Artykuł metodologiczny

Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66017

⸱

19 stycznia 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Delaware, 2School of Optometry and Vision Science Program, Indiana University, 3Department of Biomedical Engineering, University of Delaware

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Obecne protokoły opisują nowatorskie obrazowanie całego mocowania do wizualizacji struktur peryferyjnych w soczewce oka z metodami kwantyfikacji obrazu. Protokoły te mogą być wykorzystywane w badaniach w celu lepszego zrozumienia związku między strukturami mikroskali soczewek a rozwojem/funkcją soczewki.

Streszczenie

Soczewka oczna to przezroczysta, elastyczna tkanka, która zmienia swój kształt, aby skupić światło z różnych odległości na siatkówce. Oprócz błony podstawnej otaczającej narząd, zwanej torebką, soczewka jest całkowicie komórkowa składająca się z monowarstwy komórek nabłonkowych na przedniej półkuli i dużej masy komórek włókien soczewki. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się w strefie kiełkowania na równiku soczewki, a komórki nabłonka równikowego migrują, wydłużają się i różnicują w nowo powstałe komórki włókniste. Komórki nabłonka równikowego znacznie zmieniają morfologię od losowo upakowanych komórek w kształcie kostki brukowej w wyrównane komórki w kształcie sześciokąta tworzące rzędy południkowe. Nowo utworzone komórki włókien soczewkowych zachowują sześciokątny kształt komórki i wydłużają się w kierunku przedniego i tylnego bieguna, tworząc nową powłokę komórek, które są nakładane na poprzednie generacje włókien. Niewiele wiadomo na temat mechanizmów, które napędzają niezwykłą morfogenezę komórek nabłonka soczewki do komórek włóknistych. Aby lepiej zrozumieć strukturę, rozwój i funkcję soczewki, opracowano nowe protokoły obrazowania do obrazowania struktur peryferyjnych przy użyciu całych mocowań soczewek ocznych. Tutaj pokazano metody ilościowego określania grubości kapsułki, obszaru komórki nabłonkowej, obszaru i kształtu jądra komórki, południkowej kolejności komórek rzędowych i upakowania oraz szerokości komórek włókien. Pomiary te są niezbędne do wyjaśnienia zmian komórkowych, które zachodzą podczas wzrostu soczewki przez całe życie i zrozumienia zmian zachodzących wraz z wiekiem lub patologią.

Wprowadzenie

Soczewka oczna to elastyczna, przezroczysta tkanka znajdująca się w przedniej części oka, która działa w celu precyzyjnego skupienia światła na siatkówce. Zdolność obiektywu do działania można częściowo przypisać jego skomplikowanej architekturze i organizacji1,2,3,4,5,6. Wokół tkanki soczewki znajduje się torebka, błona podstawna niezbędna do utrzymania struktury soczewki i właściwości biomechanicznych7,8,9. Sama soczewka jest całkowicie komórkowa, składa się z dwóch typów komórek: komórek nabłonkowych i włóknistych. Warstwa nabłonkowa składa się z monowarstwy prostopadłościennych komórek, które pokrywają przednią półkulę soczewki10. Przez całe życie komórki nabłonkowe namnażają się i migrują wzdłuż torebki soczewki w kierunku równika soczewki. Komórki nabłonka przedniego są spokojne i brukowe w przekroju poprzecznym, a w pobliżu równika soczewki komórki nabłonkowe namnażają się i zaczynają przechodzić proces różnicowania w nowe komórki włókniste11,12. Komórki nabłonka równikowego przekształcają się z losowo upakowanych komórek w zorganizowane rzędy południkowe z komórkami w kształcie sześciokąta. Sześciokątny kształt komórki jest zachowany po stronie podstawy tych różnicujących się komórek, podczas gdy strona wierzchołkowa zwęża się i zakotwicza w punkcie podparcia soczewki lub modiolus4,13,14,15. Gdy komórki nabłonka równikowego zaczynają wydłużać się w nowo powstałe komórki włókniste, wierzchołkowe końcówki komórek migrują wzdłuż wierzchołkowej powierzchni przednich komórek nabłonka w kierunku bieguna przedniego, podczas gdy końcówki podstawy poruszają się wzdłuż torebki soczewki w kierunku bieguna tylnego. Nowe generacje komórek włóknistych nakładają się na poprzednie generacje komórek, tworząc sferyczne powłoki włókien. Podczas procesu wydłużania i dojrzewania komórek włóknistych znacznie zmieniają swoją morfologię11,12,16. Te komórki światłowodowe stanowią większość masy soczewki11,12,16,17,18.

Mechanizmy molekularne, które przyczyniają się do tworzenia skomplikowanych mikrostruktur soczewek, morfologii komórek i unikalnej organizacji komórek, nie są do końca znane. Co więcej, niejasny jest wpływ torebki soczewki i struktury komórkowej na ogólną funkcję soczewki (przezroczystość, zmiana kształtu soczewki). Jednak zależności te są wyjaśniane przy użyciu nowej metodologii obrazowania i ilościowych ocen cech strukturalnych i komórkowych soczewki2,4,19,20,21,22. Opracowano nowe protokoły obrazowania całych soczewek, które pozwalają na wizualizację torebki soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej, komórek nabłonka i komórek włókien obwodowych. Obejmuje to metodologię ilościowego określania grubości kapsułki, wielkości komórki, wielkości jądra komórkowego i kolistości, południkowej kolejności rzędów, upakowania komórek włóknistych i szerokości komórek światłowodowych. Te metody wizualizacji i kwantyfikacji obrazu umożliwiają dogłębne badanie morfometryczne i mają przewagę nad innymi metodami wizualizacji (obrazowanie płaskich mocowań lub skrawków tkanek) poprzez zachowanie ogólnej struktury tkanki 3D. Metody te pozwoliły na przetestowanie nowych hipotez i umożliwią dalszy postęp w zrozumieniu rozwoju i funkcji komórek soczewki.

Do poniższych eksperymentów używamy myszy typu dzikiego i Rosa26-tdTomato tandem dimer-Tomato (B6.129(Cg)-Gt(ROSA) (tdTomato)23 (Jackson Laboratories) w tle C57BL/6J w wieku od 6 do 10 tygodni, obu płci. Myszy tdTomato pozwalają na wizualizację komórkowych błon plazmatycznych w żywych soczewkach poprzez ekspresję białka tdTomato połączonego z N-końcowymi 8 aminokwasami zmutowanego białka MARCKS, które celuje w błonę plazmatyczną poprzez N-końcową mirystylizację i wewnętrzne miejsca palmitoilacji cysteiny23. Używamy również NMIIAE1841K/E1841K mice24 uzyskanego pierwotnie od dr Roberta Adelsteina (National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Jak opisano wcześniej20, myszy NMIIAE1841K/E1841K w tle FvBN/129SvEv/C57Bl6, które mają utratę białka pośredniego CP49 (zachowuje morfologię dojrzałych komórek włóknistych i biomechanikę całej soczewki), są krzyżowane wstecznie z myszami typu dzikiego C57BL6/J. Przebadaliśmy potomstwo pod kątem obecności allelu CP49 typu dzikiego.

Obrazowanie konfokalne zostało wykonane na laserowo-skaningowym konfokalnym mikroskopie fluorescencyjnym z powiększeniem 20x (NA = 0.8, odległość robocza = 0.55mm, 1x zoom), 40x (NA = 1.3 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.2mm, 1x zoom) lub 63x (NA = 1.4 obiektyw olejowy, odległość robocza = 0.19mm, 1x zoom) powiększeniem. Wszystkie obrazy uzyskano przy użyciu rozmiaru otworka, który jest wyznacznikiem grubości przekroju optycznego, do 1 jednostki Airy'ego (wynikowe grubości optyczne są podane w legendach rycin). Obrazy zostały przetworzone na oprogramowaniu Zen Software. Obrazy zostały wyeksportowane do formatu .tif, a następnie zaimportowane do oprogramowania FIJI ImageJ Software (imageJ.net).

Protokół

Myszy są trzymane w ośrodku dla zwierząt Uniwersytetu Delaware, utrzymywanym w środowisku wolnym od patogenów. Wszystkie procedury na zwierzętach, w tym eutanazja przez wdychanie CO2 , zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami na zwierzętach przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu Delaware (IACUC).

1. Przygotowanie całego mocowania obiektywu i obrazowanie

  1. Mocowanie soczewek do obrazowania z pełnym mocowaniem
    1. Po eutanazji należy wyłuszczyć oczy i wypreparować soczewki, jak opisano wcześniej25. Po rozbiorzeniu należy natychmiast przenieść soczewki do świeżej soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS; 1,1 mM KH2PO4, 155 mM, NaCl, 3,0 mM Na2HPO4-7H 2O; pH 7,4) w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Morfologia komórkowa może ulec zmianie, jeśli soczewki są przechowywane w PBS przez dłuższy czas, dlatego zaleca się natychmiastowe utrwalenie w ciągu ~10 minut od rozwarstwienia.
    2. W przypadku obrazowania przedniej części soczewki w całości, należy utrwalić całe soczewki, zanurzając je w 0,5 ml świeżo przygotowanego 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x PBS w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Po 30 minutach umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1x PBS. Przejdź do kroku 1.2 lub przechowuj w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Soczewki stałoogniskowe można przechowywać do 5 dni.
    3. W przypadku obrazowania obszaru paralaktycznego soczewki z pełnym mocowaniem, należy utrwalić całe soczewki, zanurzając je w 0,5 ml świeżo przygotowanego 4% PFA w 1x PBS w probówce mikrowirówkowej w temperaturze pokojowej. Po 1 godzinie umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1x PBS. Przejdź do kroku 1.3 lub przechowuj w 1x PBS w temperaturze 4 °C. Soczewki stałoogniskowe można przechowywać do 5 dni.
  2. Całe mocowanie przedniego obszaru soczewki (stałe lub na żywo)
    1. W przypadku obrazowania obiektywów stałoogniskowych z pełnym mocowaniem przejdź do kroku 1.2.3.
    2. W przypadku obrazowania soczewek na żywo w całości należy przenieść soczewki do dołka 48-dołkowej płytki zawierającej 1 ml pożywki 199 (bez czerwieni fenolowej) zawierającej 1% antybiotyku/antybiotyku. Inkubować soczewki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 do momentu obrazowania. Przed obrazowaniem należy inkubować soczewki w roztworze zawierającym znakowaną fluorescencyjnie aglutyninę z kiełków pszenicy (WGA-640, 1:500) i Hoechst 33342 (1:500) w pożywce 199 przez co najmniej 10 minut. Przejdź do kroku 1.5.
    3. Aby zabarwić torebkę soczewki, F-aktynę i jądra soczewek stałych, umieść soczewki w 500 μl roztworze zawierającym WGA-640 (1:500), rodaminę-falloidynę (1:50) i Hoechst 33342 (1:500) w buforze permeabilizacyjnym/blokującym (1x PBS zawierający 0,3% Tritonu, 0,3% albuminy surowicy bydlęcej (frakcja V) i 3% surowicy koziej) w probówce do mikrowirówki. Plamić soczewki w temperaturze 4 °C przez noc.
    4. Po całonocnej inkubacji umyj soczewki 3x (5 minut na pranie) 1 ml 1x PBS. Przejdź do obrazowania soczewek.
    5. Aby ustabilizować soczewkę stałą do obrazowania konfokalnego, utwórz wgłębienia unieruchamiające soczewkę w agarozie na czaszy obrazowania, jak opisano wcześniej21 (Rysunek 1).
      1. Podgrzej i delikatnie wymieszaj 2% agarozy w PBS za pomocą kuchenki mikrofalowej, aż roztwór się upłynni. Odpipetować 250 μl upłynnionej 2% agarozy do naczynia ze szklanym dnem (Rysunek 1A) i spłaszczyć agarozę na naczyniu za pomocą elastycznego plastikowego szkiełka nakrywkowego (Rysunek 1B). Gdy agaroza zostanie schłodzona i w pełni zestalona, usuń szkiełko nakrywkowe za pomocą kleszczyków z cienką końcówką (Rysunek 1C) i użyj 3-milimetrowego stempla do biopsji, aby utworzyć otwór w agarozie w środku naczynia (Rysunek 1D).
      2. Usuń nadmiar agarozy za pomocą delikatnej chusteczki roboczej (Rysunek 1E). Utrzymuj pleśń agarozową nawodnioną 1x PBS i utrzymuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia. Formy agarozowe były z powodzeniem przechowywane do 1 tygodnia.
    6. Za pomocą kleszczyków do zarodków delikatnie przenieś żywą lub nieruchomą soczewkę do wgłębienia w agarozie (Ryc. 1F), zawierającej ~ 2 ml 1x PBS (soczewka stała) lub pożywki 199 bez czerwieni fenolowej (soczewka żywa), a następnie umieść naczynie na stoliku mikroskopu odwróconego. Aby potwierdzić, że soczewka znajduje się w przedniej części skierowanej w stronę obiektywu, wizualizuj barwienie jąder. Jeśli nie zaobserwuje się żadnych jąder, tylny obszar może być skierowany w stronę celu.
    7. Aby odwrócić soczewkę, użyj zakrzywionych kleszczyków i delikatnie obróć soczewkę o ~180°, tak aby przednia część była skierowana w stronę obiektywu. Uzyskuj obrazy za pomocą mikroskopu konfokalnego.
    8. Aby uwidocznić kapsułki soczewek, uzyskaj obrazy z-stack za pomocą obiektywu 40x o wielkości kroku 0,3 μm. Uzyskaj pierwszy obraz przed powierzchnią torebki soczewki (wskazywaną przez barwienie WGA) i ostatni obraz po wierzchołkowej powierzchni komórek nabłonka. Aby uwidocznić komórki nabłonkowe, należy uzyskać obrazy stosu z użyciem obiektywu 63x o rozmiarze kroku 0,3 μm w celu wizualizacji komórek nabłonka soczewki.
      UWAGA: Te parametry mikroskopu pozwalają na odpowiednią trójwymiarową (3D) rekonstrukcję obrazów, co jest niezbędne do ilościowego określenia obrazu grubości torebki lub obszaru komórek nabłonka. Możliwe jest również obrazowanie szwów w soczewkach tdTomato na żywo poprzez obrazowanie poza monowarstwą komórek nabłonka, jak opisano wcześniej4.
  3. Barwienie nabłonka równikowego soczewki i komórek włóknistych
    1. Umieść stałe soczewki w 0,5 ml roztworu rodaminy-falloidyny (1:300), WGA-640 (1:250) i Hoechst 33342 (1:500) w roztworze permeabilizacyjnym/blokującym (3% BSA, 3% surowica kozia i 0,3% Triton) w probówce do mikrowirówki. Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez noc.
    2. Po całonocnej inkubacji umyj soczewki 3x w 1 ml 1x PBS (5 minut na pranie).
    3. Utwórz kliny agarozowe unieruchamiające soczewki, jak opisano wcześniej4,10.
      1. Krótko mówiąc, utwórz kliny agarozy w naczyniach ze szklanym dnem (FD35-100, WPI), wlewając ~ 5-6 ml stopionej 2% agarozy w 1x PBS do naczyń (Rysunek 2A). Gdy agaroza zastygnie (Rysunek 2B), utwórz trójkątne wgłębienie z ostrym ostrzem (Rysunek 2C). Usuń ćwiartkę agarozy i umieść 1 ml 1x PBS w naczyniu z agarozą (Rysunek 2D).
      2. Odessać wszelkie resztki agarozy, które mogą pozostać po przecięciu agarozy. Na każdą miskę można utworzyć wiele klinów, aby pasowały do wielu różnych rozmiarów soczewek (nie pokazano). Aby przechowywać formę agarozową, umieść 1 ml 1x PBS na formie agarozowej i utrzymuj w temperaturze 4 °C. Ćwiartki można przechowywać do 1 tygodnia.
    4. Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść soczewkę w klinu agarozowym zawierającym 1 ml 1x PBS i wyreguluj tak, aby obszar równikowy soczewki był skierowany w dół na szkło mikroskopu nad obiektywem konfokalnym (Rysunek 2E-F). Aby potwierdzić, że obszar równikowy jest ostry, zwizualizuj jądra i upewnij się, że jądra są wyrównane w rzędach na równiku. Komórki nabłonka równikowego można również zidentyfikować, ponieważ są nieregularnie upakowane i ukształtowane. Ponadto południkowe komórki rzędowe są precyzyjnie wyrównane i mają sześciokątny kształt, na co wskazuje barwienie F-aktyną na błonach komórkowych.
    5. Jeśli jądra w polu widzenia są upakowane losowo, przednia strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. Jeśli nie można zaobserwować jąder, to najprawdopodobniej tylna strona soczewki jest skierowana w stronę obiektywu. Jeśli soczewka nie znajduje się na równiku, zmień orientację soczewki i użyj zakrzywionej pęsety, aby obrócić soczewkę, aż do zaobserwowania precyzyjnie ustawionych jąder na równiku soczewki.
    6. Zobrazuj nabłonek równikowy soczewki i komórki włókien za pomocą laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego (obiektyw 20x, NA = 0,8, rozmiar kroku 0,5 μm i/lub obiektyw olejowy 40x, NA = 1,3, rozmiar kroku 0,4 μm). Obróć obrazy przed kolekcją z-stack, w której komórki nabłonka równikowego znajdują się na górze, a następnie rząd południkowy i komórki włókien tuż poniżej.

2. Metodologia analizy obrazu

  1. Pomiar grubości kapsułki soczewki
    1. Korzystając z obrazów z-stack uzyskanych za pomocą obiektywu 40x (rozmiar kroku 0,3 μm) soczewek na żywo tdTomato oznaczonych WGA lub soczewek stałopozycyjnych oznaczonych WGA i rho-falloidyną, uzyskaj optyczną projekcję 2D w widoku XZ rekonstrukcji 3D i zapisz w .tif formacie. Przetwarzaj obrazy za pomocą oprogramowania Zen.
    2. Otwórz obrazy plasterków XZ (.tif) w oprogramowaniu FIJI ImageJ.
    3. Aby zmierzyć grubość kapsułki soczewki, użyj funkcji linii prostej (przedstawionej w Rysunek 3A,B). Ustaw szerokość linii na 50 pikseli, wybierając opcje Edytuj > > Szerokość linii. Ta szerokość linii została empirycznie określona, aby zapewnić wysoki stosunek sygnału do szumu przy ustawieniach mikroskopu. Optymalna szerokość linii może się różnić w przypadku innych mikroskopów/ustawień mikroskopu lub w przypadku korzystania z soczewek innych gatunków. Następnie narysuj linię od górnej powierzchni kapsułki do poniżej obszaru podstawnego komórek nabłonka.
    4. Zapisz wiersz jako obszar zainteresowania, naciskając Ctrl + T.
    5. Podziel kanały na zakładki obrazu, koloru i podziału.
    6. Zmierz intensywność wzdłuż linii kanału kapsułki, naciskając Ctrl + K.
    7. W arkuszu kalkulacyjnym wykreśl wartości intensywności w funkcji odległości i określ szczyty intensywności dla kapsułki i F-aktyny, które reprezentują odpowiednio powierzchnię torebki i obszar podstawny komórek nabłonka. Na osi x znajduje się odległość w linii.
    8. Następnie oblicz grubość kapsułki, określając odległość między pikami intensywności fluorescencji kapsułki a nabłonkiem (Rysunek 3C, D).
  2. Analiza obszaru komórki
    1. Korzystając z obrazów z-stack uzyskanych za pomocą soczewki obiektywowej 63x (NA = 1,4; rozmiar kroku 0,3 μm) na żywych soczewkach tdTomato lub soczewkach stałoogniskowych oznaczonych falloidyną, przeanalizuj wycinek widoku XY z obrazu konfokalnego z-stack odpowiadający miejscu, w którym ostry jest środkowy (boczny) obszar komórek nabłonka. Zwróć uwagę, że błony boczne są widoczne za pomocą barwnika błony tdTomato lub poprzez wizualizację falloidyny, która jest obecna na bocznych błonach komórkowych.
      UWAGA: Ze względu na krzywiznę obiektywu (widzianą w widoku XZ; Rysunek 4A-C), nie wszystkie komórki nabłonkowe będą ostre na obrazie. Środkowy obszar nabłonka odpowiada obszarowi, w którym skupiają się zarówno boczne błony komórkowe (Rysunek 4D-E), jak i jądra (Figura 4G-I).
    2. Wyeksportuj obraz jako .tif i otwórz go w FIJI ImageJ.
    3. Aby ustawić skalę w FIJI ImageJ do analizy, użyj narzędzia linia, aby utworzyć linię o długości podziałki liniowej na podstawie obrazu konfokalnego.
    4. Zapisz długość linii w pikselach i długość podziałki liniowej. Przejdź do pozycji Analizuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Ustaw skalę. Wprowadź liczbę pikseli, czyli długość linii, w polu Odległość w pikselach, a w polu Znana odległość wprowadź znaną długość podziałki liniowej.
    5. Używając barwienia tdTomato lub rodamino-falloidyny jako wskazania granic komórek, ręcznie obrysuj populację komórek, które są ostre na obrazie, za pomocą narzędzia wielokątnego. Śledź tylko komórki, w których widoczne są błony boczne (Rysunek 4E) i unikaj śledzenia częściowo widocznych komórek (tj. na krawędzi obrazów). Zapisz zwrot z inwestycji, naciskając Ctrl+T. Przejdź do opcji Edytuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Teraz zmierz całkowitą powierzchnię komórki (ROI), naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ.
    6. Oblicz średnią powierzchnię komórki, dzieląc obszar ROI przez całkowitą liczbę komórek. Prostym sposobem określenia liczby komórek jest zliczenie liczby jąder. Przejdź do kanału jądrowego (niebieski). W menu ROI wybierz zapisany konspekt ROI komórek (Rysunek 4G). Wyczyść poza ROI, przechodząc do Edycja, a następnie klikając Wyczyść na zewnątrz (Rysunek 4H). Za pomocą narzędzia Multi-point policz jądra, klikając poszczególne jądra.
  3. Komórkowa analiza obszaru jądrowego i kształtu
    1. W przypadku analizy obszaru i kształtu jąder należy przeanalizować przekrój optyczny w płaszczyźnie XY z obrazu konfokalnego stosu z odpowiadającego miejscu, w którym znajduje się ostry środkowy (boczny) obszar komórek nabłonka tdPomidora. Przeanalizuj wycinek stosu z obrazu konfokalnego, w którym obszar jądrowy jest największy (Rysunek 5A); Reprezentuje środkową część jąder.
      UWAGA: Zauważ, że ze względu na krzywiznę soczewki, nie wszystkie jądra będą ostre, co można zobaczyć w widoku XZ (Rysunek 4G i Rysunek 5A).
    2. Wybierz subpopulację jąder, które są w centrum uwagi, i zapisz zwrot z inwestycji.
    3. Użyj funkcji Clear Outside. W obrębie ROI, korzystając z narzędzia do zaznaczania odręcznego (czwarty przycisk menu od lewej), ostrożnie prześledź granice jąder (Rysunek 5B). Zapisz każdy ślad jądrowy w oknie ROI, naciskając Ctrl+T. Nakreśl tylko jądra, w których widać całe jądra, a jądra nie stykają się ze sobą.
    4. Gdy wszystkie jądra zostaną obrysowane, zmierz obszar jądra i kształt poszczególnych komórek (tj. okrągłość), naciskając Ctrl + M.
    5. Skopiuj i wklej dane do arkusza kalkulacyjnego i oblicz średnią powierzchnię jądrową i cyrkularność (Rysunek 5C).
  4. Upakowanie nabłonka południkowego rzędu
    1. Aby zmierzyć zaburzenie rzędów południkowych, uzyskaj obrazy za pomocą obiektywu 20x (rozmiar kroku 0,5 μm).
    2. Zidentyfikuj punkt podparcia/modiolus obiektywu na obrazach. Punkt podparcia to obszar, w którym wierzchołkowe końce wydłużających się komórek nabłonkowych zwężają się, tworząc punkt zaczepienia podczas początkowego różnicowania i wydłużania komórek włóknistych na równiku. Zidentyfikuj punkt podparcia na podstawie jasnej intensywności F-aktyny (oznaczonej grotem strzałki w widoku XZ w Rysunek 6A; oznaczona czerwoną przerywaną linią w Rysunek 6B) i zmiana organizacji komórkowej w pojedynczym przekroju optycznym w widoku XY.
      UWAGA: Ponadto, barwienie F-aktyną zarówno w podstawnych, jak i wierzchołkowych obszarach komórek nabłonkowych jest widoczne powyżej punktu podparcia, podczas gdy tylko podstawowy obszar wydłużających się komórek jest widoczny poniżej punktu podparcia (Figura 6A). Komórki nabłonkowe powyżej linii podparcia są nieregularnie upakowane i mają tendencję do tworzenia rozet, podczas gdy komórki włókniste poniżej punktu podparcia są ułożone w równoległych rzędach, na co wskazuje jasne zabarwienie F-aktyną na błonie (Figura 6B).
    3. Po zidentyfikowaniu punktu podparcia u 2-miesięcznych myszy wybierz pojedynczą sekcję optyczną ~ 4,5-5 μm obwodową do punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki) w płaszczyźnie XY. Odległość ta jest wybierana na podstawie obserwacji, że wszystkie jądra południkowych komórek rzędowych u 2-miesięcznych myszy są zogniskowane, gdy znajdują się ~ 5 μm na obrzeżach punktu podparcia. Zapisz pojedynczą sekcję optyczną (.tif). Otwórz obraz na FIJI.
      UWAGA: Ta analiza została przeprowadzona tylko na 2-miesięcznych myszach i dlatego nie można stwierdzić, czy odległość ta zmienia się wraz z wiekiem.
    4. Przed wykonaniem analizy obrazu ustaw skalę na μm w ImageJ, wykonując krok 2.2.2.
    5. Ręcznie obrysuj całe południkowe obszary rzędów za pomocą narzędzia linii odręcznej (obszar zainteresowania / ROI), identyfikując wyrównanie jądra, jak pokazano na Rysunek 7A. Zapisz zwrot z inwestycji, naciskając Ctrl+T. Przejdź do opcji Edytuj w menu paska narzędzi i wybierz opcję Wyczyść na zewnątrz. Zmierz całkowitą powierzchnię komórki (ROI), naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ.
    6. Zidentyfikuj wszelkie obszary zaburzeń wskazane przez barwienie F-aktyną, konturując je za pomocą narzędzia linii odręcznej w FIJI ImageJ. Kryteria dla nieuporządkowanych regionów obejmują rozgałęzienia rzędów, nieregularne upakowanie i niewspółosiowość rzędów (Rysunek 7B), jak pokazano wcześniej20.
    7. Zmierz zarysowany nieuporządkowany obszar/załatany, naciskając Ctrl + M w FIJI ImageJ. Zsumuj całkowity nieuporządkowany obszar w arkuszu kalkulacyjnym.
    8. Podziel całkowity nieuporządkowany obszar przez obszar ROI, a następnie pomnóż przez 100, aby uzyskać procent nieuporządkowanego obszaru. Jeśli nie zaobserwuje się żadnego zaburzenia, umieść wartość 0% dla nieuporządkowanego obszaru.
  5. Południkowy numer rzędu sąsiednich komórek
    1. Aby zmierzyć liczbę sąsiednich komórek, użyj obrazów wybarwionych F-aktyną uzyskanych za pomocą obiektywu olejowego 40x (krok co 0,4 μm).
    2. Zidentyfikuj przekrój optyczny (płaszczyzna XY) w podstawowym obszarze komórek rzędu południkowego do wewnątrz od torebki soczewki, gdzie F-aktyna jest wzbogacona na całym obwodzie komórek rzędu południkowego, wszystkie komórki rzędu południkowego są skupione i znajdują się na tej samej płaszczyźnie.
    3. Policz liczbę sąsiednich komórek, które ma każda komórka rzędu południkowego (Rysunek 8). Zmierz średni odsetek komórek z sześcioma sąsiadującymi komórkami w arkuszu kalkulacyjnym.
      UWAGA: Określ liczbę sąsiadujących komórek za pomocą obiektywu 20x. Jednak znacznie łatwiej jest zaobserwować kształt sześciokąta za pomocą obiektywu 40x.
  6. Analiza obrazu komórek włókien równikowych
    1. Wykonaj konfokalne obrazy ze stosem z soczewkami barwionymi rodaminą falloidyną za pomocą obiektywu 20x (rozmiar kroku 0,5 μm).
    2. Zidentyfikuj punkt podparcia, jak wskazano w kroku 2.4.2. Po zidentyfikowaniu punktu podparcia wybierz pojedynczą sekcję optyczną. Dla celów standaryzacji i porównania soczewek, określ ilościowo szerokości komórek światłowodowych ~ 10 μm do wewnątrz od punktu podparcia w płaszczyźnie XY (Rysunek 9A).
    3. Eksportuj surowe obrazy do FIJI ImageJ. W FIJI ImageJ narysuj linię (zwykle o długości ~300-400 μm) przez kilka sąsiednich komórek światłowodowych, aby zmierzyć odległość między pikami barwionymi F-aktyną (analiza skanowania linii; Rysunek 9A; różowa linia).
    4. Uzyskaj intensywność fluorescencji na linii skanowania w FIDŻI, naciskając Ctrl+K. Następnie wyeksportuj dane do arkusza kalkulacyjnego, aby obliczyć odległość międzyszczytową (przykład pokazany w Rysunek 9A-B). Odpowiada to szerokościom komórek światłowodowych.

Wyniki

Przednia torebka soczewki, obszar komórek nabłonkowych i obszar jądra
Aby przeanalizować grubość torebki soczewki, barwiliśmy torebki soczewek, zarówno w soczewkach żywych, jak i utrwalonych, za pomocą WGA. Komórki nabłonka soczewki identyfikowano poprzez znakowanie błon tdTomato w żywych soczewkach (Ryc. 2A) lub poprzez barwienie rodaminą-falloidyną w celu wykazania F-aktyny w błonach komórkowych w soczewkach utrwalonych (Ryc. 2B). W projekcji ortogonalnej (XZ) barwienie WGA i tdTomato/rodaminą-falloidyną pozwala na przeprowadzenie analizy skanowania liniowego intensywności fluorescencji od szczytu do szczytu. Główny szczyt w kanale WGA wskazuje powierzchnię torebki, natomiast główny szczyt w kanale tdTomato/rodaminy-falloidyny wskazuje region podstawny komórek nabłonkowych. Obliczając odległość między tymi szczytami, możemy określić grubość torebki. Analiza skanowania liniowego wykazała, że torebki z żywej soczewki myszy w wieku 9 tygodni miały grubość 11.2 µm, a torebki z utrwalonej soczewki myszy w wieku 9 tygodni miały grubość 12.5 µm. Zaobserwowane grubości torebek są reprezentatywne dla wcześniejszych wyników2,4.

Obrazowanie całego preparatu soczewek transgenicznych myszy znakowanych tdTomato (lub soczewek barwionych rodaminą i falloidyną; nie pokazano) umożliwia wizualizację morfologii komórek nabłonkowych na żywo. Projekcja ortogonalna (XZ) zapewnia widok z boku komórki nabłonkowej soczewki, natomiast widok płaski (XY) w obszarach bocznych pozwala na wizualizację wielobocznego kształtu nabłonka. W zdrowych soczewkach nie obserwujemy żadnych przerw między komórkami. Średnią powierzchnię komórki można obliczyć, obrysowując populację komórek na obrazie i dzieląc całkowitą powierzchnię przez liczbę komórek w wybranym obszarze (ROI). Liczbę komórek określa się poprzez zliczenie liczby jąder barwionych Hoechstem w danym ROI. Analiza wykazuje średnią powierzchnię komórki wynoszącą 260 µm2, co jest zgodne z poprzednimi badaniami2,4.

Barwienie jąder Hoechst umożliwia również badanie morfometrii jąder komórek nabłonkowych soczewki w tych komórkach. Projekcje ortogonalne (XZ) pozwalają na widok jąder z boku. Widok płaski (XY) pokazuje okrągłe lub elipsoidalne kształty jąder. Obrysowywanie jąder pozwala na obliczenie pola powierzchni jądra poszczególnych komórek oraz innych parametrów kształtu, takich jak kolistość. Analiza wykazuje średnią powierzchnię jądra wynoszącą 64 µm2 przy średniej kolistości 0,8. Wartości kolistości bliskie 1 wskazują na idealne koło, natomiast wartości zbliżone do 0 wskazują na bardziej wydłużoną morfologię.

Upakowanie komórek nabłonka równikowego, heksagonalne upakowanie komórek włókien oraz szerokości komórek włókien
Widok płaszczyzny (XY) równikowego obszaru soczewki ukazuje komórki nabłonka soczewki o kształcie sześcioboka, upakowane regularnie i zbiegające się w punkcie podparcia. Punkt podparcia to miejsce, w którym wierzchołki apikalne wydłużających się komórek nabłonkowych zwężają się, tworząc punkt zakotwiczenia podczas początkowej różnicowania i elongacji komórek włókien na równiku4,13,14,15 (Rysunek 6B, zaznaczony czerwoną przerywaną linią). Punkt podparcia można zlokalizować na podstawie zwiększonego barwienia F-aktyny, tworzącego ciągłą linię oddzielającą równikowe komórki nabłonka od komórek włókien (Rysunek 6B, czerwona przerywana linia). Barwienie F-aktyny w błonach komórkowych wykazuje również zmiany w kształcie komórek, przy czym komórki poniżej punktu podparcia są precyzyjnie wyrównane i ułożone w równoległych rzędach (Rysunek 6). Jądra komórkowe są również wyrównane poniżej punktu podparcia.

Aby zwizualizować komórki nabłonkowe i komórki włókien w rzędzie południkowym soczewki, wykonano obraz 4,5-5 µm wybiera się obszar obwodowy względem punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki) w płaszczyźnie XY, w którym widoczny jest region podstawowy komórek rzędu południkowego, zgodnie z wcześniejszym opisem20Aby zmierzyć nieuporządkowanie rzędów południkowych, wyznacza się obszar zainteresowania (ROI) (Rysunek 7A; żółte pole). Powierzchnia ROI na obrazie soczewki typu dzikiego wynosi 15,833 µm2Ponieważ nie zaobserwowano zaburzeń, procentowy obszar zaburzeń wynosi 0. Krytyczna rola, jaką nie mięśniowa miozyna IIA (NMIIA) odgrywa w heksagonalnym upakowaniu komórek, została wcześniej opisana z wykorzystaniem myszy z mutacją NMIIA-E1841K.20. Rycina 7A przedstawia reprezentatywne NMIIAE1841K/E1841K obraz równikowy soczewki obrazujący zaburzenia rzędów południkowych komórek. ROI rzędu południkowego było 20,757µm2. Następnie obrysowano całkowitą powierzchnię obszarów nieuporządkowanych. Całkowita powierzchnia nieuporządkowania wynosiła 3,185 µm2Obliczony procent nieuporządkowania wyniósł 15,3% (obszar nieuporządkowany x 100/całkowity ROI; Rysunek 7B). Ten procent obszaru nieuporządkowanego mieści się w zakresie uzyskanym w poprzednim badaniu20.

Następnie przeprowadzono badanie upakowania heksagonalnego w komórkach rzędów południkowych typu dzikiego20. Ponieważ F-aktyna jest wzbogacona wokół całego obwodu komórek rzędów południkowych oraz we wszystkich sześciu wierzchołkach obszarów podstawnych błon komórkowych w soczewkach typu dzikiego (tzn. NMIIA+/+), do oceny kształtów komórek i organizacji ich upakowania zastosowano barwienie F-aktyny. Na reprezentacyjnym obrazie 1 komórki zostały oznakowane i policzono liczbę komórek sąsiadujących z każdą z nich. Na obrazie 1 wszystkie dziesięć komórek posiada sześć komórek sąsiadujących, co sugeruje, że komórki te są ułożone w organizacji upakowania przypominającej plaster miodu (Rycina 8). W przeciwieństwie do tego, na obrazie 2 osiem z 10 komórek (80% komórek) posiada sześć komórek sąsiadujących, co wskazuje na nieregularne upakowanie komórek (Rycina 8).

W końcu, aby zmierzyć szerokość komórek włókien, zbadano obwodowe komórki włókien znajdujące się około 10 µm od punktu podparcia w utrwalonych soczewkach typu dzikiego, znakowanych rhodamine-phalloidin (Ryc. 9A)2,4. Należy zauważyć, że pomiar szerokości komórek włókien jest możliwy również z wykorzystaniem żywych myszy tdTomato, jednak sygnał z soczewek heterozygotycznych pod względem tdTomato ma tendencję do bycia słabym w obszarach równikowych. Dlatego zaleca się stosowanie myszy homozygotycznych pod względem tdTomato, ponieważ wykazują one silniejszą fluorescencję (nie pokazano). Odległość między granicami komórek barwionych na F-aktynę, mierzona za pomocą analizy skanowania liniowego, została wyznaczona zgodnie z wcześniej opisaną procedurą w celu określenia szerokości komórek włókien2,4 (Ryc. 9B). Analiza ta wykazała, że średnia odległość między szczytami w soczewkach typu dzikiego wynosi 11,45 ± 2,11 µm (N=117 komórek włókien z obrazów 4 różnych soczewek mysich, Ryc. 9B).

Kroki techniki hodowli komórkowej z użyciem szalki Petriego; pokazano pipetowanie, rozmieszczenie i przygotowanie próbki.
Rycina 1: Kroki tworzenia wgłębienia w agarozie w celu unieruchomienia soczewki podczas obrazowania. (A) Do naczynia z szklanym dnem nanieść pipetą upłynnioną 2% agarozę. (B) Wyrównać powierzchnię za pomocą elastycznego szkiełka nakrywkowego i (C) po ostygnięciu usunąć je pęsetą z cienkimi końcówkami. (D) W celu wykonania wgłębienia, wyciąć otwór za pomocą 3 mm puncha do biopsji. (E) Odessać pozostałą agarozę, wypłukać PBS, a następnie oczyścić powierzchnię za pomocą chusteczki bezpyłowej. (F) Ostrożnie umieścić całą soczewkę we wgłębieniu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Eksperyment na szalce Petriego: proces wycinania żelu do mikroskopii; krok po kroku, obraz F pokazuje zbliżenie wyniku.
Rysunek 2: Kroki tworzenia wgłębienia w agarozie do obrazowania komórek nabłonkowych równikowych i włókien soczewki. (A) Wlanie 2% stopionej agarozy do naczynia hodowlanego. (B) Chłodzenie agarozy w temperaturze pokojowej aż do całkowitego zestalenia. (C) Wycięcie trójkątnego wgłębienia za pomocą ostrego ostrza. (D) Wlanie 1 mL 1x PBS do naczynia hodowlanego. (E) Umieszczenie wypreparowanej soczewki w klinie, tak aby (F) soczewka opierała się na swoim równiku, będąc zaklinowaną między ściankami agarozy (czerwona strzałka). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Fluorescencja soczewek żywych i utrwalonych, obrazowanie skanowania liniowego; WGA i tdTomato, analiza wykresu intensywności.
Rysunek 3: Wyznaczanie grubości torebki soczewki. Sagitalne przekroje optyczne (widok w płaszczyźnie X, Z) z rekonstrukcji stosów z-stack z mikroskopu konfokalnego dla (A) żywych i (B) utrwalonych torebek soczewek. Intensywność fluorescencji skanowania liniowego dla (C) żywych i (D) utrwalonych soczewek wykazuje pojedynczy pik WGA (zielony), który odpowiada górnej powierzchni torebki, oraz region podstawowy komórek nabłonkowych (czerwony) sąsiadujący z torebką. Odległość między dwoma pikami jest mierzona w celu ilościowego określenia grubości torebki. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu olejowego 40x z dziurką (pinhole) o rozmiarze 1 jednostki Airy, co pozwoliło uzyskać przekroje optyczne o grubości odpowiednio 1,0 μm w kanale tdTomato/Rhodamine-Phalloidin oraz 1,2 μm w kanale WGA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Mikroskopia komórek barwionych tdTomato/Hoechst, analiza ROI, obrazowanie fluorescencyjne, dane dotyczące powierzchni i liczby komórek.
Rycina 4: Ilościowe oznaczenie powierzchni komórek nabłonkowych. (A) Widok w płaszczyźnie X, Z komórek nabłonkowych soczewki znakowanych (B) tdTomato dla błon komórkowych oraz (C) Hoechst dla jąder. (D) Widok w płaszczyźnie X, Y środkowego regionu komórek nabłonkowych soczewki. (E) Sygnał tdTomato służy jako wskazówka do zdefiniowania obszaru zainteresowania (ROI) odpowiadającego grupie komórek znajdujących się w ostrości. (F) Wyznaczana jest powierzchnia zdefiniowanego obszaru. (G) Barwienie Hoechst jąder służy do określenia liczby komórek w zdefiniowanym obszarze. (H) Liczbę jąder zlicza się przy użyciu (I) narzędzia multipoint w programie FIJI ImageJ. Aby obliczyć średnią powierzchnię komórki, należy podzielić całkowitą powierzchnię zdefiniowanego obszaru zainteresowania przez całkowitą liczbę komórek. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu olejowego 63x z pinholem 1 airy unit, co pozwoliło na uzyskanie przekrojów optycznych o grubości odpowiednio 0.7 μm i 1.0 μm w kanałach Hoechst i tdTomato. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Analiza segmentacji komórek; obraz mikroskopowy; powierzchnie komórek, okrągłość; ocena danych ilościowych.
Rysunek 5: Wyznaczanie powierzchni i kształtu jąder komórkowych. (A) Widok w płaszczyźnie XY środkowego regionu jąder. (B) Zdefiniowano obszar zainteresowania (ROI), w którym jądra są w ostrości. Jądra w obrębie ROI są obrysowane. (C) Zestawiono w tabeli powierzchnię i okrągłość jąder poszczególnych komórek, a następnie obliczono średnie wartości powierzchni i okrągłości. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu olejowego 63x z przysłoną (pinhole) o szerokości 1 jednostki Airy, co pozwoliło uzyskać przekrój optyczny o grubości 0,7 μm w kanale Hoechst. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia fluorescencyjna przedstawiająca strukturę komórkową z barwieniem WGA, faloidyną i Hoechst, widoki XZ i XY.
Rysunek 6: Identyfikacja punktu podparcia soczewki. Aktyna F i jądra mogą być wykorzystane do identyfikacji punktu podparcia i rzędów południkowych. (A) Widok XZ pokazuje wzmocnione barwienie faloidyną dla aktyny F, która odpowiada punktowi podparcia. (B) Widok pojedynczego optycznego przekroju XY z punktem podparcia soczewki w ogniskowej. Barwienie Hoechst dla jąder pokazuje, że jądra powyżej punktu podparcia są ułożone nieregularnie, podczas gdy jądra poniżej punktu podparcia są precyzyjnie wyrównane (prawy górny róg). Barwienie faloidyną dla aktyny F pokazuje, że komórki powyżej punktu podparcia mają nieregularne kształty, podczas gdy komórki poniżej punktu podparcia są ułożone w równoległych rzędach (lewy dolny róg). Czerwona przerywana linia wskazuje położenie punktu podparcia. Obrazy zarejestrowano przy użyciu obiektywu 20x z przesłoną o wielkości 1 jednostki Airy, co pozwoliło uzyskać przekroje optyczne o grubości odpowiednio 1,5 μm, 2,0 μm i 2,2 μm w kanałach Hoechst, rodamina-faloidyna i WGA-640. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Obraz mikroskopowy tkanki mięśniowej; barwienie faloidyną i Hoechst; obszary uporządkowane i nieuporządkowane.
Rysunek 7: Wyznaczanie nieuporządkowania rzędów południkowych. (A>) Pojedynczy przekrój optyczny w płaszczyźnie XY komórek rzędów południkowych typu dzikiego oraz NMIIAE1841K/E1841K w odległości ok. 5 µm od punktu podparcia (w kierunku torebki soczewki). Wszystkie komórki rzędów południkowych obrysowano na niebiesko na podstawie ułożenia jąder. Barwienie F-aktyny (czerwone) w soczewce typu dzikiego wykazuje, że komórki rzędów południkowych są precyzyjnie ustawione i nie wykazują oznak nieuporządkowania (0%). Obrysowano reprezentatywny obszar uporządkowany w typie dzikim (pomarańczowy). W soczewkach z nieuporządkowanymi komórkami obrysowano obszary nieuporządkowane (żółty). (B>) Duże powiększenie obszaru uporządkowanego z typu dzikiego (pomarańczowa ramka w A). (C>) Duże powiększenie obszarów nieuporządkowanych, wykazujące różne rodzaje nieuporządkowania, w tym (I) rozgałęzienia rzędów, (II) nieregularny kształt komórek i utratę upakowania plastrami miodu oraz (III) nieprawidłowe ustawienie rzędów. Obrazy z soczewki NMIIAE1841K/E1841K wykazują 15,3% nieuporządkowania komórek rzędów południkowych. Obrazy pozyskano za pomocą obiektywu 20x z otworem grota o wielkości 1 jednostki Airy, co pozwoliło uzyskać przekroje optyczne o grubości 1,5 μm w kanale Hoechst i 2,0 μm w kanale Rodaminy-Faloidyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza sąsiedztwa komórek; obrazy mikroskopowe z oznakowanymi komórkami; tabela porównawcza danych; skala 20 µm.
Rysunek 8: Analiza upakowania plastra miodu komórek w rzędzie południkowym soczewki. (A) Pojedyncze optyczne przekroje XY komórek rzędu południkowego barwionych rodaminą-falloidyną na F-aktynę. Obrazy przy niskim powiększeniu (panel górny) przedstawiają oceniane komórki (oznaczone numerami w kolorze różowym). Obszar obrysowany żółtą linią został powiększony (panel dolny). Żółte cyfry rzymskie oznaczają liczbę sąsiednich komórek. Obraz 1 przedstawia komórki o kształcie wyłącznie sześciokątnym, z których każda posiada 6 sąsiednich komórek. Obraz 2 wykazuje nieprawidłowości, gdzie komórki nr 1 i 5 mają odpowiednio 5 i 7 sąsiednich komórek. (B) Dane zostały zapisane i zestawione w tabeli z obliczonym procentem komórek sześciokątnych. Obrazy pozyskano przy użyciu obiektywu 40x z otworem pinhole o wielkości 1 jednostki Airy, co pozwoliło uzyskać optyczny przekrój o grubości 1.0 μm w kanale rodaminy-falloidyny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza wzorca rodaminy-faloidyny; wykres intensywności fluorescencji z pomiarami odległości, skala 50μm.
Rysunek 9: Analiza szerokości komórek włókien. (A) Pojedynczy optyczny przekrój XY komórek włókien soczewki w odległości ok. 10 µm od punktu podparcia. Komórki barwiono rodaminą-faloidyną w celu wizualizacji aktyny F w błonach komórkowych. Nad liczbą komórek włókien wyznaczono linię (różową; przerywaną). (B) Reprezentatywny skan liniowy intensywności aktyny F w funkcji odległości. Odległość między szczytami reprezentuje szerokość komórki włókna. Obrazy wykonano przy użyciu obiektywu 40x z otworem pinhole o wielkości 1 jednostki Airy, co pozwoliło uzyskać optyczny przekrój o grubości 1,0 μm w kanałach rodaminy-faloidyny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Dyskusja

Opisane protokoły umożliwiają wizualizację w wysokiej rozdzielczości przestrzennej obwodowych struktur i komórek soczewki w przednim i równikowym obszarze soczewki. W pracy przedstawiono metody wizualizacji struktur peryferyjnych soczewek przy użyciu nienaruszonych soczewek (aktywnych lub stałych), w których zachowana jest ogólna architektura soczewek 3D. Dodatkowo dostarczono proste metody morfometrycznej analizy ilościowej z wykorzystaniem publicznie dostępnego oprogramowania FIJI ImageJ. Metody wizualizacji i kwantyfikacji całego montażu były stosowane we wcześniejszych badaniach. Metody te pozwoliły nam zrozumieć reakcję torebki przedniej i komórek na zmianę kształtu soczewki lub starzenie się 2,4. Metody te zostały również wykorzystane do zbadania ekspansji komórek włókien równikowych spowodowanych zmianą kształtu soczewki lub starzeniem się 2,4 oraz do określenia roli NMIA w ustalaniu precyzyjnych sześciokątnych kształtów i organizacji komórek włókien obwodowych20.

Obrazowanie z pełnym mocowaniem pozwala na obrazowanie struktury soczewki w wysokiej rozdzielczości przestrzennej en face . W przedniej części soczewki obrazowanie z całego mocowania jest korzystne dla obrazowania z płaskim mocowaniem, zapobiegając uszkodzeniom, które mogą zmienić integralność struktury torebki i/lub morfologię komórek nabłonka. Dodatkowo zachowany jest interfejs między komórkami nabłonkowymi i włóknistymi. Metoda ta zapewnia przewagę nad wizualizacją przekrojów soczewki, ponieważ obrazowanie en face zapewnia większą rozdzielczość przestrzenną i umożliwia analizę obszaru komórki nabłonkowej i obszaru/kształtu jądra wybranego obszaru (tj. środkowego bocznego, jak pokazano tutaj) lub innych obszarów komórek. Co więcej, metody obrazowania pozwalają na ilościowe określenie cech morfologicznych w określonych punktach wzdłuż regionów równikowych soczewki, umożliwiając wizualizację sześciokątnych kształtów, południkowego upakowania komórek rzędowych, punktu podparcia i szerokości komórek włóknistych, co nie byłoby łatwo osiągalne za pomocą wycinków soczewek barwionych obrazowaniem ze względu na brak rozdzielczości przestrzennej i zniekształcenia tkanki, które mogą wystąpić podczas cięcia.

Przedstawione protokoły pozwalają również na obrazowanie żywych soczewek w celu śledzenia określonych struktur i komórek soczewek w czasie. Protokół obrazowania soczewki na żywo odegrał zasadniczą rolę w poprzednim badaniu, w którym przeprowadzono analizę wielokrotnych pomiarów grubości torebki i obszaru komórek nabłonka z subpopulacji komórek z tej samej soczewki przed i po ucisku soczewki w celu wywołania spłaszczenia soczewki4. Stwierdzono, że kompresja soczewki indukowała zmniejszenie grubości torebki i zwiększenie powierzchni komórek nabłonka. Ze względu na znaczne różnice w grubości torebki i powierzchni komórek nabłonkowych między poszczególnymi soczewkami oraz wielkość wpływu kompresji soczewki na te parametry spowodowane kompresją soczewki, trudno byłoby wykryć różnice, gdyby zastosowano niezależny projekt pomiarowy (tj. porównując poszczególne soczewki nieściśnięte z pojedynczymi soczewkami skompresowanymi). Korzystając z metod obrazowania na żywo, przeprowadzono obrazowanie całościowe na żywych soczewkach myszy, które endogennie eksprymują LifeACT-GFP26 w celu wizualizacji F-aktyny w komórkach nabłonka22, co umożliwia śledzenie reorganizacji F-aktyny w żywych komórkach nabłonka.

Podczas gdy przedstawione protokoły zostały opracowane do obrazowania soczewek myszy i mogą być dostosowane do wizualizacji struktur soczewek u innych gatunków, protokoły barwienia do wizualizacji soczewek zarówno przednich, jak i równikowych struktur obwodowych w innych soczewkach gryzoni (szczur, świnka morska), a także w soczewkach innych ssaków (krowa, makak i człowiek; dane nie pokazane). Wizualizacja struktur w większych soczewkach wymaga dłuższego utrwalenia (4%PFA, na lodzie, 4 h), blokowania (1 h) i barwienia (przez noc, 4 °C). Warto zauważyć, że obrazowanie u różnych gatunków przeprowadzono tylko na soczewkach stałoogniskowych. Obrazowanie na żywo soczewek innych gatunków może być trudne, ponieważ protokół obrazowania na żywo wykorzystuje soczewki od myszy transgenicznych, które wykazują ekspresję białek fluorogennych. W związku z tym obrazowanie to może wykluczać obrazowanie soczewek innych gatunków, w których modyfikacje genetyczne nie są powszechne. Udało nam się jednak przeprowadzić wizualizację na żywo błon komórkowych nabłonka soczewek lub F-aktyny poprzez wstępne barwienie soczewek myszy za pomocą sondy lipofilowej, FM4-64 lub sondy wiążącej F-aktynę, odpowiednio SiR-Jasplakinolidu (SiR-aktyny) (nie pokazano). Możliwe jest użycie takich sond do obrazowania na żywo soczewek innych gatunków. Należy jednak zachować ostrożność podczas korzystania z takich sond, aby uniknąć efektów niezamierzonych; na przykład SiR-jasplakinolid może prowadzić do zmienionej dynamiki F-aktyny27. Innym ograniczeniem metod barwienia, zarówno na soczewkach na żywo, jak i stałoogniskowych, jest to, że takie sondy mają ograniczoną penetrację. Dlatego obrazowanie jest ograniczone do regionów peryferyjnych. Możliwe jest obrazowanie wewnętrznych obszarów (tj. komórek głębokich włókien) za pomocą soczewek transgenicznych myszy tdTomato4, które ponownie opierają się na transgenicznej ekspresji białek fluorogennych. Ekspresja musi być również wystarczająco wysoka, aby zapewnić jasne sygnały w głębokich komórkach światłowodowych.

Niemniej jednak przedstawione protokoły umożliwiły skuteczną morfologiczną ocenę ilościową cech soczewek peryferyjnych 2,4,20. Metodologie kwantyfikacji są skuteczne i wykorzystują publicznie dostępne oprogramowanie FIJI ImageJ o otwartym kodzie źródłowym. Podczas gdy do identyfikacji obszarów zainteresowania wykorzystano ręczne narzędzia do śledzenia, możliwe jest zautomatyzowanie identyfikacji obszarów zainteresowania. Automatyzacja może być tak prosta, jak zastosowanie progów fluorescencyjnych w celu zwiększenia kontrastu do identyfikacji określonych struktur (tj. granic jąder) w oparciu o FIJI ImageJ lub bardziej złożonych algorytmów uczenia maszynowego do wykrywania różnic w kształcie komórek (tj. nieregularnych kształtów komórek nabłonka lub włókien). Bardziej złożona analiza może wymagać specjalistycznych wtyczek lub oprogramowania do obrazowania. Specjalistyczne wtyczki lub oprogramowanie mogą również pozwolić na uzyskanie wolumetrycznych pomiarów morfologicznych 3D z pozyskanych z-stosów. Ogólnie rzecz biorąc, podczas gdy opisane metody kwantyfikacji są łatwo dostępne, opłacalne i odpowiednie dla wielu użytecznych pomiarów wyników 2,4,20, platforma protokołu obrazowania, w połączeniu z zaawansowaną analizą oprogramowania, może zapewnić bogactwo dodatkowych pomiarów morfologicznych dla przyszłych badań.

Soczewka jest skomplikowaną tkanką biologiczną o wyspecjalizowanych funkcjach, które opierają się na zależnej od lokalizacji i głębokości geometrii komórek i związanych z nimi struktur. Wykorzystanie zademonstrowanych tutaj protokołów obrazowania i metod kwantyfikacji pozwoli na lepsze zrozumienie, w jaki sposób ustalane są struktury soczewek i złożona organizacja soczewki. Co więcej, protokoły obrazowania i metody kwantyfikacji pomogą określić zależności między strukturą a funkcjami soczewek.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Eye Institute Grant R01 EY032056 dla CC i R01 EY017724 dla VMF, a także przez National Institute of General Medical Sciences w ramach grantu numer P20GM139760. STI był wspierany przez NIH-NIGMS T32-GM133395 w ramach programu szkolenia przeddoktoranckiego Chemistry-Biology Interface oraz przez University of Delaware Graduate Scholars Award.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
3 mm Dziurkacz do biopsjiAcuderm IncNC9084780
AgarozaApex BioResearch Products20-102GP
Przeciwgrzybiczy/antybiotykowyCytivaSV30079.01
Albumina surowicy bydlęcej (frakcja V)Prometheus25-529
Delikatne chusteczki do zadańKimwipe
Naczynie ze szklanym dnem ( Fluorodish)World Precision InternationalFD35-100
Hoescht 33342Biotium40046
Laserowy skaningowy mikroskop konfokalny 880Zeiss
MatTek ImagingDish MatTek Life SciencesP35G-1.5-14
Paraformaldehyd Mikroskopia elektronowa Nauki100503-917
PBSGenClone25-507B
Pożywka fenolowa wolna od czerwieni 199Gibco11043023
Rodamino-falloidynaThermo Fisher00027
Triton X100Sigma-Aldrich11332481001
WGA-640BiotiumCF 640R

Bibliografia

  1. Gokhin, D. S., et al. Tmod1 and CP49 synergize to control the fiber cell geometry, transparency, and mechanical stiffness of the mouse lens. PLoS One. 7 (11), e48734(2012).
  2. Cheng, C., et al. Age-related changes in eye lens biomechanics, morphology, refractive index and transparency. Aging (Albany NY). 11 (24), 12497-12531 (2019).
  3. Cheng, C., et al. Tropomodulin 1 regulation of actin is required for the formation of large paddle protrusions between mature lens fiber cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (10), 4084-4099 (2016).
  4. Parreno, J., Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The effects of mechanical strain on mouse eye lens capsule and cellular microstructure. Mol Biol Cell. 29 (16), 1963-1974 (2018).
  5. Sindhu Kumari, S., et al. Role of Aquaporin 0 in lens biomechanics. Biochem Biophys Res Commun. 462 (4), 339-345 (2015).
  6. Martin, J. B., et al. Arvcf dependent adherens junction stability is required to prevent age-related cortical cataracts. Front Cell Dev Biol. 10, 840129(2022).
  7. Danysh, B. P., Duncan, M. K. The lens capsule. Exp Eye Res. 88 (2), 151-164 (2009).
  8. Mekonnen, T., et al. The lens capsule significantly affects the viscoelastic properties of the lens as quantified by optical coherence elastography. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1134086(2023).
  9. Fincham, E. F. The function of the lens capsule in the accommodation of the eye. Trans Optical Society. 30 (3), 101(1929).
  10. Cheng, C., Nowak, R. B., Fowler, V. M. The lens actin filament cytoskeleton: Diverse structures for complex functions. Exp Eye Res. 156, 58-71 (2017).
  11. Bassnett, S., Sikic, H. The lens growth process. Prog Retin Eye Res. 60, 181-200 (2017).
  12. Sikic, H., Shi, Y., Lubura, S., Bassnett, S. A full lifespan model of vertebrate lens growth. R Soc Open Sci. 4 (1), 160695(2017).
  13. Cheng, C., Ansari, M. M., Cooper, J. A., Gong, X. EphA2 and Src regulate equatorial cell morphogenesis during lens development. Development. 140 (20), 4237-4245 (2013).
  14. Sugiyama, Y., Akimoto, K., Robinson, M. L., Ohno, S., Quinlan, R. A. A cell polarity protein aPKClambda is required for eye lens formation and growth. Dev Biol. 336 (2), 246-256 (2009).
  15. Zampighi, G. A., Eskandari, S., Kreman, M. Epithelial organization of the mammalian lens. Exp Eye Res. 71 (4), 415-435 (2000).
  16. Lovicu, F. J., Robinson, M. L. Development of the Ocular Lens. , Cambridge University Press. (2011).
  17. Kuszak, J. R., Zoltoski, R. K., Sivertson, C. Fibre cell organization in crystalline lenses. Exp Eye Res. 78 (3), 673-687 (2004).
  18. Cvekl, A., Ashery-Padan, R. The cellular and molecular mechanisms of vertebrate lens development. Development. 141 (23), 4432-4447 (2014).
  19. Vu, M. P., Cheng, C. Preparation and immunofluorescence staining of bundles and single fiber cells from the cortex and nucleus of the eye lens. J Vis Exp. (196), e65638(2023).
  20. Islam, S. T., Cheng, C., Parreno, J., Fowler, V. M. Nonmuscle myosin IIA regulates the precise alignment of hexagonal eye lens epithelial cells during fiber cell formation and differentiation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (4), 20(2023).
  21. Patel, S. D., Aryal, S., Mennetti, L. P., Parreno, J. Whole mount staining of lenses for visualization of lens epithelial cell proteins. MethodsX. 8, 101376(2021).
  22. Parreno, J., et al. Methodologies to unlock the molecular expression and cellular structure of ocular lens epithelial cells. Front Cell Dev Biol. 10, 983178(2022).
  23. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  24. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238-250 (2012).
  25. Cheng, C., Gokhin, D. S., Nowak, R. B., Fowler, V. M. Sequential application of glass coverslips to assess the compressive stiffness of the mouse lens: Strain and morphometric analyses. J Vis Exp. (111), e53986(2016).
  26. Riedl, J., et al. Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin. Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).
  27. Lukinavicius, G., et al. Fluorogenic probes for live-cell imaging of the cytoskeleton. Nat Methods. 11 (7), 731-733 (2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organizacja soczewkimikroskopia konfokalnakomórki nabłonkowekomórki włókiengrubość torebkiobrazowanie w stosach Zunieruchomienie w agarozie
Obrazowanie całego mocowania w celu wizualizacji i ilościowego określenia struktury soczewek obwodowych, morfologii i organizacji komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.