<ol><li> Zbuduj komorę przepływu, jak pokazano w filmie. Upewnij się, że uszczelka parafilmie jest napięty i używać umyć nakrywkowe. </li><li> Inkubować aktyny-wiążąca w komorze na 5-10 &quot;. </li><li> Blok nieswoiste wiązania na szkiełka ze szkła białka. </li><li> Polimeryzacji aktyny w komorze przez przepływające w G-aktyny w polimeryzacji bufora. </li><li> Rozmycie unpolymerized aktyny przez płynący w nadmiar buforu. </li></ol>

monitoring actin demontaż z poklatkowy mikroskopia

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

Okej, więc to co chciałbym dzisiaj zrobić, to pokazać wam, jak skonstruować komorę przepływową, komorę fuzyjną do obrazowania na pionowym mikroskopie. Następnie tworzę dwie przestrzenie za pomocą filmu. Więc to, co robię, to biorę folię para, tnę ją na małe paski.Następnie zamierzam to w zasadzie uformować kanały dla ścian i suszę je przechylonym powietrzem. Kładę szkiełko nakrywkowe na górze para, a oto gotowe. Następnie podgrzewam go na bloku grzewczym, aby stopić parametr i w zasadzie stworzyć uszczelkę.To jest szkło nakrywkowe tutaj, a na wierzchu szkła nakrywkowego znajdują się dwie warstwy kaprysu, jak widzicie tutaj. A na dodatek, znowu, jest to szkiełko nakrywkowe o wymiarach 22 na dwa kilometry. Ten właśnie tutaj, który przycisnąłem do parametru, aby spaść pieczęć.Okej, więc płyn wchodzi tutaj w jednym kierunku i mogę go odessać bibułą filtracyjną tutaj w tym kierunku. Za chwilę pokażę Ci, jak to zrobić. Więc to, co lubię robić, to umieszczać go w wilgotnej komorze, co jest bardzo proste.Weź dwa rodzaje podwyższonych pasków i umieść pod spodem filtr papieru. I żeby było głośno, tak jak ja, założyłem pokrywę, szkiełko nakrywkowe na komorę przepływu. Teraz sposób, w jaki wprowadzasz rozwiązanie do komory, polega na tym, że po prostu kładziesz końcówkę pipety przy wejściu do komory i po prostu dzielisz.Teraz inkubuję komorę z zamkniętą pokrywą przez 10 minut. To, co zwykle robię, aby odessać płyn z drugiej strony, to użyć go, wziąć bibułę filtracyjną i pokroić ją w cienkie paski, takie jak ten. I biorę jeden z tych cienkich pasków i jednocześnie nakładam roztwór do wejścia, kładąc bibułę filtracyjną na wyjściu, aby zassać wymianę, roztwór.Więc zobaczysz, jak płyn przepływa przez roztwór. A potem czekam pięć minut na środkowe zamknięcie. Teraz jestem gotów zrobić, to faktycznie umieścić aktynę i aktynę, właściwie muszę polimeryzować, polimeryzuję w komorze przepływowej i to są te same procedury wcześniej.Więc ponieważ w ten sposób, a potem teraz, gdy działanie jest spolimeryzowane, wypłukuję cały nadmiar niespolimeryzowanego działania za pomocą dużej objętości samego buforu. Więc tutaj mam około stu mikrolitrów i jest to bufor o pojemności kilku objętości komory reakcyjnej. Po prostu, wiesz, kiedy bibuła filtracyjna staje się nasycona, muszę zmienić kierunek. Porządku?Jestem więc gotowy do zrobienia obrazowania z tym. A więc komora perfuzyjna z dołączoną do niej aktyną. Teraz biorę szkiełko, montuję je pod mikroskopem, a ponieważ obrazuję za pomocą obiektywu olejowego, zamierzam nałożyć trochę olejku immersyjnego na górną powierzchnię okładki, dotyk trawy, taki jak ocena roztworu lub białka lub czegokolwiek na działanie w środku.Więc to, co robię, to mogę wymieniać się stroną rozwiązania podczas wykonywania zdjęć poklatkowych. Jako takie.

monitoring-actin-disassembly-with-time-lapse-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Monitoring Actin Disassembly with Time-lapse Microscopy

<ol><li> Zbuduj komorę przepływu, jak pokazano w filmie. Upewnij się, że uszczelka parafilmie jest napięty i używać umyć nakrywkowe. </li><li> Inkubować aktyny-wiążąca w komorze na 5-10 ". </li><li> Blok nieswoiste wiązania na szkiełka ze szkła białka. </li><li> Polimeryzacji aktyny w komorze przez przepływające w G-aktyny w polimeryzacji bufora. </li><li> Rozmycie unpolymerized aktyny przez płynący w nadmiar buforu. </li></ol>

Monitoring Actin Demontaż z poklatkowy Mikroskopia

In This Article

Protocol

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles