Opracowanie modelu ekspozycji miazgi mysiej z nowatorskim kneblem do badań nad zapaleniem miazgi

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia uproszczony protokół tworzenia modelu zapalenia miazgi u myszy za pomocą innowacyjnego knebla ustnego, po którym następuje analiza histologiczna.

Streszczenie

Zapalenie miazgi, częsta przyczyna naturalnej utraty zębów, prowadzi do martwicy i utraty bioaktywności w zapalnej miazdze zębowej. Wyjaśnienie mechanizmów leżących u podstaw zapalenia miazgi i jego skuteczne leczenie jest przedmiotem ciągłych badań endodontycznych. Dlatego zrozumienie procesu zapalnego w miazdze zębowej ma kluczowe znaczenie dla poprawy zachowania miazgi. W porównaniu z innymi eksperymentami in vitro, mysi model zapalenia miazgi oferuje bardziej autentyczny i genetycznie zróżnicowany kontekst do obserwacji patologicznego postępu zapalenia miazgi. Jednak korzystanie z myszy, pomimo ich opłacalności i dostępności, stwarza trudności ze względu na ich małe rozmiary, słabą koordynację i niską tolerancję, co komplikuje zabiegi wewnątrzustne i dentystyczne. Protokół ten wprowadza nowatorski projekt i zastosowanie knebla do ust w celu odsłonięcia miazgi myszy, ułatwiając bardziej wydajne procedury wewnątrzustne. Knebel ustny, składający się z łuku zębowego łatwo dostępnego dla większości dentystów i może znacznie przyspieszyć przygotowanie chirurgiczne, nawet do pierwszych zabiegów. Mikrotomografia komputerowa, barwienie hematoksyliną-eozyną (HE) i barwienie immunofluorescencyjne zostały wykorzystane do identyfikacji zmian w morfologii i ekspresji komórek. Celem tego artykułu jest pomoc naukowcom w ustaleniu bardziej powtarzalnej i mniej wymagającej procedury tworzenia modelu zapalenia miazgi przy użyciu tego nowatorskiego knebla.

Wprowadzenie

Miazga zębowa, integralna część zęba, jest odpowiedzialna za wiele podstawowych funkcji, takich jak dostarczanie składników odżywczych, tworzenie zębiny, funkcje sensoryczne i reakcje obronne¹. Niemniej jednak miazga zębowa, otoczona twardą tkanką, jest podatna na urazy i uszkodzenia spowodowane głęboką próchnicą, zapaleniem miazgi, urazami lub późniejszymi terapiami^2,3. Brak funkcjonalnej miazgi zębowej zwiększa ryzyko łamliwości zębów⁴. Co więcej, utrata żywotności miazgi w młodych zębach stałych może niekorzystnie wpływać na dojrzewanie zębów, a obecne techniki protetyczne nie są w stanie przywrócić neuronalnego sprzężenia zwrotnego oferowanego przez zdrową miazgę ⁴. Ta sytuacja skłoniła naukowców do zbadania alternatywnych rozwiązań w zakresie radzenia sobie z zapalną miazgą, wykraczających poza zwykłe usunięcie.

W 2007 roku Murray et al. zainicjowali zastosowanie inżynierii tkankowej w endodoncji regeneracyjnej, wywołując tym samym wzrost zainteresowania konserwacją i regeneracją miazgi⁵. Jednak stan zapalny tkanki miazgi stanowi wyzwanie, ponieważ komórki uwalniają czynniki zapalne, takie jak IL-6, które rekrutują komórki zapalne i powodują martwicę komórek, utratę witalności miazgi i komplikacje w powrocie do sprawności^6,7. Zrozumienie stanu zapalnego i związanej z nim śmierci komórki ma zatem kluczowe znaczenie dla postępów w zachowaniu niezbędnej miazgi. Istnieje wiele eksperymentów, które zostały przeprowadzone w celu zbadania biologii molekularnej zapalnej miazgi in vivo lub in vitro^8,9. Chociaż eksperymenty in vitro, takie jak hodowle komórkowe 2D lub 3D, są opracowywane od lat i stają się dojrzałe i szeroko stosowane do testowania reakcji komórek miazgi na czynniki zapalne, eksperymenty te nie mogą odzwierciedlać interakcji między tkanką miazgi a układowym układem odpornościowym¹⁰. Jeśli badane zjawisko pochodzi z komórek pochodzenia tkankowego innego niż układ odpornościowy, naczyniowy i nerwowy, to czysta hodowla komórek miazgi doprowadzi do ślepego zaułka. Dlatego eksperymenty in vivo są bardzo potrzebne i referencyjne.

Myszy coraz częściej stają się częstym wyborem w badaniach nad stanami zapalnymi in vivo ze względu na ich opłacalność, wysoką płodność i witalność. Jednak obecnie brakuje kompleksowego protokołu dla modelu zapalenia miazgi u myszy, który mógłby służyć jako odniesienie. Niewielkie rozmiary myszy i ich wrażliwość na stymulację stanowią poważne wyzwanie podczas procedur eksperymentalnych. Obserwacja maleńkich zębów ukrytych głęboko w jamie ustnej myszy często wymaga użycia mikroskopu wspornikowego, niezależnie od bardziej powszechnej obecności mikroskopów biurkowych w laboratoriach. Brak otwieracza do ust wymaga pomocy innych. Aby rozwiązać ten problem, grupa opracowała knebel z łatwo dostępnymi materiałami, który ma na celu zapewnienie ustandaryzowanego i powtarzalnego protokołu konstruowania modelu zapalenia miazgi u myszy. Ten artykuł szczegółowo opisuje procedurę, obejmującą przygotowanie przedoperacyjne, unieruchomienie, operację odsłonięcia miazgi i pobieranie próbek na myszach C57. Protokół ten zaleca stosowanie knebla ustnego, dostarczając informacji na temat jego struktury, produkcji i zastosowania, aby ułatwić innym badaczom odtworzenie procedury.

Protokół

Procedury eksperymentalne w tym badaniu zostały zatwierdzone przez komisję etyczną West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2021-125). Dorosłe myszy C57BL/6 uzyskano z Gempharmatech Experimental Animals Company w Chengdu w Chinach. Cała korona pierwszego zęba trzonowego szczęki wyrzyna się 21 dni po urodzeniu. Myszy do zabiegu chirurgicznego powinny być starsze niż 21 dni i mieć normalną witalność¹¹. Tutaj do modelowania wykorzystano myszy w wieku od 6 do 8 tygodni. Rysunek 1 to diagram przepływu pokazujący używany protokół.

1. Przygotowanie przedoperacyjne (Rysunek 2)

1. Zaopatrz się w następujące instrumenty: mikroskop stereoskopowy, płytkę mocującą, taśmę medyczną, knebel, minimalnie inwazyjny frez dentystyczny o średnicy 0,6 mm, szybkoobrotową rękojeść dentystyczną, pilnik 8 # C +, poduszkę grzewczą, strzykawkę 1 ml, sterylny wacik, kleszcze do oczu.
2. Zaopatrz się w następujące leki: mieszankę anestezjologiczną, maść weterynaryjną.

2. Przygotowanie knebla do ust

1. Zważ i znieczul mysz przez dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu mieszanki znieczulającej (10% chlorowodorek ketaminy + 5% ksylazyna + 85% sterylna izotoniczna sól fizjologiczna) w stężeniu 0,007 ml/g masy ciała i potwierdź prawidłowe znieczulenie metodą szczypania palców u stóp. Nałóż okulistyczną maść nawilżającą na oczy, aby zapobiec obrażeniom oczu z powodu wysuszenia podczas pracy.
   UWAGA: Niezbędne są czapki medyczne, maski, rękawice i kombinezony oraz inne podstawowe środki ochrony. Upewnij się, że zarówno środowisko zabiegowe, jak i komora myszy są czyste i bezpieczne. Niezbędna jest poduszka grzewcza zapewniająca wsparcie termiczne podczas całej procedury.
2. Przygotuj knebel do ust zgodnie z opisem poniżej (Rysunek 3).
   1. Zaopatrz się w następujące materiały: drut łukowy ortodontyczny o średnicy 8 μm, szczypce do gięcia pętli dla młodzieży, ciężki obcinak do drutu, marker, gumową nasadkę o długości 3 mm i średnicy przekroju 1 mm.
   2. Najpierw wyprostuj drut łukowy lewą ręką w celu zamocowania i kciukiem, palec wskazujący prawej ręki zegnij lekko w stosunku do łuku drutu. Powtórz tę czynność kilka razy, ułatwi to zginanie do prawidłowego kąta trójwymiarowego.
   3. Użyj szczypiec do gięcia pętli Yong, aby zgiąć górną krawędź (Rysunek 3G, a-i) trapezu (Rysunek 3C, a-l-k-b) o długości około 8 mm w środku drutu dziobowego. Upewnij się, że punkt a (Rysunek 3) znajduje się na krawędzi dzioba szczypiec.
   4. Przytrzymaj szczypce lewą ręką, zaciśnij wolny koniec drutu kabłąkowego prawym kciukiem i palcem wskazującym, a następnie zegnij drut kabłąkowy od punktu a, aby uzyskać kąt około 120°. Zduplikuj poprzednią akcję w punkcie i (Rysunek 3G). Sprawdź, czy drut łukowy znajduje się w jednej płaszczyźnie, kładąc go na poziomym stole bez podważania.
   5. Pozostaw około 9 mm długości z każdej strony (Rysunek 3D, a-b, l-k) i zegnij wolny koniec pod kątem 75°, używając tych samych umiejętności, co w kroku 2.2.4, upewniając się, że każda krawędź znajduje się w jednej płaszczyźnie. Zegnij ten ostry kąt końcówką dzioba szczypiec.
   6. Znajdź punkt c około 5 mm od punktu b. Postępuj zgodnie z tą samą umiejętnością, aby zgiąć kąt 105° w punkcie c. Zegnij kolejny kąt 105° w punkcie d 5 mm od punktu c. Pozostaw około 4,5 mm od punktu d i znajdź punkt e. Zegnij swobodny koniec w punkcie e, aby utworzyć kąt około 100 -105° (Rysunek 3E).
      UWAGA: 6-8-tygodniowe myszy C57, których używaliśmy, ważyły około 20 g. Odstęp 5 mm mógł nie tylko zablokować górną i dolną szczękę myszy bez ruchu, ale także nie uciskał skóry myszy i nie powodował dyskomfortu. Jeśli używane są inne gatunki lub wiek myszy, dostosuj długość części c-d i i-h zgodnie z rzeczywistą sytuacją ( Rysunek 3E,G).
   7. Zegnij dodatkowy depresor języka dla części żuchwy (Rysunek 3G, j-i-h-g).
   8. Zduplikuj kroki gięcia części a-b-c na części l-k-j. Clamp części i-k i k-j w tym samym czasie i zegnij wolny koniec w punkcie j, aby ustawić go pionowo do płaszczyzny i-k-j. Clamp punkt i, który znajduje się 5 mm od punktu j, zegnij wolny koniec, aby był równoległy zarówno do płaszczyzny i-k-j, jak i części c-d (Rysunek 3H).
   9. Pozostaw 5 mm długości od punktu i, w punkcie h zegnij łuk pionowo do części IH i równolegle do płaszczyzny JAH. Znajdź punkt g w odległości 5 mm od punktu h. Clamp płaszczyznę j-i-h-g i zegnij wolny koniec symetrycznie do części k-j. Wtedy wolny koniec po punkcie f powinien być symetryczny do punktu e-wolnego końca (Rysunek 3H).
   10. Umieść gumowe zaślepki na wolnym końcu (Rysunek 3F).

3. Unieruchomienie

1. Przymocuj mysz na wznak do płytki mocującej za pomocą kończyn zabezpieczonych taśmą ochronną. Ściśnij wolne końce knebla kciukiem i palcem wskazującym.
2. Zamocuj przednie siekacze myszy w trapezoidalnym rowku dwóch ramion. Upewnij się, że ramię z depresorem języka jest przeznaczone dla żuchwy. Dostosuj knebel ustny, aby upewnić się, że język myszy jest unieruchomiony, ale nie niedokrwiony.

4. Ocena zębów

1. Upewnij się, że pierwszy ząb trzonowy szczęki do operacji powinien być wolny od próchnicy, urazów i zębodontogenezy. Upewnij się, że na otaczającym dziąśle nie ma zaczerwienienia, obrzęku ani przetoki. Upewnij się, że przeciwległe zęby są zdrowe i mogą działać jako zdrowa grupa kontrolna.

5. Ekspozycja na miazgę

1. Użyj wiertła dentystycznego, aby wywiercić po stronie zgryzowej pierwszego zęba trzonowego szczęki z prędkością 20 000 obr./min. Upewnij się, że szkliwo zostało usunięte. Utrzymuj operację rękojeścią dentystyczną tylko w płytkiej warstwie zębiny, aby zapobiec nadmiernej stymulacji termicznej tkanki miazgi zębowej¹².
2. Jednocześnie zapobiegaj przegrzaniu, używając strzykawki do upuszczania zwykłej soli fizjologicznej na ząb co 3 minuty podczas operacji.
3. Umieść pilnik C+ 8 # lub 10 # w najniższej pozycji wywierconego dołu i przebij ostatnią zębinę, aby odsłonić komorę miazgi. Będzie to oczywiste uczucie upadku, gdy miejscowa zębina zostanie dokładnie usunięta. Nie sonduj zbyt głęboko, ponieważ tkanka miazgi zębowej może zostać wyprowadzona z komory miazgi.
4. Oczyść fragmenty wokół zęba. Zdejmij knebel do ust; Operacja jest zakończona. Użyj przeciwległego pierwszego zęba trzonowego szczęki jako kontroli bez operacji.

6. Opieka pooperacyjna

1. Po zabiegu należy podać karprofen (5 mg/kg) podskórnie i umieścić mysz na chemotermicznej poduszce grzewczej w pozycji leżącej do czasu wyzdrowienia ze znieczulenia. Nakarm myszy i zapewnij wodę pitną. Proces odzyskiwania powinien być nadzorowany. Żadne inne zwierzęta nie powinny przebywać w tej samej komorze, dopóki mysz nie odzyska pełnej sprawności.

7. Pobieranie i przechowywanie próbek

1. Poddaj mysz eutanazji z zwichnięciem szyjki macicy w warunkach głębokiego znieczulenia 24 godziny po operacji lub w dowolnym innym punkcie czasowym zgodnie z eksperymentem⁹. Przetnij mięśnie szkieletu przyczepione do szczęki i jarzmowej nożyczkami okulistycznymi. Usunąć szkielet, kość czołową i tkanki miękkie, a następnie wyjąć blaszkę gnathostegite z zębami trzonowymi szczęki.
   UWAGA: Według He i wsp., zaleca się, aby próbka zapalenia miazgi była pobierana mniej niż 72 godziny po operacji, aby uniknąć rozległej martwicy tkanki miazgi zębowej¹³.
2. Strzałkowo podzielić gnacjatom na pół i przechowywać tkankę w 4% paraformaldehydzie w PBS, pH 7,4, w temperaturze 4 °C przez 24 godziny utrwalenia.

8. Analiza histologiczna

1. Przemyj tkankę solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i odwapnij ją w codziennie zmienianym roztworze odwapniającym 5% EDTA i 4% sacharozy w PBS, pH 7,4, w temperaturze 4 °C przez 2-4 tygodnie¹⁰.
2. Zanurz 1/2 gnathostegitu w parafinie i upewnij się, że strzałkowa powierzchnia bez zębów znajduje się na dnie kaset z tkankami.
3. Pokrój blok parafiny na plastry o grubości 5 μm za pomocą mikrotomu parafinowego. Dostosuj kąt bloku parafiny zgodnie z bliższą, dystalną, górną i dolną zależnością obserwowaną pod mikroskopem, aby zapewnić wycięcie całej miazgi koronowej i perforacji pierwszego zęba trzonowego.

Wyniki

Opisaną powyżej procedurę przeprowadzono na prawym pierwszym trzonowcu szczękowym u 3 myszy rasy C57BL/6 w wieku od 6 do 8 tygodni, natomiast lewe pierwsze trzonowce szczękowe zachowano jako kontrolę. Do celów demonstracyjnych wykorzystano wyniki badań histologicznych i immunofluorescencyjnych z próbek kontrolnych (blank control) oraz próbek z zapaleniem miazgi po 12 h i 24 h.

Zgodnie z protokołem analizy CT według Goldman et al.¹⁵, odsłonięcie miazgi potwierdzono za po...

Dyskusja

Jako jedyna tkanka miękka w zębach, miazga zębowa spełnia kluczową rolę w utrzymaniu bioaktywności zęba, ale pozostaje bardzo wrażliwa. Zachowanie tej niezbędnej miazgi stało się preferowanym podejściem początkowym w ostatnich zabiegach endodontycznych, co wymaga kompleksowego zrozumienia mechanizmów zapalnych miazgi zębowej¹⁶. Czasoprzestrzenne fluktuacje mikrośrodowiska zapalnego i interakcje między typami komórek rezydentnych w zapaleniu miazgi komplikują jego badanie poprzez badania in vit...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Animal
C57/B6J	myszy Gempharmatech Experimental Animals Company	C57/B6J	Do ustalenia ekspozycji na miazgę
< silny>Sprzęt< / silny>
1 mL strzykawka	Chengdu Xinjin Shifeng Aparatura medyczna i Instrumenty Co., Sp. z o.o.	SB1-074(IV)	Stosować w iniekcjach leków.
8 # Plik C +	Readysteel	0010047	Zastosuj do odsłaniania dachu komory miazgi.
		znieczulenia	10% chlorowodorek ketaminy + 5% ksylazyna + 85% sterylna sól fizjologiczna izotoniczna.
Roztwór do barwienia DAPI	Beyotime	C1005	Stosować w barwieniu immunofluorescencyjnym w celu barwienia przeciwstawnego jądra.
Dentystyczna szybkobieżna rękojeść dentystyczna	Jing yuan technologia handlu elektronicznego	WJ-422	Zastosuj w ekspozycji miazgi.
Ciężki przecinak do drutu	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	brak	Zastosuj cięcie łukowe.
Zestaw do barwienia hematoksyliny i eozyny	Biosharp	BL700B	Do analizy histologicznej szkiełek.
Przeciwciało IL-6	Novus	NBP2-89149	Zastosuj w barwieniu immunofluorescencyjnym w celu wykrycia zapalenia miazgi zębowej.
Ketamina (chlorowodorek ketaminy)	Vet One, Boise, Idaho, USA	C3N VT1	100 mg / kg, IP. Zastosuj w nestetyzacji.
Kran	medyczny 3M	1530	Stosować w unieruchomieniu myszy.
Drut łuku ortodontycznego	Shanghai Wei Rong Aparatura Medyczna Co., LTD.	K417	Średnica 8 i mikro;
m Okrągły wiertło dentystyczne (0,6 mm)	Shofu global	072208	Stosować do usuwania szkliwa i płytkiej warstwy zębiny.
Młode szczypce do gięcia pętli	Jirui Medical Instrument Co., Ltd.	brak	Stosować przy gięciu łukowym.

Roztwór do