Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66017

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Streszczenie

Soczewka oczna to przezroczysta, elastyczna tkanka, która zmienia swój kształt, aby skupić światło z różnych odległości na siatkówce. Oprócz błony podstawnej otaczającej narząd, zwanej torebką, soczewka jest całkowicie komórkowa składająca się z monowarstwy komórek nabłonkowych na przedniej półkuli i dużej masy komórek włókien soczewki. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się w strefie kiełkowania na równiku soczewki, a komórki nabłonka równikowego migrują, wydłużają się i różnicują w nowo powstałe komórki włókniste. Komórki nabłonka równikowego znacznie zmieniają morfologię od losowo upakowanych komórek w kształcie kostki brukowej w wyrównane komórki w kształcie sześciokąta tworzące rzędy południkowe. Nowo utworzone komórki włókien soczewkowych zachowują sześciokątny kształt komórki i wydłużają się w kierunku przedniego i tylnego bieguna, tworząc nową powłokę komórek, które są nakładane na poprzednie generacje włókien. Niewiele wiadomo na temat mechanizmów, które napędzają niezwykłą morfogenezę komórek nabłonka soczewki do komórek włóknistych. Aby lepiej zrozumieć strukturę, rozwój i funkcję soczewki, opracowano nowe protokoły obrazowania do obrazowania struktur peryferyjnych przy użyciu całych mocowań soczewek ocznych. Tutaj pokazano metody ilościowego określania grubości kapsułki, obszaru komórki nabłonkowej, obszaru i kształtu jądra komórki, południkowej kolejności komórek rzędowych i upakowania oraz szerokości komórek włókien. Pomiary te są niezbędne do wyjaśnienia zmian komórkowych, które zachodzą podczas wzrostu soczewki przez całe życie i zrozumienia zmian zachodzących wraz z wiekiem lub patologią.

Wprowadzenie

Soczewka oczna to elastyczna, przezroczysta tkanka znajdująca się w przedniej części oka, która działa w celu precyzyjnego skupienia światła na siatkówce. Zdolność obiektywu do działania można częściowo przypisać jego skomplikowanej architekturze i organizacji1,2,3,4,5,6. Wokół tkanki soczewki znajduje się torebka, błona podstawna niezbędna do utrzymania struktury soczewki i właściwości biomechanicznych7,8,9. Sama soczewka jest całkowicie komórkowa, składa się z dwóch typów komórek: komórek nabłonkowych i włóknistych. Warstwa nabłonkowa składa się z monowarstwy prostopadłościennych komórek, które pokrywają przednią półkulę soczewki10. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się i migrują wzdłuż torebki soczewki w kierunku równika soczewki. Komórki nabłonka przedniego są spokojne i brukowe w przekroju poprzecznym, a w pobliżu równika soczewki komórki nabłonkowe namnażają się i zaczynają przechodzić proces różnicowania w nowe komórki włókniste11,12. Komórki nabłonka równikowego przekształcają się z losowo upakowanych komórek w zorganizowane rzędy południkowe z komórkami w kształcie sześciokąta. Sześciokątny kształt komórki jest zachowany po stronie podstawy tych różnicujących się komórek, podczas gdy strona wierzchołkowa zwęża się i zakotwicza w punkcie podparcia soczewki lub modiolus4,13,14,15. Gdy komórki nabłonka równikowego zaczynają wydłużać się w nowo powstałe komórki włókniste, wierzchołkowe końcówki komórek migrują wzdłuż wierzchołkowej powierzchni przednich komórek nabłonka w kierunku bieguna przedniego, podczas gdy końcówki podstawy poruszają się wzdłuż torebki soczewki w kierunku bieguna tylnego. Nowe generacje komórek włóknistych nakładają się na poprzednie generacje komórek, tworząc sferyczne powłoki włókien. Podczas procesu wydłużania i dojrzewania komórek włóknistych znacznie zmieniają swoją morfologię11,12,16. Te komórki światłowodowe stanowią większość masy soczewki11,12,16,17,18.

Mechanizmy molekularne, które przyczyniają się do tworzenia skomplikowanych mikrostruktur soczewek, morfologii komórek i unikalnej organizacji komórek, nie są do końca znane. Co więcej, niejasny jest wpływ torebki soczewki i struktury komórkowej na ogólną funkcję soczewki (przezroczystość, zmiana kształtu soczewki). Jednak zależności te są wyjaśniane przy użyciu nowej metodologii obrazowania i ilościowych ocen cech strukturalnych i komórkowych soczewki2,4,19,20,21,22. Opracowano nowe protokoły obrazowania całych soczewek, które pozwalają na wizualizację torebki soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, komórek nabłonka i komórek włókien obwodowych. Obejmuje to metodologię ilościowego określania grubości kapsułki, wielkości komórki, wielkości jądra komórkowego i kolistości, południkowej kolejności rzędów, upakowania komórek włóknistych i szerokości komórek światłowodowych. Te metody wizualizacji i kwantyfikacji obrazu umożliwiają dogłębne badanie morfometryczne i mają przewagę nad innymi metodami wizualizacji (obrazowanie płaskich mocowań lub skrawków tkanek) poprzez zachowanie ogólnej struktury tkanki 3D. Metody te pozwoliły na przetestowanie nowych hipotez i umożliwią dalszy postęp w zrozumieniu rozwoju i funkcji komórek soczewki.

Do poniższych eksperymentów używamy myszy typu dzikiego i Rosa26-tdTomato tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) w tle C57BL/6J w wieku od 6 do 10 tygodni, obu płci. Myszy tdTomato pozwalają na wizualizację komórkowych błon plazmatycznych w żywych soczewkach poprzez ekspresję białka tdTomato połączonego z N-końcowymi 8 aminokwasami zmutowanego białka MARCKS, które celuje w błonę plazmatyczną poprzez N-końcową mirystylizację i wewnętrzne miejsca palmitoilacji cysteiny23. Używamy również NMIIAE1841K/E1841K mice24 uzyskanego pierwotnie od dr Roberta Adelsteina (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Jak opisano wcześniej20, myszy NMIIAE1841K/E1841K w tle FvBN/129SvEv/C57Bl6, które mają utratę białka pośredniego CP49 (zachowuje morfologię dojrzałych komórek włóknistych i biomechanikę całej soczewki), są krzyżowane wstecznie z myszami typu dzikiego C57BL6/J. Przebadaliśmy potomstwo pod kątem obecności allelu CP49 typu dzikiego.

Obrazowanie konfokalne zostało wykonane na laserowo-skaningowym konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym z powiększeniem 20x (NA = 0.8, odległość robocza = 0.55mm, 1x zoom), 40x (NA = 1.3 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.2mm, 1x zoom) lub 63x (NA = 1.4 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.19mm, 1x zoom) powiększeniem. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu rozmiaru otworka, który jest wyznacznikiem grubości przekroju optycznego, do 1 jednostki Airy'ego (wynikowe grubości optyczne są podane w legendach rycin). Obrazy zostały przetworzone na oprogramowaniu Zen Software. Obrazy zostały wyeksportowane do formatu .tif, a następnie zaimportowane do oprogramowania FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Myszy są trzymane w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Delaware, utrzymywanym w środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym eutanazja przez wdychanie CO2 , zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami na zwierzętach przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Delaware (IACUC).

1. Przygotowanie całego mocowania obiektywu i obrazowanie

  1. Mocowanie soczewek do obrazowania z pełnym mocowaniem
    1. Po eutanazji należy wyłuszczyć oczy i wypreparować soczewki, jak opisano wcześniej25. Po rozbiorzeniu należy natychmiast przenieść soczewki do świeżej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO4-7H 2O; pH 7,4) w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Morfologia komórkowa może ulec zmianie, jeśli soczewki są przechowywane w PBS przez dłuższy czas, dlatego zaleca się natychmiastowe utrwalenie w ciągu ~10 minut od rozwarstwienia.
    2. W przypadku obrazowania przedniej części soczewki w całości, należy utrwalić całe soczewki, zanurzając je w 0,5 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1x PBS. Przejdź do kroku 1.2 lub przechowuj w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Soczewki stałoogniskowe można przechowywać do 5 dni.
    3. W przypadku obrazowania obszaru paralaktycznego soczewki z pełnym mocowaniem, należy utrwalić całe soczewki, zanurzając je w 0,5 ml świeżo przygotowanego 4% PFA w 1x PBS w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1x PBS. Przejdź do kroku 1.3 lub przechowuj w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Soczewki stałoogniskowe można przechowywać do 5 dni.
  2. Całe mocowanie przedniego obszaru soczewki (stałe lub na żywo)
    1. W przypadku obrazowania obiektywów stałoogniskowych z pełnym mocowaniem przejdź do kroku 1.2.3.
    2. W przypadku obrazowania soczewek na żywo w całości należy przenieść soczewki do dołka 48-dołkowej płytki zawierającej 1 ml pożywki 199 (bez czerwieni fenolowej) zawierającej 1% antybiotyku/antybiotyku. Inkubować soczewki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu obrazowania. Przed obrazowaniem należy inkubować soczewki w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie aglutyninę z kiełków pszenicy (WGA-640, 1:500) i Hoechst 33342 (1:500) w pożywce 199 przez co najmniej 10 minut. Przejdź do kroku 1.5.
    3. Aby zabarwić torebkę soczewki, F-aktynę i jądra soczewek stałych, umieść soczewki w 500 μl roztworze zawierającym WGA-640 (1:500), rodaminę-falloidynę (1:50) i Hoechst 33342 (1:500) w buforze permeabilizacyjnym/blokującym (1x PBS zawierający 0,3% Tritonu, 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V) i 3% surowicy koziej) w probówce do mikrowirówki. Plamić soczewki w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Po całonocnej inkubacji umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1 ml 1x PBS. Przejdź do obrazowania soczewek.
    5. Aby ustabilizować soczewkę stałą do obrazowania konfokalnego, utwórz wgłębienia unieruchamiające soczewkę w agarozie na czaszy obrazowania, jak opisano wcześniej21 (Rysunek 1).
      1. Podgrzej i delikatnie wymieszaj 2% agarozy w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż roztwór się upłynni. Odpipetować 250 μl upłynnionej 2% agarozy do naczynia ze szklanym dnem (Rysunek 1A) i spłaszczyć agarozę na naczyniu za pomocą elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B). Gdy agaroza zostanie schłodzona i w pełni zestalona, usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1C) i użyj 3-milimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć otwór w agarozie w środku naczynia (Rysunek 1D).
      2. Usuń nadmiar agarozy za pomocą delikatnej chusteczki roboczej (Rysunek 1E). Utrzymuj pleśń agarozową nawodnioną 1x PBS i utrzymuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Formy agarozowe były z powodzeniem przechowywane do 1 tygodnia.
    6. Za pomocą kleszczyków do zarodków delikatnie przenieś żywą lub nieruchomą soczewkę do wgłębienia w agarozie (Ryc. 1F), zawierającej ~ 2 ml 1x PBS (soczewka stała) lub pożywki 199 bez czerwieni fenolowej (soczewka żywa), a następnie umieść naczynie na stoliku mikroskopu odwróconego. Aby potwierdzić, że soczewka znajduje się w przedniej części skierowanej w stronę obiektywu, wizualizuj barwienie jąder. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych jąder, tylny obszar może być skierowany w stronę celu.
    7. Aby odwrócić soczewkę, użyj zakrzywionych kleszczyków i delikatnie obróć soczewkę o ~180°, tak aby przednia część była skierowana w stronę obiektywu. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    8. Aby uwidocznić kapsułki soczewek, uzyskaj obrazy z-stack za pomocą obiektywu 40x o wielkości kroku 0,3 μm. Uzyskaj pierwszy obraz przed powierzchnią torebki soczewki (wskazywaną przez barwienie WGA) i ostatni obraz po wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka. Aby uwidocznić komórki nabłonkowe, należy uzyskać obrazy stosu z użyciem obiektywu 63x o rozmiarze kroku 0,3 μm w celu wizualizacji komórek nabłonka soczewki.
      UWAGA: Te parametry mikroskopu pozwalają na odpowiednią trójwymiarową (3D) rekonstrukcję obrazów, co jest niezbędne do ilościowego określenia obrazu grubości torebki lub obszaru komórek nabłonka. Możliwe jest również obrazowanie szwów w soczewkach tdTomato na żywo poprzez obrazowanie poza monowarstwą komórek nabłonka, jak opisano wcześniej4.
  3. Barwienie nabłonka równikowego soczewki i komórek włóknistych
    1. Umieść stałe soczewki w 0,5 ml roztworu rodaminy-falloidyny (1:300), WGA-640 (1:250) i Hoechst 33342 (1:500) w roztworze permeabilizacyjnym/blokującym (3% BSA, 3% surowica kozia i 0,3% Triton) w probówce do mikrowirówki. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Po całonocnej inkubacji umyj soczewki 3x w 1 ml 1x PBS (5 minut na pranie).
    3. Utwórz kliny agarozowe unieruchamiające soczewki, jak opisano wcześniej4,10.
      1. Krótko mówiąc, utwórz kliny agarozy w naczyniach ze szklanym dnem (FD35-100, WPI), wlewając ~ 5-6 ml stopionej 2% agarozy w 1x PBS do naczyń (Rysunek 2A). Gdy agaroza zastygnie (Rysunek 2B), utwórz trójkątne wgłębienie z ostrym ostrzem (Rysunek 2C). Usuń ćwiartkę agarozy i umieść 1 ml 1x PBS w naczyniu z agarozą (Rysunek 2D).
      2. Odessać wszelkie resztki agarozy, które mogą pozostać po przecięciu agarozy. Na każdą miskę można utworzyć wiele klinów, aby pasowały do wielu różnych rozmiarów soczewek (nie pokazano). Aby przechowywać formę agarozową, umieść 1 ml 1x PBS na formie agarozowej i utrzymuj w temperaturze 4 °C. Ćwiartki można przechowywać do 1 tygodnia.
    4. Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść soczewkę w klinu agarozowym zawierającym 1 ml 1x PBS i wyreguluj tak, aby obszar równikowy soczewki był skierowany w dół na szkło mikroskopu nad obiektywem konfokalnym (Rysunek 2E-F). Aby potwierdzić, że obszar równikowy jest ostry, zwizualizuj jądra i upewnij się, że jądra są wyrównane w rzędach na równiku. Komórki nabłonka równikowego można również zidentyfikować, ponieważ są nieregularnie upakowane i ukształtowane. Ponadto południkowe komórki rzędowe są precyzyjnie wyrównane i mają sześciokątny kształt, na co wskazuje barwienie F-aktyną na błonach komórkowych.
    5. Jeśli jądra w polu widzenia są upakowane losowo, przednia strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. Jeśli nie można zaobserwować jąder, to najprawdopodobniej tylna strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. Jeśli soczewka nie znajduje się na równiku, zmień orientację soczewki i użyj zakrzywionej pęsety, aby obrócić soczewkę, aż do zaobserwowania precyzyjnie ustawionych jąder na równiku soczewki.
    6. Zobrazuj nabłonek równikowy soczewki i komórki włókien za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (obiektyw 20x, NA = 0,8, rozmiar kroku 0,5 μm i/lub obiektyw olejowy 40x, NA = 1,3, rozmiar kroku 0,4 μm). Obróć obrazy przed kolekcją z-stack, w której komórki nabłonka równikowego znajdują się na górze, a następnie rząd południkowy i komórki włókien tuż poniżej.

2. Metodologia analizy obrazu

  1. Pomiar grubości kapsułki soczewki
    1. Korzystając z obrazów z-stack uzyskanych za pomocą obiektywu 40x (rozmiar kroku 0,3 μm) soczewek na żywo tdTomato oznaczonych WGA lub soczewek stałopozycyjnych oznaczonych WGA i rho-falloidyną, uzyskaj optyczną projekcję 2D w widoku XZ rekonstrukcji 3D i zapisz w .tif formacie. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania Zen.
    2. Otwórz obrazy plasterków XZ (.tif) w oprogramowaniu FIJI ImageJ.
    3. Aby zmierzyć grubość kapsułki soczewki, użyj funkcji linii prostej (przedstawionej w Rysunek 3A,B). Ustaw szerokość linii na 50 pikseli, wybierając opcje Edytuj > > Szerokość linii. Ta szerokość linii została empirycznie określona, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu przy ustawieniach mikroskopu. Optymalna szerokość linii może się różnić w przypadku innych mikroskopów/ustawień mikroskopu lub w przypadku korzystania z soczewek innych gatunków. Następnie narysuj linię od górnej powierzchni kapsułki do poniżej obszaru podstawnego komórek nabłonka.
    4. Zapisz wiersz jako obszar zainteresowania, naciskając Ctrl + T.
    5. Podziel kanały na zakładki obrazu, koloru i podziału.
    6. Zmierz intensywność wzdłuż linii kanału kapsułki, naciskając Ctrl + K.
    7. W arkuszu kalkulacyjnym wykreśl wartości intensywności w funkcji odległości i określ szczyty intensywności dla kapsułki i F-aktyny, które reprezentują odpowiednio powierzchnię torebki i obszar podstawny komórek nabłonka. Na osi x znajduje się odległość w linii.
    8. Następnie oblicz grubość kapsułki, określając odległość między pikami intensywności fluorescencji kapsułki a nabłonkiem (Rysunek 3C, D).
  2. Analiza obszaru komórki
    1. Korzystając z obrazów z-stack uzyskanych za pomocą soczewki obiektywowej 63x (NA = 1,4; rozmiar kroku 0,3 μm) na żywych soczewkach tdTomato lub soczewkach stałoogniskowych oznaczonych falloidyną, przeanalizuj wycinek widoku XY z obrazu konfokalnego z-stack odpowiadający miejscu, w którym ostry jest środkowy (boczny) obszar komórek nabłonka. Zwróć uwagę, że błony boczne są widoczne za pomocą barwnika błony tdTomato lub poprzez wizualizację falloidyny, która jest obecna na bocznych błonach komórkowych.
      UWAGA: Ze względu na krzywiznę obiektywu (widzianą w widoku XZ; Rysunek 4A-C), nie wszystkie komórki nabłonkowe będą ostre na obrazie. Środkowy obszar nabłonka odpowiada obszarowi, w którym skupiają się zarówno boczne błony komórkowe (Rysunek 4D-E), jak i jądra (Figura 4G-I).
    2. Wyeksportuj obraz jako .tif i otwórz go w FIJI ImageJ.
    3. Aby ustawić skalę w FIJI ImageJ do analizy, użyj narzędzia linia, aby utworzyć linię o długości podziałki liniowej na podstawie obrazu konfokalnego.
    4. Zapisz długość linii w pikselach i długość podziałki liniowej. Przejdź do pozycji Analizuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Ustaw skalę. Wprowadź liczbę pikseli, czyli długość linii, w polu Odległość w pikselach, a w polu Znana odległość wprowadź znaną długość podziałki liniowej.
    5. Używając barwienia tdTomato lub rodamino-falloidyny jako wskazania granic komórek, ręcznie obrysuj populację komórek, które są ostre na obrazie, za pomocą narzędzia wielokątnego. Śledź tylko komórki, w których widoczne są błony boczne (Rysunek 4E) i unikaj śledzenia częściowo widocznych komórek (tj. na krawędzi obrazów). Zapisz zwrot z inwestycji, naciskając Ctrl+T. Przejdź do opcji Edytuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Teraz zmierz całkowitą powierzchnię komórki (ROI), naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ.
    6. Oblicz średnią powierzchnię komórki, dzieląc obszar ROI przez całkowitą liczbę komórek. Prostym sposobem określenia liczby komórek jest zliczenie liczby jąder. Przejdź do kanału jądrowego (niebieski). W menu ROI wybierz zapisany konspekt ROI komórek (Rysunek 4G). Wyczyść poza ROI, przechodząc do Edycja, a następnie klikając Wyczyść na zewnątrz (Rysunek 4H). Za pomocą narzędzia Multi-point policz jądra, klikając poszczególne jądra.
  3. Komórkowa analiza obszaru jądrowego i kształtu
    1. W przypadku analizy obszaru i kształtu jąder należy przeanalizować przekrój optyczny w płaszczyźnie XY z obrazu konfokalnego stosu z odpowiadającego miejscu, w którym znajduje się ostry środkowy (boczny) obszar komórek nabłonka tdPomidora. Przeanalizuj wycinek stosu z obrazu konfokalnego, w którym obszar jądrowy jest największy (Rysunek 5A); Reprezentuje środkową część jąder.
      UWAGA: Zauważ, że ze względu na krzywiznę soczewki, nie wszystkie jądra będą ostre, co można zobaczyć w widoku XZ (Rysunek 4G i Rysunek 5A).
    2. Wybierz subpopulację jąder, które są w centrum uwagi, i zapisz zwrot z inwestycji.
    3. Użyj funkcji Clear Outside. W obrębie ROI, korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego (czwarty przycisk menu od lewej), ostrożnie prześledź granice jąder (Rysunek 5B). Zapisz każdy ślad jądrowy w oknie ROI, naciskając Ctrl+T. Nakreśl tylko jądra, w których widać całe jądra, a jądra nie stykają się ze sobą.
    4. Gdy wszystkie jądra zostaną obrysowane, zmierz obszar jądra i kształt poszczególnych komórek (tj. okrągłość), naciskając Ctrl + M.
    5. Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią powierzchnię jądrową i cyrkularność (Rysunek 5C).
  4. Upakowanie nabłonka południkowego rzędu
    1. Aby zmierzyć zaburzenie rzędów południkowych, uzyskaj obrazy za pomocą obiektywu 20x (rozmiar kroku 0,5 μm).
    2. Zidentyfikuj punkt podparcia/modiolus obiektywu na obrazach. Punkt podparcia to obszar, w którym wierzchołkowe końce wydłużających się komórek nabłonkowych zwężają się, tworząc punkt zaczepienia podczas początkowego różnicowania i wydłużania komórek włóknistych na równiku. Zidentyfikuj punkt podparcia na podstawie jasnej intensywności F-aktyny (oznaczonej grotem strzałki w widoku XZ w Rysunek 6A; oznaczona czerwoną przerywaną linią w Rysunek 6B) i zmiana organizacji komórkowej w pojedynczym przekroju optycznym w widoku XY.
      UWAGA: Ponadto, barwienie F-aktyną zarówno w podstawnych, jak i wierzchołkowych obszarach komórek nabłonkowych jest widoczne powyżej punktu podparcia, podczas gdy tylko podstawowy obszar wydłużających się komórek jest widoczny poniżej punktu podparcia (Figura 6A). Komórki nabłonkowe powyżej linii podparcia są nieregularnie upakowane i mają tendencję do tworzenia rozet, podczas gdy komórki włókniste poniżej punktu podparcia są ułożone w równoległych rzędach, na co wskazuje jasne zabarwienie F-aktyną na błonie (Figura 6B).
    3. Po zidentyfikowaniu punktu podparcia u 2-miesięcznych myszy wybierz pojedynczą sekcję optyczną ~ 4,5-5 μm obwodową do punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki) w płaszczyźnie XY. Odległość ta jest wybierana na podstawie obserwacji, że wszystkie jądra południkowych komórek rzędowych u 2-miesięcznych myszy są zogniskowane, gdy znajdują się ~ 5 μm na obrzeżach punktu podparcia. Zapisz pojedynczą sekcję optyczną (.tif). Otwórz obraz na FIJI.
      UWAGA: Ta analiza została przeprowadzona tylko na 2-miesięcznych myszach i dlatego nie można stwierdzić, czy odległość ta zmienia się wraz z wiekiem.
    4. Przed wykonaniem analizy obrazu ustaw skalę na μm w ImageJ, wykonując krok 2.2.2.
    5. Ręcznie obrysuj całe południkowe obszary rzędów za pomocą narzędzia linii odręcznej (obszar zainteresowania / ROI), identyfikując wyrównanie jądra, jak pokazano na Rysunek 7A. Zapisz zwrot z inwestycji, naciskając Ctrl+T. Przejdź do opcji Edytuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Zmierz całkowitą powierzchnię komórki (ROI), naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ.
    6. Zidentyfikuj wszelkie obszary zaburzeń wskazane przez barwienie F-aktyną, konturując je za pomocą narzędzia linii odręcznej w FIJI ImageJ. Kryteria dla nieuporządkowanych regionów obejmują rozgałęzienia rzędów, nieregularne upakowanie i niewspółosiowość rzędów (Rysunek 7B), jak pokazano wcześniej20.
    7. Zmierz zarysowany nieuporządkowany obszar/załatany, naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ. Zsumuj całkowity nieuporządkowany obszar w arkuszu kalkulacyjnym.
    8. Podziel całkowity nieuporządkowany obszar przez obszar ROI, a następnie pomnóż przez 100, aby uzyskać procent nieuporządkowanego obszaru. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego zaburzenia, umieść wartość 0% dla nieuporządkowanego obszaru.
  5. Południkowy numer rzędu sąsiednich komórek
    1. Aby zmierzyć liczbę sąsiednich komórek, użyj obrazów wybarwionych F-aktyną uzyskanych za pomocą obiektywu olejowego 40x (krok co 0,4 μm).
    2. Zidentyfikuj przekrój optyczny (płaszczyzna XY) w podstawowym obszarze komórek rzędu południkowego do wewnątrz od torebki soczewki, gdzie F-aktyna jest wzbogacona na całym obwodzie komórek rzędu południkowego, wszystkie komórki rzędu południkowego są skupione i znajdują się na tej samej płaszczyźnie.
    3. Policz liczbę sąsiednich komórek, które ma każda komórka rzędu południkowego (Rysunek 8). Zmierz średni odsetek komórek z sześcioma sąsiadującymi komórkami w arkuszu kalkulacyjnym.
      UWAGA: Określ liczbę sąsiadujących komórek za pomocą obiektywu 20x. Jednak znacznie łatwiej jest zaobserwować kształt sześciokąta za pomocą obiektywu 40x.
  6. Analiza obrazu komórek włókien równikowych
    1. Wykonaj konfokalne obrazy ze stosem z soczewkami barwionymi rodaminą falloidyną za pomocą obiektywu 20x (rozmiar kroku 0,5 μm).
    2. Zidentyfikuj punkt podparcia, jak wskazano w kroku 2.4.2. Po zidentyfikowaniu punktu podparcia wybierz pojedynczą sekcję optyczną. Dla celów standaryzacji i porównania soczewek, określ ilościowo szerokości komórek światłowodowych ~ 10 μm do wewnątrz od punktu podparcia w płaszczyźnie XY (Rysunek 9A).
    3. Eksportuj surowe obrazy do FIJI ImageJ. W FIJI ImageJ narysuj linię (zwykle o długości ~300-400 μm) przez kilka sąsiednich komórek światłowodowych, aby zmierzyć odległość między pikami barwionymi F-aktyną (analiza skanowania linii; Rysunek 9A; różowa linia).
    4. Uzyskaj intensywność fluorescencji na linii skanowania w FIDŻI, naciskając Ctrl+K. Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć odległość międzyszczytową (przykład pokazany w Rysunek 9A-B). Odpowiada to szerokościom komórek światłowodowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przednia torebka soczewki, obszar komórek nabłonkowych i obszar jądra
Aby przeanalizować grubość torebki soczewki, barwiliśmy torebki soczewek, zarówno w soczewkach żywych, jak i utrwalonych, za pomocą WGA. Komórki nabłonka soczewki identyfikowano poprzez znakowanie błon tdTomato w żywych soczewkach (Ryc. 2A) lub poprzez barwienie rodaminą-falloidyną w celu wykazania F-aktyny w błonach komórkowych w soczewkach utrwalonych (Ryc. 2B). W projek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Opisane protokoły umożliwiają wizualizację w wysokiej rozdzielczości przestrzennej obwodowych struktur i komórek soczewki w przednim i równikowym obszarze soczewki. W pracy przedstawiono metody wizualizacji struktur peryferyjnych soczewek przy użyciu nienaruszonych soczewek (aktywnych lub stałych), w których zachowana jest ogólna architektura soczewek 3D. Dodatkowo dostarczono proste metody morfometrycznej analizy ilościowej z wykorzystaniem publicznie dostępnego oprogramowania FIJI ImageJ. Metody wizualizacji i kwantyfi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute Grant R01 EY032056 dla CC i R01 EY017724 dla VMF, a także przez National Institute of General Medical Sciences w ramach grantu numer P20GM139760. STI był wspierany przez NIH-NIGMS T32-GM133395 w ramach programu szkolenia przeddoktoranckiego Chemistry-Biology Interface oraz przez University of Delaware Graduate Scholars Award.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3 mm Dziurkacz do biopsjiAcuderm IncNC9084780
AgarozaApex BioResearch Products20-102GP
Przeciwgrzybiczy/antybiotykowyCytivaSV30079.01
Albumina surowicy bydlęcej (frakcja V)Prometheus25-529
Delikatne chusteczki do zadańKimwipe
Naczynie ze szklanym dnem ( Fluorodish)World Precision InternationalFD35-100
Hoescht 33342Biotium40046
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 880Zeiss
MatTek ImagingDish MatTek Life SciencesP35G-1.5-14
Paraformaldehyd Mikroskopia elektronowa Nauki100503-917
PBSGenClone25-507B
Pożywka fenolowa wolna od czerwieni 199Gibco11043023
Rodamino-falloidynaThermo Fisher00027
Triton X100Sigma-Aldrich11332481001
WGA-640BiotiumCF 640R

Bibliografia

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129(2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086(2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101(1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695(2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638(2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20(2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376(2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986(2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Organizacja soczewkimikroskopia konfokalnakomórki nabłonkowekomórki włókiengrubość torebkiobrazowanie w stosach Zunieruchomienie w agarozie
Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.