Umożliwienie wysokoprzepustowych badań ekspresji transgenów z wykorzystaniem zautomatyzowanej obsługi cieczy dla etiolowanych protoplastów liści kukurydzy

Summary

Ten protokół opisuje tworzenie losowego układu transfekcji przy użyciu automatycznego urządzenia do obsługi cieczy, protokołu izolacji protoplastów dla etiolowanych liści kukurydzy oraz procedury transfekcji 96-dołkowej przy użyciu płynu.

Abstract

Dziedzina biotechnologii roślin była świadkiem niezwykłego postępu w ostatnich latach, rewolucjonizując możliwość manipulowania i inżynierii roślin do różnych celów. Jednak w miarę jak badania w tej dziedzinie stają się coraz bardziej zróżnicowane i coraz bardziej wyrafinowane, coraz bardziej widoczna jest potrzeba wczesnych, skutecznych, niezawodnych i wysokowydajnych rozwiązań w zakresie badań przesiewowych w celu zawężenia strategii prowadzących do stabilnej transformacji. Jedną z metod, która pojawiła się ponownie w ostatnich latach, jest wykorzystanie protoplastów roślinnych, dla których metody izolacji i transfekcji są dostępne w wielu gatunkach, tkankach i stadiach rozwojowych. W pracy opisano prosty zautomatyzowany protokół randomizowanego przygotowania plazmidu na 96-dołkowej płytce, metodę izolacji etiolowanego protoplastu liści kukurydzy oraz zautomatyzowaną procedurę transfekcji. Zastosowanie zautomatyzowanych rozwiązań w biotechnologii roślin, czego przykładem są te nowatorskie protokoły postępowania z cieczami do transfekcji protoplastów roślinnych, stanowi znaczący postęp w porównaniu z metodami ręcznymi. Wykorzystując automatyzację, naukowcy mogą łatwo przezwyciężyć ograniczenia tradycyjnych metod, zwiększyć wydajność i przyspieszyć postęp naukowy.

Introduction

Transfekcja protoplastów roślinnych, wprowadzanie obcego materiału genetycznego do komórek roślinnych pozbawionych ścian komórkowych, jest kluczową techniką i w ciągu ostatniego półwiecza objęła wiele gatunków wspierających badania nad biotechnologią roślin. Jednak stosowanie tych metod może być bolesne i mieć ograniczony zakres, nawet przy milionach protoplastów wytwarzanych na izolację. Tradycyjne metody transfekcji protoplastów roślinnych są często pracochłonne, czasochłonne, podatne na zmienność i wymagające technicznie, co prowadzi do powstania niszowych systemów o niskiej odtwarzalności¹. Jednak potencjał, jaki w ostatnich latach przyniosły zautomatyzowane rozwiązania, rzuca światło na możliwość tchnięcia nowego życia w tę 60-letnią technikę^2,3. Dzięki możliwości automatyzacji kluczowych, ale powtarzalnych etapów, takich jak przygotowanie materiału, inkubacja glikolu polietylenowego (PEG) i późniejsze dozowanie odczynnika do transfekcji, naukowcy mogą znacznie zmniejszyć wymagania dotyczące fizycznej obsługi i inne potencjalne źródła błędów ludzkich⁴. Ponadto precyzyjna kontrola i jednorodność oferowana przez zautomatyzowane systemy obsługi cieczy zapewnia spójne i powtarzalne wyniki transfekcji.

Podczas gdy izolacja protoplastów to drobiazgowy proces, który obejmuje siekanie, trawienie, inkubację, filtrację i wirowanie, część transfekcyjna tych protokołów jest dostosowana do potrzeb automatycznych urządzeń do obsługi cieczy. Procedura dla większości protokołów transfekcji protoplastów jest zapośredniczona przez PEG, a mieszanie wyizolowanego protoplastu w obecności PEG i oczyszczonego plazmidowego DNA przez określony czas w precyzyjnym stężeniu (zależnym od gatunku i tkanki) pozwala tym komórkom na pobranie plazmidowego DNA⁵. Po tej transfekcji następuje seria etapów mycia, których kulminacją jest nocna inkubacja⁶. Po okresie inkubacji, jeśli wszystko zostało prawidłowo zaprojektowane i dostarczone, eksperyment skutkuje wyrażeniem interesującego składnika i/lub potencjału oceny różnych składników regulacyjnych⁷. Wszystkie etapy aspiracji, dozowania i mieszania/mieszania związane z tą procedurą są zwykle obsługiwane przez pipetę ręczną. Ręczne wykonywanie takiego protokołu, pojedyncza reakcja na raz, jest pracochłonne i wprowadza niepotrzebne różnice między próbkami, jednocześnie ograniczając pojemność, którą można ocenić w danym momencie. Zautomatyzowane protokoły manipulacji komórkami ssaków lub owadów oraz syntezy chemicznej w przemyśle farmaceutycznym są stosowane w praktyce od kilku lat^4,8,9. Wykorzystanie protoplastów i protokoły obejmujące zautomatyzowaną obsługę cieczy w materiałach roślinnych są coraz powszechniejsze^10,11,12,13.

Przyjęcie protokołów automatycznego postępowania z cieczami do transfekcji protoplastów roślin jest bardzo obiecujące dla zastosowań badawczych. Naukowcy mogą eksplorować większe biblioteki genetyczne, w przyspieszonym tempie badać określone funkcje genów i bardziej kompleksowo badać złożone interakcje genetyczne związane ze stresem roślin¹⁴. Skalowalność zautomatyzowanych podejść wykorzystujących 96-dołkowe strąki w połączeniu z przesiewowymi badaniami fluorescencyjnymi umożliwia eksperymenty o wysokiej przepustowości i pozwala naukowcom szybko generować dane i spostrzeżenia, które mogą napędzać postęp w biotechnologii roślin¹¹. Jednak przy tym wzroście przepustowości, prowadzącym do generowania setek, jeśli nie tysięcy punktów danych, musi istnieć dodatkowa kontrola jakości, która uwzględnia wszelkie źródła błędów, które mogą zakłócać wyniki¹⁵. Jednym z elementów, który został zidentyfikowany jako czynnik przyczyniający się do tego w wielu dyscyplinach naukowych, jest efekt krawędzi. Niektóre strategie łagodzące zasugerują najlepszą płytę do użycia lub wypełnienie wodą przestrzeni między studniami lub najbardziej zewnętrznych studni, aby zwalczyć to zjawisko^16,17. Jednak te strategie wydłużają czas, a jeśli konkretny jednorazowy produkt jest niedostępny, jedyną opcją jest zapłacenie za mniej lub odroczenie. Alternatywnie, przyjrzenie się strategiom, które uwzględniają ten efekt za pomocą schematu blokowania, nie poświęca przepustowości ani opóźnień w wykonaniu.

Ten protokół etiolowanego protoplastu liści kukurydzy i jego dwie zautomatyzowane metody zilustrowane w Rysunek 1 ma na celu rozwiązanie problemu zmienności nieodłącznie związanej z eksperymentami z protoplastami poprzez automatyzację wielu części kanonicznej metody protoplastów, alokacji materiału plazmidowego do naczynia używanego do transfekcji oraz samej transfekcji. Metody te zademonstrowano dla etiolowanej platformy protoplastowej z liści kukurydzy, ponieważ jest to dobrze scharakteryzowana, prosta i wydajna platforma protoplastowa. Wszystkie kroki opisane w tym dokumencie są natychmiast dostępne dla protokołów transfekcji protoplastów, które wykorzystują podobne lub te same roztwory buforowe. Jednak przed przyjęciem tych technik należy zwrócić szczególną uwagę na unikalne cechy tkanek i gatunków źródłowych protoplastów. Te ulepszenia wynikające z automatyzacji upraszczają przygotowanie materiału do poszczególnych eksperymentów i znacznie poprawiają przepustowość, od sekwencyjnej transfekcji pojedynczo do 96 transfekcji obsługiwanych jednocześnie. Praca ta pokaże również uzasadnienie wykorzystania losowych niekompletnych bloków w celu uwzględnienia odchylenia pozycyjnego płyty.

Protocol

1. Tworzenie płyty transfekcyjnej

1. Tworzenie układu talii: Aby utworzyć metodę randomizacji płytki DNA, otwórz oprogramowanie do obsługi płynów. Kliknij przycisk Nowa metoda na pasku menu, aby utworzyć nową metodę. Dodaj linię ustawień instrumentu między liniami startu i mety, naciskając przycisk ustawień instrumentu na lewym panelu.
   UWAGA: Odpowiednie zrzuty ekranu, które następują wraz z tym automatycznym protokołem, można znaleźć na Rysunku Uzupełniającym 1, Rysunku Uzupełniającym 2 i Rysunku Uzupełniającym 3.
2. Kliknij linię Instrument Setup (Ustawienia instrumentów), znajdź odpowiednie przybory laboratoryjne w menu kategorii Sprzęt laboratoryjny i przeciągnij je na układ pokładu, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 1.
   UWAGA: Jeśli sprzęt laboratoryjny nie jest wcześniej zdefiniowany, będzie musiał zostać zaprogramowany w urządzeniu do obsługi cieczy zgodnie ze specyfikacją producenta, ale takie instrukcje wykraczają poza zakres tego protokołu.
3. Przenieś z ustawień pliku: Naciśnij przycisk Przenieś z pliku na paletach kroków i umieść wiersz Przenieś z pliku poniżej linii ustawień instrumentu. Upewnij się, że wybór i wymiana końcówki są takie, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 3.
4. Sprawdź, czy plik ma wiersz nagłówka i upewnij się, że informacje o kolumnie są poprawne.
5. Naciśnij obszar źródłowy, aby go aktywować i kliknij płytkę źródłową w układzie pokładu, zdefiniuj płytkę docelową i wprowadź ilość DNA do pipetowania.
6. Naciśnij przycisk Dostosuj, aby szczegółowo zdefiniować technikę pipetowania, np. dotknąć końcówki na ściance.
7. Określ ilość plazmidowego DNA do przeniesienia. W protokole tym wykorzystuje się 20 μl plazmidowego DNA o stężeniu 1 μg/μl na transfekcję (studzienkę).
   UWAGA: ilość plazmidowego DNA, która jest przenoszona na płytkę transfekcyjną przed transfekcją protoplastów, będzie zależeć od użytej platformy protoplastowej.
8. Utwórz plik z pliku .csv dokumentu.
   1. Ten dokument składa się z dwóch kolumn. Przygotować pierwszą kolumnę, tj. kolumnę Od, która wskazuje położenie podstawowego plazmidowego DNA w stojaku na probówki, tj. dla próbki 1; to byłoby dobrze A01. Ponieważ ten transfer odbywa się trzy razy (trzy powtórzenia), trzy wiersze powinny oznaczać A01 w kolumnie Od.
   2. Przygotuj drugą kolumnę, tj. Kolumnę Do, używaną do określenia dołka docelowego konstruktu plazmidu na 96-dołkowej płytce. Na przykład próbka 1 (A01) może być B02, D04 i H07. Zapisz go jako plik .csv, aby był kompatybilny z oprogramowaniem do obsługi cieczy.
9. Przed uruchomieniem protokołu sprawdź, czy pozycje pokładu są załadowane, sprzęt laboratoryjny jest poprawnie zdefiniowany, dokument randomizacji zawiera lokalizacje studni dla wszystkich próbek DNA w stojaku na probówki oraz czy w probówkach jest wystarczająca ilość próbki plazmidu do wykonania protokołu.
10. Rozwiń menu Właściwości pliku w kroku Transfer From File (Przenieś z pliku), wybierz .csv utworzony plik i uruchom protokół.
11. Przykryj płytki transfekcyjne uszczelką z folii aluminiowej, gdy protokół zostanie pomyślnie zakończony. Płytki transfekcyjne należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu przygotowania do użycia. Wyizolowany etiolowany protoplast liści kukurydzy zostanie dodany do tej płytki transfekcyjnej w kroku 3.3.

2. Izolacja protoplastów z liści kukurydzy w etiolowanej

1. Aby rozpocząć izolację etiolowanego protoplastu liści kukurydzy, należy uzyskać tło genetyczne kompatybilne z protoplastami, takie jak NP222, które zostało użyte tutaj¹⁸. Przed rozpoczęciem doświadczenia należy przygotować tylko 3, a mianowicie MMg, W5 i WI, wymienione w Tabeli 1 i utrzymywać w temperaturze 4 °C. Aby uzyskać najlepsze wyniki, należy przygotować roztwór mineralizujący i PEG w dniu eksperymentu.
2. Wysterylizuj powierzchniowo 25 nasion, zanurzając je najpierw w 25% komercyjnym roztworze wybielacza i potrząsając nimi na wytrząsarce na platformie obrotowej przez około 15 do 20 minut w temperaturze pokojowej.
3. Po wymieszaniu dokładnie opłucz nasiona sterylną wodą (DI). Powtórz krok płukania 5 razy. Nasiona należy spożywać przez noc w sterylnej wodzie o temperaturze pokojowej.
4. Następnego dnia wysiewaj nasiona na wilgotnej, autoklawowanej glebie. Dodaj suche granulki gliny, aby odprowadzić nadmiar wilgoci z gleby, aby zapobiec zanieczyszczeniu grzybami.
5. Sadzonki kukurydzy należy uprawiać w 16-godzinnej komorze wzrostu w temperaturze 28 °C (wilgotność względna (RH)) 30%) przez około 3 dni, aż chrząszcz znajdzie się 1-2 cm nad glebą, a następnie przenieść do ciemnej komory o tej samej temperaturze i wilgotności względnej przez dodatkowe 5 - 7 dni.
6. Zbierz pierwszą prawdziwą tkankę liścia, przecinając ją tuż nad pierwszym kołnierzem.
7. Powierzchnię wysterylizuj krótko tkankę liścia w 25% komercyjnym wybielaczu i 250 μl 20% roztworu Tween 20 przez 1 min. Dokładnie spłucz materiał liścia 5x wodą DI.
8. Osusz (delikatnie) tkankę liścia kukurydzy niestrzępiącymi się chusteczkami i za pomocą ostrego ostrza usuń ~1,5 cm zarówno z czubka, jak i podstawy każdej blaszki liściowej.
9. Pozostałą tkankę liścia pokrój w wąskie (0,5 mm - 1 mm) poprzeczne paski i umieść na szalce Petriego o wymiarach 100 x 25 mm.
10. Przefiltrować i wysterylizować 25 ml roztworu wytrawiającego przez filtr strzykawkowy 0,22 μm bezpośrednio na szalkę Petriego zawierającą pokrojoną tkankę.
11. Infiltrować próżniowo tkankę liścia roztworem trawiącym, stosując próżnię przez 30 minut w temperaturze pokojowej w eksykatorze próżniowym pod ciśnieniem około -75 mbar.
    UWAGA: Podciśnienie w domu dla wielu laboratoriów akademickich i prywatnych powinno być wystarczające do tego etapu.
12. Umieścić na wytrząsarce z platformą obrotową i wstrząsać w temperaturze 25 °C w ciemności przy 60 obr./min przez 2,5 do 3 godzin. Gdy do końca okresu mineralizacji pozostało 10 minut, zwiększ prędkość do 90 obr./min.
13. Wlać roztwór wytrawiający i wszelki niestrawiony materiał roślinny przez lejek na górze filtra sitowego 40 μm do probówki o pojemności 50 ml.
14. Odwirować roztwór wewnątrz probówki o pojemności 50 ml o sile 150 x g przez 4 minuty w celu osadzenia protoplastu. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 10 - 15 ml roztworu buforowego MMg.
15. Powtórzyć wirowanie i usunąć supernatant. Zawiesić w 5 - 10 ml świeżego buforu MMg.
16. Za pomocą hemocytometru dokładnie zmierz gęstość izolowanego protoplastu. Zawiesić do przybliżonej gęstości 5 x 10⁵ protoplastów na ml.
17. Pozostaw izolat do odpoczynku na lodzie przez ~30 minut przed transfekcją. W tym czasie przygotuj roztwór PEG. Całkowicie rozpuścić PEG w roztworze w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i pozostawić tam do transfekcji.

3. Zautomatyzowana transfekcja protoplastów

UWAGA: Kroki od 3.6 do 3.15 są całkowicie zarządzane przez automatyczną obsługę cieczy, z wyjątkiem dwóch przerw użytkownika w krokach 3.10 i 3.13, które wymagają ręcznego wirowania. Odpowiednie zrzuty ekranu, które następują wraz z tym automatycznym protokołem, można znaleźć w suplemencie, rysunku uzupełniającym 1, rysunku uzupełniającym 3, rysunku uzupełniającym 4 i rysunku uzupełniającym 5.

1. Przygotować układ pokładu urządzenia do obsługi cieczy do transfekcji zgodnie z metodą transfekcji protoplastów opisaną w poniższych krokach. Zmontuj następujące materiały: płytkę docelową (w tym przypadku byłaby to 96-dołkowa płytka z przezroczystą dolną mikropłytką do pomiaru fluorescencji), jedno pudełko z końcówkami automatycznymi o szerokim otworze 25 - 250 μl do etapu aspiracji PEG, pięć pudełek z końcówkami do automatyzacji pipet o pojemności 25 - 250 μl dla pozostałych etapów obsługi cieczy, trzy plastikowe koryta jako zbiorniki na odczynniki, jedna pusta płytka 96-dołkowa do zbierania odpadów, pozostałe roztwory buforowe do przetaczania, W5 i WI.
2. Bezpośrednio przed rozpoczęciem procedury transfekcji przesterylizuj roztwór PEG przez sterylny jednorazowy filtr próżniowy o wielkości 0,22 μm do świeżej probówki o pojemności 50 ml.
3. Z protoplastu zawieszonego w buforze MMg dodać 100 μl (około 50 000 protoplastów) do każdego dołka wstępnie przygotowanej, rozmrożonej płytki transfekcyjnej. W tym celu należy wlać roztwór buforowy zawierający protoplasty do sterylnego koryta o pojemności 10 ml i użyć pipety wielokanałowej. Kontynuuj delikatne mieszanie koryta, aby zapobiec osadzaniu się protoplastu w roztworze podczas tego ręcznego etapu przenoszenia.
4. Wlej roztwór PEG do odpowiedniego koryta i odłóż płytkę transfekcyjną, teraz zawierającą protoplast i plazmidowe DNA zawierającą płytkę transfekcyjną, przygotowaną przy użyciu kroku 1, w określonym miejscu zgodnie z układem pokładu.
5. Aby utworzyć metodę transfekcji protoplastów, otwórz oprogramowanie do obsługi cieczy i wykonaj czynności opisane poniżej.
   1. Przenoszenie przyborów laboratoryjnych między pokładami: Zastąp puste pudełko na napiwki na pokładzie załadowczym napiwków za pomocą polecenia Przenieś sprzęt laboratoryjny. Wybierz pokłady Od i Do w widoku Konfiguracja.
   2. W przypadku objętości większych niż 200 μl: Nie wymieniaj końcówek między transferami. Załaduj wskazówki dla pierwszego kroku transferu i rozładuj po ostatnim kroku przeładunku, co wymaga prawidłowego określenia opcji załadunku/rozładunku dla każdego kroku przeładunku, jak pokazano na rysunku uzupełniającym 3.
6. Tworzenie układu pokładu: Podobnie jak w przypadku metody tworzenia płytki transfekcyjnej, aby utworzyć metodę automatycznej transfekcji DNA, otwórz oprogramowanie do obsługi cieczy. Kliknij przycisk Nowa metoda na pasku menu, aby utworzyć nową metodę. Dodaj linię ustawień instrumentu między liniami startu i mety, naciskając przycisk ustawień instrumentu na lewym panelu. Utwórz układ pokładu zgodnie z układem pokładu pokazanym na rysunku uzupełniającym 1.
7. Mieszanie komórki/DNA: Dodaj krok, aby wymieszać protoplast i DNA przed dodaniem PEG za pomocą przycisku działania urządzenia i skonfigurowania urządzenia (potrząsanie automatycznym pozycjonerem laboratoryjnym lub ALP), prędkości wytrząsania (1500 obr./min) i czasu do wstrząsania (10 s).
8. Dodawanie i mieszanie PEG: Aby zainicjować transfekcję, dodaj krok przenoszenia, aby dodać 110 μl PEG ze zbiornika PEG za pomocą pipety z 96 saszetkami. Upewnij się, że prawidłowe pozycje źródłowe i docelowe są zaprogramowane zgodnie z określonym układem pokładu. Zaprogramować etap transferu tak, aby zassać PEG 1 mm od dna zbiornika i umieścić PEG 3 mm od podstawy 96-dołkowej płytki zawierającej mieszaninę protoplast/DNA. Dodaj kolejny krok potrząsania po dodaniu PEG, kopiując i wklejając wcześniej zaprogramowane kroki.
9. Inkubacja PEG: Dodaj krok pauzy, wybierając przycisk Pauza, wybierz shaker i wprowadź wcześniej określony czas inkubacji, który rozpoczyna się od dodania PEG.
   UWAGA: Licznik czasu pauzy będzie kontynuowany, chyba że wystąpią jakiekolwiek przerwy w działaniu kurtyny świetlnej lub zakłócenia, które skutkowałyby wyświetleniem komunikatu o błędzie. Upewnij się, że jeśli konieczna jest manipulacja talią, te wiadomości zostaną usunięte przed odejściem.
10. Dodawanie/mieszanie buforu W5: Dodać trzy linie transferu 200 μl, aby przenieść łącznie 600 μl buforu W5 na płytkę transfekcyjną w celu wygaszenia reakcji inkubacji PEG. Postępuj zgodnie z dodaniem buforu W5, potrząsając i robiąc przerwę przez użytkownika, aby umożliwić odwirowanie płytki transfekcyjnej.
11. Przerwa użytkownika 1: Odwirować płytkę transfekcyjną protoplastu przy 100 x g przez 4 min. Przywrócić płytkę transfekcyjną, teraz z granulowanym protoplastem, z powrotem do odpowiedniej pozycji pokładu. Dodaj pauzę użytkownika, klikając przycisk Wstrzymaj, z wyjątkiem teraz z wybraną opcją Wstrzymaj cały system i wyświetl wiadomość.
    UWAGA: Wyskakujące okienko komunikatu o wstrzymaniu musi zostać usunięte, zanim osoba zajmująca się obsługą płynów będzie kontynuować resztę protokołu.
12. Usuwanie supernatantu: Dodać dwie linie transferu, aby usunąć 400 μl supernatantu i przenieść na płytkę odpadową. Aby uniknąć zasysania komórek podczas usuwania supernatantu, należy ustawić odległość od dna na 6 mm.
13. Dodawanie/mieszanie WI Dodaj 3 linie transferu, aby przenieść 580 μl buforu WI na płytkę transfekcyjną. Dodaj kolejny krok potrząsania po dodaniu WI, kopiując i wklejając wcześniej zaprogramowane kroki. Przejdź do następnej pauzy użytkownika.
14. Przerwa użytkownika 2: Odwirować płytkę transfekcyjną protoplastu przy 100 x g przez 4 minuty. Przywrócić płytkę transfekcyjną, teraz z granulowanym protoplastem, z powrotem do odpowiedniej pozycji pokładu.
15. Usuwanie supernatantu: Dodać cztery linie transferu, aby usunąć 680 μl supernatantu i przenieść na płytkę odpadową. Aby uniknąć zasysania komórek podczas usuwania supernatantu, należy ustawić odległość od dna na 6 mm.
16. Przenoszenie protoplastów na mikropłytkę: Końcowy transfer tego protokołu składa się z dwóch etapów transferu o pojemności 150 μl. Przed każdym pojedynczym etapem należy kilkakrotnie zassać protoplasty w ilości 50 μl/s w odległości 2 mm od dna płytki transfekcyjnej i dozować w odległości 3 mm. Następnie, używając tych samych końcówek pipet, przenieś do docelowej mikropłytki.
    UWAGA: Zasysanie i dozowanie objętości buforu powyżej osadu przed przeniesieniem do mikropłytki zakłóci wszelkie pozostałe protoplasty osadzone na dnie płytki transfekcyjnej, aby upewnić się, że nie dojdzie do utraty próbki. Ponieważ randomizacja została przeprowadzona podczas tworzenia płytki transfekcyjnej, kończy to automatyczny protokół.
17. Inkubować mikropłytkę w temperaturze pokojowej w ciemności przez 24 do 48 godzin przed pierwszym pomiarem fluorescencji.

Results

Aby uzyskać dane obserwacyjne potwierdzające, że efekty krawędziowe mogą wpływać na pomiary odpowiedzi; przeprowadzono badanie pilotażowe, aby potwierdzić te podejrzenia. W tym badaniu powyższe metody zastosowano do trzech powtórzonych 96-dołkowych płytek z tylko jednym poziomem traktowania; wszystkie protoplasty transfekowano przy użyciu pSYN11250¹⁹, plazmidu, który konstytutywnie wyraża ZsGreen, w celu wykazania, że istnieją systematyczne różnice w poziomie odpowiedzi dla jednostek na krawędzi płytki w porównaniu z drugim rzędem i centralnymi obszarami płytki. 36 dołków na zewnętrznej krawędzi płyty jest zdefiniowanych jako blok 1, 28 dołków w drugim rzędzie od krawędzi jako blok 2, a środkowe 32 dołki jako blok 3 - patrz Rysunek 2A prawy dolny panel. Ten układ może pomieścić 28 poziomów leczenia jako losowy projekt pełnego bloku (RCBD) lub 32 poziomy leczenia jako losowy niekompletny projekt blokowy (RIBD). W Rysunek 2A, dla każdej repliki (powtórzenia), surowe punkty danych dla każdego dołka zostały znormalizowane przez średnią z odpowiedniej płytki. We wszystkich trzech powtórzeniach eksperymentu odpowiedzi na krawędzi płytki są średnio 1-1,5 raza większe niż minimalne. Rysunek 2B przedstawia średnie blokowe jako procent ogólnej średniej płytki dla każdej repliki. Tabela 2 przedstawia jednoczynnikowe tabele ANOVA wynikające z dopasowania modelu liniowego z blokiem jako efektem stałym. Z powodów związanych z ograniczoną randomizacją związaną z projektami bloków, wnioskowanie oparte na testowaniu hipotez dla czynnika blokującego jest uważane w najlepszym razie za przybliżone, aw najgorszym za nieważne. Jednak dopasowanie modelu ze stałym współczynnikiem blokującym jest przydatne do oceny, czy schemat blokowania jest korzystny. Mn_Sq (blok) reprezentuje średnie kwadratowe odchylenia średnich blokowych względem średniej ogólnej. Mn_Sq (Błąd) reprezentuje średnie kwadratowe odchylenie poszczególnych obserwacji względem ich odpowiednich średnich grupowych, w tym przypadku średniej ogólnej, ponieważ w modelu nie ma czynnika leczenia. Gdy Mn Sq (blok) jest większy niż Mn Sq (błąd), tj. współczynnik F jest większy niż jeden, rozmiar błędu średniokwadratowego został skutecznie zmniejszony w stosunku do całkowicie randomizowanego projektu (CRD), zwiększając w ten sposób moc statystyczną do porównywania interesujących nas metod leczenia i zmniejszając szerokość przedziałów ufności szacujących kontrasty leczenia. Rysunek 2B pokazuje współczynniki F, które znacznie przekraczają jeden, a zmierzona odpowiedź ma tendencję do zmniejszania się, gdy zbliża się do środka na wszystkich trzech powtórzonych płytach. We wszystkich trzech powtórzeniach obserwuje się 95% przedziały ufności na poziomie 0,05 dla co najmniej jednego bloku, który nie pokrywa obserwowanej średniej tablicowej. W związku z tym można stwierdzić, że schemat blokowania znacznie zwiększa precyzję tych szacunków. Poza mniejszą precyzją, nieuwzględnienie zmienności uciążliwości przestrzennej może prowadzić do fałszywych wyników ze względu na możliwość pomylenia efektów leczenia z efektem krawędzi.

Chociaż istnieje długa historia protoplastów etiolowanych z kukurydzy sięgająca wczesnych lat 90., ten protokół wprowadza pewne dodatkowe modyfikacje do tradycyjnej procedury, aby lepiej ułatwić powtarzalną, masową izolację protoplastów w celu transfekcji protoplastów o wysokiej przepustowości²⁰. Etapy sterylizacji powierzchni nasion i tkanek liści przed trawieniem zmniejszają zanieczyszczenie grzybami bez konieczności stosowania pożywek aseptycznych. Wykorzystanie gleby pomoże również obniżyć koszty w porównaniu z używaniem specjalistycznych pożywek wzrostowych lub kupowaniem sterylnych jednorazowych pojemników. Protokół na wielu etapach może być skalowany w celu dostosowania do różnych poziomów przepustowości. Około 2 g tkanki pierwszego liścia daje pomiędzy 5 x 10⁶ - 10 x 10⁶ protoplastów. Ponieważ na transfekcję płytki 96-dołkowej wymagane jest 5 x 10⁶ protoplastów, protokół izolacji, jak jest napisany, może pomieścić 2 przebiegi protokołu transfekcji. Protokół ten wykorzystuje również MMg jako roztwór myjący zamiast kanonicznego roztworu W5. Zostało to pierwotnie wyprowadzone z publikacji dotyczących pierwotnego protoplastu rzodkiewnika jako sposób na zmniejszenie liczby roztworów buforowych używanych na dowolnym etapie procedury transfekcji protoplastów²¹. Zastosowano go jednak również w przypadku etiolowanych protoplastów liści kukurydzy w ramach 2022²². Dalsze doskonalenie izolacji i transfekcji dowolnego protokołu protoplastów polegałoby na uproszczeniu i zmniejszeniu roztworów buforowych. W obecnej formie protokół ten przełącza się między kanonicznym buforem trawienia, buforem W5, buforem MMg i buforem WI. Uproszczenie rozwiązań byłoby bardzo korzystne dla poprawy odtwarzalności eksperymentów z protoplastami i zmniejszenia zmienności między eksperymentami między osobami lub partiami. Zauważalną ostatnią nowością protokołu jest brak całkowitego usunięcia roztworów buforowych po transfekcji PEG. Powodem, dla którego automatyzacja jest możliwa, jest to, że protoplastyczna, etiolowana kukurydza pokazana tutaj i inne, które testowaliśmy, polega na tym, że wydają się tolerować rozcieńczanie jako sposób na wygaszenie reakcji, a nie całkowite usunięcie różnych roztworów buforowych¹¹. Produkcja reporterowa, jak wskazuje nasza kontrola transfekcji GFP zastosowana tutaj, wskazuje, że protoplast może tolerować do 5% PEG bez negatywnego wpływu na intensywność fluorescencji (rysunek uzupełniający 6). Wartość ta jest ponad dwukrotnie wyższa niż przewidywane stężenie PEG po zakończeniu opisanego tutaj protokołu.

Rysunek 1: Ilustracyjny schemat procedury izolacji i transfekcji protoplastów. Kroki, na których wprowadzono automatyzację, są oznaczone czerwonymi liniami przerywanymi i towarzyszącymi im niebieskimi polami. Liczby otoczone czerwonym kółkiem odpowiadają trzem opisanym metodom. Stworzony z BioRender.com. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Efekt krawędzi i wpływ łagodzenia układów replikacji. (A) Mapy topograficzne pokazujące zmianę intensywności fluorescencji dla 96-dołkowych płytek transfekowanych pSYN11250 w stosunku do średniej płytki dla 3 niezależnych eksperymentów powtórzonych (Rep). Średnia z tych eksperymentów jest również pokazana za pomocą schematu blokowania, wskazywanego przez różne kolory przerywanych linii ułożonych na górze. (B) Wykresy paskowe przedstawiające średnie blokowe jako procent całkowitej średniej z tablic dla powtórzonych tablic 1, 2 i 3 od lewej do prawej. Półprzezroczyste okręgi reprezentują surowe punkty danych po podzieleniu przez średnią z płyty. Słupki błędów to 95% przedziały ufności na poziomie 0,05, przy czym środkowa kreska oznacza średnią. Kolory brązowy, złoty i szary wskazują odpowiednio krawędź, drugi rząd i wewnętrzną część płytki. Przerywana czerwona linia na poziomie 100% reprezentuje ogólną średnią płytową. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

bufor	Odczynnik
trawienie	1,5% Celuloza Rs
	0,3% Makroenzym
	0,6 M Mannitol
	10 mM MES (ph 5,7)
	1 mM CaCl2
	0,1% (w/v) powierzchnia ciała
	0,5 nM β-merkaptoetanolu lub 0,5 mM naziemnej telewizji cyfrowej
Karabin maszynowy (Mmg	0,6 M Mannitol
	15 mM MgCl2
	4 mM MES, pH 5,7
Zobacz materiał W5	154 mM NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM KCl
	2 mM MES, pH 5,7
Wi	0,6 M Mannitol
	4 mM MES, pH 5,7
	4 mM KCl
czop	30% PEG (w/v)
	0,6 M Mannitol
	100 mM CaCl2

Tabela 1: Roztwory buforowe do izolacji i transfekcji etiolowanego protoplastu kukurydzy.

pkt. pkt. pkt. pkt. jezdnego pkt.

Rep	źródło	Df	Suma kwadratowa	Mn Sq	Wartość F	Pr (>F)
Replikacja 1	blok	cyfra arabska	0,26	0,13	Godzina 10,64	<0,001
	szczątkowy	93 Rozdział 93	1,135	0,012
Replikacja 2	blok	cyfra arabska	0,507	0,25	O godz. 21.41	<0,001
	szczątkowy	93 Rozdział 93	Pytanie 1,102	0,012
Replikacja 3	blok	cyfra arabska	0,179	0,09	Godzina 4,48	0,014
	szczątkowy	93 Rozdział 93	1,861	0,02

Tabela 2: Jednokierunkowa tabela ANOVA dla trzech powtórzeń eksperymentu transfekcji pSYN11250 z 96 dołkami. Dla każdej płytki repliki: kolumna Źródło oznacza źródło zmienności, Df oznacza stopnie swobody, Sum Sq oznacza sumę kwadratów, Mn Sq oznacza średnie kwadraty (Suma Sq/Df), wartość F oznacza stosunek Mn_Sq (blok) do Mn_Sq (błąd), a Pr(>F) oznacza wartość p globalnego testu F.

Rysunek uzupełniający 1: Zrzuty ekranu z pulpitu nawigacyjnego oprogramowania. Kategorie wyboru, które odnoszą się do tworzenia nowej metody, a także układy talii dla protokołów losowania i transfekcji. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Kluczowe kroki w konfiguracji protokołu tworzenia płytki transfekcyjnej. Zrzuty ekranu wykonane podczas tworzenia protokołu tworzenia płyty transfekcyjnej. Numer i tytuł każdego panelu odpowiadają krokom w protokole. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 3: Zrzuty ekranu do manipulowania sprzętem laboratoryjnym i ładowania końcówek do tworzenia protokołu transfekcji. Reprezentują one kroki, które występują wielokrotnie w całym protokole, więc aby uniknąć powtarzających się wzmianek, reprezentatywne kroki są pokazane tutaj. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 4: Mieszanie komórek i DNA przez Pauzę Użytkownika 1. Zrzuty ekranu wykonane podczas tworzenia protokołu transfekcji. Numer i tytuł każdego panelu odpowiadają krokom w treści protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 5: Usunięcie supernatantu po Pauzie Użytkownika 1 poprzez przeniesienie próbek na mikropłytkę. Zrzuty ekranu wykonane podczas tworzenia protokołu transfekcji. Numer i tytuł każdego panelu odpowiadają krokom w treści protokołu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 6: Transfekowany proteplast z liści kukurydzy transfekowany ZsGreen traktowany różnymi stężeniami PEG w przebiegu czasu buforowego WI. Wykres słupkowy przedstawiający względną intensywność fluorescencji protoplastu po potraktowaniu PEG po 24, 48 i 72 godzinach z pomiarem za pomocą czytnika mikropłytek. Pasek błędów = SD, n = 4. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Discussion

W manuskrypcie opisano protokół automatyzacji tworzenia płytek transfekcyjnych i etiolowanej izolacji protoplastów liści kukurydzy za pomocą automatycznej transfekcji. Do pomyślnego zakończenia części protokołu dotyczącej tworzenia płytek transfekcyjnych potrzebny jest zautomatyzowany robot do obsługi cieczy, który jest wyposażony w 8-kanałową kapsułę. W protokole transfekcji zalecana jest 96-dołkowa kapsuła do pełnej i jednolitej transfekcji na 96-dołkowej płytce. Metodę transfekcji można wykonać za pomocą 8-kanałowej kapsuły, ale należy zwrócić szczególną uwagę na czas potrzebny na etapy aspiracji i dozowania, a także czas, który można przypisać na wymianę końcówek między kolumnami. Różnice w czasie trwania inkubacji PEG są dobrze udokumentowane i mają znaczący wpływ na skuteczność i ekspresję transfekcji, dlatego należy zwrócić szczególną uwagę na te czynniki, aby zapobiec rozbieżnościom w obchodzeniu się z próbkami¹³. Przed rozpoczęciem protokołu obsługi cieczy ważne jest, aby rozważyć kroki protokołu i to, czy niektóre czynności można wykonać jednocześnie. Protokół ten wykorzystuje urządzenie, które ładuje końcówki do 96-dołkowej kapsuły z 1 pozycji na pokładzie. Obsługa cieczy dla tego protokołu zawiera funkcję, w której robot zamienia pudełka z końcówkami podczas okresów inkubacji lub podczas kroków pauzy użytkownika, aby uniknąć dodawania dodatkowego czasu do protokołu. Podejmując decyzję o zakupie płynnej kolektora, pomyśl o funkcjonalności i potencjalnych udogodnieniach oszczędzających czas.

Chociaż protokół ten został opracowany z myślą o wykorzystaniu urządzeń Beckman Coulter NXp i Biomek FX, protokół ten można dostosować do dowolnego porównywalnego urządzenia do obsługi cieczy. Wszystkie osoby zajmujące się obsługą cieczy mają pewne sposoby oznaczania, w jaki sposób przenosić objętości z jednego miejsca do drugiego i ile. W przypadku tego protokołu urządzenia te używały polecenia wiersza Transfer from File (Transfer z wiersza plików). Jeśli sprzęt laboratoryjny jest poprawnie zdefiniowany, użytkownik może przenieść się z lub do dowolnego statku. W wyjątkowych okolicznościach, np. gdy stojaki na rurki lub adaptery nie są dostępne na rynku, można zastosować druk 3D takich łączników. W przypadku typowych protoplastów transfekcji 20 μg DNA o stężeniu 1 μg/μL transfekcji jest standardową objętością materiału dla wielu platform protoplastowych¹³_. Podczas tworzenia płytki transfekcyjnej, jako dodatkowy środek ostrożności, należy użyć końcówek filtrujących o pojemności 0,2 - 20 μl, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia z powodu plazmidu w aerozolu podczas transferu. Usunięcie składnika ludzkiego z preparatu zmniejsza zmienność w czasie i poprawia odtwarzalność tych wysokoprzepustowych eksperymentów. Ponadto talerze można przygotować z dużym wyprzedzeniem. Preparat ten złagodzi stres naukowca zajmującego się transfekcją w dniu eksperymentu. Jednak ważne jest, aby unikać przechowywania tych płytek plazmidowego DNA w temperaturze 4 °C przez dłuższy czas, ponieważ próbki mogą odparować. Próbki należy przechowywać w zamrażarce o temperaturze -20 °C, a następnie można je rozmrozić w lodówce o temperaturze 4 °C przed transfekcją. Po zaprogramowaniu tego protokołu tworzenia płytki transfekcyjnej powinno być łatwo powtarzalne poprzez dostarczenie nowego .csv transferu z pliku i zajęcie tych samych lokalizacji pokładu dla próbek, sprzętu laboratoryjnego i odczynników.

W przypadku zautomatyzowanej procedury transfekcji (etap 3) przygotowuje się nadwyżkę roztworu PEG, aby zapewnić równe zasysanie lepkiej cieczy z koryta, zwykle nadmiar 40 ml w celu uwzględnienia objętości martwej. Użycie dokładnie takiej ilości wymaganej do transfekcji może spowodować zassanie powietrza do pipet i zassanie nierównych objętości PEG przez 96-kanałową głowicę. Chociaż ten roztwór można również przygotować z wyprzedzeniem, zaleca się, aby był przygotowany w dniu transfekcji. Sterylizacja roztworu PEG może być wykonana przy użyciu filtra strzykawkowego, ale ze względu na lepkość może być trudna. Korzystanie z filtra próżniowego jest szybsze i może złagodzić frustrację lub ból związany z tą czynnością. Podobnie jak w przypadku roztworu PEG, dostarczany jest również nadmiar innych roztworów buforowych do transfekcji (W5, WI), aby zapewnić równomierne pipetowanie w całej 96-kanałowej głowicy. Roztwory buforowe (W5 i WI) mogą być przygotowywane z wyprzedzeniem luzem do wykorzystania w przyszłych operacjach obsługi cieczy. Chociaż odczynniki nie są drogie, istnieje duża ilość poświęcenia roztworu buforowego. Wraz z rosnącą liczbą przebiegów dziennie lepszym rozwiązaniem może być stosowanie alternatyw dla zbiornika, które zmniejszyłyby nadmiar wyrzucany na końcu biegu. Podczas działania protokołu obsługi cieczy, W5 i WI mogą być dodawane do odpowiednich koryt przed rozpoczęciem protokołu, podczas 15-minutowej inkubacji lub podczas kroków pauzy użytkownika w protokole. Zachowaj ostrożność podczas dodawania w okresie inkubacji ze względu na zabezpieczenia, takie jak kurtyna świetlna. Pamiętaj, aby usunąć wszelkie komunikaty ostrzegawcze z oprogramowania, aby zapobiec niezamierzonym zakłóceniom działania protokołu.

Protokół ten odzwierciedla niezawodne, powtarzalne i szeroko stosowane ulepszenie wcześniej udokumentowanych zautomatyzowanych protokołów postępowania z protoplastem^12,13. Metodę tę można dostosować do pozornie nieskończonego repertuaru protokołów protoplastów, ponieważ wiele z nich zależy od tej samej serii etapów manipulacji buforem. Łagodzenie efektu krawędzi za pomocą RICBD podczas automatycznego tworzenia płytki transfekcyjnej jednocześnie zmniejsza ilość wysiłku i zmienność, jednocześnie stosując statystycznie istotną korektę efektu krawędzi. Transfekcja w 96-dołkowym strąku protoplastu eliminuje możliwość jakichkolwiek zmian związanych z czasem inkubacji PEG, prowadząc reakcję we wszystkich 96 dołkach jednocześnie. Chociaż protokół miał na celu osiągnięcie pełnej automatyzacji etapów transfekcji, pauzy użytkownika będą wymagały fizycznej interwencji naukowca zajmującego się transfekcją. W ostatnich latach poczyniono wiele postępów w zakresie wirówek odpornych na niewyważenie, kompatybilnych z automatyzacją. Dzięki temu sprzętowi możliwe byłoby zautomatyzowanie całej metody bez udziału użytkownika. Alternatywnie, w innych protokołach uniknięto wirowania, pozwalając protoplastowi osiąść na dnie studni po transfekcji^12,13. Spowoduje to jednak wydłużenie procedury transfekcji i wydłużenie czasu inkubacji w buforze W5 przed nocną inkubacją w stanie Wisconsin.

W wielu miejscach w metodzie transfekcji opisuje ona postępowanie z objętościami przekraczającymi 200 μl, gdzie obchodzenie się z cieczą musi odbywać się przy użyciu wielokrotnych transferów. W zależności od wieku i modelu urządzenia do obsługi cieczy, ten krok może i powinien być wykonany jako jedna objętość. W przypadku starszych urządzeń do obsługi cieczy, takich jak opisywany tutaj model, najwięcej, co można zassać za pomocą 96-dołkowej głowicy, to 200 μl. Oczywistym ulepszeniem metody zarówno pod względem wydajności, jak i dokładności byłoby zmniejszenie liczby transferów w celu zminimalizowania potencjalnego ryzyka rozlania, kapania lub zanieczyszczenia. Inne kwestie dotyczące poprawy protokołów postępowania z cieczami przedstawiono w przeglądach tych technologii i ich wykorzystania w dziedzinie biotechnologii²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)β-merkaptoetanol	Sigma	M6250
Monohydrat kwasu 2-(N-morfolino)etanosulfonowego (MES)	Sigma	69892
50 ml probówki wirówkowe z płaską nasadką sterylne	Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase z pokrywką Hodowla komórkowa Sterylna PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Końcówki do robotów Axygen Biomek FX/NX, niesterylne, szerokootworowe	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips Filtr 30uL, sterylny, stojakowy	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Okrągłe filtratory próżniowe	Fisher	08-648-10
Bemis 2 IN. X 250 Ft. Roll Laboratoryjny Parafilm	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Dwuwodny chlorek wapnia	Sigma	C5080
Chemglass Jednorazowy hemocytometr nauk przyrodniczych	Fisher	50-131-1352
Wybielacz bakteriobójczy Clorox, skoncentrowana
Corning Microplate	Fisher	07-200-684
Corning 96-dołkowe bloki testowe, 2 mL, standard 96 dołków	Fisher	07-200-701
DL-Ditiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol	Sigma	M9546
Fisherbrand 60 ml plastikowa strzykawka	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Sterylne sitko komórkowe 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Szalki Petriego z przezroczystą pokrywką, Możliwość układania w stosy, 100 mm x 25 mm, Etui 325	Fisher	FB0875711
Sześciowodny chlorek magnezu	Fisher	M2670
Jednostka filtrująca napędzana strzykawką Millex Sterylna 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
filtrująca napędzana strzykawką Millex Sterylna 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Sterylne jednorazowe filtry próżniowe 50 ml PES	Fisher	SCGP00525
Poli(glikol etylenowy) 4000	Sigma	81240
Wtyczka uziemienia Redi-Earth i Mieszanka sadzonek	Wyatt Quarles	GP92747
Regularna maszynka do golenia z pojedynczą krawędzią stalowy tył .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Chlorek sodu	Sigma	S7653
Wkładka do tacy - 36 ogniw - zagnieżdżona 6x6	Hummert	11635000
Tween-20	Pompa próżniowa Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1, 100-120V, 50/60 Hz, wtyczka amerykańska	VWR	97058-164