<ol><li> Zbuduj komorę przepływu, jak pokazano w filmie. Upewnij się, że uszczelka parafilmie jest napięty i używać umyć nakrywkowe. </li><li> Inkubować aktyny-wiążąca w komorze na 5-10 &quot;. </li><li> Blok nieswoiste wiązania na szkiełka ze szkła białka. </li><li> Polimeryzacji aktyny w komorze przez przepływające w G-aktyny w polimeryzacji bufora. </li><li> Rozmycie unpolymerized aktyny przez płynący w nadmiar buforu. </li></ol>

monitoring actin demontaż z poklatkowy mikroskopia

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Dzisiaj chciałbym pokazać Państwu, jak skonstruować komorę przepływową, komorę fuzyjną do obrazowania za pomocą mikroskopu pionowego. W tym celu tworzę dwie przestrzenie przy użyciu folii. Wykorzystuję do tego Parafilm, który tnę na małe paski.W następnym kroku utworzę kanały, które będą stanowić ścianki, a następnie wysuszę je strumieniem powietrza pod kątem. Kładę szkiełko nakrywki na parafilmie i oto gotowy efekt. Następnie podgrzewam całość na bloku grzewczym, aby stopić parafilm i w ten sposób stworzyć uszczelnienie.Oto szkiełko nakrywowe, a na nim dwie warstwy folii, jak widać tutaj. Następnie na górze znajduje się ponownie szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 by 22 mm. To konkretne szkiełko, które docisnąłem do folii, aby uzyskać szczelne zamknięcie.Zatem ciecz wpływa tutaj w jednym kierunku, a ja mogę ją odessać za pomocą papieru filtracyjnego w tym kierunku. Pokażę wam za chwilę, jak to zrobić. To, co zazwyczaj robię, to umieszczenie próbki w komorze uwilżeniowej, co jest bardzo proste.Pobierz dwa rodzaje podwyższonych pasków i umieść pod nimi filtr papierowy. Aby zapobiec zanieczyszczeniom, na komorę przepływową nałóż szkiełko przykrywcze. Sposób wprowadzania roztworu do komory polega na umieszczeniu końcówki pipety przy wlocie do komory i wykonaniu aplikacji.Teraz inkubuję komorę z zamkniętą pokrywą przez 10 minut. Aby odessać ciecz z drugiej strony, zazwyczaj używam papieru filtracyjnego, który tnę na cienkie paski w ten sposób. Biorę jeden z tych cienkich pasków i jednocześnie podaję roztwór do wlotu, przykładając papier filtracyjny do wylotu, aby odessać wymieniany roztwór.Zobaczą Państwo ciecz przepływającą przez roztwór. Następnie oczekuję pięciu minut na zamknięcie procesu. Teraz jestem gotowy, aby wprowadzić aktynę; aktynę muszę faktycznie spolimeryzować, co robię wewnątrz komory przepływowej, stosując te same procedury co wcześniej.Ponieważ w ten sposób, a teraz gdy aktyna uległa polimeryzacji, wypłukuję cały nadmiar niepolimeryzowanej aktyny, używając dużej objętości samego buforu. Mam tutaj około 100 µL, co odpowiada kilku objętościom komory reakcyjnej buforu. Gdy papier filtracyjny stanie się nasycony, muszę zmienić kierunek. Dobrze?Jestem zatem gotowy do przeprowadzenia obrazowania. Komora perfuzyjna z przytwierdzoną aktyną. Teraz biorę preparat, montuję go pod mikroskopem i ponieważ obrazowanie wykonuję za pomocą obiektywu olejowego, nałożę olej immersyjny na górną powierzchnię szkiełka nakrywkowe, aby ocenić roztwór, białko lub cokolwiek wewnątrz aktyny.W związku z tym, podczas wykonywania obrazowania poklatkowego, mogę w rzeczywistości wymieniać roztwór po stronie dopływowej.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

<ol><li> Zbuduj komorę przepływu, jak pokazano w filmie. Upewnij się, że uszczelka parafilmie jest napięty i używać umyć nakrywkowe. </li><li> Inkubować aktyny-wiążąca w komorze na 5-10 ". </li><li> Blok nieswoiste wiązania na szkiełka ze szkła białka. </li><li> Polimeryzacji aktyny w komorze przez przepływające w G-aktyny w polimeryzacji bufora. </li><li> Rozmycie unpolymerized aktyny przez płynący w nadmiar buforu. </li></ol>

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

W tym artykule

Protokół

Przedruki i uprawnienia

Tagi