Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F

1.9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/66019

⸱

2 lutego 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Latvian Biomedical Research and Study Centre, 2Institute of Solid-State Physics, University of Latvia, 3Cellbox labs LTD, Atari, 4Faculty of Materials Science and Applied Chemistry, Institute of General Chemical Engineering, Riga Technical university

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe są niezwykle obiecujące dla zastosowań biomedycznych, ale obecne metody izolacji są czasochłonne i niepraktyczne do użytku klinicznego. W niniejszej pracy prezentujemy urządzenie mikroprzepływowe, które umożliwia bezpośrednią izolację pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z dużych objętości płynów biologicznych w sposób ciągły przy minimalnych krokach.

Streszczenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) mają ogromny potencjał do różnych zastosowań biomedycznych, w tym diagnostyki, dostarczania leków i medycyny regeneracyjnej. Niemniej jednak obecne metodologie izolowania pojazdów elektrycznych stanowią poważne wyzwania, takie jak złożoność, czasochłonność i zapotrzebowanie na nieporęczny sprzęt, co utrudnia ich kliniczne zastosowanie. Aby rozwiązać te problemy, naszym celem było opracowanie innowacyjnego systemu mikroprzepływowego opartego na cyklicznym tiolowo-senowym tiolowo-senowym kopolimerze olefin poza stechiometrią (COC-OSTE) do wydajnej izolacji EV od próbek o dużej objętości w sposób ciągły. Wykorzystując separację opartą na wielkości i wyporności, technologia zastosowana w tym badaniu osiągnęła znacznie węższy rozkład wielkości w porównaniu z istniejącymi podejściami z próbek moczu i pożywek komórkowych, umożliwiając ukierunkowanie na określone frakcje wielkości EV w przyszłych zastosowaniach. Nasza innowacyjna konstrukcja urządzenia mikroprzepływowego COC-OSTE, wykorzystująca technologię frakcjonowania w polu przepływu bifurkowanego asymetrycznego, oferuje proste i ciągłe podejście do izolacji EV dla próbek o dużej objętości. Co więcej, potencjał masowej produkcji tego urządzenia mikroprzepływowego zapewnia skalowalność i spójność, co umożliwia integrację izolacji EV z rutynową diagnostyką kliniczną i procesami przemysłowymi, w których niezbędna jest wysoka spójność i przepustowość.

Wprowadzenie

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to cząstki błonowe pochodzenia komórkowego, składające się z dwóch głównych typów: egzosomy (30-200 nm) i mikropęcherzyki (200-1000 nm)1. Egzosomy powstają poprzez wewnętrzne pączkowanie błony endosomalnej w ciele wielopęcherzykowym (MVB), uwalniając pęcherzyki śródświetlne (ILV) do przestrzeni zewnątrzkomórkowej po fuzji z błoną plazmatyczną1. W przeciwieństwie do tego, mikropęcherzyki są generowane przez pączkowanie na zewnątrz i rozszczepienie błony komórkowej2. EV odgrywają kluczową rolę w komunikacji międzykomórkowej poprzez transport białek, kwasów nukleinowych, lipidów i metabolitów, odzwierciedlając stan fizjologiczny komórki, w tym wzrost, angiogenezę, przerzuty, proliferację i oporność na terapię3. W rezultacie okazały się obiecującymi biomarkerami i celami terapeutycznymi dla chorób, w tym raka, podkreślając ich potencjał w diagnostyce i systemach dostarczania leków4.

Aby w pełni wykorzystać EVs w diagnostyce chorób i terapii, niezbędna jest skuteczna izolacja od różnych płynów biologicznych5. Typowe metody obejmują ultrawirowanie (UC), wirowanie w gradionym gradiorze, chromatografię wykluczania wielkości (SEC), filtrację i immunoizolację6. UC jest szeroko stosowaną techniką, ale może dawać cząstki o podobnej gęstości, które nie są EV i mogą generować agregaty EVs7. SEC zyskał popularność ze względu na swoją zdolność do dostarczania próbek o wyższej czystości poprzez wykluczanie cząstek na podstawie rozmiaru, a nie gęstości8. Jednak staranny dobór odpowiedniej wielkości porów dla kolumny SEC i optymalizacja warunków chromatograficznych są niezbędne, aby zminimalizować koizolację niepożądanych cząstek, takich jak chylomikrony i lipoproteiny o niskiej gęstości8. Pomimo swojej skuteczności, obie metody są czasochłonne i trudne do zautomatyzowania, szczególnie w przypadku próbek o większej objętości, takich jak pożywki komórkowe lub mocz, co ogranicza ich skalowalność do zastosowań przemysłowych9.

W ostatnich latach, frakcjonowanie pola asymetrycznego przepływu pola (A4F) rozwinęło się jako potężna technika separacji mikro- i nanometrowych cząstek na podstawie wielkości i wyporu10. Zasada działania A4F opiera się na kanale mikroprzepływowym wyposażonym w porowatą membranę u podstawy, generującą siłę wywieraną w kierunku membrany zwaną przepływem krzyżowym10. W połączeniu z ruchem Browna i przepływem Poiseuille'a nieodłącznie związanymi z systemem, przepływ krzyżowy ułatwia efektywną separację cząstek dzięki zmiennemu położeniu cząstek w dynamice przepływu11. Pomimo korzyści, metoda ta jest ograniczona do objętości próbek w zakresie mikrolitrów12 i wymaga dodatkowego kroku ogniskowania, wydłużając czas trwania procesu10.

W ciągu ostatniej dekady, mikrofluidyka zyskała na znaczeniu jako narzędzie do szybkiej, efektywnej i klinicznie niezawodnej separacji EV13. Jednak większość metod mikroprzepływowych przeznaczonych do separacji EV jest zoptymalizowana dla próbek EV o małej objętości i wysokim stężeniu lub zależy od złożonych procedur separacji14. Ponadto, w dziedzinie mikrofluidyki, polidimetylosiloksan (PDMS) jest uznawany za złoty standard ze względu na swoją przezroczystość optyczną, biokompatybilność i łatwość użycia15. Niemniej jednak, jego znana skłonność do wchłaniania małych cząsteczek lipofilowych, w tym EV, może być problematyczna dla jego zastosowania w polu EV13.

Cykliczny kopolimer olefin (COC) jest często używanym materiałem w mikrofluidyce ze względu na biokompatybilność, małą absorpcję cząsteczek i wysoką odporność chemiczną15. Jednak produkcja urządzeń COC często wiąże się ze złożonymi procesami lub specjalistycznym sprzętem16. Alternatywnie, pozastechiometryczny tiol-en (OSTE) jest obiecującą alternatywą dla PDMS ze względu na zmniejszoną absorpcję małych cząsteczek, doskonałą stabilność chemiczną, łatwość wytwarzania i skalowalny proces wytwarzania17,18. Jednak ze względu na skomplikowane połączenia z rurkami, urządzenia mogą być podatne na przeciekanie19.

Celem tego badania było zaprojektowanie i wyprodukowanie urządzenia mikroprzepływowego łączącego OSTE i COC oraz rozwidloną zasadę A4F do separacji EV od próbek o dużej objętości, takich jak mocz lub media komórkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Pobieranie próbek zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Naukowych Łotewskiego Uniwersytetu Naturalnego i Medycznego (decyzja N0-71-35/54)

UWAGA: Materiały użyte w tym badaniu są zawarte w pliku Tabela materiałów.

1. Produkcja drukowanych form w trójwymiarowym (3D)

  1. Zaprojektuj podwójną formę ujemną w kształcie serpentyny w oprogramowaniu CAD o następujących wymiarach kanału górnego: wysokość 0,5 mm, szerokość 1 mm i długość 210 mm. W przypadku dolnego kanału użyj tej samej konstrukcji o szerokości 1,5 mm, wysokości 0,6 mm i długości 210 mm. Wymiary, takie jak szerokość, długość, wysokość i izometryczna ilustracja wzoru, są pokazane w Rysunek 1. Zapisz projekt jako plik .stl.
  2. Przygotuj plik w pakiecie Z-Suite; nie musisz dodawać żadnej obsługi. Wydrukuj formy za pomocą ultrafioletowej drukarki 3D z wyświetlaczem ciekłokrystalicznym (UV LCD) z wytrzymałą czarną żywicą.
  3. Po wydrukowaniu ostrożnie usuń formy z powierzchni drukarki. Umyj formy w izopropanolu (IPA) w sonikacji przez 20 minut.
  4. Wysuszyć foremki suszarką z N2.
  5. Wystawić formy na działanie zalania za pomocą filtra ND33 przez 810 s, a następnie wstawić je do piekarnika w temperaturze 60 °C na 48 godzin.

2. Przygotowanie form PDMS

  1. Waga PDMS w stosunku 10:1 w/w (do każdej formy należy użyć 16 g bazy elastomerowej i 1,6 g środka sieciującego). Wymieszaj składniki w planetarnym mieszalniku odśrodkowym, mieszając przez 1 minutę przy 500 obr./min.
  2. Wlej zmieszany PDMS do form wydrukowanych w 3D i odgazuj w eksykatorze próżniowym przy -800 mbar przez 30 minut lub do momentu, gdy nie zaobserwuje się pęcherzyków.
  3. Ostrożnie umieść wkładkę z polichlorku winylu o grubości 100 μm na wierzchu płynnego PDMS.
    UWAGA: Nakładaj wkładkę powoli z jednej strony na drugą, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków.
  4. Włóż formę z PDMS do przyrządu Mold-in-Place i dokręć przyrząd za pomocą klucza dynamometrycznego ustawionego na 0.3 Nm.
  5. Umieść przyrząd w piekarniku o temperaturze 60 °C na 3 godziny, aby utwardził PDMS.
  6. Zdemontuj przyrząd za pomocą klucza imbusowego i wyjmij wydrukowaną w 3D formę z przyrządu.
  7. Ostrożnie wyjmij formy PDMS z wydrukowanych w 3D form wzorcowych, przesuwając się po krawędziach formy za pomocą skalpela, a następnie usuwając formę za pomocą pęsety.
    UWAGA: W celu łatwiejszego usuwania pleśni można użyć IPA; jednak formy należy podgrzewać w temperaturze 60 °C przez 10 minut, aby odparować nadmiar IPA.

3. Przygotowanie górnego kanału OSTE-COC

  1. Waga OSTE w stosunku 1,09:1 w/w (dla 5 urządzeń potrzebne jest 1,56 g części A i 1,44 g części B). Wymieszaj składniki w planetarnym mieszalniku odśrodkowym: mieszaj przez 5 minut przy 750 obr./min, a następnie odgazowuj przez 5 min przy 750 obr./min.
  2. Przenieść zmieszany OSTE do probówki wirówkowej i odgazować przy -800 mbar w eksykatorze próżniowym przez 30 minut.
  3. Wyczyść szkiełka COC za pomocą złączy 2 x 16 mini Luer metodą sonikacji w IPA przez 10 minut. Ostrożnie osusz szkiełka za pomocą N2.
  4. Umieść czyste szkiełka COC w asherze plazmowym tak, aby płaska powierzchnia była skierowana do góry, a następnie traktuj powierzchnię plazmą tlenową 800 SCCM przez 2 minuty przy mocy 700 W i ciśnieniu 0.133 mbar.
  5. Umieść utleniony szkiełko COC na formie PDMS dla górnego kanału tak, aby obrabiana powierzchnia stykała się ze strukturalną powierzchnią PDMS. Umieść zespół w przyrządzie Mold-in-Place, dokręcając przyrząd kluczem dynamometrycznym ustawionym na 0.3 Nm.
  6. Podłączyć układ ciśnieniowy do przewodu sprężonego powietrza pod ciśnieniem 6 barów. Weź probówkę wirówkową z odgazowanym OSTE i zmontuj ją zgodnie z instrukcjami systemu ciśnieniowego za pomocą rurki z politetrafluoroetylenu (PTFE) o średnicy wewnętrznej 0,8 mm (ID).
  7. Podłączyć rurkę PTFE do wlotu formy PDMS i za pomocą ciśnienia 1000 mbar utrzymywanego przez pompę piezoelektryczną umieszczoną w układzie ciśnieniowym napełnić urządzenie. Umieść przyrząd szklaną stroną do góry w nakładce maski i naświetl dawką 850 mJ przy użyciu filtra ND33.
  8. Po naświetleniu zdemontuj przyrząd za pomocą klucza imbusowego i ostrożnie wyjmij suwak COC ze strukturalną warstwą OSTE z formy PDMS.
  9. Doprowadzić strukturalny OSTE do kontaktu z membraną o wymiarach 25 mm x 75 mm z porami 50 nm i gęstością porów 11,8%, tak aby kanały były całkowicie pokryte membraną.
    UWAGA: Szczególnie ważne jest, aby membrana była jak najbardziej prosta podczas procesu aplikacji.
  10. Umieść zespół na płycie grzejnej ustawionej na 60°C stroną z membraną do góry, umieść czyste szkiełko na membranie i zastosuj ciśnienie 1.6 kPa od góry, aby zapewnić równomierne połączenie. Podgrzej zestaw przez noc.
    UWAGA: Po tym kroku szczególnie ważna jest ocena wydajności wiązania i deformacji kanału.

4. Przygotowanie dolnego kanału OSTE-COC i montażu urządzenia

  1. Wymieszaj OSTE w proporcji 1,09:1 w/w (na 5 urządzeń potrzebne jest 1,56 g części A i 1,44 g części B). Wymieszaj składniki w planetarnym mikserze odśrodkowym: mieszaj przez 5 minut przy 750 obr./min, a następnie odgazowuj przez 5 minut przy 750 obr./min.
  2. Przenieść zmieszany OSTE do probówki Falcon i odgazować przy -800 mbar w eksykatorze próżniowym przez 30 minut.
  3. Wyczyść szkiełka COC za pomocą sonikacji w IPA przez 10 minut. Ostrożnie osuszyć szkiełka za pomocą N2.
  4. Umieść czyste szkiełka COC w asherze plazmowym i traktuj powierzchnię plazmą tlenową 800 SCCM przez 2 minuty przy mocy 700 W i ciśnieniu 0.133 mbar.
  5. Umieść utleniony szkiełko COC na formie PDMS dla dolnego kanału tak, aby obrabiana powierzchnia stykała się ze strukturalną powierzchnią PDMS. Umieść zespół w przyrządzie Mold-in-Place, dokręcając przyrząd kluczem dynamometrycznym ustawionym na 0.3 Nm.
  6. Weź rurkę falcon z odgazowanym OSTE i zmontuj ją zgodnie z instrukcją systemu ciśnieniowego za pomocą rurki PTFE o średnicy wewnętrznej 0,8 mm.
  7. Podłącz rurkę PTFE do wlotu formy PDMS i pod ciśnieniem 1000 mbar napełnij urządzenie. Umieść przyrząd szklaną stroną do góry w wyrównywaczu maski i naświetlaj dawką 1100 mJ za pomocą filtra ND33.
  8. Po naświetleniu zdemontuj przyrząd za pomocą klucza imbusowego i ostrożnie wyjmij suwak COC ze strukturalną warstwą OSTE z formy PDMS.
  9. Połącz strukturalną warstwę OSTE z zespołem górnego kanału, tak aby konstrukcja górnej i dolnej warstwy była wyrównana ze sobą i aby dolna warstwa OSTE stykała się z membraną.
  10. Włóż wzór do przyrządu Mold-in-Place i za pomocą klipsów buldoga równomiernie dociśnij urządzenie 1.6 kPa. Wstaw przyrząd na noc do piekarnika o temperaturze 60°C.
    UWAGA: Nierówne rozmieszczenie klipsów może prowadzić do nierównomiernego łączenia.

5. Ocena urządzenia

  1. Po klejeniu należy wizualnie ocenić urządzenia pod mikroskopem pod kątem wad wizualnych, na przykład deformacji kanału lub nieudanego klejenia.
  2. Przetestuj urządzenia bez wad, przepuszczając przefiltrowaną wodę dejonizowaną 0,02 μm przez kanały pod ciśnieniem 30 mbar. Zwróć uwagę na nieszczelności kanału przepływowego i portu Luer oraz przepływ wody.
    UWAGA: Jeśli nie można wykryć wycieku, a przepływ kanałów jest nieprzerwany, urządzenia uważa się za nadające się do dalszych eksperymentów.

6. Konfiguracja urządzenia

  1. Napełnij dwie strzykawki o pojemności 5 ml 2 ml 20 nm przefiltrowanego 3% H2O2 i umieść je na pompie strzykawkowej (użyj strzałek ruchu na żądaną odległość, włóż strzykawki i zamocuj je na miejscu za pomocą górnego pręta).
    OSTROŻNOŚĆ! Zawsze należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z H2O2. Nosić fartuch laboratoryjny, gumowe rękawice ochronne i okulary ochronne.
  2. Podłącz rurkę PTFE o długości 14 cm o średnicy wewnętrznej 800 μm do strzykawek za pomocą igieł strzykawkowych oraz do wlotów urządzenia za pomocą złączy Luer.
  3. Podłącz rurki polieteroeteroketonowe (PEEK) o długości 20 cm i średnicy wewnętrznej 200 μm do wylotów.
  4. Podłącz drugi koniec rurki PEEK do pojemnika na odpady. Konfigurację można zobaczyć w Rysunek 3.
  5. Uruchomić pompę strzykawkową z prędkością przepływu 500 μl/min dla każdego wlotu (na ekranie przyrządu: Ustawienia > System Ustaw > Strzykawka (producent: strzykawka medyczna, strzykawka: 5 ml) > przycisk Wstecz > Parametry (Wybierz: zaparzanie, Powtórzenie: 1, Objętość: 1,5 ml, Przepływ: 500 μl/min) > Przycisk Wstecz > Wstecz przycisk). Zebrać przepływ do pojemnika na odpady.
  6. Napełnij dwie nowe strzykawki o pojemności 5 ml 2 ml przefiltrowanego 70% etanolu o długości fali 20 nm.
  7. Zastąp poprzednie strzykawki strzykawkami wypełnionymi etanolem i uruchom pompę strzykawkową, korzystając z tych samych parametrów, które opisano w kroku 6.5.
  8. Użyj nowych strzykawek o pojemności 5 ml i napełnij je 5 ml przefiltrowanego roztworu soli fizjologicznej (PBS) o długości 20 nm.
  9. Zastąp poprzednie strzykawki strzykawkami wypełnionymi PBS i przepłucz urządzenie 4 ml PBS, powtarzając kroki 6.1. i 6.5.
    UWAGA: Upewnij się, że zmieniłeś parametry konfiguracji systemu na Objętość: 4 ml (na ekranie instrumentu: Ustawienia > Parametry > (Wybierz: Objętość: 4 ml).
  10. Odłącz rurkę od urządzenia i zamknij każdy wlot i wylot za pomocą zatyczek Luer.
    UWAGA: Pozostaw PBS w urządzeniu i unikaj zatrzymywania powietrza, dodając dodatkowe PBS na każdym wlocie i wylocie za pomocą mikropipety przed zamknięciem.
  11. Pozostaw urządzenie na noc w ciemnym miejscu w temperaturze pokojowej (RT).
  12. Następnego dnia przepłukać urządzenie wypełnione PBS 4 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm (jak opisano w kroku 6.8).
  13. Zebrać ostatni 1 ml przepływu z obu wylotów do probówki o niskiej ilości białka o pojemności 2 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C jako ślepą próbę dla cząstek wprowadzanych przez urządzenie.
  14. Wyjąć strzykawki wypełnione PBS i zastąpić je nowymi strzykawkami o pojemności 5 ml wypełnionymi powietrzem.
  15. Oczyść urządzenie 4 ml powietrza, aż cały płyn opuści urządzenie i rurkę.

7. Testowanie urządzeń za pomocą standardowych koralików lateksowych

  1. Przygotuj znormalizowaną próbkę kulek przy użyciu polistyrenu 1,0 μm i kulek karboksylowych 0,1 μm. Do probówki o pojemności 15 ml dodaj 500 μl wzorców kulek polistyrenowych 1,0 μm, 1 μl wzorców kulek karboksylowych 0,1 μm i 9499 μl przefiltrowanego PBS o długości 20 nm (końcowe stężenie mieszanki kulek 1,0 i 0,1 μm wyniesie odpowiednio 5 × 108 kulek/ml i 3,6 × 1010 kulek/ml).
  2. Wirować próbkę kulki przez 30 s i przechowywać ją w temperaturze +4 °C, gdy nie jest używana.
  3. Napełnij jedną nową strzykawkę o pojemności 5 ml 1,5 ml znormalizowanej mieszaniny kulek, a drugą 1,5 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
  4. Wyjąć poprzednio podłączone strzykawki i przymocować strzykawkę z mieszanką kulek do pierwszej rurki wlotowej, a drugą do drugiego wlotu.
  5. Wyjmij pojemnik na odpady i przygotuj co najmniej pięć probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml na każdy przewód wylotowy.
  6. Zmień parametry rozruchu systemu pompy strzykawkowej na Objętość: 1 ml; Przepływ: 250 μl/min.
    UWAGA: W zależności od potrzeb użytkownika można ustawić różne prędkości przepływu, takie jak 250 μL/min, 200 μL/min, 150 μL/min, 100 μL/min i 50 μL/min. Zaleca się przeprowadzenie wstępnego badania w celu wybrania najkorzystniejszej prędkości dla pożądanego wyniku.
  7. Uruchomić pompę strzykawkową i zebrać odpływ - 5 do 6 kropel w każdej probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: Jeśli to samo urządzenie jest używane wiele razy, przepłucz je zgodnie z opisem w kroku 6.8 i wymień wszystkie złącza, wtyczki i igły. Umyj zużyte złącza, zatyczki i igły, pozostawiając je w 20 nm przefiltrowanym 70% etanolu na co najmniej 30 minut. Następnie przenieś wszystkie części do probówki zawierającej przefiltrowaną wodę dejonizowaną o długości 20 nm, dokładnie wstrząśnij probówką i przenieś je na szalkę Petriego zawierającą 20 ml przefiltrowanej wody dejonizowanej o długości 20 nm. Pozostaw szalkę Petriego na wytrząsarce na co najmniej 30 minut przy 100 obr./min, a następnie pozostaw rzeczy do wyschnięcia na suchej szalce Petriego (na co najmniej 12 godzin) przed ponownym użyciem.

8. Testowanie urządzenia z próbkami moczu

  1. Przygotuj urządzenie zgodnie z opisem w krokach 6.1-6.15.
  2. Zbierz 100 ml porannego moczu na dawcę za pomocą sterylnych pojemników na mocz i dostarcz go do laboratorium w celu przetworzenia w ciągu 2 godzin od pobrania.
  3. Każdą próbkę moczu rozdzielić do dwóch probówek o pojemności 50 ml i odwirować przy 2'000 x g przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  4. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
  5. Odwirować supernatant o sile 10 000 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się dużych cząstek i resztek komórek.
  6. Zebrać sklarowany osad i wyrzucić osad.
  7. Umyj urządzenie zgodnie z opisem w 6.6.
  8. Zamień strzykawki o pojemności 5 ml na strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną przygotowaną próbką moczu dla wlotu próbki i kolejną strzykawkę o pojemności 20 ml wypełnioną 20 ml przefiltrowanego DEPC-PBS o długości fali 20 ml dla wlotu buforu. Zmień ustawienia pompy strzykawkowej na BDPlastipak; Strzykawka: cc; Objętość: 20 mL; Przepływ: 250 μl/min (optymalne natężenie przepływu), podobnie jak opisano w kroku 6.2. Uruchomić pompę strzykawkową i zebrać przepływ z każdego wylotu w oddzielnych probówkach o pojemności 50 ml.
  9. Zagęścić każdy przepływ oddzielnie za pomocą 100 000 probówek o masie cząsteczkowej do 100 μl każda przy 3 000 x g w 4 °C.
  10. Przenieść koncentraty do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
  11. Wirować zagęszczone próbki przez 30 sekund, a następnie wirować przez 10 sekund.
  12. Porcjować próbki, przenosząc 25 μl próbki na probówkę, oznaczyć je i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

9. Testowanie urządzeń z kondycjonowanymi mediami

  1. Przygotuj urządzenie zgodnie z opisem w krokach 6.1-6.15.
  2. Hodowla komórek w 5% nawilżonym środowisku CO2 w temperaturze 37 °C, aż całkowita liczba osiągnie 100 milionów według Bajo-Santos et al.20 Przenieś komórki do pojedynczej kolby zawiesinowej T175 w 100 ml pożywki wolnej od surowicy uzupełnionej 2% substytutem surowicy i hoduj w 5% nawilżonym środowisku CO2 w temperaturze 37 °C przez dodatkowe 48 godzin.
  3. Zebrać zawiesinę komórkową i odwirować ją przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby pozbyć się komórek.
  4. Zebrać i ponownie odwirować supernatant w temperaturze 3 000 x g przez 30 minut w temperaturze +4 °C, aby pozbyć się dużych cząstek i resztek komórek.
  5. Zebrać supernatant i przechowywać go w temperaturze +4°C do czasu rozdzielenia, ale nie dłużej niż 3 godziny.
  6. Zamień strzykawki o pojemności 5 ml na strzykawki o pojemności 20 ml wypełnione przygotowanym kondycjonowanym podłożem dla wlotu próbki i wypełnione 20 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm dla wlotu buforu.
  7. Ustaw ustawienia w stacji pomp zgodnie z opisem w kroku 7.8.
  8. Uruchomić pompę strzykawkową i zebrać przepływ z każdego wylotu do oddzielnej probówki o pojemności 50 ml.
  9. Zagęścić każdy przepływ oddzielnie za pomocą probówek o masie odcięcia masy cząsteczkowej 100 000 do 150 μl każda przy 3 000 x g w temperaturze +4 °C.
  10. Przenieść koncentraty do probówek mikrowirówek o pojemności 0,5 ml.
  11. Wirowanie zagęszczone próbki przez 30 s.
  12. Wirować skoncentrowane próbki przez 10 sekund.
  13. Porcjować próbki, przenosząc 25 μl próbki na probówkę, oznaczyć je i zamrozić w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

10. Izolacja EV za pomocą ultrawirowania

  1. Odwirować 20 ml moczu lub kondycjonowanego podłoża komórkowego przy 100 000 x g przez 70 minut w temperaturze +4 °C za pomocą wirówki z wirnikiem o stałym kącie
    2. nachylenia.
  2. Odrzucić sklarowany sklarat i ponownie zawiesić osad w 20 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
  3. Ponownie odwirować, jak wyjaśniono w 10.1.
  4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 12 ml przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
  5. Wirować przy 100 000 x g przez 70 minut w temperaturze +4 °C za pomocą wirnika obrotowego.
  6. Odrzucić supernatant.
    UWAGA: Tym razem należy zachować ostrożność podczas wyrzucania supernatantu. Zaleca się robienie tego za pomocą pipety.
  7. Zawiesić osad w 100 μl przefiltrowanego PBS o długości 20 nm.
  8. Podwielokrotnić próbkę i przejść do ustawienia 12 w celu charakterystyki EV. W przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

11. Izolacja EV za pomocą chromatografii wykluczania wielkości (SEC)

  1. Zagęścić 20 ml moczu lub kondycjonowanego podłoża komórkowego do 500 μl za pomocą filtrów odśrodkowych o masie cząsteczkowej 100 kDa (MWCO) przy 3 000 x g w temperaturze +4 °C przez 15 minut.
  2. Przenieść koncentrat na kolumnę SEC (zakres obciążenia 35 nm).
  3. Wlać przefiltrowany PBS o długości 20 nm do kolumny i zebrać 15 frakcji po 0,5 ml.
  4. Analizuj frakcje za pomocą systemu dynamicznego rozpraszania światła (DLS) zgodnie z instrukcjami producenta.
  5. Zbierz wybrane frakcje. Wybieraj frakcje o tłumieniu niższym niż 11 i co najmniej 30% wszystkich cząstek większych niż 40 nm.
  6. Zagęścić wybrane frakcje do 100 μl za pomocą odśrodkowych jednostek filtrujących 3 kDa z odcięciem masy cząsteczkowej (MWCO) przy 14 000 x g w temperaturze +4 °C przez 15 min.
  7. Podwielokrotnić próbkę i przejść do sekcji 12 w celu scharakteryzowania EV. W przeciwnym razie przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.

12. Charakterystyka EV

  1. Próbkę, która ma zostać scharakteryzowana, pobrać z zamrażarki i powoli ją rozmrażać (na bloku lodu lub w temperaturze +4 °C).
  2. Wykonaj analizę śledzenia nanocząstek (NTA), aby określić rozkład wielkości i ilość cząstek13. Wykonaj test immunoenzymatyczny sprzężony z białkiem błony komórkowej komórek T o wysokim powinowactwie (TIM-4) z podwójnym testem immunoenzymatycznym (dsELISA)14, aby potwierdzić obecność EV w próbkach.

13. NTA

  1. Rozmrożoną próbkę EV należy wirować przez 30 s i wirować przez 10 s, a następnie przenieść 1 μl do 999 μl przefiltrowanego PBS o długości 20 nm w probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml w celu rozcieńczenia 1000-krotnie. Zaoszczędź 1 ml dodatkowego PBS użytego do rozcieńczenia, aby sprawdzić, czy nie zawiera żadnych cząstek. Przechowywać wszystko w temperaturze +4 °C do momentu pomiaru.
    UWAGA: Przed użyciem przefiltruj PBS przez filtr 0,02 nm.
  2. Wirować próbkę EV lub ślepą próbę przez 30 s i włożyć ją do modułu za pomocą strzykawki. Napełnij moduł około 0,7 ml próbki i umieść ją w urządzeniu.
  3. Zmierz próbkę za pomocą analizatora nanocząstek, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

14. dsELISA dla znaczników EV

  1. Przygotować roztwór 1 μg/ml białka TIM4-Fc. Pokryć studzienki 96-dołkowej płytki ELISA, przenosząc 100 μl roztworu do każdej niezbędnej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze +4 °C, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
  2. Następnego dnia przygotuj roztwór myjący (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl2).
  3. Wylej cały płyn z każdej studzienki. Umyj każdą studzienkę, dodając 200 μl roztworu myjącego, wstrząsając z prędkością 200 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odrzucając. Powtórz ten krok dwukrotnie.
  4. Przygotować roztwór blokujący (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% albuminy surowicy bydlęcej. Dodać 200 μl roztworu blokującego do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
  5. Umyj każdą studzienkę zgodnie z opisem w kroku 14.3.
  6. Przygotować 220 μl każdej próbki rozcieńczonej w buforze płuczącym (optymalne stężenie EV wynosi 2,7 × 105 EVs/μL). Dodać 100 μl rozcieńczonej próbki do dołka i przeprowadzić dwie kontrpróby. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 90 minut, wytrząsając z prędkością 200 obr./min.
  7. Umyj każdą studzienkę zgodnie z opisem w kroku 14.3.
  8. Dodać 100 μl odpowiednich przeciwciał do każdej studzienki. Użyj odpowiednich znaczników EV do potwierdzania EV i zanieczyszczeń4. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, wytrząsając z prędkością 200 obr./min. UWAGA: Jeśli stosowane są przeciwciała drugorzędowe, powtórz kroki 14.7-14.8. Należy jednak skrócić okres inkubacji przeciwciał drugorzędowych do 1 godziny.
  9. Umyj każdą studzienkę zgodnie z opisem w kroku 14.3.
  10. Dodać 100 μl substratu peroksydazy chrzanowej do każdej studzienki, mieszać płytkę przez 1 minutę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
  11. Dodać 1 M H2SO4 do każdego dołka, aby zatrzymać reakcję.
  12. Za pomocą czytnika mikropłytek zmierzyć absorbancję przy 450 nm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Wytworzyliśmy urządzenie mikroprzepływowe, wykorzystując wydrukowaną w technologii 3D podwójną formę negatywową (Rysunek 1) za pomocą miękkiej litografii (Rysunek 2A), w celu wysokoprzepływowej separacji EV w oparciu o zasadę rozwidlonego A4F (Rysunek 2B,C). Układ wymaga pompy oraz stacji przepływowej, co przedstawiono na Rysunku 3, w celu zautomatyzowanej izolacji EV. W pierwszej kolej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zaprezentowane urządzenie mikroprzepływowe stanowi obiecującą metodę izolacji i ekstrakcji pojazdów elektrycznych z płynów biologicznych, rozwiązując niektóre z krytycznych ograniczeń istniejących metod opartych na złotych standardach, takich jak UC i SEC12. UC i SEC są znane z tego, że są pracochłonne, czasochłonne i charakteryzują się niską wydajnością, co czyni je mniej odpowiednimi do zastosowań o wysokiej przepustowości, w których potrzebne są duże ilości pojazdów elektrycznych

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

A.A., G.M. i R.R. są założycielami, członkami zarządu i udziałowcami Cellbox Labs, LLC

Podziękowania

Dziękujemy wszystkim darczyńcom, którzy wzięli udział w tym badaniu, pracownikom Łotewskiej Bazy Danych Genomu za dostarczenie próbek. Instytut Fizyki Ciała Stałego Uniwersytetu Łotewskiego jako Centrum Doskonałości otrzymał dofinansowanie z Programu Ramowego Unii Europejskiej Horyzont 2020 H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017-TeamongPhase2 na podstawie umowy o grant nr 739508, projekt CAMART2. Prace te były wspierane przez Łotewską Radę Nauki w ramach projektu nr 1. lzp-2019/1-0142 oraz nr projektu: lzp-2022/1-0373.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,1 &mikro; m karboksylan FluoSpheresInvitrogen#F8803Stężenie magazynowe: 3,6 x 1013 kulek/ml (w zależności od LOT)
0,5 ml probówki do mikrowirówekStarstedt72.704
1 mL Strzykawka stożkowa Luer jednorazowego użytku bez igłyRAYSTUB1ML
1.0 µ m polistyren FluoSpheresInvitrogen#F13083Stężenie magazynowe: 1 x 1010 kulek/ml (w zależności od LOT)
10 ml Pipety serologiczneSarstedt86.1254.001
15 mL (100k) Filtry odśrodkowe Amicon UltraMerck MilliporeUFC910024
2,0 mL Białkowe rurkiLoBind Eppendorf30108132
strzykawki 20 mlBD PlastikPak
250 &mikro; m ID rurki polieteroeteroetero-ketonoweDarwin MicrofluidicsCIL-1581
3 kDa MWCO odśrodkowe jednostki filtrująceMerck Millipore,UFC200324
5 ml strzykawka medyczna bez igłyAnhui Hongyu Wuzhou Medical159646
50 ml rurki stożkoweSarstedt62.547.254
70 Ti ultrawirówka o stałym kącieBeckman Coulter
800 &mikro; m ID rurki z politetrafluoroetylenuDarwin MicrofluidicsLVF-KTU-15
96-dołkowa mikropłytka, f-bottom, med. wiązanieGreiner Bio-One655001płytka ELISA
Suplement B-27 (50x), bez surowicyThermo Fisher Scientific17504044
Albumina surowicy bydlęcejSigmaAldrichA7906-100G
COC Topas platformaszkiełek mikroskopowychMikroprzepływowy sklep z chipami10000002
platforma szkiełek mikroskopowych COC Topas 2 x 16 Mini Luer Chipshop mikroprzepływowy10000387
Regulator ciśnienia Elveflow OB1Grupa Elvesys Złącza
LuerDarwin Microfluidics  CS-10000095
Nakładka do masek Suss MA/BA6SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250Thinky Corporation
Analizator nanocząstek NanoSight NS300Malvern PanalyticalNS300 
Mikroskop optyczny Nikon Eclipse LV150NNikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal ClearMercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg darmowy. Bioodczynniki Fishera. 100 gMembrana Fisher ScientificBP2944-100
PC (średnica porów 50 nm, gęstość 11,8%)it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgia
Szalki Petriego, sterylneSarstedt82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 MPVA TePla America, LLC
qEVoriginal/35 nm kolumnaIzonSP5SEC
kolumnaQSIL 216 Zestaw elastomerów silikonowychPP & S
Resin Tough BlackZortrax
SW40 Ti wirnik ultrawirówkowywahadłowy Beckman Coulter331301
Pompa strzykawkowaDK InfusetekISPLab002
T175 kolba zawiesinowaSarstedt83.3912.502
Białko TIM4-FcAdipogen LifeSciencesAG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna)SigmaAldrichT0440-100MLPodłoże peroksydazy chrzanowej
Tween20SigmaAldrichP1379-100ML
Ultrawirówka Optima L100XPBeckman Coulter
Ultradźwiękowa jednostka czyszcząca P 60 HElma Schmidbauer GmbH
Uniwersalny spektrofotometrdo mikropłytekInstrumenty Bio-Tek71777-1
Kubek do zbierania moczu, 150 ml, sterylnyAPTACA2120_SG
Filtr strzykawkowy Whatman Anotop 25SigmaAldrich68092002
Zetasizer Nano ZSMalvern Panalyticalsystem dynamicznego rozpraszania światła (DLS) 
Zortrax InkspireZortrax
10569215 nachylenia 337922

Bibliografia

  1. Colombo, M., et al. Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles. Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).
  2. Tricarico, C., et al. Biology and biogenesis of shed microvesicles. Small GTPases. 8 (4), 220-232 (2017).
  3. Yáñez-Mó, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4 (1), 27066(2015).
  4. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  5. Wang, Z. Extracellular vesicles as an emerging drug delivery system for cancer treatment: Current strategies and recent advances. Biomed Pharmacother. 153, 113480(2022).
  6. Royo, F., et al. Methods for separation and characterization of extracellular vesicles: Results of a Worldwide Survey Performed by the ISEV Rigor and Standardization Subcommittee. Cells. 9 (9), 1955(2020).
  7. Sidhom, K., et al. A review of exosomal isolation methods: Is size exclusion chromatography the best option. Int J Mol Sci. 21 (18), 6466(2020).
  8. Reshi, Q. U. A., et al. Isolation of extracellular vesicles (EVs) using benchtop size exclusion chromatography (SEC) columns. Methods Mol Biol. 2273, 201-206 (2021).
  9. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. J Chromatogr A. 1636, 461773(2021).
  10. Priedols, M., et al. Bifurcated asymmetric field flow fractionation of nanoparticles in PDMS-free microfluidic devices for applications in label-free extracellular vesicle separation. Polymers. 15 (4), 789(2023).
  11. Zhang, H., Lyden, D. Asymmetric-flow field-flow fractionation technology for exomere and small extracellular vesicle separation and characterization. Nat Protoc. 14 (4), 1027-1053 (2019).
  12. Talebjedi, B., et al. Exploiting microfluidics for extracellular vesicle isolation and characterization: Potential use for standardized embryo quality assessment. Front Vet Sci. 7, 620809(2020).
  13. van Meer, B. J., et al. Small molecule absorption by PDMS in the context of drug response bioassays. Biochem Biophys Res Commun. 482 (2), 323-328 (2017).
  14. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  15. Bussooa, A., et al. Real-time monitoring of oxygen levels within thermoplastic Organ-on-Chip devices. Biosensors and Bioelectronics: X. 11, 100198(2022).
  16. Tang, L., Lee, N. Y. A facile route for irreversible bonding of plastic-PDMS hybrid microdevices at room temperature. Lab Chip. 10 (10), 1274-1280 (2010).
  17. Borda, E., et al. Conformable neural interface based on off-stoichiometry thiol-ene-epoxy thermosets. Biomaterials. 293, 121979(2023).
  18. Sandström, N., et al. Reaction injection molding and direct covalent bonding of OSTE+ polymer microfluidic devices. Journal of Micromechanics and Microengineering. 25 (7), 075002(2015).
  19. Sticker, D., et al. Thiol-ene based polymers as versatile materials for microfluidic devices for life sciences applications. ACS Appl Mater Interfaces. 12 (9), 10080-10095 (2020).
  20. Bajo-Santos, C., et al. Extracellular vesicles isolation from large volume samples using a polydimethylsiloxane-free microfluidic device. Int J Mol Sci. 24 (9), 7971(2023).
  21. Claridge, B., et al. Development of extracellular vesicle therapeutics: Challenges, considerations, and opportunities. Front Cell Dev Biol. 9, 734720(2021).
  22. Rezaie, J., et al. Review on exosomes application in clinical trials: Perspective, questions, and challenges. Cell Commun Signal. 20 (1), 145(2022).
  23. Aragón, I. M., et al. The urinary tract microbiome in health and disease. Eur Urol Focus. 4 (1), 128-138 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Izolacja EVasymetryczne frakcjonowanie przepływoweseparacja oparta na wielkościprzetwarzanie płynów biologicznychprzygotowanie próbek moczuodzysk cząstekultrawirowanie
Jednoetapowa izolacja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek o dużej objętości za pomocą rozwidlonego urządzenia mikroprzepływowego A4F
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.