkowe hydrożele bez wbudowanego eksplantatu rdzeniowego nie zagęszczały się wykrywalnie, udział skurczu wywołanego utratą wody wydaje się być znikomy (Rysunek 3B i plik uzupełniający 6).

Brak zagęszczenia hydrożelu może być zatem wykorzystany do wykrywania błędów w montażu assembloidu (np. niskie stężenia komórek) i powinien być sprawdzony przed kontynuowaniem droższych metod odczytu. Podczas opracowywania tej metody częstymi błędami zmniejszającymi stężenie komórek były obumieranie komórek w zewnętrznym hydrożelu, ponieważ pozostawiono je zbyt długo w stosunkowo ostrym roztworze sieciującym (wysokie pH, niska temperatura) oraz suszenie eksplantatów rdzeniowych, ponieważ czas między aspiracją pożywki a wstrzyknięciem hydrożelu był zbyt długi lub dlatego, że eksplant rdzenia był zaciśnięty zbyt wysoko, aby mógł zostać osadzony w kolagenie.

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna: Analiza żywotności i morfologii (Rysunek 3)
Po wyjęciu z zacisków za pomocą nożyczek (Rysunek 3B), asembloidy można utrwalić, wybarwić i zobrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego jako całości bez dzielenia na sekcje. W tym przypadku rdzeń // komórka śródbłonka, rdzeń // makrofagi i rdzeń // asembloidy fibroblastów zostały wybarwione DAPI (NucBlue) i Ethidium Homodimer (EthD-1) w celu analizy żywotności oraz DAPI i F-aktyny w celu analizy morfologii i rozprzestrzeniania się komórek w hydrożelu kolagenowym 3D (Rysunek 3D). Żywotność assembloidów komórek śródbłonka (Rysunek 3E) została określona ilościowo i stwierdzono, że jest ogólnie niższa po złożeniu assembloidu niż wcześniej zgłaszano dla rdzenia // makrofagów i rdzenia // fibroblastów assembloids⁸⁴. Jednak żywotność pozostawała stabilna podczas hodowli asembloidów co najmniej do 7 dnia.

Mikrouszkodzenia indukowane mechanicznie i pomiar właściwości mechanicznych (Rysunek 4)
i kołki przymocowane do uchwytów zaciskowych umożliwiają mocowanie zaciśniętych zespołów do jednoosiowych urządzeń rozciągających. Zastosowane tutaj urządzenie do rozciągania wykonane na zamówienie jest wyposażone w ogniwo obciążnikowe 10 N i zostało opisane w poprzednich publikacjach (Rysunek 4A)²². Wszystkie próbki zostały wstępnie kondycjonowane pięcioma cyklami rozciągania do 1% odkształcenia przed pomiarami.

Zapis pełnej krzywej naprężenie-odkształcenie rdzenia eksplantatów lub asembloidów (Rysunek 4B) pozwoliłoby na ilościowe określenie liniowego modułu sprężystości (α), maksymalnego naprężenia (β) i maksymalnego odkształcenia (у). Jednak nieodwracalnie uszkadza również rdzeń eksplantat lub asembloid, co uniemożliwia ocenę podłużnego rozwoju maksymalnego naprężenia (β) i maksymalnego odkształcenia (у) dla tych samych próbek (Rysunek 4B). W tym przypadku liniowy moduł sprężystości został użyty jako miara zdolności próbki do wytrzymywania sił, ponieważ pomiar ten wymaga rozciągnięcia próbki do zaledwie 2% odkształcenia, co jak wykazano wcześniej, nie powoduje trwałego zmniejszenia liniowego modułu sprężystości ¹⁸. W szczególności zespoły komórek rdzeniowych // śródbłonka poddano procedurze zaciskania na 2% odkształcenia (w przybliżeniu koniec liniowego obszaru elastycznego) lub 6% odkształcenia (w przybliżeniu maksymalne odkształcenie). Powstałe mikrouszkodzenia oceniono, mierząc liniowy moduł sprężystości przed i po zabiegu (Rysunek 4C).

Zgodnie z poprzednio przeprowadzonymi eksperymentami wykorzystującymi monokulturowe eksplantaty rdzeniowe, zespoły komórek rdzeniowych // rdzeniowych zachowywały swój liniowy moduł sprężystości przez co najmniej 14 dni, gdy były hodowane w niszowych warunkach quasi-homeostatycznych (29 °C, 3% O₂) i wystawione na szczepy nie wyższe niż 2%¹⁸^,²¹. Jeśli chodzi o mechaniczną stymulację podstawową, rozciąganie statyczne stosowane przez zaciski wydawało się wystarczająco naśladować natywne poziomy naprężeń doświadczane przez jednostki rdzenia ścięgien in vivo, aby zapobiec procesom katabolicznym ogólnie związanym z odciążaniem matrycy⁸⁷. Rzeczywiście, postępujący i statystycznie istotny spadek liniowego modułu sprężystości obserwowany w zespołach komórek rdzenia // śródbłonka narażonych na 6% odkształcenie można przypisać rozładowaniu matrycy wynikającemu z mechanicznie indukowanego mikrouszkodzenia matrycy.

Podczas przeprowadzania tych eksperymentów ważne jest, aby zapobiec wysuszeniu asembloidu. W tym przypadku zostały one zamknięte w autoklawie i zwilżonym papierze, ale inne metody mogą być również opłacalne w zależności od ich kompatybilności z zastosowanym urządzeniem do rozciągania. Ponieważ tarcie między metalowymi zaciskami a eksplantatem rdzenia jest ograniczone, dodaj małe kawałki papieru między metal a eksplantat rdzenia podczas zaciskania, aby zapobiec poślizgowi i ściśle monitorować proces rozciągania, aby wykryć i wykluczyć poślizgnięte eksplantaty rdzenia i asembloidy.

Analiza transkryptomu specyficznego dla przedziału i sekretomu specyficznego dla asembloidu (Rysunek 5 i Rysunek 6)
W pierwszym zestawie podstawowych eksperymentów monokulturowych przedstawionych tutaj, stabilność ekspresji genów rdzeniowych po izolacji eksplantatów została oceniona w celu oddzielenia izolacji od efektów eksperymentalnych (Rysunek 5A). Chociaż do precyzyjnych wniosków niezbędna jest wyższa liczba powtórzeń, ekspresja Vegfa i Mmps znacznie wzrosła w świeżo wyizolowanych eksplantatach rdzeniowych w ciągu kilku godzin po izolacji eksplantatu, gdy były hodowane w niszowych warunkach przypominających zmiany chorobowe (37 °C, 20%_O2).

Neowaskularyzacja jest główną cechą charakterystyczną chorób i naprawy ścięgien, która może być częściowo napędzana przez komórki śródbłonka aktywowane przez czynniki pro-angiogenne (tj. czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, Vegfa) wydzielane przez rdzeń ścięgna w warunkach niedotlenienia⁸⁸. Badając pierwszy etap tego potencjalnego przesłuchu (Figura 5B), stwierdzono, że ekspresja zarówno Vegfa, jak i markera hipoksji anhydrazy węglanowej 9 (Ca9) jest statystycznie istotna u eksplantatów monohodowanych przy niskim ciśnieniu tlenu (3% O₂) w przeciwieństwie do tych monokulturowanych pod wysokim ciśnieniem tlenu (20% O₂). Tymczasem niższe ciśnienie tlenu nie wydaje się powodować zmian w ekspresji markerów fibroblastów ścięgien, takich jak twardówka (Scx) i kolagen-1 (Col1a1). Łącznie wyniki te identyfikują komórki rezydujące w rdzeniu jako prawdopodobne czynniki przyczyniające się do sygnalizacji pro-angiogennej w niszy niedotlenionej.

Następnie, aktywacja komórek śródbłonka przez pro-angiogenną sygnalizację rdzeniową została oceniona w kokulturze asembloidów komórek śródbłonka w rdzeniu // pod wysokim (20% O₂) i niskim (3% O₂) ciśnieniem tlenu. Na szczęście modułowy skład asembloidów umożliwia specyficzną dla przedziałów analizę transkryptomu po hodowli poprzez fizyczne oddzielenie eksplantatu rdzenia od zewnętrznego hydrożelu kolagenowego (Figura 6A). W rdzeniu eksplantatu (Ryc. 6D) ponownie potwierdzono, że ekspresja Vegfa wzrasta przy niskim ciśnieniu tlenu, chociaż wpływ na inne markery hipoksji, takie jak Fgf2, był mniej wyraźny i wymaga większej liczby powtórzeń w celu uzyskania precyzyjnych wniosków. Ponadto ekspresja markerów prozapalnych, takich jak Tnf-α i markerów degradacji macierzy zewnątrzkomórkowej, takich jak Mmp3, była zmniejszona w rdzeniu przy niskim ciśnieniu tlenu. W zewnętrznym hydrożelu początkowo wysianym komórkami śródbłonka (Ryc. 6E), obecność żywego eksplantatu rdzeniowego (aC) zmniejszała ekspresję Vegfa przy niskim ciśnieniu tlenu, ale nie przy wysokim ciśnieniu tlenu. Ponadto obecność zdewitalizowanego (dC) eksplantatu rdzeniowego przy niskim ciśnieniu tlenu również nie zmniejszyła ekspresji Vegfa. Przy niskim ciśnieniu tlenu ekspresja Tnf-α w zewnętrznym hydrożelu była porównywalna w okolicach aC/dC, ale wzrastała przy wysokim ciśnieniu tlenu wokół żywych eksplantatów rdzeniowych. Ekspresja Fgf2 była zmniejszona we wszystkich warunkach w porównaniu z zewnętrznym hydrożelem obciążonym komórkami śródbłonka hodowanym wokół zdewitalizowanego eksplantatu rdzeniowego pod wysokim ciśnieniem tlenu, ale większość pod niskim napięciem tlenu. Ekspresja Mmp3 była najwyższa wokół żywych eksplantatów rdzeniowych przy wysokim ciśnieniu tlenu, a najniższa wokół zdewitalizowanych eksplantatów rdzeniowych przy niskim napięciu tlenu. Ogólnie rzecz biorąc, współhodowane komórki śródbłonka wydają się reagować zarówno na aktywny eksplantat rdzenia, który jest zdolny do inicjowania przesłuchów, jak i zmian poziomu tlenu. Bardziej kompleksowa analiza transkryptomu ułatwiłaby wyjaśnienie ich wkładu.

Modułowość systemu assembloid pozwala na integrację genetycznie zmodyfikowanych komórek zawierających fluorescencyjne geny reporterowe. W tym przypadku komórki śródbłonka wyizolowane z myszy MG Pdgfb-iCreER ⁸⁹ zostały wysiane do komory hydrożelowej. Komórki te wykazują współekspresję markera komórek śródbłonka podjednostki b (Pdgfb) pochodzącego z płytek krwi wraz ze wzmocnionym białkiem zielonej fluorescencji (EGFP), co sprawia, że komórki śródbłonka wyrażające Pdgfb wydają się zielone pod mikroskopem (Figura 6C). Stosując tę metodę, potwierdzono, że obecność komórek śródbłonka wykazujących ekspresję Pdgfb utrzymuje się przez 7 dni w hodowli (37 °C) i wydaje się być niezależna od ciśnienia tlenu (20%_O2 w porównaniu do 3%_O2).

Aby przeanalizować sekretom asembloidów, pożywka hodowlana używana odpowiednio do hodowli rdzenia // bezkomórkowego i rdzeniowego // fibroblastu, rdzenia // makrofagów lub rdzenia // kohodowli komórek śródbłonka została zastąpiona swoim odpowiednikiem bez surowicy na trzy dni przed aspiracją i zamrożeniem supernatantu teraz wzbogaconego o sekretom (Rysunek 6A). Ten czas wzbogacania był wystarczający do wykrycia cytokin, takich jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyń krwionośnych (VEGF) za pomocą testu MSD, jak pokazano tutaj dla eksplantatów rdzeniowych i asembloidów fibroblastów rdzeniowych // hodowlanych w niszowych warunkach podobnych do zmian chorobowych (Figura 6B).

Ważne kwestie do rozważenia podczas analizy sekretomów i transkryptomów głównych eksplantatów i asembloidów dotyczą użycia odpowiednich kontroli. Świeżo wyizolowane eksplantaty rdzeniowe mają ograniczoną wartość, ponieważ zwłaszcza ich ekspresja Vegfa i Mmps znacznie wzrasta w ciągu kilku godzin po izolacji (Rysunek 5A). Dopasowane w czasie eksplantaty otoczone początkowo bezkomórkowym hydrożelem są bardziej odpowiednie jako kontrola ekspresji genów w rdzeniu przedziału. W przypadku hydrożelu zewnętrznego, hydrożele obciążone komórkami hodowane bez eksplantatu rdzenia są gorszą kontrolą w porównaniu z hydrożelami obciążonymi komórkami hodowanymi wokół zdewitalizowanych eksplantatów rdzeniowych (plik uzupełniający 7), głównie dlatego, że zagęszczają się w okrągłe kształty zamiast wydłużonych hydrożeli, co znacznie zmienia morfologię komórki (Rysunek 3A).

figure-results-1
Rysunek 1: Izolacja i montaż komponentów Assembloid do modelowania przesłuchów in vivo. Eksplantaty rdzenia ścięgien zostały wyekstrahowane z ogonów myszy, przecięte i zaciśnięte. Mięśnie nóg myszy (tj. mięsień czworogłowy uda (QF), mięsień brzuchaty łydki (G) i piszczel przedni (TA)) zostały strawione w celu wyizolowania komórek śródbłonka, które następnie hodowano na plastiku do hodowli tkankowej. Ścięgna Achillesa (AT) zostały również strawione w celu wyizolowania fibroblastów ścięgien, które następnie wyhodowano na plastikowej hodowli tkankowej. Szpik kostny z kości piszczelowej i kości udowej został wypłukany z kości. Następnie wyizolowane monocyty hodowano na plastiku z kulturą tkankową i różnicowano w naiwne makrofagi. Obrazy z mikroskopii świetlnej (10x) przedstawiają wygląd eksplantatów rdzeniowych, komórek śródbłonka, fibroblastów ścięgien i makrofagów bezpośrednio przed ich integracją w assembloidy. Podczas składania komórki hodowane na plastiku umieszczono w zawiesinie, a następnie wysiewano do roztworu kolagenu-1 (1,6 mg/ml). Następnie mieszaninę komórkowo-hydrożelową odlewano wokół zaciśniętego eksplantatu rdzeniowego i polimeryzowano przez 50 minut w temperaturze 37 °C przed dodaniem pożywki hodowlanej. Warunki hodowli kontrolowano za pomocą zacisków (naprężenie mechaniczne) i ustawień inkubatora (stężenie tlenu, temperatura). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Charakterystyka komórkowych komponentów asembloidu. (A) Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływu komórek śródbłonka pochodzących z mięśni po jednym pasażu (P1, górny rząd) i dwóch przejściach (P2, dolny rząd). Liczba komórek niebarwionych (szarych) i barwionych CD31 (zielonych) została znormalizowana do modalu. Wartości procentowe podano dla grupy barwionej CD31. (B) Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływowa fibroblastów pochodzących ze ścięgna Achillesa po jednym pasażu (P1, górny rząd) i dwóch pasażach (P2, dolny rząd). Osie informują o intensywności fluorescencji komórek niebarwionych (szarych) i komórek zarówno wyrażających ScxGFP, jak i barwionych przeciwciałami CD146 (kolory tęczy). (C) Reprezentatywna analiza cytometryczna przepływowa makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego po hodowli. W górnym rzędzie liczba komórek niebarwionych (szarych) i barwionych F4/80 (zielonych) została znormalizowana do modalnego. Wartości procentowe podano dla grupy barwionej F4/80. Wykres w dolnym wierszu przedstawia intensywność fluorescencji niebarwionych komórek (szary) i podzbioru F4/80⁺ komórek barwionych przeciwciałami CD206 i przeciwciałami CD86 (kolory tęczy). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Obrazowanie i wygląd asembloidu. (A) Reprezentatywne fotografie wykonane w dniu 0 (d0) i dniu 21 (d21) hodowli (37 °C, 20% O₂) pokazują wielowymiarowe skurczenie hydrożelu zawierającego zewnętrzne fibroblasty bez osadzonego eksplantatu rdzenia i silne promieniste zagęszczenie hydrożelu zawierającego zewnętrzne fibroblasty wokół rdzenia eksplantatu. (B) Reprezentatywne fotografie wykonane w 21 dniu (d21) hodowli (37 °C, 20% O₂) pokazują różnice w prędkości zagęszczania między bezkomórkowymi hydrożelami, bezkomórkowymi hydrożelami odlewanymi wokół eksplantatu rdzeniowego i hydrożelami zawierającymi fibroblasty ścięgna odlane wokół eksplantatu rdzeniowego. (C) Reprezentatywne obrazy mikroskopii świetlnej (10x) wykonane w dniu 0 (d0) i dniu 21 (d21) hodowli (37 °C, 20% O₂) wskazują na zmiany podłużne w obecności populacji komórek i prędkości zagęszczania hydrożelu kolagenowego (HG) wokół eksplantatu rdzenia (E) w kokulturze asembloidu fibroblastów / / bezkomórkowych i rdzeniowych // . Schematyczne przedstawienie przedstawia różnice w zagęszczeniu hydrożelu między kokulturą asembloidów rdzeniowych // bezkomórkowych a kokulturą asembloidów fibroblastów // rdzeniowych. (D) Reprezentatywne obrazy mikroskopii konfokalnej wykonane w dniu 7 (d7) komórki rdzenia // śródbłonka, rdzenia // makrofagów i rdzenia // koasembloidu fibroblastów (37 °C, 20 % O₂). Obrazy w lewym rzędzie przedstawiają asembloidy z jądrami komórkowymi zabarwionymi na niebiesko (DAPI) i martwymi komórkami zabarwionymi na różowo (Ethidium homodimer-1). Pozostałe dwa rzędy przedstawiają asembloidy z jądrami komórkowymi zabarwionymi na niebiesko (DAPI) i włóknami aktynowymi na zielono (F-aktyna). (E) Wykresy pudełkowe przedstawiające ilościową żywotność zespołów komórek śródbłonka w dniu 1 (d1) i dniu 7 (d7) kohodowli. N = 5. Górny i dolny zawias odpowiadają pierwszemu i trzeciemu kwartylowi⁽²⁵^{. i} 75. percentyl), a środkowy – medianie. Wąsy rozciągają się od górnego/dolnego zawiasu do największej/najmniejszej wartości nie dalej niż 1,5-krotność przedziału międzykwartylowego. Wartości P: ^n.s.p > 0,05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Mechaniczna stymulacja asembloidów i pomiar właściwości mechanicznych assembloidów. (A) Graficzne przedstawienie wykonanego na zamówienie urządzenia rozciągającego, składającego się z platform uchwytów zaciskowych, czujnika siły i silnika krokowego. Na zdjęciu fotograficznym widać asembloid zamontowany do urządzenia rozciągającego za pomocą zacisków. Pokrywka plastikowej probówki o pojemności 15 ml (Ø: 17 mm) używana do skalowania. (B) Wykres przedstawiający reprezentatywne krzywe naprężeń/odkształceń dla eksplantatów rdzeniowych (jasnoniebieski) i asembloidów (jasnoczerwony). Liniowy moduł sprężystości (α), maksymalne naprężenie (β) i maksymalne odkształcenie (у) można wyodrębnić z danych, aby mechanicznie scharakteryzować eksplantat lub asembloid rdzenia. (C) Wykres przedstawiający liniowy moduł sprężystości (Emod) zespołów komórek śródbłonka // współhodowanych (29 °C, 3%_O2) w ciągu 14 dni po zaciśnięciu (linia ciągła), zaciśnięciu i rozciągnięciu do 2% odkształcenia L₀ (linia przerywana) lub zaciśnięciu i rozciągnięciu do 6% szczepu L₀(linia przerywana) na początku eksperymentu. N = 5. Punkty danych zostały znormalizowane do początkowego liniowego modułu sprężystości przed rozciąganiem i wszystkie są wyświetlane jako średnia (±sem). Wartości P: *p < 0,05, **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Zmiany w transkryptomie rdzenia po izolacji i hodowli w różnych warunkach niszowych. (A) Wykres rozrzutu przedstawiający zmiany fałdowania w ekspresji genów Vegfa, Mmp13 i Mmp3 w monokulturowych (37 °C, 20% O₂) mysich eksplantatach po 2 godzinach, 4 godzinach, 6 godzinach i 8 godzinach po wyizolowaniu ich od ogona. Zmiany fałdowania w odpowiednich punktach czasowych znormalizowano do ekspresji genu 2 godziny po izolacji. N = 2. (B) Wykresy pudełkowe przedstawiające zmiany fałdowania ekspresji genów Ca9, Vegfa, Scx i Col1a1 w eksplantatach rdzeniowych monohodowanych przy niskim ciśnieniu tlenu (3%_O2) znormalizowane i porównane z monokulturami przy wysokim ciśnieniu tlenu (20%_O2). N = 5-6. Górne i dolne zawiasy wykresów skrzynkowych odpowiadają pierwszemu i trzeciemu kwartylowi⁽²⁵^{. i} 75. percentylowi), a środkowy medianie. Wąsy rozciągają się od górnego/dolnego zawiasu do największej/najmniejszej wartości nie dalej niż 1,5-krotność przedziału międzykwartylowego. Punkty danych używane do normalizacji są przedstawiane jako czarne kropki, a poszczególne punkty danych jako czerwone kropki. Wartości P: **p < 0,01, ***p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rysunek 6: Analiza sekretomu specyficznego dla asembloidu i transkryptomu specyficznego dla kompartmentu. (A) Reprezentatywne zdjęcie przedstawiające asembloid w dniu 7 (d7), kiedy pobrano próbki sekretomu i transkryptomu, oraz przedstawienie podstawowego przepływu pracy. (B) Stężenie VEGF (pg/ml) w supernatancie asembloidów rdzeniowych // bezkomórkowych i rdzeniowych // fibroblastów po 7 dniach kohodowli (37 °C, 20%_O2) przedstawionych jako wykresy pudełkowe. N = 6. (C) Reprezentatywne obrazy z mikroskopii konfokalnej zespołów komórek rdzenia // śródbłonka po 7 dniach wspólnej hodowli (37 °C) przy wysokim ciśnieniu tlenu (20% O₂) i niskim ciśnieniu tlenu (3% O_{2 ).} Jądra komórkowe są barwione na niebiesko (DAPI), a osadzone komórki śródbłonka wykazują współekspresję wzmocnionego białka zielonej fluorescencji (EGFP) wraz z markerem komórek śródbłonka podjednostką b czynnika wzrostu pochodzącego z płytek krwi (Pdgfb). Przerywana linia wskazuje interfejs kompartmentowy między eksplantatem rdzenia (E) a hydrożelem obciążonym komórkami śródbłonka (HG). (D) Wykres rozrzutu przedstawiający zmiany fałdowania ekspresji genów Vegfa, Tnf-α, Fgf2 i Mmp3 w przedziale rdzenia z asembloidów komórek rdzenia // śródbłonka współhodowanych w warunkach niskiego ciśnienia tlenu (3% O₂) znormalizowanych i porównanych z tymi hodowanymi pod wysokim ciśnieniem tlenu (20% O₂). N = 2. (E) Wykres rozrzutu przedstawiający zmiany fałdowania ekspresji genów Vegfa, Tnf-α, Fgf2 i Mmp3 w zewnętrznym przedziale zespołów komórek rdzenia // śródbłonka z żywym rdzeniem (aC) lub zdewitalizowanym rdzeniem (dC) współhodowanym w warunkach wysokiego ciśnienia tlenu (20% O₂) i niskiego ciśnienia tlenu (3% O₂). Zmiany fałdowania w odpowiednich warunkach znormalizowano do zewnętrznego przedziału rdzenia // zespołu komórek śródbłonka ze zdewitalizowanym rdzeniem (dC) współhodowanym pod wysokim napięciem tlenu (20%_O2). N = 3-4. W B górne i dolne zawiasy wykresów skrzynkowych odpowiadają pierwszemu i trzeciemu kwartylowi⁽²⁵^{. i} 75. percentyl), a środkowy – medianie. Wąsy rozciągają się od górnego / dolnego zawiasu do największej / najmniejszej wartości nie dalej niż 1,5 razy przedziału międzykwartylowego. Wartości odstające są przedstawiane jako czarne kropki. Wartości P: *p < 0,05. W D i E punkty danych używane do normalizacji są przedstawiane jako czarne kropki, a poszczególne punkty danych są przedstawiane jako czerwone kropki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Wymagania wejściowe dla systemów modelowania chorób ścięgien i urazów. Lista pierwotnych czynników wywołujących choroby ścięgien i czynników drugorzędnych dopasowanych do wybranych parametrów wejściowych, których wykonalność ma kluczowe znaczenie dla modelowania chorób i urazów ścięgien. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Wymagania wyjściowe dla systemów modeli chorób ścięgien i urazów. Wybór cech charakterystycznych chorób ścięgien dopasowanych do wybranych parametrów wyjściowych, których kwantyfikacja ma kluczowe znaczenie dla interpretacji choroby ścięgien i zachowania modelu urazów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Plik uzupełniający 1: plik .stl dla uchwytów zacisków, stacji montażowej i form komory. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Plan prawego uchwytu zacisku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 3: Plan lewego uchwytu zacisku. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 4: Plan platformy montażowej Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 5: Plan zacisków metalowych. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 6: Obraz przedstawiający skurcz hydrożelu bez komórek. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 7: Obraz przedstawiający zdewitalizowany rdzeń eksplantacji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ogólnie rzecz biorąc, przedstawiony tutaj system modeli assembloid ma kilka krytycznych kroków, na które należy zwrócić uwagę. Po pierwsze, system modelowy jest tylko tak dobry, jak jakość jego komponentów. Bardzo ważne jest, aby przed rozpoczęciem procesu składania sprawdzić rdzeń eksplantatu i populacje komórek, które mają zostać wysiane, pod mikroskopem. Równie ważne jest przynajmniej jednokrotne zweryfikowanie fenotypu izolowanych populacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Zwłaszcza, gdy nowa partia kolagenu-1 jest używana po raz pierwszy, korzystne jest sprawdzenie szybkości sieciowania w próbnym przebiegu przed osadzeniem w nim komórek. Montaż assembloid wymaga dużo ręcznej obsługi, co zwiększa ryzyko infekcji. Aby zminimalizować ryzyko infekcji, pracuj w sterylnym kapturze bezpieczeństwa biologicznego z laminarnym przepływem powietrza, często wymieniaj rękawice i odkażaj rękawice oraz przestrzeń roboczą za pomocą 80% etanolu. Z podobnych powodów nie używaj wydrukowanych w 3D uchwytów zaciskowych więcej niż raz. Przed samym procesem zatapiania ważne jest, aby wszystkie składniki hydrożelu (roztwór sieciujący, roztwór kolagenu-1) znajdowały się na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu sieciowaniu. W związku z tym należy działać szybko po dodaniu komórek do roztworu sieciującego, aby ograniczyć śmierć komórek z powodu wysokiego pH i niskiej temperatury roztworu sieciującego. Aby zapobiec śmierci komórek związanej z wysuszeniem w eksplantacie rdzenia, należy zassać pożywkę pokrywającą zaciśnięte eksplantaty rdzenia bezpośrednio przed zmieszaniem roztworu sieciującego z roztworem kolagenu-1. Aby zagwarantować centralne umieszczenie eksplantatu rdzenia w hydrożelu, idealnie jest odlewać hydrożel wokół zaciśniętego eksplantatu rdzeniowego, który jest lekko napięty. W tym celu użyj kołka ustalającego i śrubowej M3 x 16 mm, aby przymocować clamp uchwyty do (wydrukowanej w 3D) płytki z otworami o odpowiednich długościach. Po 50-minutowym czasie polimeryzacji osadzony eksplant rdzeniowy może być ponownie naprężony w zależności od pożądanych warunków hodowli. Stopień napięcia, jakiego doświadcza asembloid podczas hodowli, ma głęboki wpływ na wyniki eksperymentów i musi być jednolity we wszystkich próbkach i warunkach²¹.

Niemniej jednak duży wpływ obciążenia mechanicznego (roz)obciążenia na wyniki eksperymentalne jest główną przewagą modelu assembloidowego nad większością alternatyw inżynierii tkankowej, zwłaszcza że zachowany skład matrycy eksplantatu rdzenia powinien również odtwarzać złożone wzorce obciążenia in vivo na poziomie komórkowym⁹⁰. Podczas gdy w praktyce do tej pory wykazano jedynie pomiar liniowego modułu sprężystości sprężystości, maksymalnego odkształcenia przy rozciąganiu i maksymalnego naprężenia rozciągającego asembloidów, protokoły pomiarów wytrzymałości zmęczeniowej i relaksacji naprężeń zostały opisane dla eksplantatów rdzeni ścięgien w innym miejscu i powinny mieć zastosowanie do zespołów ^91,92. Oprócz wzorców obciążenia podobnych do in vivo, prawdopodobnie największą zaletą asembloida jest jego wielopoziomowa modułowość. Dzięki indywidualnym komorom hodowlanym można ustawić kontrolowany zestaw warunków niszowych dla każdej próbki z osobna (tj. temperatura, ciśnienie tlenu, stężenie glukozy, suplementacja, stymulatory, inhibitory i rozciąganie statyczne za pomocą płytki). Następnie, sztywność matrycy i skład matrycy przedziału zewnętrznego można dostosować za pomocą kompozycji hydrożelowej i pozwoliłoby to na przykład na badanie wpływu coraz bardziej chorego mikrośrodowiska tkanek poprzez włączenie większej ilości kolagenu-3 i fibronektyny komórkowej 93,94,95. Oceniane populacje komórek w przedziale zewnętrznym można łatwo dostosować, wybierając komórki do wysiewu, ale można je również modyfikować w eksplantacie rdzenia ścięgna, wykorzystując ustalone genetycznie zmodyfikowane linie komórkowe i linie myszy (tj. Zubożenie komórek ScxLin)⁹⁶. Różny skład matrycy i komórek dwóch przedziałów zapewnia unikalną strukturę 3D z przedziałami, która jest kolejną centralną cechą charakterystyczną ścięgna ^1,30,46.

Podczas korzystania z tego systemu ważne jest, aby wziąć pod uwagę konsekwencje modułowości systemu dla szczegółowości parametrów wynikowych. Podczas gdy proliferację i rekrutację komórek można ocenić osobno dla każdego przedziału, właściwości mechaniczne, składniki sekretomu i produkty degradacji są obecnie mierzalne tylko dla całego asembloidu. Jeśli chodzi o przepustowość, jedna odpowiednio przeszkolona osoba może przygotować do 50 zespołów w ciągu zwykłego dnia pracy, przy czym głównym wąskim gardłem jest procedura zaciskania. Chociaż niektóre metody odczytu wzajemnie się wykluczają, możliwa jest powtarzalna ocena właściwości mechanicznych i składników sekretomu na tej samej próbce, a także składu populacji komórek (cytometria przepływowa), transkryptomu komórkowego (RT-qPCR, sekwencjonowanie RNA) lub matrycy i dystrybucji komórek (immunocytochemia/mikroskopia fluorescencyjna) w punktach końcowych. W poprzednich publikacjach metody te zostały zastosowane w celu obszernego scharakteryzowania interakcji międzykomórkowych, międzyprzedziałowych w zespołach rdzeniowych // fibroblastów i rdzeni // makrofagów wystawionych na niszę podobną do zmiany^84,85. W niniejszej pracy zbadano zdolność systemu modelu assembloidowego do badania wzajemnych oddziaływań międzyprzedziałowych między komórkami śródbłonka rdzenia i zewnętrznymi pod wpływem różnych bodźców mikrośrodowiskowych.

Modułowość systemu modelu pozwala na przyszłe udoskonalanie metody, co jest niezbędne do przezwyciężenia następujących ograniczeń obecnej iteracji projektu. Analiza cytometrii przepływowej przedstawiona w tej pracy oraz opublikowane niedawno dane z sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek wykazały, że tenocyty rezydujące w rdzeniu ścięgna i populacje pochodzące ze ścięgna Achillesa są bardziej niejednorodne niż wcześniej zakładano 24,34,59,84,97. Ponadto zachowania migracyjne populacji komórek początkowo zamieszkałych w rdzeniu lub hydrożelu zacierają podział assembloidów podczas hodowli. Oba czynniki razem sprawiają, że trudno jest przypisać różnice transkryptomiczne określonym typom komórek i oddzielić procesy proliferacji od procesów opartych na migracji. Ograniczenie to można przezwyciężyć poprzez udoskonalenie populacji wejściowej za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS) w oparciu o skład komórkowy zdrowych lub chorych ścięgien scharakteryzowanych w ostatnich badaniach in vivo, poprawę odczytu poprzez wdrożenie sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki i integrację markerów proliferacji, takich jak barwienie EdU (5-etynylo-2'-deoksyurydyna) podczas mikroskopii.

Przedstawione tu asembloidy mają również wspólną słabość z większością obecnie dostępnych systemów in vitro, które symulują chore narządy odłączone od reszty ciała^98,99. Jednak zastosowana tutaj platforma oparta na komorze hodowlanej dobrze pozycjonuje system modelowy do integracji z platformą wielonarządową, w której połączone są asembloidy naśladujące różne narządy i można badać interakcje międzynarządowe.

W swojej istocie system modelowy opiera się na pozycyjnych ścięgnach gryzoni, co skutkuje unikalnym zestawem wad. Po pierwsze, przekładalność wyników jest utrudniona przez myszy typu dzikiego, które nie rozwijają się lub nie cierpią na choroby ścięgien ^8,100,101. Integracja tkanek i komórek pochodzących od ludzi lub nowo opracowanych szczepów myszy, które wykazują aspekty choroby ścięgien, może złagodzić ten problem¹⁰². Przejście w kierunku asembloidu opartego na człowieku jest szczególnie interesujące, ponieważ umożliwiłoby badania na tkankach pochodzących od pacjentów z różnie chorych ścięgien (tj. zapalenie ścięgien, ścięgien lub zapalenie okołościęgnistych), a nawet dawców opornych na leczenie, które mogłyby odblokować bardziej spersonalizowane programy leczenia. Po drugie, eksplantaty ścięgien mysiego ogona nie radzą sobie szczególnie dobrze z mikrouszkodzeniami wywołanymi przeciążeniem, co ogranicza możliwość zastosowania systemu modelowego do badania ostrych uszkodzeń ścięgien.

Z tych wszystkich powodów asembloidy eksplantatywne // hydrożelowe są w doskonałej pozycji do badania biologii rdzenia ścięgna, interakcji struktura-funkcja macierzy oraz interakcji międzyprzedziałowych między określonymi populacjami komórek w odpowiedzi na mikrouszkodzenia wywołane przez niszę. Wnioski zebrane z tych dość wysokoprzepustowych badań mogą nadać kierunek badaniom in vivo i rozwojowi leczenia.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez ETH Grant 1-005733

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Igła iniekcyjna 0,4 mm x 25 mm (G27)	Sterican	9186174
: Przezroczysty prusament z kwasu polimlekowego	Prusa	NA
4% formaldehyd	Roti-Histofix	P087.4
Roztwór do odrywania komórek Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML
Amfoterycyna	VWR	L0009-100
Dołączana cyfrowa kamera z mocowaniem C: Moticam 2	Motic	NA
Śruba śrubowa M3 x 16 mm, stal nierdzewna	RS Pro	1871235
Śruba śrubowa M3 x 6 mm, stal nierdzewna	RS Pro	1871207
CaCl2	Sigma-Aldrich	C5670
CD146 przeciwciało: PE anty-mysie	BioLegend	134703
Przeciwciało CD206: Alexa Przeciwciało anty-mysie Fluor 488	BioLegend	141709
CD31: Alexa Fluor 488 anty-mysie	BioLegend	102413
Przeciwciało CD86: PE anty-mysie	BioLegend	105007
Collagenase I	Thermo Fisher Scientific	17100017
Kolagenaza IV	Gibco	17104-019
Dializowana płodowa surowica bydlęca (FBS)	Sigma-Aldrich	F0392-100ML
Dimetylosulfotlenek (DMSO)	Sigma-Aldrich	7000183
Dypaza II	Sigma-Aldrich	D4693-1G
DMEM/F12	Sigma	7002211
Kołek ustalający, 3 mm x 16 mm, stal nierdzewna	Accu	HDP-3-16-A1
Dragon Skin 10 Slow/1 silikon	KauPO	09301-004-000001
Zestaw Endopan 3	Pan-Biotech	P04-0010K
Suplement na wzrost komórek śródbłonka	Lonza	CC-3162
Plastikowe probówki Eppendorf safe-lock (1,5 ml)	Eppendorf	30121023
homodimer Ethidium, EthD-1, 2 mM zapas w DMSO	Sigma-Aldrich	46043-1MG-F
F4/80 przeciwciało: Apc/fire 750 anty-mysie	BioLegend	123151
Falcon plastikowa tuba (15 ml)	Corning	352096
Falcon plastik probówka (50 ml)	Corning	352070
Cytometr przepływowy: LSR II Fortessa	BD Bioscience	23-11617-02
Żelatyna	Invitrogen	D12054
Hellmanex III alkaliczny koncentrat czyszczący	Sigma	Z805939-1EA
Heparyna	Sigma-Aldrich	H3149-10KU
Test hydroksyproliny	Sigma-Aldrich	MAK008
Oprogramowanie do analizy obrazu: Motic Images Plus 3.0 ML	Motic	NA
Kwas L-askorbinowy Fosforan Sól magnezu n-hydrat	Wako Chemicals	013-19641
LSE Low Speed Orbital Shaker	Corning	6780-FP
MEM endogenne aminokwasy	Sigma	7002231
Mysi czynnik stymulujący makrofagi ( m-CSF)	PeproTech	315-02-50ug
Test MSD	Mezoscale Discovery	różne
NucBlue	Thermo Fisher Scientific	R37605
Nasadka sitka z siatki nylonowej, 100 i mikro; m	Corning	734-2761
Oryginalna drukarka 3D Prusa i3 MK3S	Prusa	i3 MK3S
Penicylina-Streptomycyna	Sigma-Aldrich	P4333
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4, sterylna, 10 L	Gibco	10010001
Puromycin	Gibco	A1113803
Bufor do lizy RBC	VWR	786-650
rekombinowany m-CSF	PeproTech	315-02
: Rneasy plus Micro	Qiagen	74034
Oprogramowanie do krojenia: PrusaSlicer	Prusa		NA wersja 2.6.0 lub nowsza
Sterylne Filtry Komórkowe 100 µ	m Fisherbrand	22363549
Ostrze skalpela chirurgicznego nr 21	Swann-Morton	307
Odczynnik	Trizol Thermo Fisher Scientific	15596018
Trypsin-EDTA (0,5 %)	Gibco	15400054

Filament do druku 3D Zestaw do ekstrakcji RNA

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair - A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomaterialia. 63, 18-36 (2017).
Wang, J. H. C. Mechanobiology of tendon. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1563-1582 (2006).
Kirkendall, D. T., Garrett, W. E. Function and biomechanics of tendons. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports. 7 (2), 62-66 (1997).
Götmark, F., Cafaro, P., O'Sullivan, J. Aging human populations: Good for us, good for the earth. Trends in Ecology and Evolution. 33 (11), 851-862 (2018).
Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clinics in Sports Medicine. 22 (4), 675-692 (2003).
Renström, P. A. F. H., Woo, S. L. -Y. Tendinopathy: A major medical problem in sport. Tendinopathy in Athletes. , (2007).
Screen, H. R. C., Birk, D. E., Kadler, K. E., Ramirez, F., Young, M. Tendon functional extracellular matrix. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 793-799 (2016).
Wunderli, S. L., Blache, U., Snedeker, J. G., Wunderli, S. L., Blache, U., Tendon, J. G. S. Tendon explant models for physiologically relevant in vitro study of tissue biology - a perspective. Connective Tissue Research. 61 (3-4), 262-277 (2020).
Magnusson, S. P., Langberg, H., Kjaer, M. The pathogenesis of tendinopathy: balancing the response to loading. Nature Reviews Rheumatology. 6 (5), 262-268 (2010).
Heinemeier, K. M., Schjerling, P., Øhlenschlæger, T. F., Eismark, C., Olsen, J., Kjær, M. Carbon-14 bomb pulse dating shows that tendinopathy is preceded by years of abnormally high collagen turnover. FASEB Journal. 32 (9), 4763-4775 (2018).
Andersson, G., Backman, L. J., Scott, A., Lorentzon, R., Forsgren, S., Danielson, P. Substance P accelerates hypercellularity and angiogenesis in tendon tissue and enhances paratendinitis in response to Achilles tendon overuse in a tendinopathy model. British Journal of Sports Medicine. 45 (13), 1017-1022 (2011).
Rolf, C. G., Fu, B. S. C., Pau, A., Wang, W., Chan, B. Increased cell proliferation and associated expression of PDGFRβ causing hypercellularity in patellar tendinosis. Rheumatology. 40 (3), 256-261 (2001).
Riley, G. The pathogenesis of tendinopathy. A molecular perspective. Rheumatology. 43 (2), 131-142 (2004).
Jarvinen, M., Jozsa, L., Kannus, P., Järvinen, T. L., Kvist, M., Leadbetter, W. Histopathological findings in chronic tendon disorders. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 7 (2), 86-95 (1997).
Soslowsky, L. J., et al. Overuse activity injures the supraspinatus tendon in an animal model: A histologic and biomechanical study. Journal of Shoulder and Elbow Surgery. 9 (2), 79-84 (2000).
Tran, P. H. T., et al. Early development of tendinopathy in humans: Sequence of pathological changes in structure and tissue turnover signaling. FASEB Journal. 34 (1), 776-788 (2020).
Theodossiou, S. K., Schiele, N. R. Models of tendon development and injury. BMC Biomedical Engineering. 1 (1), 1-24 (2019).
Stauber, T., Blache, U., Snedeker, J. G. Tendon tissue microdamage and the limits of intrinsic repair. Matrix Biology. 85-86, 68-79 (2020).
Wang, T., et al. In vitro loading models for tendon mechanobiology. Journal of Orthopaedic Research. 36 (2), 566-575 (2018).
Fang, F., Sawhney, A. S., Lake, S. P. Different regions of bovine deep digital flexor tendon exhibit distinct elastic, but not viscous, mechanical properties under both compression and shear loading. Journal of Biomechanics. 47 (12), 2869-2877 (2014).
Wunderli, S. L., et al. Tendon response to matrix unloading is determined by the patho-physiological niche. Matrix Biology. 89, 11-26 (2020).
Wunderli, S. L., et al. Minimal mechanical load and tissue culture conditions preserve native cell phenotype and morphology in tendon - A novel ex vivo mouse explant model. Journal of Orthopaedic Research. 36 (5), 1383-1390 (2017).
Arnoczky, S. P., Lavagnino, M., Egerbacher, M., Caballero, O., Gardner, K. Matrix metalloproteinase inhibitors prevent a decrease in the mechanical properties of stress-deprived tendons. The American Journal of Sports Medicine. 35 (5), 763-769 (2007).
de Micheli, A. J., et al. Single-cell transcriptomic analysis identifies extensive heterogeneity in the cellular composition of mouse Achilles tendons. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 319 (5), C885-C894 (2020).
Arvind, V., Huang, A. H. Reparative and maladaptive inflammation in tendon healing. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9 (July), 1-16 (2021).
Marsolais, D., Côté, C. H., Frenette, J. Neutrophils and macrophages accumulate sequentially following Achilles tendon injury. Journal of Orthopaedic Research. 19 (6), 1203-1209 (2001).
Garcia-Melchor, E., et al. Novel self-amplificatory loop between T cells and tenocytes as a driver of chronicity in tendon disease. Annals of the Rheumatic Diseases. 80 (8), 1075-1085 (2021).
Stolk, M., Klatte-Schulz, F., Schmock, A., Minkwitz, S., Wildemann, B., Seifert, M. New insights into tenocyte-immune cell interplay in an in vitro model of inflammation. Scientific Reports. 7 (1), 9801(2017).
Tempfer, H., Traweger, A. Tendon vasculature in health and disease. Frontiers in Physiology. 6, 330(2015).
Mienaltowski, M. J., Adams, S. M., Birk, D. E. Regional differences in stem cell/progenitor cell populations from the mouse achilles tendon. Tissue Engineering - Part A. 19 (1-2), 199-210 (2013).
Sakabe, T., et al. Transcription factor scleraxis vitally contributes to progenitor lineage direction in wound healing of adult tendon in mice. Journal of Biological Chemistry. 293, (2018).
Dyment, N. A., Hagiwara, Y., Matthews, B. G., Li, Y., Kalajzic, I., Rowe, D. W. Lineage tracing of resident tendon progenitor cells during growth and natural healing. PLoS One. 9 (4), e96113(2014).
Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. M. A Tppp3 + Pdgfra + tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
Zhang, J., et al. Characterization of the structure, vascularity, and stem/progenitor cell populations in porcine Achilles tendon (PAT). Cell and Tissue Research. 384 (2), 367-387 (2021).
Tarafder, S., et al. Tendon stem/progenitor cells regulate inflammation in tendon healing via JNK and STAT3 signaling. FASEB Journal. 31 (9), 3991-3998 (2017).
Lee, C. H., et al. Harnessing endogenous stem/progenitor cells for tendon regeneration Find the latest version Harnessing endogenous stem/progenitor cells for tendon regeneration. J Clin Invest. 125 (7), 2690-2701 (2015).
Lui, P. P. Y., Chan, L. S., Cheuk, Y. C., Lee, Y. W., Chan, K. M. Expression of bone morphogenetic protein-2 in the chondrogenic and ossifying sites of calcific tendinopathy and traumatic tendon injury rat models. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 4, 27(2009).
Takeuchi, E., et al. Localization and expression of osteopontin in the rotator cuff tendons in patients with calcifying tendinitis. Virchows Archiv. 438 (6), 612-617 (2001).
Kadler, K. E., Hill, A., Canty-Laird, E. G. Collagen fibrillogenesis: fibronectin, integrins, and minor collagens as organizers and nucleators. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 495-501 (2008).
Millar, N. L., et al. MicroRNA29a regulates IL-33-mediated tissue remodelling in tendon disease. Nature Communications. 6, 6774(2015).
Riley, G. P., Harrall, R. L., Constant, C. R., Chard, M. D., Cawston, T. E., Hazleman, B. L. Tendon degeneration and chronic shoulder pain: changes in the collagen composition of the human rotator cuff tendons in rotator cuff tendinitis. Annals of the Rheumatic Diseases. 53 (6), 359-366 (1994).
Thorpe, C. T., Peffers, M. J., Simpson, D., Halliwell, E., Screen, H. R. C., Clegg, P. D. Anatomical heterogeneity of tendon: Fascicular and interfascicular tendon compartments have distinct proteomic composition. Scientific Reports. 6, 20455(2016).
Thorpe, C. T., et al. Distribution of proteins within different compartments of tendon varies according to tendon type. Journal of Anatomy. 229 (3), 450-458 (2016).
Choi, H., et al. Heterogeneity of proteome dynamics between connective tissue phases of adult Tendon. eLife. 9, e55262(2020).
Spiesz, E. M., et al. Tendon extracellular matrix damage, degradation and inflammation in response to in vitro overload exercise. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 889-897 (2015).
Dyment, N. A., et al. The paratenon contributes to scleraxis-expressing cells during patellar tendon healing. PLoS One. 8 (3), e59944(2013).
Cadby, J. A., Buehler, E., Godbout, C., Van Weeren, P. R., Snedeker, J. G. Differences between the cell populations from the peritenon and the tendon core with regard to their potential implication in tendon repair. PLoS One. 9 (3), e92474(2014).
Huh, D., Hamilton, G. A., Ingber, D. E. From three-dimensional cell culture to organs-on-chips. Trends in Cell Biology. 21 (12), 745-754 (2011).
Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology. 32 (4), 266(2017).
Wang, J. H. C. Mechanobiology of tendon. Journal of Biomechanics. 39 (9), 1563-1582 (2006).
Derwin, K. A., Soslowsky, L. J. A quantitative investigation of structure-function relationships in a tendon fascicle model. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (6), 598-604 (1999).
Herod, T. W., Veres, S. P. Development of overuse tendinopathy: A new descriptive model for the initiation of tendon damage during cyclic loading. Journal of Orthopaedic Research. 36 (1), 467-476 (2017).
Andersen, M. B., Pingel, J., Kjær, M., Langberg, H. Interleukin-6: A growth factor stimulating collagen synthesis in human tendon. Journal of Applied Physiology. 110 (6), 1549-1554 (2011).
Langberg, H., Rosendal, L., Kjær, M. Training-induced changes in peritendinous type I collagen turnover determined by microdialysis in humans. Journal of Physiology. 534 (1), 297-302 (2001).
Zitnay, J. L., et al. Molecular level detection and localization of mechanical damage in collagen enabled by collagen hybridizing peptides. Nature Communications. 8, 14913(2017).
Hwang, J., et al. Molecular assessment of collagen denaturation in decellularized tissues using a collagen hybridizing peptide. Acta Biomaterialia. 53, 268-278 (2016).
Lin, A. H., Zitnay, J. L., Li, Y., Yu, S. M., Weiss, J. A. Microplate assay for denatured collagen using collagen hybridizing peptides. Journal of Orthopaedic Research. 37 (2), 431-438 (2019).
Blomgran, P., Blomgran, R., Ernerudh, J., Aspenberg, P. A possible link between loading, inflammation and healing: Immune cell populations during tendon healing in the rat. Scientific Reports. 6, 29824(2016).
Harvey, T., Flamenco, S., Fan, C. -M. A Tppp3+Pdgfra+ tendon stem cell population contributes to regeneration and reveals a shared role for PDGF signalling in regeneration and fibrosis. Nature Cell Biology. 21 (12), 1490-1503 (2019).
Pryce, B. A., Brent, A. E., Murchison, N. D., Tabin, C. J., Schweitzer, R. Generation of transgenic tendon reporters, ScxGFP and ScxAP, using regulatory elements of the scleraxis gene. Developmental Dynamics. 236 (6), 1677-1682 (2007).
Godinho, M. S. C., Thorpe, C. T., Greenwald, S. E., Screen, H. R. C. Elastin is localised to the interfascicular matrix of energy storing tendons and becomes increasingly disorganised with ageing. Scientific Reports. 7 (1), 9713(2017).
Smith, M. M., et al. Modulation of aggrecan and ADAMTS expression in ovine tendinopathy induced by altered strain. Arthritis and Rheumatism. 58 (4), 1055-1066 (2008).
Asundi, K. R., Rempel, D. M. MMP-1, IL-1β, and COX-2 mRNA expression is modulated by static load in rabbit flexor tendons. Annals of Biomedical Engineering. 36 (2), 237-243 (2008).
Millar, N. L., et al. Inflammation is present in early human tendinopathy. American Journal of Sports Medicine. 38 (10), 2085-2091 (2010).
Dakin, S. G., et al. Inflammation activation and resolution in human tendon disease. Science Translational Medicine. 7 (311), 311ra173(2015).
Jelinsky, S. A., Rodeo, S. A., Li, J., Gulotta, L. V., Archambault, J. M., Seeherman, H. J. Regulation of gene expression in human tendinopathy. BMC Musculoskeletal Disorders. 12, 86(2011).
Kannus, P., Józsa, L. Histopathological changes preceding spontaneous rupture of a tendon. A controlled study of 891 patients. The Journal of Bone and Joint Surgery. American. 73 (10), 1507-1525 (1991).
Comin, J., et al. The prevalence and clinical significance of sonographic tendon abnormalities in asymptomatic ballet dancers: A 24-month longitudinal study. British Journal of Sports Medicine. 47 (2), 89-92 (2013).
Schubert, T. E. O., Weidler, C., Lerch, K., Hofstädter, F., Straub, R. H. Achilles tendinosis is associated with sprouting of substance P positive nerve fibres. Annals of the Rheumatic Diseases. 64 (7), 1083-1086 (2005).
Quigley, A. S., Bancelin, S., Deska-Gauthier, D., Légaré, F., Kreplak, L., Veres, S. P. In tendons, differing physiological requirements lead to functionally distinct nanostructures. Scientific Reports. 8 (1), 4409(2018).
Herod, T. W., Chambers, N. C., Veres, S. P. Collagen fibrils in functionally distinct tendons have differing structural responses to tendon rupture and fatigue loading. Acta Biomaterialia. 42, 296-307 (2016).
Shepherd, J. H., Riley, G. P., Screen, H. R. C. Early stage fatigue damage occurs in bovine tendon fascicles in the absence of changes in mechanics at either the gross or micro-structural level. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 38, 163-172 (2014).
Birch, H. L. Tendon matrix composition and turnover in relation to functional requirements. International Journal of Experimental Pathology. 88 (4), 241-248 (2007).
Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Archives of Medical Science. 14 (4), 910-919 (2018).
Hussien, A. A., Niederoest, B., Bollhalder, M., Goedecke, N., Snedeker, J. G. The stiffness-sensitive transcriptome of human tendon stromal cells. Advanced Healthcare Materials. 12 (7), 2101216(2023).
Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nature Biomedical Engineering. 7 (2), 177-191 (2023).
Liu, C. -F., Aschbacher-Smith, L., Barthelery, N. J., Dyment, N., Butler, D., Wylie, C. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: A developmental biology perspective. Tissue Engineering Part B: Reviews. 17 (3), 165-176 (2011).
Ruiz-Alonso, S., Lafuente-Merchan, M., Ciriza, J., Saenz-del-Burgo, L., Pedraz, J. L. Tendon tissue engineering: Cells, growth factors, scaffolds and production techniques. Journal of Controlled Release. 333, 448-486 (2021).
Rinoldi, C., et al. Tendon tissue engineering: Effects of mechanical and biochemical stimulation on stem cell alignment on cell-laden hydrogel yarns. Advanced Healthcare Materials. 8 (7), e1801218(2019).
Walia, B., Huang, A. H. Tendon stem progenitor cells: Understanding the biology to inform therapeutic strategies for tendon repair. Journal of Orthopaedic Research. 37 (6), 1270-1280 (2018).
Thorpe, C. T., Riley, G. P., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. Fascicles from energy-storing tendons show an age-specific response to cyclic fatigue loading. Journal of The Royal Society Interface. 11 (92), 20131058-20131058 (2014).
Thorpe, C. T., Riley, G. P., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. Fascicles and the interfascicular matrix show decreased fatigue life with ageing in energy storing tendons. Acta Biomaterialia. 56, 58-64 (2017).
Youngstrom, D. W., Rajpar, I., Kaplan, D. L., Barrett, J. G. A bioreactor system for in vitro tendon differentiation and tendon tissue engineering. Journal of Orthopaedic Research. 33 (6), 911-918 (2015).
Stauber, T., et al. Extrinsic macrophages protect while tendon progenitors degrade: Insights from a tissue engineered model of tendon compartmental crosstalk. Advanced Healthcare Materials. 10 (20), e2100741(2021).
Stauber, T., Moschini, G., Hussien, A. A., Jaeger, P. K., De Bock, K., Snedeker, J. G. IL-6 signaling exacerbates hallmarks of chronic tendon disease by stimulating progenitor proliferation & migration to damage. eLife. 12, RP87092(2023).
Doillon, C. J., Mantovani, D., Rajan, N., Habermehl, J., Cote, M. Preparation of ready-to-use storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nature Protocols. 1 (6), 2753-2758 (2007).
Blache, U., et al. Inhibition of ERK 1/2 kinases prevents tendon matrix breakdown. Scientific Reports. 11 (1), 6838(2021).
Liu, X., et al. The role of vascular endothelial growth factor in tendon healing. Frontiers in Physiology. 12, 766080(2021).
Claxton, S., Kostourou, V., Jadeja, S., Chambon, P., Hodivala-dilke, K., Fruttiger, M. Efficient, inducible Cre-recombinase activation in vascular endothelium. Genesis. 46 (2), 74-80 (2008).
Passini, F. S., et al. Shear-stress sensing by PIEZO1 regulates tendon stiffness in rodents and influences jumping performance in humans. Nature Biomedical Engineering. 5 (12), 1457-1471 (2021).
Lee, A. H., Szczesny, S. E., Santare, M. H., Elliott, D. M. Investigating mechanisms of tendon damage by measuring multi-scale recovery following tensile loading. Acta Biomaterialia. 57, 363-372 (2017).
Lee, A. H., Elliott, D. M. Multi-scale loading and damage mechanisms of plantaris and rat tail tendons. Journal of Orthopaedic Research. 37 (8), 1827-1837 (2019).
Williams, I. F., Heaton, A., McCullagh, K. G. Cell morphology and collagen types in equine tendon scar. Research in Veterinary Science. 28 (3), 302-310 (1980).
Maffulli, N., Ewen, S. W. B., Waterston, S. W., Reaper, J., Barrass, V. Tenocytes from ruptured and tendinopathic achilles tendons produce greater quantities of type III collagen than tenocytes from normal achilles tendons: An in vitro model of human tendon healing. American Journal of Sports Medicine. 28 (4), 499-505 (2000).
Pajala, A., Melkko, J., Leppilahti, J., Ohtonen, P., Soini, Y., Risteli, J. Tenascin-C and type I and III collagen expression in total Achilles tendon rupture. An immunohistochemical study. Histology and Histopathology. 24 (10), 1207-1211 (2009).
Best, K. T., et al. Scleraxis-lineage cell depletion improves tendon healing and disrupts adult tendon homeostasis. eLife. 10, e62203(2021).
Lehner, C., et al. Tenophages: A novel macrophage-like tendon cell population expressing CX3CL1 and CX3CR1. DMM Disease Models and Mechanisms. 12 (12), dmm041384(2019).
Ajalik, R. E., et al. Human organ-on-a-chip microphysiological systems to model musculoskeletal pathologies and accelerate therapeutic discovery. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 846230(2022).
Ingber, D. E. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nature Reviews Genetics. 23 (8), 467-491 (2022).
Brehm, M. A., Shultz, L. D., Luban, J., Greiner, D. L. Overcoming current limitations in humanized mouse research. The Journal of Infectious Diseases. 208 Suppl (Suppl 2), 125-130 (2013).
Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Disease Models & Mechanisms. 7 (11), 1205-1213 (2014).
Costa-Almeida, R., Calejo, I., Reis, R. L., Gomes, M. E. Crosstalk between adipose stem cells and tendon cells reveals a temporal regulation of tenogenesis by matrix deposition and remodeling. Journal of Cellular Physiology. 233 (7), 5383-5395 (2018).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tendon Repair 3D Tendon Model Collagen Hydrogel Tendon Core Explants Fibroblast Isolation Macrophage Isolation Confocal Microscopy Gene Expression

Inżynieria asembloidów ścięgien do badania przesłuchów komórkowych w chorobach i naprawach

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły