Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

Summary

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Abstract

Soczewka oczna to przezroczysta, elastyczna tkanka, która zmienia swój kształt, aby skupić światło z różnych odległości na siatkówce. Oprócz błony podstawnej otaczającej narząd, zwanej torebką, soczewka jest całkowicie komórkowa składająca się z monowarstwy komórek nabłonkowych na przedniej półkuli i dużej masy komórek włókien soczewki. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się w strefie kiełkowania na równiku soczewki, a komórki nabłonka równikowego migrują, wydłużają się i różnicują w nowo powstałe komórki włókniste. Komórki nabłonka równikowego znacznie zmieniają morfologię od losowo upakowanych komórek w kształcie kostki brukowej w wyrównane komórki w kształcie sześciokąta tworzące rzędy południkowe. Nowo utworzone komórki włókien soczewkowych zachowują sześciokątny kształt komórki i wydłużają się w kierunku przedniego i tylnego bieguna, tworząc nową powłokę komórek, które są nakładane na poprzednie generacje włókien. Niewiele wiadomo na temat mechanizmów, które napędzają niezwykłą morfogenezę komórek nabłonka soczewki do komórek włóknistych. Aby lepiej zrozumieć strukturę, rozwój i funkcję soczewki, opracowano nowe protokoły obrazowania do obrazowania struktur peryferyjnych przy użyciu całych mocowań soczewek ocznych. Tutaj pokazano metody ilościowego określania grubości kapsułki, obszaru komórki nabłonkowej, obszaru i kształtu jądra komórki, południkowej kolejności komórek rzędowych i upakowania oraz szerokości komórek włókien. Pomiary te są niezbędne do wyjaśnienia zmian komórkowych, które zachodzą podczas wzrostu soczewki przez całe życie i zrozumienia zmian zachodzących wraz z wiekiem lub patologią.

Introduction

Soczewka oczna to elastyczna, przezroczysta tkanka znajdująca się w przedniej części oka, która działa w celu precyzyjnego skupienia światła na siatkówce. Zdolność obiektywu do działania można częściowo przypisać jego skomplikowanej architekturze i organizacji^1,2,3,4,5,6. Wokół tkanki soczewki znajduje się torebka, błona podstawna niezbędna do utrzymania struktury soczewki i właściwości biomechanicznych^7,8,9. Sama soczewka jest całkowicie komórkowa, składa się z dwóch typów komórek: komórek nabłonkowych i włóknistych. Warstwa nabłonkowa składa się z monowarstwy prostopadłościennych komórek, które pokrywają przednią półkulę soczewki¹⁰. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się i migrują wzdłuż torebki soczewki w kierunku równika soczewki. Komórki nabłonka przedniego są spokojne i brukowe w przekroju poprzecznym, a w pobliżu równika soczewki komórki nabłonkowe namnażają się i zaczynają przechodzić proces różnicowania w nowe komórki włókniste^11,12. Komórki nabłonka równikowego przekształcają się z losowo upakowanych komórek w zorganizowane rzędy południkowe z komórkami w kształcie sześciokąta. Sześciokątny kształt komórki jest zachowany po stronie podstawy tych różnicujących się komórek, podczas gdy strona wierzchołkowa zwęża się i zakotwicza w punkcie podparcia soczewki lub modiolus^4,13,14,15. Gdy komórki nabłonka równikowego zaczynają wydłużać się w nowo powstałe komórki włókniste, wierzchołkowe końcówki komórek migrują wzdłuż wierzchołkowej powierzchni przednich komórek nabłonka w kierunku bieguna przedniego, podczas gdy końcówki podstawy poruszają się wzdłuż torebki soczewki w kierunku bieguna tylnego. Nowe generacje komórek włóknistych nakładają się na poprzednie generacje komórek, tworząc sferyczne powłoki włókien. Podczas procesu wydłużania i dojrzewania komórek włóknistych znacznie zmieniają swoją morfologię^11,12,16. Te komórki światłowodowe stanowią większość masy soczewki^{11,12,16,17,18}.

Mechanizmy molekularne, które przyczyniają się do tworzenia skomplikowanych mikrostruktur soczewek, morfologii komórek i unikalnej organizacji komórek, nie są do końca znane. Co więcej, niejasny jest wpływ torebki soczewki i struktury komórkowej na ogólną funkcję soczewki (przezroczystość, zmiana kształtu soczewki). Jednak zależności te są wyjaśniane przy użyciu nowej metodologii obrazowania i ilościowych ocen cech strukturalnych i komórkowych soczewki^{2,4,19,20,21,22}. Opracowano nowe protokoły obrazowania całych soczewek, które pozwalają na wizualizację torebki soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, komórek nabłonka i komórek włókien obwodowych. Obejmuje to metodologię ilościowego określania grubości kapsułki, wielkości komórki, wielkości jądra komórkowego i kolistości, południkowej kolejności rzędów, upakowania komórek włóknistych i szerokości komórek światłowodowych. Te metody wizualizacji i kwantyfikacji obrazu umożliwiają dogłębne badanie morfometryczne i mają przewagę nad innymi metodami wizualizacji (obrazowanie płaskich mocowań lub skrawków tkanek) poprzez zachowanie ogólnej struktury tkanki 3D. Metody te pozwoliły na przetestowanie nowych hipotez i umożliwią dalszy postęp w zrozumieniu rozwoju i funkcji komórek soczewki.

Do poniższych eksperymentów używamy myszy typu dzikiego i Rosa26-tdTomato tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)²³ (Jackson Laboratories) w tle C57BL/6J w wieku od 6 do 10 tygodni, obu płci. Myszy tdTomato pozwalają na wizualizację komórkowych błon plazmatycznych w żywych soczewkach poprzez ekspresję białka tdTomato połączonego z N-końcowymi 8 aminokwasami zmutowanego białka MARCKS, które celuje w błonę plazmatyczną poprzez N-końcową mirystylizację i wewnętrzne miejsca palmitoilacji cysteiny²³. Używamy również NMIIA^{E1841K/E1841K} mice²⁴ uzyskanego pierwotnie od dr Roberta Adelsteina (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Jak opisano wcześniej²⁰, myszy NMIIA^{E1841K/E1841K} w tle FvBN/129SvEv/C57Bl6, które mają utratę białka pośredniego CP49 (zachowuje morfologię dojrzałych komórek włóknistych i biomechanikę całej soczewki), są krzyżowane wstecznie z myszami typu dzikiego C57BL6/J. Przebadaliśmy potomstwo pod kątem obecności allelu CP49 typu dzikiego.

Obrazowanie konfokalne zostało wykonane na laserowo-skaningowym konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym z powiększeniem 20x (NA = 0.8, odległość robocza = 0.55mm, 1x zoom), 40x (NA = 1.3 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.2mm, 1x zoom) lub 63x (NA = 1.4 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.19mm, 1x zoom) powiększeniem. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu rozmiaru otworka, który jest wyznacznikiem grubości przekroju optycznego, do 1 jednostki Airy'ego (wynikowe grubości optyczne są podane w legendach rycin). Obrazy zostały przetworzone na oprogramowaniu Zen Software. Obrazy zostały wyeksportowane do formatu .tif, a następnie zaimportowane do oprogramowania FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Protocol

Myszy są trzymane w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Delaware, utrzymywanym w środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym eutanazja przez wdychanie CO_{2 ,} zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami na zwierzętach przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Delaware (IACUC).

1. Przygotowanie całego mocowania obiektywu i obrazowanie

1. Mocowanie soczewek do obrazowania z pełnym mocowaniem
   1. Po eutanazji należy wyłuszczyć oczy i wypreparować soczewki, jak opisano wcześniej²⁵. Po rozbiorzeniu należy natychmiast przenieść soczewki do świeżej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS; 1,1 mM KH₂PO₄, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na₂HPO_{4-7H 2}O; pH 7,4) w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Morfologia komórkowa może ulec zmianie, jeśli soczewki są przechowywane w PBS przez dłuższy czas, dlatego zaleca się natychmiastowe utrwalenie w ciągu ~10 minut od rozwarstwienia.
   2. W przypadku obrazowania przedniej części soczewki w całości, należy utrwalić całe soczewki, zanurzając je w 0,5 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1x PBS. Przejdź do kroku 1.2 lub przechowuj w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Soczewki stałoogniskowe można przechowywać do 5 dni.
   3. W przypadku obrazowania obszaru paralaktycznego soczewki z pełnym mocowaniem, należy utrwalić całe soczewki, zanurzając je w 0,5 ml świeżo przygotowanego 4% PFA w 1x PBS w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1x PBS. Przejdź do kroku 1.3 lub przechowuj w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Soczewki stałoogniskowe można przechowywać do 5 dni.
2. Całe mocowanie przedniego obszaru soczewki (stałe lub na żywo)
   1. W przypadku obrazowania obiektywów stałoogniskowych z pełnym mocowaniem przejdź do kroku 1.2.3.
   2. W przypadku obrazowania soczewek na żywo w całości należy przenieść soczewki do dołka 48-dołkowej płytki zawierającej 1 ml pożywki 199 (bez czerwieni fenolowej) zawierającej 1% antybiotyku/antybiotyku. Inkubować soczewki w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ do momentu obrazowania. Przed obrazowaniem należy inkubować soczewki w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie aglutyninę z kiełków pszenicy (WGA-640, 1:500) i Hoechst 33342 (1:500) w pożywce 199 przez co najmniej 10 minut. Przejdź do kroku 1.5.
   3. Aby zabarwić torebkę soczewki, F-aktynę i jądra soczewek stałych, umieść soczewki w 500 μl roztworze zawierającym WGA-640 (1:500), rodaminę-falloidynę (1:50) i Hoechst 33342 (1:500) w buforze permeabilizacyjnym/blokującym (1x PBS zawierający 0,3% Tritonu, 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V) i 3% surowicy koziej) w probówce do mikrowirówki. Plamić soczewki w temperaturze 4 °C przez noc.
   4. Po całonocnej inkubacji umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1 ml 1x PBS. Przejdź do obrazowania soczewek.
   5. Aby ustabilizować soczewkę stałą do obrazowania konfokalnego, utwórz wgłębienia unieruchamiające soczewkę w agarozie na czaszy obrazowania, jak opisano wcześniej²¹ (Rysunek 1).
      1. Podgrzej i delikatnie wymieszaj 2% agarozy w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż roztwór się upłynni. Odpipetować 250 μl upłynnionej 2% agarozy do naczynia ze szklanym dnem (Rysunek 1A) i spłaszczyć agarozę na naczyniu za pomocą elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B). Gdy agaroza zostanie schłodzona i w pełni zestalona, usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1C) i użyj 3-milimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć otwór w agarozie w środku naczynia (Rysunek 1D).
      2. Usuń nadmiar agarozy za pomocą delikatnej chusteczki roboczej (Rysunek 1E). Utrzymuj pleśń agarozową nawodnioną 1x PBS i utrzymuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Formy agarozowe były z powodzeniem przechowywane do 1 tygodnia.
   6. Za pomocą kleszczyków do zarodków delikatnie przenieś żywą lub nieruchomą soczewkę do wgłębienia w agarozie (Ryc. 1F), zawierającej ~ 2 ml 1x PBS (soczewka stała) lub pożywki 199 bez czerwieni fenolowej (soczewka żywa), a następnie umieść naczynie na stoliku mikroskopu odwróconego. Aby potwierdzić, że soczewka znajduje się w przedniej części skierowanej w stronę obiektywu, wizualizuj barwienie jąder. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych jąder, tylny obszar może być skierowany w stronę celu.
   7. Aby odwrócić soczewkę, użyj zakrzywionych kleszczyków i delikatnie obróć soczewkę o ~180°, tak aby przednia część była skierowana w stronę obiektywu. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego.
   8. Aby uwidocznić kapsułki soczewek, uzyskaj obrazy z-stack za pomocą obiektywu 40x o wielkości kroku 0,3 μm. Uzyskaj pierwszy obraz przed powierzchnią torebki soczewki (wskazywaną przez barwienie WGA) i ostatni obraz po wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka. Aby uwidocznić komórki nabłonkowe, należy uzyskać obrazy stosu z użyciem obiektywu 63x o rozmiarze kroku 0,3 μm w celu wizualizacji komórek nabłonka soczewki.
      UWAGA: Te parametry mikroskopu pozwalają na odpowiednią trójwymiarową (3D) rekonstrukcję obrazów, co jest niezbędne do ilościowego określenia obrazu grubości torebki lub obszaru komórek nabłonka. Możliwe jest również obrazowanie szwów w soczewkach tdTomato na żywo poprzez obrazowanie poza monowarstwą komórek nabłonka, jak opisano wcześniej⁴.
3. Barwienie nabłonka równikowego soczewki i komórek włóknistych
   1. Umieść stałe soczewki w 0,5 ml roztworu rodaminy-falloidyny (1:300), WGA-640 (1:250) i Hoechst 33342 (1:500) w roztworze permeabilizacyjnym/blokującym (3% BSA, 3% surowica kozia i 0,3% Triton) w probówce do mikrowirówki. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez noc.
   2. Po całonocnej inkubacji umyj soczewki 3x w 1 ml 1x PBS (5 minut na pranie).
   3. Utwórz kliny agarozowe unieruchamiające soczewki, jak opisano wcześniej^4,10.
      1. Krótko mówiąc, utwórz kliny agarozy w naczyniach ze szklanym dnem (FD35-100, WPI), wlewając ~ 5-6 ml stopionej 2% agarozy w 1x PBS do naczyń (Rysunek 2A). Gdy agaroza zastygnie (Rysunek 2B), utwórz trójkątne wgłębienie z ostrym ostrzem (Rysunek 2C). Usuń ćwiartkę agarozy i umieść 1 ml 1x PBS w naczyniu z agarozą (Rysunek 2D).
      2. Odessać wszelkie resztki agarozy, które mogą pozostać po przecięciu agarozy. Na każdą miskę można utworzyć wiele klinów, aby pasowały do wielu różnych rozmiarów soczewek (nie pokazano). Aby przechowywać formę agarozową, umieść 1 ml 1x PBS na formie agarozowej i utrzymuj w temperaturze 4 °C. Ćwiartki można przechowywać do 1 tygodnia.
   4. Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść soczewkę w klinu agarozowym zawierającym 1 ml 1x PBS i wyreguluj tak, aby obszar równikowy soczewki był skierowany w dół na szkło mikroskopu nad obiektywem konfokalnym (Rysunek 2E-F). Aby potwierdzić, że obszar równikowy jest ostry, zwizualizuj jądra i upewnij się, że jądra są wyrównane w rzędach na równiku. Komórki nabłonka równikowego można również zidentyfikować, ponieważ są nieregularnie upakowane i ukształtowane. Ponadto południkowe komórki rzędowe są precyzyjnie wyrównane i mają sześciokątny kształt, na co wskazuje barwienie F-aktyną na błonach komórkowych.
   5. Jeśli jądra w polu widzenia są upakowane losowo, przednia strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. Jeśli nie można zaobserwować jąder, to najprawdopodobniej tylna strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. Jeśli soczewka nie znajduje się na równiku, zmień orientację soczewki i użyj zakrzywionej pęsety, aby obrócić soczewkę, aż do zaobserwowania precyzyjnie ustawionych jąder na równiku soczewki.
   6. Zobrazuj nabłonek równikowy soczewki i komórki włókien za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (obiektyw 20x, NA = 0,8, rozmiar kroku 0,5 μm i/lub obiektyw olejowy 40x, NA = 1,3, rozmiar kroku 0,4 μm). Obróć obrazy przed kolekcją z-stack, w której komórki nabłonka równikowego znajdują się na górze, a następnie rząd południkowy i komórki włókien tuż poniżej.

2. Metodologia analizy obrazu

1. Pomiar grubości kapsułki soczewki
   1. Korzystając z obrazów z-stack uzyskanych za pomocą obiektywu 40x (rozmiar kroku 0,3 μm) soczewek na żywo tdTomato oznaczonych WGA lub soczewek stałopozycyjnych oznaczonych WGA i rho-falloidyną, uzyskaj optyczną projekcję 2D w widoku XZ rekonstrukcji 3D i zapisz w .tif formacie. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania Zen.
   2. Otwórz obrazy plasterków XZ (.tif) w oprogramowaniu FIJI ImageJ.
   3. Aby zmierzyć grubość kapsułki soczewki, użyj funkcji linii prostej (przedstawionej w Rysunek 3A,B). Ustaw szerokość linii na 50 pikseli, wybierając opcje Edytuj > > Szerokość linii. Ta szerokość linii została empirycznie określona, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu przy ustawieniach mikroskopu. Optymalna szerokość linii może się różnić w przypadku innych mikroskopów/ustawień mikroskopu lub w przypadku korzystania z soczewek innych gatunków. Następnie narysuj linię od górnej powierzchni kapsułki do poniżej obszaru podstawnego komórek nabłonka.
   4. Zapisz wiersz jako obszar zainteresowania, naciskając Ctrl + T.
   5. Podziel kanały na zakładki obrazu, koloru i podziału.
   6. Zmierz intensywność wzdłuż linii kanału kapsułki, naciskając Ctrl + K.
   7. W arkuszu kalkulacyjnym wykreśl wartości intensywności w funkcji odległości i określ szczyty intensywności dla kapsułki i F-aktyny, które reprezentują odpowiednio powierzchnię torebki i obszar podstawny komórek nabłonka. Na osi x znajduje się odległość w linii.
   8. Następnie oblicz grubość kapsułki, określając odległość między pikami intensywności fluorescencji kapsułki a nabłonkiem (Rysunek 3C, D).
2. Analiza obszaru komórki
   1. Korzystając z obrazów z-stack uzyskanych za pomocą soczewki obiektywowej 63x (NA = 1,4; rozmiar kroku 0,3 μm) na żywych soczewkach tdTomato lub soczewkach stałoogniskowych oznaczonych falloidyną, przeanalizuj wycinek widoku XY z obrazu konfokalnego z-stack odpowiadający miejscu, w którym ostry jest środkowy (boczny) obszar komórek nabłonka. Zwróć uwagę, że błony boczne są widoczne za pomocą barwnika błony tdTomato lub poprzez wizualizację falloidyny, która jest obecna na bocznych błonach komórkowych.
      UWAGA: Ze względu na krzywiznę obiektywu (widzianą w widoku XZ; Rysunek 4A-C), nie wszystkie komórki nabłonkowe będą ostre na obrazie. Środkowy obszar nabłonka odpowiada obszarowi, w którym skupiają się zarówno boczne błony komórkowe (Rysunek 4D-E), jak i jądra (Figura 4G-I).
   2. Wyeksportuj obraz jako .tif i otwórz go w FIJI ImageJ.
   3. Aby ustawić skalę w FIJI ImageJ do analizy, użyj narzędzia linia, aby utworzyć linię o długości podziałki liniowej na podstawie obrazu konfokalnego.
   4. Zapisz długość linii w pikselach i długość podziałki liniowej. Przejdź do pozycji Analizuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Ustaw skalę. Wprowadź liczbę pikseli, czyli długość linii, w polu Odległość w pikselach, a w polu Znana odległość wprowadź znaną długość podziałki liniowej.
   5. Używając barwienia tdTomato lub rodamino-falloidyny jako wskazania granic komórek, ręcznie obrysuj populację komórek, które są ostre na obrazie, za pomocą narzędzia wielokątnego. Śledź tylko komórki, w których widoczne są błony boczne (Rysunek 4E) i unikaj śledzenia częściowo widocznych komórek (tj. na krawędzi obrazów). Zapisz zwrot z inwestycji, naciskając Ctrl+T. Przejdź do opcji Edytuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Teraz zmierz całkowitą powierzchnię komórki (ROI), naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ.
   6. Oblicz średnią powierzchnię komórki, dzieląc obszar ROI przez całkowitą liczbę komórek. Prostym sposobem określenia liczby komórek jest zliczenie liczby jąder. Przejdź do kanału jądrowego (niebieski). W menu ROI wybierz zapisany konspekt ROI komórek (Rysunek 4G). Wyczyść poza ROI, przechodząc do Edycja, a następnie klikając Wyczyść na zewnątrz (Rysunek 4H). Za pomocą narzędzia Multi-point policz jądra, klikając poszczególne jądra.
3. Komórkowa analiza obszaru jądrowego i kształtu
   1. W przypadku analizy obszaru i kształtu jąder należy przeanalizować przekrój optyczny w płaszczyźnie XY z obrazu konfokalnego stosu z odpowiadającego miejscu, w którym znajduje się ostry środkowy (boczny) obszar komórek nabłonka tdPomidora. Przeanalizuj wycinek stosu z obrazu konfokalnego, w którym obszar jądrowy jest największy (Rysunek 5A); Reprezentuje środkową część jąder.
      UWAGA: Zauważ, że ze względu na krzywiznę soczewki, nie wszystkie jądra będą ostre, co można zobaczyć w widoku XZ (Rysunek 4G i Rysunek 5A).
   2. Wybierz subpopulację jąder, które są w centrum uwagi, i zapisz zwrot z inwestycji.
   3. Użyj funkcji Clear Outside. W obrębie ROI, korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego (czwarty przycisk menu od lewej), ostrożnie prześledź granice jąder (Rysunek 5B). Zapisz każdy ślad jądrowy w oknie ROI, naciskając Ctrl+T. Nakreśl tylko jądra, w których widać całe jądra, a jądra nie stykają się ze sobą.
   4. Gdy wszystkie jądra zostaną obrysowane, zmierz obszar jądra i kształt poszczególnych komórek (tj. okrągłość), naciskając Ctrl + M.
   5. Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią powierzchnię jądrową i cyrkularność (Rysunek 5C).
4. Upakowanie nabłonka południkowego rzędu
   1. Aby zmierzyć zaburzenie rzędów południkowych, uzyskaj obrazy za pomocą obiektywu 20x (rozmiar kroku 0,5 μm).
   2. Zidentyfikuj punkt podparcia/modiolus obiektywu na obrazach. Punkt podparcia to obszar, w którym wierzchołkowe końce wydłużających się komórek nabłonkowych zwężają się, tworząc punkt zaczepienia podczas początkowego różnicowania i wydłużania komórek włóknistych na równiku. Zidentyfikuj punkt podparcia na podstawie jasnej intensywności F-aktyny (oznaczonej grotem strzałki w widoku XZ w Rysunek 6A; oznaczona czerwoną przerywaną linią w Rysunek 6B) i zmiana organizacji komórkowej w pojedynczym przekroju optycznym w widoku XY.
      UWAGA: Ponadto, barwienie F-aktyną zarówno w podstawnych, jak i wierzchołkowych obszarach komórek nabłonkowych jest widoczne powyżej punktu podparcia, podczas gdy tylko podstawowy obszar wydłużających się komórek jest widoczny poniżej punktu podparcia (Figura 6A). Komórki nabłonkowe powyżej linii podparcia są nieregularnie upakowane i mają tendencję do tworzenia rozet, podczas gdy komórki włókniste poniżej punktu podparcia są ułożone w równoległych rzędach, na co wskazuje jasne zabarwienie F-aktyną na błonie (Figura 6B).
   3. Po zidentyfikowaniu punktu podparcia u 2-miesięcznych myszy wybierz pojedynczą sekcję optyczną ~ 4,5-5 μm obwodową do punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki) w płaszczyźnie XY. Odległość ta jest wybierana na podstawie obserwacji, że wszystkie jądra południkowych komórek rzędowych u 2-miesięcznych myszy są zogniskowane, gdy znajdują się ~ 5 μm na obrzeżach punktu podparcia. Zapisz pojedynczą sekcję optyczną (.tif). Otwórz obraz na FIJI.
      UWAGA: Ta analiza została przeprowadzona tylko na 2-miesięcznych myszach i dlatego nie można stwierdzić, czy odległość ta zmienia się wraz z wiekiem.
   4. Przed wykonaniem analizy obrazu ustaw skalę na μm w ImageJ, wykonując krok 2.2.2.
   5. Ręcznie obrysuj całe południkowe obszary rzędów za pomocą narzędzia linii odręcznej (obszar zainteresowania / ROI), identyfikując wyrównanie jądra, jak pokazano na Rysunek 7A. Zapisz zwrot z inwestycji, naciskając Ctrl+T. Przejdź do opcji Edytuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Zmierz całkowitą powierzchnię komórki (ROI), naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ.
   6. Zidentyfikuj wszelkie obszary zaburzeń wskazane przez barwienie F-aktyną, konturując je za pomocą narzędzia linii odręcznej w FIJI ImageJ. Kryteria dla nieuporządkowanych regionów obejmują rozgałęzienia rzędów, nieregularne upakowanie i niewspółosiowość rzędów (Rysunek 7B), jak pokazano wcześniej²⁰.
   7. Zmierz zarysowany nieuporządkowany obszar/załatany, naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ. Zsumuj całkowity nieuporządkowany obszar w arkuszu kalkulacyjnym.
   8. Podziel całkowity nieuporządkowany obszar przez obszar ROI, a następnie pomnóż przez 100, aby uzyskać procent nieuporządkowanego obszaru. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego zaburzenia, umieść wartość 0% dla nieuporządkowanego obszaru.
5. Południkowy numer rzędu sąsiednich komórek
   1. Aby zmierzyć liczbę sąsiednich komórek, użyj obrazów wybarwionych F-aktyną uzyskanych za pomocą obiektywu olejowego 40x (krok co 0,4 μm).
   2. Zidentyfikuj przekrój optyczny (płaszczyzna XY) w podstawowym obszarze komórek rzędu południkowego do wewnątrz od torebki soczewki, gdzie F-aktyna jest wzbogacona na całym obwodzie komórek rzędu południkowego, wszystkie komórki rzędu południkowego są skupione i znajdują się na tej samej płaszczyźnie.
   3. Policz liczbę sąsiednich komórek, które ma każda komórka rzędu południkowego (Rysunek 8). Zmierz średni odsetek komórek z sześcioma sąsiadującymi komórkami w arkuszu kalkulacyjnym.
      UWAGA: Określ liczbę sąsiadujących komórek za pomocą obiektywu 20x. Jednak znacznie łatwiej jest zaobserwować kształt sześciokąta za pomocą obiektywu 40x.
6. Analiza obrazu komórek włókien równikowych
   1. Wykonaj konfokalne obrazy ze stosem z soczewkami barwionymi rodaminą falloidyną za pomocą obiektywu 20x (rozmiar kroku 0,5 μm).
   2. Zidentyfikuj punkt podparcia, jak wskazano w kroku 2.4.2. Po zidentyfikowaniu punktu podparcia wybierz pojedynczą sekcję optyczną. Dla celów standaryzacji i porównania soczewek, określ ilościowo szerokości komórek światłowodowych ~ 10 μm do wewnątrz od punktu podparcia w płaszczyźnie XY (Rysunek 9A).
   3. Eksportuj surowe obrazy do FIJI ImageJ. W FIJI ImageJ narysuj linię (zwykle o długości ~300-400 μm) przez kilka sąsiednich komórek światłowodowych, aby zmierzyć odległość między pikami barwionymi F-aktyną (analiza skanowania linii; Rysunek 9A; różowa linia).
   4. Uzyskaj intensywność fluorescencji na linii skanowania w FIDŻI, naciskając Ctrl+K. Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć odległość międzyszczytową (przykład pokazany w Rysunek 9A-B). Odpowiada to szerokościom komórek światłowodowych.

Results

Torebka przedniej soczewki, obszar komórki nabłonkowej i obszar jądrowy
Aby przeanalizować grubość kapsułki soczewki, zabarwiliśmy kapsułki soczewek, w soczewkach żywych lub stałych, za pomocą WGA. Zidentyfikowaliśmy komórki nabłonka soczewki, znakując błony tdTomato w żywych soczewkach (Figura 2A) lub poprzez barwienie rodaminą i falloidyną dla F-aktyny na błonach komórkowych w soczewkach stałych (Figura 2B). W projekcji ortogonalnej (XZ) barwienie dla WGA i tdPomidor/rodamina-falloidyna pozwala nam przeprowadzić analizę intensywności fluorescencji od piku do piku. Główny pik w kanale WGA wskazuje na powierzchnię torebki, podczas gdy główny pik w kanale tdTomato/rodamina-falloidyna wskazuje na obszar podstawny komórek nabłonkowych. Obliczając odległość między tymi pikami, możemy uzyskać grubość torebki. Analiza skanowania linii pokazuje, że kapsułki z 9-tygodniowej soczewki myszy miały grubość 11,2 μm, a kapsułki z 9-tygodniowej soczewki stałej myszy miały grubość 12,5 μm. Te zaobserwowane grubości kapsułek są reprezentatywne dla poprzednich wyników^2,4.

Całościowe obrazowanie transgenicznych soczewek myszy znakowanych tdTomato (lub soczewek barwionych rodaminą i falloidyną; nie pokazane) pozwala na wizualizację na żywo morfologii komórek nabłonkowych. Rzut ortogonalny (XZ) zapewnia widok z boku komórki nabłonka soczewki, podczas gdy widok płaski (XY) w obszarach bocznych pozwala na wizualizację wielokątnego kształtu nabłonka. W zdrowych soczewkach nie obserwujemy żadnych przerw między komórkami. Możemy obliczyć średnią powierzchnię komórki, śledząc populację komórek na obrazie i dzieląc obszar przez liczbę komórek w ROI. Liczbę komórek określa się poprzez zliczenie liczby jąder barwionych metodą Hoechsta w danym ROI. Analiza wykazała średnią powierzchnię komórki wynoszącą 260^μm2, co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami^2,4.

Barwienie jąder metodą Hoechst pozwala również na badanie morfometrii komórek nabłonka soczewki w komórkach nabłonkowych. Rzuty ortogonalne (XZ) pozwalają na widok jąder z boku. Widok płaski (XY) pokazuje koliste/elipsoidalne kształty jąder. Śledzenie jąder pozwala na obliczenie powierzchni jądrowej poszczególnych komórek i innych parametrów kształtu, takich jak okrągłość. Analiza wykazała, że średnia powierzchnia jądra wynosi 64^μm2 przy średniej okrągłości 0,8. Wartości kołowości bliskie 1 wskazują na idealne koło, podczas gdy wartości zbliżające się do 0 wskazują na bardziej wydłużoną morfologię.

Upakowanie komórek nabłonka równikowego, sześciokątne upakowanie komórek włóknistych i szerokości komórek włóknistych
Płaski (XY) widok obszaru równikowego soczewki pokazuje sześciokątne i regularnie upakowane komórki nabłonka soczewki, które zbiegają się w punkcie podparcia. Punkt podparcia to miejsce, w którym wierzchołkowe końce wydłużających się komórek nabłonka zwężają się, tworząc punkt zaczepienia podczas początkowego różnicowania i wydłużania komórek włóknistych na równiku^4,13,14,15 (Rysunek 6B, oznaczone czerwoną przerywaną linią). Punkt podparcia może być zlokalizowany w oparciu o zwiększone barwienie F-aktyną, tworząc ciągłą linię oddzielającą komórki nabłonka równikowego i komórki włókniste (Rysunek 6B, czerwona przerywana linia). Barwienie F-aktyną na błonach komórkowych pokazuje również zmiany w kształcie komórki, w których komórki poniżej punktu podparcia są precyzyjnie wyrównane i ułożone w równoległych rzędach (Ryc. 6). Jądra komórkowe są również ustawione poniżej punktu podparcia.

Aby zobrazować komórki nabłonkowe południkowe i komórki włókien soczewki, wybiera się obraz 4,5-5 μm obwodowy do punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki) w płaszczyźnie XY, gdzie widoczny jest obszar podstawowy komórek rzędu południkowego, jak opisano wcześniej20. Aby zmierzyć zaburzenie rzędu południkowego, nakreślono obszar zainteresowania (ROI) (Rysunek 7A; żółte pole). Obszar ROI na obrazie soczewki typu dzikiego wynosi 15 833 μm². Ponieważ nie ma obserwowalnego zaburzenia, procent obszaru zaburzenia wynosi 0. Krytyczna rola, jaką odgrywa miozyna IIA (NMIIA) bez mięśni w sześciokątnym upakowaniu komórek przy użyciu myszy z mutacją NMIIA-E1841K, została wcześniej opisana²⁰. Rysunek 7A pokazuje reprezentatywny obraz równikowy soczewki NMIIA^{E1841K/E1841K}, aby pokazać zaburzenie komórek południkowych. Zwrot z inwestycji w wiersz południkowy wyniósł 20 757 μm2. Następnie prześledzono całkowitą powierzchnię nieuporządkowanych plam. Całkowita powierzchnia nieładu wynosiła 3 185^μm2. Obliczony odsetek zaburzeń określono na 15,3% (obszar nieuporządkowany x 100/całkowity zwrot z inwestycji; Rysunek 7B). Ten procent nieuporządkowanego obszaru mieści się w zakresie z poprzedniego badania²⁰.

Następnie zademonstrowano badanie sześciokątnego upakowania w południkowych komórkach rzędów typu dzikiego²⁰. Ponieważ F-aktyna jest wzbogacona na całym obwodzie południkowych komórek rzędowych i we wszystkich sześciu wierzchołkach podstawowych regionów błon komórkowych w soczewkach typu dzikiego (tj. NMIIA^+/+), barwienie F-aktyną zastosowano do oceny kształtów komórek i organizacji upakowania. Na reprezentatywnym obrazie 1 komórki zostały oznaczone i policzono liczbę sąsiednich komórek wokół każdej komórki. Na rysunku 1 wszystkie dziesięć komórek ma sześć sąsiadujących ze sobą komórek, co sugeruje, że komórki te są ułożone w organizację o strukturze plastra miodu (Rysunek 8). Natomiast osiem na 10 komórek (80% komórek) ma sześć sąsiadujących komórek na obrazie 2, co wskazuje, że komórki są nieregularnie upakowane (Rysunek 8).

Na koniec, aby zmierzyć szerokość komórek światłowodowych, zbadano obwodowe komórki światłowodowe znajdujące się ~10 μm do wewnątrz od punktu podparcia w stałych soczewkach typu dzikiego oznaczonych rodaminą-falloidyną (Rysunek 9A)^2,4. Warto zauważyć, że możliwe jest również zmierzenie szerokości komórek światłowodowych za pomocą żywych myszy tdTomato, jednak sygnał z soczewek, które są heterozygotyczne dla tdTomato, jest zwykle słaby w regionach równikowych. Dlatego zaleca się używanie myszy, które są homozygotyczne pod względem tdTomato, ponieważ stwierdzono, że mają one silniejszą fluorescencję (nie pokazano). Odległość między granicami komórek barwionych F-aktyną za pomocą analizy liniowej została zmierzona zgodnie z wcześniejszym opisem, aby wskazać szerokość komórki światłowodowej^2,4 (Rysunek 9B). Analiza ta wykazała, że średnia odległość międzyszczytowa w soczewkach typu dzikiego wynosi 11,45 ± 2,11 μm (N = 117 komórek światłowodowych z 4 różnych obrazów soczewek myszy, Rysunek 9B).

Rysunek 1: Kroki do stworzenia agarozowego divota w celu unieruchomienia soczewki podczas obrazowania.(A) Używając naczynia ze szklanym dnem, pipetą upłynnić 2% agarozy. (B) Spłaszczyć elastycznym szkiełkiem nakrywkowym i (C) po schłodzeniu usunąć za pomocą kleszczyków z cienką końcówką. (D) W przypadku wgłębienia należy utworzyć otwór za pomocą stempla do biopsji o średnicy 3 mm. (E) Odessać resztki agaros, spłukać PBS, wytrzeć powierzchnię do czysta za pomocą niestrzępiącej się chusteczki. (F) Ostrożnie zamontuj cały obiektyw w divot. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Kroki do stworzenia divota agarozowego do obrazowania komórek nabłonka równikowego soczewki i komórek włóknistych. (A) Wlej 2% stopionej agarozy do naczynia do hodowli tkankowej. (B) Schłodzić agarozę w temperaturze pokojowej, aż całkowicie się zestale. (C) Ostrym ostrzem utwórz trójkątny divot. (D) Umieścić 1 ml 1x PBS w naczyniu do hodowli tkankowej. (E) Umieść wypreparowaną soczewkę w klinie z (F) soczewką opartą o jej równik zaklinowaną między ściankami agarozy (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Określenie grubości kapsułki soczewki. Strzałkowe (widok w płaszczyźnie X, Z) przekroje optyczne z rekonstrukcji konfokalnych stosów Z (A) żywych i (B) stałych kapsułek soczewek. Intensywność fluorescencji skanu liniowego soczewek (C) żywych i (D) stałoogniskowych wykazuje pojedynczy pik WGA (zielony), który odpowiada górnej powierzchni torebki i obszarowi podstawnemu komórek nabłonka (czerwony) przylegającego do kapsułki. Odległość między dwoma pikami jest mierzona w celu ilościowego określenia grubości kapsułki. Obrazy uzyskane przy użyciu obiektywu olejowego 40x z otworkiem otworkowym o wielkości 1 jednostki powietrznej, co daje przekroje optyczne 1,0 μm i 1,2 μm odpowiednio w kanałach tdTomato/Rhodamina-Phalloidin i WGA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Kwantyfikacja obszaru komórek nabłonkowych.(A) Widok w płaszczyźnie X, Z komórek nabłonka soczewki oznaczonych symbolem (B) tdPomidor dla błon komórkowych i (C) Hoechst dla jąder. (D) Widok w płaszczyźnie X, Y środkowego obszaru komórek nabłonka soczewki. (E) sygnał tdTomato służy jako przewodnik do zdefiniowania obszaru zainteresowania odpowiadającego grupie komórek, które są w centrum uwagi. (F) Określa się obszar określonego regionu. (G) Barwienie Hoechsta jąder stosuje się w celu określenia liczby komórek w określonym obszarze. (H) Liczba jąder jest liczona za pomocą (I) narzędzia wielopunktowego FIJI ImageJ. Aby obliczyć średnią powierzchnię komórki, podziel całkowitą powierzchnię zdefiniowanego obszaru zainteresowania przez łączną liczbę komórek. Obrazy uzyskane za pomocą obiektywu olejowego 63x z otworkiem o średnicy 1 przewiewnej, co daje przekroje optyczne 0,7 μm i 1,0 μm odpowiednio w kanałach Hoechst i tdTomato. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Wyznaczanie powierzchni i kształtu jądra. (A) Widok na płaszczyźnie XY środkowego obszaru jąder. (B) Zdefiniowano obszar zainteresowania, w którym jądra są w centrum uwagi. Jądra w obrębie ROI są zarysowane. (C) Powierzchnię i okrągłość jąder poszczególnych komórek zestawiono w tabeli, a średnie dla powierzchni i kołowości obliczono. Obrazy uzyskane przy użyciu obiektywu olejowego 63x z otworkiem o średnicy 1 pojedynczej otworka, co daje przekrój optyczny 0,7 μm w kanale Hoechsta. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Identyfikacja punktu podparcia soczewki. F-aktyna i jądra mogą być używane do identyfikacji rzędów podparcia i południka. (A) Widok XZ pokazuje wzbogacone barwienie falloidyną dla F-aktyny, która odpowiada punktowi podparcia. (B) Pojedynczy optyczny przekrój płaszczyzny XY z punktem podparcia soczewki w ostrości. Barwienie Hoechsta dla jąder pokazuje, że jądra powyżej punktu podparcia są nieregularnie upakowane, podczas gdy jądra poniżej punktu podparcia są precyzyjnie wyrównane (u góry po prawej). Barwienie falloidyną dla F-aktyny pokazuje, że komórki powyżej punktu podparcia mają nieregularny kształt, podczas gdy komórki poniżej punktu podparcia są upakowane w równoległych rzędach (na dole po lewej). Czerwona przerywana linia pokazuje położenie punktu podparcia. Obrazy uzyskane przy użyciu obiektywu 20x z 1 przewiewnym otworkiem, co daje przekroje optyczne 1,5 μm, 2,0 μm i 2,2 μm odpowiednio w kanałach Hoechst, Rhodamina-Phalloidyna i WGA-640. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Określenie zaburzenia rzędu południkowego. (A) Przekrój optyczny z pojedynczym widokiem w płaszczyźnie XY typu dzikiego i komórek południkowego rzędu NMIIA^{E1841K / E1841K} ~ 5 μm od punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki). Całe komórki rzędu południkowego są obrysowane na niebiesko w oparciu o wyrównanie jądrowe. Zabarwienie F-aktyną (na czerwono) w soczewce typu dzikiego pokazuje, że południkowe komórki rzędowe są precyzyjnie wyrównane bez oznak zaburzeń (0%). Reprezentatywny uporządkowany region w formacie dzikim jest zaznaczony (pomarańczowy). W soczewkach z nieuporządkowanymi komórkami obrysowujemy nieuporządkowane obszary (na żółto). (B) Wysokie powiększenie uporządkowanego obszaru od dzikiego typu (pomarańczowa ramka w A). (C) Duże powiększenie nieuporządkowanych obszarów wykazujących różne rodzaje nieporządku, w tym (I) rozgałęzianie rzędów, (II) nieregularny kształt komórek i utrata upakowania plastra miodu oraz (III) niewspółosiowość rzędów. Obrazy z soczewki NMIIA^{E1841K/E1841K} pokazują 15,3% zaburzenie południkowych komórek rzędowych. Obrazy uzyskane za pomocą obiektywu 20x z otworkiem o średnicy otworkowej 1 powietrznej, co daje przekroje optyczne 1,5 μm i 2,0 μm odpowiednio w kanale Hoechst i Rhodamina-falloidyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Analiza upakowania komórek miodu w warstwie plastra miodu południkowej soczewki. (A) Pojedyncze optyczne przekroje XY komórek południkowych rzędów barwione rodaminą-falloidyną dla F-aktyny. Obrazy w małym powiększeniu (górny panel) pokazują oceniane komórki (ponumerowane na różowo). Obszar zaznaczony na żółto zostanie powiększony (dolny panel). Żółte cyfry rzymskie to liczba sąsiadujących komórek. Obraz 1 przedstawia komórki, które mają kształt sześciokąta, a każda z nich ma 6 sąsiadujących komórek. Obraz 2 ma nieregularności, przy czym komórki numer 1 i 5 mają odpowiednio 5 i 7 sąsiadujących ze sobą komórek. (B) Dane są rejestrowane i zestawiane w tabelach z obliczonym procentem komórek sześciokątnych. Obrazy uzyskane za pomocą obiektywu 40x z otworkiem o wielkości 1 pojedynczej poduszki powietrznej, co daje przekrój optyczny 1,0 μm w kanale rodamina-falloidyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Analiza szerokości komórek światłowodowych. (A) Pojedynczy optyczny przekrój XY komórek światłowodowych soczewki ~10 μm od punktu podparcia. Komórki barwiono rodaminą-falloidyną w celu uwidocznienia F-aktyny na błonach komórkowych. Linia (różowa; kreska) jest narysowana nad kilkoma komórkami włókien. (B) Reprezentatywny skan liniowy intensywności F-aktyny w funkcji odległości. Odległość międzyszczytowa reprezentuje szerokość komórki światłowodowej. Obrazy uzyskane za pomocą obiektywu 40x z otworkiem o średnicy 1 pojedynczej otworka, co daje przekrój optyczny 1,0 μm w kanałach rodamina-falloidyna. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

Opisane protokoły umożliwiają wizualizację w wysokiej rozdzielczości przestrzennej obwodowych struktur i komórek soczewki w przednim i równikowym obszarze soczewki. W pracy przedstawiono metody wizualizacji struktur peryferyjnych soczewek przy użyciu nienaruszonych soczewek (aktywnych lub stałych), w których zachowana jest ogólna architektura soczewek 3D. Dodatkowo dostarczono proste metody morfometrycznej analizy ilościowej z wykorzystaniem publicznie dostępnego oprogramowania FIJI ImageJ. Metody wizualizacji i kwantyfikacji całego montażu były stosowane we wcześniejszych badaniach. Metody te pozwoliły nam zrozumieć reakcję torebki przedniej i komórek na zmianę kształtu soczewki lub starzenie się ^2,4. Metody te zostały również wykorzystane do zbadania ekspansji komórek włókien równikowych spowodowanych zmianą kształtu soczewki lub starzeniem się ^2,4 oraz do określenia roli NMIA w ustalaniu precyzyjnych sześciokątnych kształtów i organizacji komórek włókien obwodowych²⁰.

Obrazowanie z pełnym mocowaniem pozwala na obrazowanie struktury soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej en face . W przedniej części soczewki obrazowanie z całego mocowania jest korzystne dla obrazowania z płaskim mocowaniem, zapobiegając uszkodzeniom, które mogą zmienić integralność struktury torebki i/lub morfologię komórek nabłonka. Dodatkowo zachowany jest interfejs między komórkami nabłonkowymi i włóknistymi. Metoda ta zapewnia przewagę nad wizualizacją przekrojów soczewki, ponieważ obrazowanie en face zapewnia większą rozdzielczość przestrzenną i umożliwia analizę obszaru komórki nabłonkowej i obszaru/kształtu jądra wybranego obszaru (tj. środkowego bocznego, jak pokazano tutaj) lub innych obszarów komórek. Co więcej, metody obrazowania pozwalają na ilościowe określenie cech morfologicznych w określonych punktach wzdłuż regionów równikowych soczewki, umożliwiając wizualizację sześciokątnych kształtów, południkowego upakowania komórek rzędowych, punktu podparcia i szerokości komórek włóknistych, co nie byłoby łatwo osiągalne za pomocą wycinków soczewek barwionych obrazowaniem ze względu na brak rozdzielczości przestrzennej i zniekształcenia tkanki, które mogą wystąpić podczas cięcia.

Przedstawione protokoły pozwalają również na obrazowanie żywych soczewek w celu śledzenia określonych struktur i komórek soczewek w czasie. Protokół obrazowania soczewki na żywo odegrał zasadniczą rolę w poprzednim badaniu, w którym przeprowadzono analizę wielokrotnych pomiarów grubości torebki i obszaru komórek nabłonka z subpopulacji komórek z tej samej soczewki przed i po ucisku soczewki w celu wywołania spłaszczenia soczewki⁴. Stwierdzono, że kompresja soczewki indukowała zmniejszenie grubości torebki i zwiększenie powierzchni komórek nabłonka. Ze względu na znaczne różnice w grubości torebki i powierzchni komórek nabłonkowych między poszczególnymi soczewkami oraz wielkość wpływu kompresji soczewki na te parametry spowodowane kompresją soczewki, trudno byłoby wykryć różnice, gdyby zastosowano niezależny projekt pomiarowy (tj. porównując poszczególne soczewki nieściśnięte z pojedynczymi soczewkami skompresowanymi). Korzystając z metod obrazowania na żywo, przeprowadzono obrazowanie całościowe na żywych soczewkach myszy, które endogennie eksprymują LifeACT-GFP²⁶ w celu wizualizacji F-aktyny w komórkach nabłonka²², co umożliwia śledzenie reorganizacji F-aktyny w żywych komórkach nabłonka.

Podczas gdy przedstawione protokoły zostały opracowane do obrazowania soczewek myszy i mogą być dostosowane do wizualizacji struktur soczewek u innych gatunków, protokoły barwienia do wizualizacji soczewek zarówno przednich, jak i równikowych struktur obwodowych w innych soczewkach gryzoni (szczur, świnka morska), a także w soczewkach innych ssaków (krowa, makak i człowiek; dane nie pokazane). Wizualizacja struktur w większych soczewkach wymaga dłuższego utrwalenia (4%PFA, na lodzie, 4 h), blokowania (1 h) i barwienia (przez noc, 4 °C). Warto zauważyć, że obrazowanie u różnych gatunków przeprowadzono tylko na soczewkach stałoogniskowych. Obrazowanie na żywo soczewek innych gatunków może być trudne, ponieważ protokół obrazowania na żywo wykorzystuje soczewki od myszy transgenicznych, które wykazują ekspresję białek fluorogennych. W związku z tym obrazowanie to może wykluczać obrazowanie soczewek innych gatunków, w których modyfikacje genetyczne nie są powszechne. Udało nam się jednak przeprowadzić wizualizację na żywo błon komórkowych nabłonka soczewek lub F-aktyny poprzez wstępne barwienie soczewek myszy za pomocą sondy lipofilowej, FM4-64 lub sondy wiążącej F-aktynę, odpowiednio SiR-Jasplakinolidu (SiR-aktyny) (nie pokazano). Możliwe jest użycie takich sond do obrazowania na żywo soczewek innych gatunków. Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z takich sond, aby uniknąć efektów niezamierzonych; na przykład SiR-jasplakinolid może prowadzić do zmienionej dynamiki F-aktyny²⁷. Innym ograniczeniem metod barwienia, zarówno na soczewkach na żywo, jak i stałoogniskowych, jest to, że takie sondy mają ograniczoną penetrację. Dlatego obrazowanie jest ograniczone do regionów peryferyjnych. Możliwe jest obrazowanie wewnętrznych obszarów (tj. komórek głębokich włókien) za pomocą soczewek transgenicznych myszy tdTomato⁴, które ponownie opierają się na transgenicznej ekspresji białek fluorogennych. Ekspresja musi być również wystarczająco wysoka, aby zapewnić jasne sygnały w głębokich komórkach światłowodowych.

Niemniej jednak przedstawione protokoły umożliwiły skuteczną morfologiczną ocenę ilościową cech soczewek peryferyjnych ^2,4,20. Metodologie kwantyfikacji są skuteczne i wykorzystują publicznie dostępne oprogramowanie FIJI ImageJ o otwartym kodzie źródłowym. Podczas gdy do identyfikacji obszarów zainteresowania wykorzystano ręczne narzędzia do śledzenia, możliwe jest zautomatyzowanie identyfikacji obszarów zainteresowania. Automatyzacja może być tak prosta, jak zastosowanie progów fluorescencyjnych w celu zwiększenia kontrastu do identyfikacji określonych struktur (tj. granic jąder) w oparciu o FIJI ImageJ lub bardziej złożonych algorytmów uczenia maszynowego do wykrywania różnic w kształcie komórek (tj. nieregularnych kształtów komórek nabłonka lub włókien). Bardziej złożona analiza może wymagać specjalistycznych wtyczek lub oprogramowania do obrazowania. Specjalistyczne wtyczki lub oprogramowanie mogą również pozwolić na uzyskanie wolumetrycznych pomiarów morfologicznych 3D z pozyskanych z-stosów. Ogólnie rzecz biorąc, podczas gdy opisane metody kwantyfikacji są łatwo dostępne, opłacalne i odpowiednie dla wielu użytecznych pomiarów wyników ^2,4,20, platforma protokołu obrazowania, w połączeniu z zaawansowaną analizą oprogramowania, może zapewnić bogactwo dodatkowych pomiarów morfologicznych dla przyszłych badań.

Soczewka jest skomplikowaną tkanką biologiczną o wyspecjalizowanych funkcjach, które opierają się na zależnej od lokalizacji i głębokości geometrii komórek i związanych z nimi struktur. Wykorzystanie zademonstrowanych tutaj protokołów obrazowania i metod kwantyfikacji pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ustalane są struktury soczewek i złożona organizacja soczewki. Co więcej, protokoły obrazowania i metody kwantyfikacji pomogą określić zależności między strukturą a funkcjami soczewek.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 mm Dziurkacz do biopsji	Acuderm Inc	NC9084780
Agaroza	Apex BioResearch Products	20-102GP
Przeciwgrzybiczy/antybiotykowy	Cytiva	SV30079.01
Albumina surowicy bydlęcej (frakcja V)	Prometheus	25-529
Delikatne chusteczki do zadań	Kimwipe
Naczynie ze szklanym dnem ( Fluorodish)	World Precision International	FD35-100
Hoescht 33342	Biotium	40046
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 880	Zeiss
MatTek Imaging	Dish MatTek Life Sciences	P35G-1.5-14
Paraformaldehyd	Mikroskopia elektronowa Nauki	100503-917
PBS	GenClone	25-507B
Pożywka fenolowa wolna od czerwieni 199	Gibco	11043023
Rodamino-falloidyna	Thermo Fisher	00027
Triton X100	Sigma-Aldrich	11332481001
WGA-640	Biotium	CF 640R