Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

Podsumowanie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) mają ogromny potencjał do różnych zastosowań biomedycznych, w tym diagnostyki, dostarczania leków i medycyny regeneracyjnej. Niemniej jednak obecne metodologie izolowania pojazdów elektrycznych stanowią poważne wyzwania, takie jak złożoność, czasochłonność i zapotrzebowanie na nieporęczny sprzęt, co utrudnia ich kliniczne zastosowanie. Aby rozwiązać te problemy, naszym celem było opracowanie innowacyjnego systemu mikroprzepływowego opartego na cyklicznym tiolowo-senowym tiolowo-senowym kopolimerze olefin poza stechiometrią (COC-OSTE) do wydajnej izolacji EV od próbek o dużej objętości w sposób ciągły. Wykorzystując separację opartą na wielkości i wyporności, technologia zastosowana w tym badaniu osiągnęła znacznie węższy rozkład wielkości w porównaniu z istniejącymi podejściami z próbek moczu i pożywek komórkowych, umożliwiając ukierunkowanie na określone frakcje wielkości EV w przyszłych zastosowaniach. Nasza innowacyjna konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego COC-OSTE, wykorzystująca technologię frakcjonowania w polu przepływu bifurkowanego asymetrycznego, oferuje proste i ciągłe podejście do izolacji EV dla próbek o dużej objętości. Co więcej, potencjał masowej produkcji tego urządzenia mikroprzepływowego zapewnia skalowalność i spójność, co umożliwia integrację izolacji EV z rutynową diagnostyką kliniczną i procesami przemysłowymi, w których niezbędna jest wysoka spójność i przepustowość.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to cząstki błonowe pochodzenia komórkowego, składające się z dwóch głównych typów: egzosomy (30-200 nm) i mikropęcherzyki (200-1000 nm)¹. Egzosomy powstają poprzez wewnętrzne pączkowanie błony endosomalnej w ciele wielopęcherzykowym (MVB), uwalniając pęcherzyki śródświetlne (ILV) do przestrzeni zewnątrzkomórkowej po fuzji z błoną plazmatyczną¹. W przeciwieństwie do tego, mikropęcherzyki są generowane przez pączkowanie na zewnątrz i rozszczepienie błony komórkowej². EV odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport białek, kwasów nukleinowych, lipidów i metabolitów, odzwierciedlając stan fizjologiczny komórki, w tym wzrost, angiogenezę, przerzuty, proliferację i oporność na terapię³. W rezultacie okazały się obiecującymi biomarkerami i celami terapeutycznymi dla chorób, w tym raka, podkreślając ich potencjał w diagnostyce i systemach dostarczania leków⁴.

Aby w pełni wykorzystać EVs w diagnostyce chorób i terapii, niezbędna jest skuteczna izolacja od różnych płynów biologicznych⁵. Typowe metody obejmują ultrawirowanie (UC), wirowanie w gradionym gradiorze, chromatografię wykluczania wielkości (SEC), filtrację i immunoizolację⁶. UC jest szeroko stosowaną techniką, ale może dawać cząstki o podobnej gęstości, które nie są EV i mogą generować agregaty EVs⁷. SEC zyskał popularność ze względu na swoją zdolność do dostarczania próbek o wyższej czystości poprzez wykluczanie cząstek na podstawie rozmiaru, a nie gęstości⁸. Jednak staranny dobór odpowiedniej wielkości porów dla kolumny SEC i optymalizacja warunków chromatograficznych są niezbędne, aby zminimalizować koizolację niepożądanych cząstek, takich jak chylomikrony i lipoproteiny o niskiej gęstości⁸. Pomimo swojej skuteczności, obie metody są czasochłonne i trudne do zautomatyzowania, szczególnie w przypadku próbek o większej objętości, takich jak pożywki komórkowe lub mocz, co ogranicza ich skalowalność do zastosowań przemysłowych⁹.

W ostatnich latach, frakcjonowanie pola asymetrycznego przepływu pola (A4F) rozwinęło się jako potężna technika separacji mikro- i nanometrowych cząstek na podstawie wielkości i wyporu¹⁰. Zasada działania A4F opiera się na kanale mikroprzepływowym wyposażonym w porowatą membranę u podstawy, generującą siłę wywieraną w kierunku membrany zwaną przepływem krzyżowym¹⁰. W połączeniu z ruchem Browna i przepływem Poiseuille'a nieodłącznie związanymi z systemem, przepływ krzyżowy ułatwia efektywną separację cząstek dzięki zmiennemu położeniu cząstek w dynamice przepływu¹¹. Pomimo korzyści, metoda ta jest ograniczona do objętości próbek w zakresie mikrolitrów¹² i wymaga dodatkowego kroku ogniskowania, wydłużając czas trwania procesu¹⁰.

W ciągu ostatniej dekady, mikrofluidyka zyskała na znaczeniu jako narzędzie do szybkiej, efektywnej i klinicznie niezawodnej separacji EV¹³. Jednak większość metod mikroprzepływowych przeznaczonych do separacji EV jest zoptymalizowana dla próbek EV o małej objętości i wysokim stężeniu lub zależy od złożonych procedur separacji¹⁴. Ponadto, w dziedzinie mikrofluidyki, polidimetylosiloksan (PDMS) jest uznawany za złoty standard ze względu na swoją przezroczystość optyczną, biokompatybilność i łatwość użycia¹⁵. Niemniej jednak, jego znana skłonność do wchłaniania małych cząsteczek lipofilowych, w tym EV, może być problematyczna dla jego zastosowania w polu EV¹³.

Cykliczny kopolimer olefin (COC) jest często używanym materiałem w mikrofluidyce ze względu na biokompatybilność, małą absorpcję cząsteczek i wysoką odporność chemiczną¹⁵. Jednak produkcja urządzeń COC często wiąże się ze złożonymi procesami lub specjalistycznym sprzętem¹⁶. Alternatywnie, pozastechiometryczny tiol-en (OSTE) jest obiecującą alternatywą dla PDMS ze względu na zmniejszoną absorpcję małych cząsteczek, doskonałą stabilność chemiczną, łatwość wytwarzania i skalowalny proces wytwarzania^17,18. Jednak ze względu na skomplikowane połączenia z rurkami, urządzenia mogą być podatne na przeciekanie¹⁹.

Celem tego badania było zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego łączącego OSTE i COC oraz rozwidloną zasadę A4F do separacji EV od próbek o dużej objętości, takich jak mocz lub media komórkowe.

Protokół

Pobieranie próbek zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych Łotewskiego Uniwersytetu Naturalnego i Medycznego (decyzja N0-71-35/54)

UWAGA: Materiały użyte w tym badaniu są zawarte w pliku Tabela materiałów.

1. Produkcja drukowanych form w trójwymiarowym (3D)

1. Zaprojektuj podwójną formę ujemną w kształcie serpentyny w oprogramowaniu CAD o następujących wymiarach kanału górnego: wysokość 0,5 mm, szerokość 1 mm i długość 210 mm. W przypadku dolnego kanału użyj tej samej konstrukcji o szerokości 1,5 mm, wysokości 0,6 mm i długości 210 mm. Wymiary, takie jak szerokość, długość, wysokość i izometryczna ilustracja wzoru, są pokazane w Rysunek 1. Zapisz projekt jako plik .stl.
2. Przygotuj plik w pakiecie Z-Suite; nie musisz dodawać żadnej obsługi. Wydrukuj formy za pomocą ultrafioletowej drukarki 3D z wyświetlaczem ciekłokrystalicznym (UV LCD) z wytrzymałą czarną żywicą.
3. Po wydrukowaniu ostrożnie usuń formy z powierzchni drukarki. Umyj formy w izopropanolu (IPA) w sonikacji przez 20 minut.
4. Wysuszyć foremki suszarką z N₂.
5. Wystawić formy na działanie zalania za pomocą filtra ND33 przez 810 s, a następnie wstawić je do piekarnika w temperaturze 60 °C na 48 godzin.

2. Przygotowanie form PDMS

1. Waga PDMS w stosunku 10:1 w/w (do każdej formy należy użyć 16 g bazy elastomerowej i 1,6 g środka sieciującego). Wymieszaj składniki w planetarnym mieszalniku odśrodkowym, mieszając przez 1 minutę przy 500 obr./min.
2. Wlej zmieszany PDMS do form wydrukowanych w 3D i odgazuj w eksykatorze próżniowym przy -800 mbar przez 30 minut lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się pęcherzyków.
3. Ostrożnie umieść wkładkę z polichlorku winylu o grubości 100 μm na wierzchu płynnego PDMS.
   UWAGA: Nakładaj wkładkę powoli z jednej strony na drugą, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
4. Włóż formę z PDMS do przyrządu Mold-in-Place i dokręć przyrząd za pomocą klucza dynamometrycznego ustawionego na 0.3 Nm.
5. Umieść przyrząd w piekarniku o temperaturze 60 °C na 3 godziny, aby utwardził PDMS.
6. Zdemontuj przyrząd za pomocą klucza imbusowego i wyjmij wydrukowaną w 3D formę z przyrządu.
7. Ostrożnie wyjmij formy PDMS z wydrukowanych w 3D form wzorcowych, przesuwając się po krawędziach formy za pomocą skalpela, a następnie usuwając formę za pomocą pęsety.
   UWAGA: W celu łatwiejszego usuwania pleśni można użyć IPA; jednak formy należy podgrzewać w temperaturze 60 °C przez 10 minut, aby odparować nadmiar IPA.

3. Przygotowanie górnego kanału OSTE-COC

1. Waga OSTE w stosunku 1,09:1 w/w (dla 5 urządzeń potrzebne jest 1,56 g części A i 1,44 g części B). Wymieszaj składniki w planetarnym mieszalniku odśrodkowym: mieszaj przez 5 minut przy 750 obr./min, a następnie odgazowuj przez 5 min przy 750 obr./min.
2. Przenieść zmieszany OSTE do probówki wirówkowej i odgazować przy -800 mbar w eksykatorze próżniowym przez 30 minut.
3. Wyczyść szkiełka COC za pomocą złączy 2 x 16 mini Luer metodą sonikacji w IPA przez 10 minut. Ostrożnie osusz szkiełka za pomocą N₂.
4. Umieść czyste szkiełka COC w asherze plazmowym tak, aby płaska powierzchnia była skierowana do góry, a następnie traktuj powierzchnię plazmą tlenową 800 SCCM przez 2 minuty przy mocy 700 W i ciśnieniu 0.133 mbar.
5. Umieść utleniony szkiełko COC na formie PDMS dla górnego kanału tak, aby obrabiana powierzchnia stykała się ze strukturalną powierzchnią PDMS. Umieść zespół w przyrządzie Mold-in-Place, dokręcając przyrząd kluczem dynamometrycznym ustawionym na 0.3 Nm.
6. Podłączyć układ ciśnieniowy do przewodu sprężonego powietrza pod ciśnieniem 6 barów. Weź probówkę wirówkową z odgazowanym OSTE i zmontuj ją zgodnie z instrukcjami systemu ciśnieniowego za pomocą rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy wewnętrznej 0,8 mm (ID).
7. Podłączyć rurkę PTFE do wlotu formy PDMS i za pomocą ciśnienia 1000 mbar utrzymywanego przez pompę piezoelektryczną umieszczoną w układzie ciśnieniowym napełnić urządzenie. Umieść przyrząd szklaną stroną do góry w nakładce maski i naświetl dawką 850 mJ przy użyciu filtra ND33.
8. Po naświetleniu zdemontuj przyrząd za pomocą klucza imbusowego i ostrożnie wyjmij suwak COC ze strukturalną warstwą OSTE z formy PDMS.
9. Doprowadzić strukturalny OSTE do kontaktu z membraną o wymiarach 25 mm x 75 mm z porami 50 nm i gęstością porów 11,8%, tak aby kanały były całkowicie pokryte membraną.
   UWAGA: Szczególnie ważne jest, aby membrana była jak najbardziej prosta podczas procesu aplikacji.
10. Umieść zespół na płycie grzejnej ustawionej na 60°C stroną z membraną do góry, umieść czyste szkiełko na membranie i zastosuj ciśnienie 1.6 kPa od góry, aby zapewnić równomierne połączenie. Podgrzej zestaw przez noc.
    UWAGA: Po tym kroku szczególnie ważna jest ocena wydajności wiązania i deformacji kanału.

4. Przygotowanie dolnego kanału OSTE-COC i montażu urządzenia

1. Wymieszaj OSTE w proporcji 1,09:1 w/w (na 5 urządzeń potrzebne jest 1,56 g części A i 1,44 g części B). Wymieszaj składniki w planetarnym mikserze odśrodkowym: mieszaj przez 5 minut przy 750 obr./min, a następnie odgazowuj przez 5 minut przy 750 obr./min.
2. Przenieść zmieszany OSTE do probówki Falcon i odgazować przy -800 mbar w eksykatorze próżniowym przez 30 minut.
3. Wyczyść szkiełka COC za pomocą sonikacji w IPA przez 10 minut. Ostrożnie osuszyć szkiełka za pomocą N₂.
4. Umieść czyste szkiełka COC w asherze plazmowym i traktuj powierzchnię plazmą tlenową 800 SCCM przez 2 minuty przy mocy 700 W i ciśnieniu 0.133 mbar.
5. Umieść utleniony szkiełko COC na formie PDMS dla dolnego kanału tak, aby obrabiana powierzchnia stykała się ze strukturalną powierzchnią PDMS. Umieść zespół w przyrządzie Mold-in-Place, dokręcając przyrząd kluczem dynamometrycznym ustawionym na 0.3 Nm.
6. Weź rurkę falcon z odgazowanym OSTE i zmontuj ją zgodnie z instrukcją systemu ciśnieniowego za pomocą rurki PTFE o średnicy wewnętrznej 0,8 mm.
7. Podłącz rurkę PTFE do wlotu formy PDMS i pod ciśnieniem 1000 mbar napełnij urządzenie. Umieść przyrząd szklaną stroną do góry w wyrównywaczu maski i naświetlaj dawką 1100 mJ za pomocą filtra ND33.
8. Po naświetleniu zdemontuj przyrząd za pomocą klucza imbusowego i ostrożnie wyjmij suwak COC ze strukturalną warstwą OSTE z formy PDMS.
9. Połącz strukturalną warstwę OSTE z zespołem górnego kanału, tak aby konstrukcja górnej i dolnej warstwy była wyrównana ze sobą i aby dolna warstwa OSTE stykała się z membraną.
10. Włóż wzór do przyrządu Mold-in-Place i za pomocą klipsów buldoga równomiernie dociśnij urządzenie 1.6 kPa. Wstaw przyrząd na noc do piekarnika o temperaturze 60°C.
    UWAGA: Nierówne rozmieszczenie klipsów może prowadzić do nierównomiernego łączenia.

5. Ocena urządzenia

1. Po klejeniu należy wizualnie ocenić urządzenia pod mikroskopem pod kątem wad wizualnych, na przykład deformacji kanału lub nieudanego klejenia.
2. Przetestuj urządzenia bez wad, przepuszczając przefiltrowaną wodę dejonizowaną 0,02 μm przez kanały pod ciśnieniem 30 mbar. Zwróć uwagę na nieszczelności kanału przepływowego i portu Luer oraz przepływ wody.
   UWAGA: Jeśli nie można wykryć wycieku, a przepływ kanałów jest nieprzerwany, urządzenia uważa się za nadające się do dalszych eksperymentów.

6. Konfiguracja urządzenia

1. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 5 ml 2 ml 20 nm przefiltrowanego 3% H_2O2 i umieść je na pompie strzykawkowej (użyj strzałek ruchu na żądaną odległość, włóż strzykawki i zamocuj je na miejscu za pomocą górnego pręta).
   OSTROŻNOŚĆ! Zawsze należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z H₂O₂. Nosić fartuch laboratoryjny, gumowe rękawice ochronne i okulary ochronne.
2. Podłącz rurkę PTFE o długości 14 cm o średnicy wewnętrznej 800 μm do strzykawek za pomocą igieł strzykawkowych oraz do wlotów urządzenia za pomocą złączy Luer.
3. Podłącz rurki polieteroeteroketonowe (PEEK) o długości 20 cm i średnicy wewnętrznej 200 μm do wylotów.
4. Podłącz drugi koniec rurki PEEK do pojemnika na odpady. Konfigurację można zobaczyć w Rysunek 3.
5. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością przepływu 500 μl/min dla każdego wlotu (na ekranie przyrządu: Ustawienia > System Ustaw > Strzykawka (producent: strzykawka medyczna, strzykawka: 5 ml) > przycisk Wstecz > Parametry (Wybierz: zaparzanie, Powtórzenie: 1, Objętość: 1,5 ml, Przepływ: 500 μl/min) > Przycisk Wstecz > Wstecz przycisk). Zebrać przepływ do pojemnika na odpady.
6. Napełnij dwie nowe strzykawki o pojemności 5 ml 2 ml przefiltrowanego 70% etanolu o długości fali 20 nm.
7. Zastąp poprzednie strzykawki strzykawkami wypełnionymi etanolem i uruchom pompę strzykawkową, korzystając z tych samych parametrów, które opisano w kroku 6.5.
8. Użyj nowych strzykawek o pojemności 5 ml i napełnij je 5 ml przefiltrowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) o długości 20 nm.
9. Zastąp poprzednie strzykawki strzykawkami wypełnionymi PBS i przepłucz urządzenie 4 ml PBS, powtarzając kroki 6.1. i 6.5.
   UWAGA: Upewnij się, że zmieniłeś parametry konfiguracji systemu na Objętość: 4 ml (na ekranie instrumentu: Ustawienia > Parametry > (Wybierz: Objętość: 4 ml).
10. Odłącz rurkę od urządzenia i zamknij każdy wlot i wylot za pomocą zatyczek Luer.
    UWAGA: Pozostaw PBS w urządzeniu i unikaj zatrzymywania powietrza, dodając dodatkowe PBS na każdym wlocie i wylocie za pomocą mikropipety przed zamknięciem.
11. Pozostaw urządzenie na noc w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej (RT).
12. Następnego dnia przepłukać urządzenie wypełnione PBS 4 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm (jak opisano w kroku 6.8).
13. Zebrać ostatni 1 ml przepływu z obu wylotów do probówki o niskiej ilości białka o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C jako ślepą próbę dla cząstek wprowadzanych przez urządzenie.
14. Wyjąć strzykawki wypełnione PBS i zastąpić je nowymi strzykawkami o pojemności 5 ml wypełnionymi powietrzem.
15. Oczyść urządzenie 4 ml powietrza, aż cały płyn opuści urządzenie i rurkę.

7. Testowanie urządzeń za pomocą standardowych koralików lateksowych

1. Przygotuj znormalizowaną próbkę kulek przy użyciu polistyrenu 1,0 μm i kulek karboksylowych 0,1 μm. Do probówki o pojemności 15 ml dodaj 500 μl wzorców kulek polistyrenowych 1,0 μm, 1 μl wzorców kulek karboksylowych 0,1 μm i 9499 μl przefiltrowanego PBS o długości 20 nm (końcowe stężenie mieszanki kulek 1,0 i 0,1 μm wyniesie odpowiednio 5 × 108 kulek/ml i 3,6 × 1010 kulek/ml).
2. Wirować próbkę kulki przez 30 s i przechowywać ją w temperaturze +4 °C, gdy nie jest używana.
3. Napełnij jedną nową strzykawkę o pojemności 5 ml 1,5 ml znormalizowanej mieszaniny kulek, a drugą 1,5 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
4. Wyjąć poprzednio podłączone strzykawki i przymocować strzykawkę z mieszanką kulek do pierwszej rurki wlotowej, a drugą do drugiego wlotu.
5. Wyjmij pojemnik na odpady i przygotuj co najmniej pięć probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml na każdy przewód wylotowy.
6. Zmień parametry rozruchu systemu pompy strzykawkowej na Objętość: 1 ml; Przepływ: 250 μl/min.
   UWAGA: W zależności od potrzeb użytkownika można ustawić różne prędkości przepływu, takie jak 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min i 50 μL/min. Zaleca się przeprowadzenie wstępnego badania w celu wybrania najkorzystniejszej prędkości dla pożądanego wyniku.
7. Uruchomić pompę strzykawkową i zebrać odpływ - 5 do 6 kropel w każdej probówce do mikrowirówki.
   UWAGA: Jeśli to samo urządzenie jest używane wiele razy, przepłucz je zgodnie z opisem w kroku 6.8 i wymień wszystkie złącza, wtyczki i igły. Umyj zużyte złącza, zatyczki i igły, pozostawiając je w 20 nm przefiltrowanym 70% etanolu na co najmniej 30 minut. Następnie przenieś wszystkie części do probówki zawierającej przefiltrowaną wodę dejonizowaną o długości 20 nm, dokładnie wstrząśnij probówką i przenieś je na szalkę Petriego zawierającą 20 ml przefiltrowanej wody dejonizowanej o długości 20 nm. Pozostaw szalkę Petriego na wytrząsarce na co najmniej 30 minut przy 100 obr./min, a następnie pozostaw rzeczy do wyschnięcia na suchej szalce Petriego (na co najmniej 12 godzin) przed ponownym użyciem.

8. Testowanie urządzenia z próbkami moczu

1. Przygotuj urządzenie zgodnie z opisem w krokach 6.1-6.15.
2. Zbierz 100 ml porannego moczu na dawcę za pomocą sterylnych pojemników na mocz i dostarcz go do laboratorium w celu przetworzenia w ciągu 2 godzin od pobrania.
3. Każdą próbkę moczu rozdzielić do dwóch probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 2'000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
4. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
5. Odwirować supernatant o sile 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się dużych cząstek i resztek komórek.
6. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
7. Umyj urządzenie zgodnie z opisem w 6.6.
8. Zamień strzykawki o pojemności 5 ml na strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną przygotowaną próbką moczu dla wlotu próbki i kolejną strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną 20 ml przefiltrowanego DEPC-PBS o długości fali 20 ml dla wlotu buforu. Zmień ustawienia pompy strzykawkowej na BDPlastipak; Strzykawka: cc; Objętość: 20 mL; Przepływ: 250 μl/min (optymalne natężenie przepływu), podobnie jak opisano w kroku 6.2. Uruchomić pompę strzykawkową i zebrać przepływ z każdego wylotu w oddzielnych probówkach o pojemności 50 ml.
9. Zagęścić każdy przepływ oddzielnie za pomocą 100 000 probówek o masie cząsteczkowej do 100 μl każda przy 3 000 x g w 4 °C.
10. Przenieść koncentraty do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
11. Wirować zagęszczone próbki przez 30 sekund, a następnie wirować przez 10 sekund.
12. Porcjować próbki, przenosząc 25 μl próbki na probówkę, oznaczyć je i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

9. Testowanie urządzeń z kondycjonowanymi mediami

1. Przygotuj urządzenie zgodnie z opisem w krokach 6.1-6.15.
2. Hodowla komórek w 5% nawilżonym środowisku CO₂ w temperaturze 37 °C, aż całkowita liczba osiągnie 100 milionów według Bajo-Santos et al.²⁰ Przenieś komórki do pojedynczej kolby zawiesinowej T175 w 100 ml pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej 2% substytutem surowicy i hoduj w 5% nawilżonym środowisku CO₂ w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 48 godzin.
3. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować ją przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się komórek.
4. Zebrać i ponownie odwirować supernatant w temperaturze 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze +4 °C, aby pozbyć się dużych cząstek i resztek komórek.
5. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze +4°C do czasu rozdzielenia, ale nie dłużej niż 3 godziny.
6. Zamień strzykawki o pojemności 5 ml na strzykawki o pojemności 20 ml wypełnione przygotowanym kondycjonowanym podłożem dla wlotu próbki i wypełnione 20 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm dla wlotu buforu.
7. Ustaw ustawienia w stacji pomp zgodnie z opisem w kroku 7.8.
8. Uruchomić pompę strzykawkową i zebrać przepływ z każdego wylotu do oddzielnej probówki o pojemności 50 ml.
9. Zagęścić każdy przepływ oddzielnie za pomocą probówek o masie odcięcia masy cząsteczkowej 100 000 do 150 μl każda przy 3 000 x g w temperaturze +4 °C.
10. Przenieść koncentraty do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
11. Wirowanie zagęszczone próbki przez 30 s.
12. Wirować skoncentrowane próbki przez 10 sekund.
13. Porcjować próbki, przenosząc 25 μl próbki na probówkę, oznaczyć je i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

10. Izolacja EV za pomocą ultrawirowania

1. Odwirować 20 ml moczu lub kondycjonowanego podłoża komórkowego przy 100 000 x g przez 70 minut w temperaturze +4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie
nachylenia.
2. Odrzucić sklarowany sklarat i ponownie zawiesić osad w 20 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
3. Ponownie odwirować, jak wyjaśniono w 10.1.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
5. Wirować przy 100 000 x g przez 70 minut w temperaturze +4 °C za pomocą wirnika obrotowego.
6. Odrzucić supernatant.
   UWAGA: Tym razem należy zachować ostrożność podczas wyrzucania supernatantu. Zaleca się robienie tego za pomocą pipety.
7. Zawiesić osad w 100 μl przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
8. Podwielokrotnić próbkę i przejść do ustawienia 12 w celu charakterystyki EV. W przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

11. Izolacja EV za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC)

1. Zagęścić 20 ml moczu lub kondycjonowanego podłoża komórkowego do 500 μl za pomocą filtrów odśrodkowych o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) przy 3 000 x g w temperaturze +4 °C przez 15 minut.
2. Przenieść koncentrat na kolumnę SEC (zakres obciążenia 35 nm).
3. Wlać przefiltrowany PBS o długości 20 nm do kolumny i zebrać 15 frakcji po 0,5 ml.
4. Analizuj frakcje za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zgodnie z instrukcjami producenta.
5. Zbierz wybrane frakcje. Wybieraj frakcje o tłumieniu niższym niż 11 i co najmniej 30% wszystkich cząstek większych niż 40 nm.
6. Zagęścić wybrane frakcje do 100 μl za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących 3 kDa z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) przy 14 000 x g w temperaturze +4 °C przez 15 min.
7. Podwielokrotnić próbkę i przejść do sekcji 12 w celu scharakteryzowania EV. W przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

12. Charakterystyka EV

1. Próbkę, która ma zostać scharakteryzowana, pobrać z zamrażarki i powoli ją rozmrażać (na bloku lodu lub w temperaturze +4 °C).
2. Wykonaj analizę śledzenia nanocząstek (NTA), aby określić rozkład wielkości i ilość cząstek¹³. Wykonaj test immunoenzymatyczny sprzężony z białkiem błony komórkowej komórek T o wysokim powinowactwie (TIM-4) z podwójnym testem immunoenzymatycznym (dsELISA)¹⁴, aby potwierdzić obecność EV w próbkach.

13. NTA

1. Rozmrożoną próbkę EV należy wirować przez 30 s i wirować przez 10 s, a następnie przenieść 1 μl do 999 μl przefiltrowanego PBS o długości 20 nm w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml w celu rozcieńczenia 1000-krotnie. Zaoszczędź 1 ml dodatkowego PBS użytego do rozcieńczenia, aby sprawdzić, czy nie zawiera żadnych cząstek. Przechowywać wszystko w temperaturze +4 °C do momentu pomiaru.
   UWAGA: Przed użyciem przefiltruj PBS przez filtr 0,02 nm.
2. Wirować próbkę EV lub ślepą próbę przez 30 s i włożyć ją do modułu za pomocą strzykawki. Napełnij moduł około 0,7 ml próbki i umieść ją w urządzeniu.
3. Zmierz próbkę za pomocą analizatora nanocząstek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

14. dsELISA dla znaczników EV

1. Przygotować roztwór 1 μg/ml białka TIM4-Fc. Pokryć studzienki 96-dołkowej płytki ELISA, przenosząc 100 μl roztworu do każdej niezbędnej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze +4 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
2. Następnego dnia przygotuj roztwór myjący (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl₂).
3. Wylej cały płyn z każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę, dodając 200 μl roztworu myjącego, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucając. Powtórz ten krok dwukrotnie.
4. Przygotować roztwór blokujący (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% albuminy surowicy bydlęcej. Dodać 200 μl roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
5. Umyj każdą studzienkę zgodnie z opisem w kroku 14.3.
6. Przygotować 220 μl każdej próbki rozcieńczonej w buforze płuczącym (optymalne stężenie EV wynosi 2,7 × 10⁵ EVs/μL). Dodać 100 μl rozcieńczonej próbki do dołka i przeprowadzić dwie kontrpróby. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
7. Umyj każdą studzienkę zgodnie z opisem w kroku 14.3.
8. Dodać 100 μl odpowiednich przeciwciał do każdej studzienki. Użyj odpowiednich znaczników EV do potwierdzania EV i zanieczyszczeń⁴. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, wytrząsając z prędkością 200 obr./min. UWAGA: Jeśli stosowane są przeciwciała drugorzędowe, powtórz kroki 14.7-14.8. Należy jednak skrócić okres inkubacji przeciwciał drugorzędowych do 1 godziny.
9. Umyj każdą studzienkę zgodnie z opisem w kroku 14.3.
10. Dodać 100 μl substratu peroksydazy chrzanowej do każdej studzienki, mieszać płytkę przez 1 minutę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
11. Dodać 1 M H₂SO₄ do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
12. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję przy 450 nm.

Wyniki

Wyprodukowaliśmy urządzenie mikroprzepływowe za pomocą wydrukowanej w 3D podwójnej formy negatywowej (Rysunek 1) za pomocą miękkiej litografii (Rysunek 2A) do wysokoprzepustowej separacji EV w oparciu o rozwidloną zasadę A4F (Rysunek 2B,C). Konfiguracja wymaga pompy i stacji przepływowej, jak można zobaczyć na Rysunek 3, do izolacji pojazdów elektrycznych w sposób zautomatyzowany. Po pierwsze, aby ocenić słuszność koncepcji urządzeń, przygotowano mieszaninę kulek polistyrenowych o średnicach 100 nm i 1000 nm, które reprezentują odpowiednio pęcherzyki i drobne resztki komórek¹⁰. Przeprowadzono eksperymenty z różnymi natężeniami przepływu dla mieszanki kulek, zarówno z przepływem rozwidlającym, jak i bez niego, w celu zbadania wpływu prędkości liniowej na wydajność separacji. We wszystkich eksperymentach odzyskiwanie małych koralików utrzymywało się na stałym poziomie i przekraczało 90%¹⁰, co pokazuje potencjał urządzenia do odzyskiwania pojazdów elektrycznych.

Następnie oceniliśmy i porównaliśmy potencjał urządzenia COC-OSTE w izolowaniu EV od dużych objętości (>1 ml) od złożonych płynów biologicznych przy minimalnym wstępnym przetwarzaniu. W związku z tym mocz od 10 zdrowych dawców (Rysunek 4) oraz pożywki komórkowe z dwóch różnych linii komórkowych prostaty (Ryc. 5) zostały użyte jako matryca do jednoczesnej izolacji EV zgodnie z trzema różnymi procedurami: ultrawirowanie (UC), chromatografia wykluczania wielkości (SEC) i urządzenie OSTE-COC oparte na mikrofluidyce A4F. Po wyizolowaniu oceniono całkowitą liczbę cząstek i ich rozkład wielkości za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Przeciętnie urządzenie OSTE-COC wykazało lepszy całkowity odzysk cząstek z płynów biologicznych w porównaniu z UC, ale istotność statystyczna została osiągnięta tylko po połączeniu liczby cząstek z obu portów (Rysunek 4A). W celu porównania wydajności urządzenia z innymi systemami, należy wziąć pod uwagę łączne gniazdka R & L. Jak pokazano na rysunku Rysunek 4, wydajność wylotu L i R razem przy odzyskiwaniu EV przewyższa UC i SEC. Oddzielnie, port L został zaprojektowany do wychwytywania małej frakcji EV, podczas gdy port R został zaprojektowany do zbierania większej frakcji EV z innymi cząsteczkami o podobnej wielkości. Co ciekawe, odzyskiwanie przy użyciu R-PORT urządzenia OSTE-COC było nieco wyższe niż w przypadku samych SEC i UC (Rysunek 4A). Wyrażenie CD63 wykazało podobny wzorzec (Rysunek 4C). Odkrycie to wskazuje, że urządzenie OSTE-COC było bardziej skuteczne w całkowitym odzyskiwaniu pojazdów elektrycznych. Stwierdzono równoważny rozkład wielkości między różnymi metodologiami, z wyjątkiem UC, która pokazuje większy rozkład wielkości cząstek (Rysunek 4B).

Porównywalne wyniki zaobserwowano w hodowlach pożywek komórkowych. W obu scenariuszach całkowity odzysk cząstek z obu portów urządzenia wykazał lepszą wydajność w porównaniu z metodologiami SEC lub UC (jak pokazano w Rysunek 5A,B). Warto zauważyć, że EV pochodzące z komórek PC3 wykazały wyraźny rozkład wielkości, z większą jednorodnością w rozkładzie L-PORT w porównaniu z innymi grupami eksperymentalnymi (Rysunek 5C,D). Co więcej, analiza ekspresji CD63 potwierdziła wyższe wskaźniki odzysku EV osiągnięte przy użyciu urządzenia COC-OSTE (jak pokazano na Rysunek 5E,F). Podsumowanie porównujące charakterystykę izolacji różnych metodologii analizowanych w tym badaniu znajduje się w tabeli 1.

Rysunek 1: 3DP serpentynowy podwójny ujemny wymiar formy i widok izometryczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Urządzenie mikroprzepływowe COC-OSTE. (A) Schemat różnych głównych etapów produkcji urządzenia OSTE-COC. (B) Zasada działania urządzenia. (C) Obraz gotowego urządzenia. Podziałka: 15 mm. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Priedols et al.¹⁰ oraz Bajo-Santos et al.²⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Eksperymentalna konfiguracja urządzenia. Pompa strzykawkowa znajduje się po lewej stronie, urządzenie OSTE-COC znajduje się pośrodku, a stacja odzyskiwania znajduje się po prawej. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Priedols et al.¹⁰ oraz Bajo-Santos et al.²⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Rozkład wielkości EV w moczu i odzyskiwanie cząstek od 10 dawców przy użyciu ultrawirowania (UC), chromatografii wykluczania wielkości (SEC) i urządzenia COC-OSTE. (A) Ilość cząstek odzyskanych z każdej metody izolacji za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA). Dane przedstawione jako średnia +/- odchylenie standardowe. Istotność statystyczna oznaczona * (p<0,05). (B) Wykresy skrzynkowe przedstawiają średni rozkład wielkości cząstek we wszystkich próbkach moczu ocenionych przez NTA, z wąsami wskazującymi wartości minimalne i maksymalne. Wartości P uzyskano z porównań do UC, gdzie **** wskazuje na wysoką istotność statystyczną (p<0,0001). (C) Medianę i zakres średniej ilości CD63, oceniane za pomocą testu immunoenzymatycznego z podwójną kanapką (dsELISA), dla każdej metody izolacji, obliczono dla wszystkich próbek. Port L: Lewy port; Port R: Prawy port. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bajo-Santos et al.²⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Charakterystyka EV wyizolowanych z komórek PC3 i LNCaP przy użyciu różnych metod. (A) Ilość cząstek odzyskanych z pożywki PC3 za pomocą analizy śledzenia nanocząstek (NTA) reprezentowana przez średnią+/- odchylenie standardowe. (B) Ilość cząstek odzyskanych z pożywki komórkowej LNCaP przy użyciu NTA reprezentowanej jako średnie +/- odchylenie standardowe. (C) Średni rozkład wielkości cząstek EV z kultur PC3, wraz z zakresem, został określony przez NTA. (D) Mediana rozkładu wielkości EV wyizolowanych z kultur LNCaP z zasięgiem. (E) Mediana i zakres ekspresji CD63 dla każdej metody izolacji EV pochodzącej z linii komórkowej PC3, przy użyciu testu immunoenzymatycznego z podwójną kanapką (dsELISA). (F) Mediana i zakres ekspresji EV CD63 pochodzącej z LNCaP za pomocą dsELISA dla każdej metody izolacji. UC: Ultrawirowanie; SEC: Chromatografia wykluczająca rozmiar; Port L: Lewy port; R-port: Prawy port. Ten rysunek został zmodyfikowany za zgodą Bajo-Santos et al.²⁰. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

	Uc	S	COC-OSTE
Czas przetwarzania/próbka	++/+++	+++	+
przepustowość	++	+	+++
Koszt/próbka	+	+++	++
czystość	+	+++	++
Automatyzacja	++	+	+++
Zysk z pojazdów elektrycznych	++	++	+++
Wybór rozmiaru	+	++	++

Tabela 1. Porównanie charakterystyk izolacji pojazdów elektrycznych za pomocą trzech metod: UC, SEC i urządzenia COC-OSTE. UC: Ultrawirowanie; SEC: Chromatografia wykluczania wielkości. COC-OSTE: cykliczny kopolimer olefin poza stechiometrią tiol-en. +: niski; ++: średnia; +++: wysoki. * W zależności od urządzenia.

Dyskusja

Zaprezentowane urządzenie mikroprzepływowe stanowi obiecującą metodę izolacji i ekstrakcji pojazdów elektrycznych z płynów biologicznych, rozwiązując niektóre z krytycznych ograniczeń istniejących metod opartych na złotych standardach, takich jak UC i SEC¹². UC i SEC są znane z tego, że są pracochłonne, czasochłonne i charakteryzują się niską wydajnością, co czyni je mniej odpowiednimi do zastosowań o wysokiej przepustowości, w których potrzebne są duże ilości pojazdów elektrycznych^21,22. W przeciwieństwie do tego, opisywane urządzenie mikroprzepływowe może w sposób ciągły przetwarzać znaczną objętość do 20 ml płynu biologicznego przy minimalnym udziale użytkownika, co czyni je potencjalnym przełomem w warunkach przemysłowych lub klinicznych. Jedną z kluczowych zalet tego urządzenia mikroprzepływowego jest jego zdolność do standaryzacji izolacji pojazdów elektrycznych i poprawy odtwarzalności w porównaniu z tradycyjnymi metodami, które wymagają ręcznych kroków. Zmniejszając zmienność produkcji urządzeń izolujących pojazdy elektryczne poprzez masową produkcję, wydajność urządzenia może być lepiej kontrolowana i spójna, co ma kluczowe znaczenie dla zastosowań takich jak terapia i diagnostyka oparta na pojazdach elektrycznych. Co więcej, kompatybilność urządzenia z produkcją wielkoseryjną poprzez wtryskiwanie reakcyjne odpowiednich podłoży jeszcze bardziej zwiększa jego potencjał skalowalności i szerszego zastosowania.

Aby zapewnić powtarzalność i stałą wydajność, niezbędny jest obszerny i dobrze zdefiniowany protokół, zarówno do produkcji chipa, jak i do jego wykorzystania w eksperymentach. Chip został zaprojektowany z myślą o industrializacji. Jednak podczas wytwarzania urządzenia w środowisku laboratoryjnym należy zwrócić uwagę na unikanie tworzenia się pęcherzyków, zapewnienie precyzyjnego i solidnego wiązania oraz przeprowadzenie dokładnych testów przy wyższych prędkościach przepływu niż oczekiwane w rzeczywistych eksperymentach. Ten środek ostrożności jest szczególnie ważny w przypadku urządzeń COC-OSTE, ponieważ mogą one być podatne na wycieki z powodu nieudanego łączenia, zwłaszcza przy wyższych natężeniach przepływu. Dodatkowo, ponieważ OSTE jest materiałem światłoczułym, produkcja urządzenia powinna odbywać się w żółtym świetle, aby uniknąć niepotrzebnej ekspozycji na promieniowanie UV. Ponieważ technologia ta jest wciąż w początkowej fazie, naukowcy powinni eksperymentować z różnymi prędkościami przepływu, aby określić optymalne ustawienie dla ich konkretnego zastosowania, ponieważ ustandaryzowane protokoły dla tej nowatorskiej metody nie zostały jeszcze ustalone, a lepkość cieczy może wyraźnie wpłynąć na skuteczność izolacji EV w oparciu o nasze wyniki. Postępując zgodnie z tymi wytycznymi i stawiając czoła wyzwaniom standaryzacji, potencjał tego mikroprzepływowego urządzenia do izolacji pojazdów elektrycznych może być w pełni wykorzystany w różnych obszarach badawczych i zastosowaniach.

Metoda izolacji EV za pomocą urządzenia mikroprzepływowego pozwala na daleko idące modyfikacje i rozwiązywanie problemów w celu optymalizacji wydajności. Aby poprawić separację cząstek, naukowcy mogą badać dłuższe kanały, różne porowatości i gęstości porów błony oraz zmienione wymiary. Jeśli na wylocie małych cząstek znajduje się dużo dużych cząstek, korzystne może być przetestowanie wyższej prędkości wlotowej bufora, natomiast jeśli na wylocie dużych cząstek znajduje się wiele małych cząstek, zaleca się eksperymentowanie z dłuższym kanałem lub membraną z większymi porami. Zajęcie się absorpcją cząstek może obejmować dostosowanie prędkości przepływu, modyfikacje powierzchni i składu OSTE lub zmianę czasu ekspozycji na promieniowanie UV. W przypadku urządzeń, w których występuje niestabilność i nieszczelność, zmniejszenie prędkości przepływu i zapewnienie prawidłowego klejenia są kluczowymi krokami. Aby zminimalizować uszkodzenia pojazdów elektrycznych, naukowcy mogą zmniejszyć prędkość przepływu, dokładniej umyć PBS po sterylizacji urządzenia i rozważyć użycie mniejszych porów membranowych lub alternatywnych technik i materiałów do projektowania form. Dzięki tym zmianom urządzenie mikroprzepływowe może zostać precyzyjnie dostrojone, uwalniając jego potencjał do różnorodnych zastosowań w badaniach nad pojazdami elektrycznymi i pokrewnych dziedzinach. Dodatkowo, aby zoptymalizować wydajność urządzenia, można włączyć charakterystykę próbki przed procesem, w tym pomiary gęstości i lepkości, w celu dostosowania parametrów przepływu. Ponadto należy położyć szczególny nacisk na charakter próbki, biorąc pod uwagę stwierdzoną niesterylność płynów biologicznych²³. W związku z tym należy należycie rozważyć sterylizację próbek przed ich podaniem w zastosowaniach klinicznych.

Pomimo tych wyzwań urządzenie mikroprzepływowe ma ogromny potencjał w różnych obszarach badawczych. Jego zdolność do ciągłego izolowania pojazdów elektrycznych od dużych ilości wysoce niejednorodnych próbek otwiera drzwi do automatyzacji, ułatwiając aplikacje o wysokiej przepustowości i umożliwiając bardziej dogłębną analizę pojazdów elektrycznych z różnych źródeł. Zintegrowanie tego modułu mikroprzepływowego z różnymi urządzeniami, takimi jak wkłady bioreaktorów z pustymi włóknami lub cytometry przepływowe o wysokiej rozdzielczości, może sprawić, że zastosowania pojazdów elektrycznych staną się bardziej przyjazne dla przemysłu i napędzać innowacje w dziedzinach takich jak dostarczanie leków, diagnostyka i kosmetyki⁴. Ogólnie rzecz biorąc, to urządzenie mikroprzepływowe stanowi znaczący krok naprzód w dziedzinie badań nad pojazdami elektrycznymi, oferując wydajną i ustandaryzowaną metodę izolacji pojazdów elektrycznych z obiecującymi zastosowaniami w szerokim zakresie badań i warunków przemysłowych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,1 &mikro; m karboksylan FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Stężenie magazynowe: 3,6 x 1013 kulek/ml (w zależności od LOT)
0,5 ml probówki do mikrowirówek	Starstedt	72.704
1 mL Strzykawka stożkowa Luer jednorazowego użytku bez igły	RAYS	TUB1ML
1.0 µ m polistyren FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Stężenie magazynowe: 1 x 1010 kulek/ml (w zależności od LOT)
10 ml Pipety serologiczne	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Filtry odśrodkowe Amicon Ultra	Merck Millipore	UFC910024
2,0 mL Białkowe rurki	LoBind Eppendorf	30108132
strzykawki 20 ml	BD PlastikPak
250 &mikro; m ID rurki polieteroeteroetero-ketonowe	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO odśrodkowe jednostki filtrujące	Merck Millipore,	UFC200324
5 ml strzykawka medyczna bez igły	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 ml rurki stożkowe	Sarstedt	62.547.254
70 Ti ultrawirówka o stałym kącie	Beckman Coulter
800 &mikro; m ID rurki z politetrafluoroetylenu	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
96-dołkowa mikropłytka, f-bottom, med. wiązanie	Greiner Bio-One	655001	płytka ELISA
Suplement B-27 (50x), bez surowicy	Thermo Fisher Scientific	17504044
Albumina surowicy bydlęcej	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Topas platforma	szkiełek mikroskopowychMikroprzepływowy sklep z chipami	10000002
platforma szkiełek mikroskopowych COC Topas 2 x 16 Mini Luer	Chipshop mikroprzepływowy	10000387
Regulator ciśnienia Elveflow OB1	Grupa Elvesys Złącza
Luer	Darwin Microfluidics	CS-10000095
Nakładka do masek Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
Analizator nanocząstek NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300
Mikroskop optyczny Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg darmowy. Bioodczynniki Fishera. 100 g	Membrana Fisher Scientific	BP2944-100
PC (średnica porów 50 nm, gęstość 11,8%)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgia
Szalki Petriego, sterylne	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm kolumna	Izon	SP5	SEC
kolumnaQSIL 216 Zestaw elastomerów silikonowych	PP & S
Resin Tough Black	Zortrax
SW40 Ti wirnik ultrawirówkowy	wahadłowy Beckman Coulter	331301
Pompa strzykawkowa	DK Infusetek	ISPLab002
T175 kolba zawiesinowa	Sarstedt	83.3912.502
Białko TIM4-Fc	Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Podłoże peroksydazy chrzanowej
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultrawirówka Optima L100XP	Beckman Coulter
Ultradźwiękowa jednostka czyszcząca P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Uniwersalny spektrofotometr	do mikropłytekInstrumenty Bio-Tek	71777-1
Kubek do zbierania moczu, 150 ml, sterylny	APTACA	2120_SG
Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 25	SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical		system dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
Zortrax Inkspire	Zortrax