Method Article

Metoda szybkiej homogenizacji wspomagana separacją magnetyczną do produkcji pęcherzyków pochodzących z endosomów na dużą skalę

DOI:

10.3791/66021

⸱

January 26th, 2024

 ,  , 
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowy typ egzosomów naśladujących (EM), które mają to samo pochodzenie biologiczne i podobną strukturę, morfologię i skład białkowy natywnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przyciągnęły znaczną uwagę w badaniach fizjologicznych i patologicznych, diagnozowaniu chorób i leczeniu; jednak ich kliniczne zastosowanie zostało ograniczone przez brak metod produkcji na dużą skalę. W związku z tym protokół ten zapewnia metodę szybkiej homogenizacji wspomaganą separacją magnetyczną do produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jako nowego rodzaju egzosomów naśladujących (EM) pochodzących z endosomów, które mają około 100-krotnie wyższą wydajność niż konwencjonalna metoda ultrawirowania. W tej metodzie nanocząstki magnetyczne (MNP) zostały zinternalizowane przez komórki rodzicielskie poprzez endocytozę, a następnie zostały zgromadzone w ich endosomach. Następnie endosomy obciążone MNP zebrano i oczyszczono przez leczenie hipotoniczne i separację magnetyczną. Szybki homogenizator wykorzystano do rozbicia endosomów obciążonych MNP na monodyspersyjne nanopęcherzyki. Powstałe pęcherzyki pochodzące z endosomów mają to samo pochodzenie biologiczne i strukturę, charakteryzującą się analizą śledzenia nanocząstek, transmisyjnym mikroskopem elektronowym i western blotting. Ich morfologia i skład białkowy są podobne do natywnych EV, co wskazuje, że EMs mogą potencjalnie służyć jako tani i wysokowydajny substytut natywnych EV do translacji klinicznej.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EVs) to małe pęcherzyki wydzielane przez prawie wszystkie komórki o zakresie wielkości 30-150 nm, zawierające obfite substancje bioaktywne. W zależności od komórki, z której pochodzą, EV wykazują wysoką heterogeniczność, posiadając wiele składników specyficznych dla komórek macierzystych1. EV są uwalniane do płynów ustrojowych i transportowane do odległych miejsc, gdzie są pobierane przez komórki docelowe do działania2, które mogą być wykorzystane do dostarczania szerokiej gamy bioaktywnych cząsteczek i leków do naprawy tkanek, diagnozowania i leczenia nowotworów oraz modulacji immunologicznej3,4. Jednak inne nanocząstki biologiczne (np. lipoproteiny) i nanopęcherzyki (np. EV pochodzące ze szlaków nieendosomalnych) o podobnych właściwościach biofizycznych w płynach ustrojowych nieuchronnie wpływają na izolację i oczyszczanie EV. Do tej pory ultrawirowanie pozostaje złotym standardem izolacji EV, a inne metody izolacji, w tym wirowanie w gradionym gradifikacji gęstości sacharozy, ultrafiltracja, wytrącanie glikolu polietylenowego, chromatografia i izolacja kulek immunomagnetycznych, zostały opracowane5. Obecnym wąskim gardłem ograniczającym translację kliniczną i komercjalizację terapii EV jest poważny brak technik izolacji, które pozwalają na wysoce skalowalną i odtwarzalną izolację EVs6,7,8. Tradycyjne techniki izolacji EV (np. ultrawirowanie i chromatografia wykluczania wielkości) charakteryzują się niską wydajnością (1 x 107-1 x 108/1 x 106 komórek), długim cyklem produkcyjnym (24-48 godzin), słabą odtwarzalnością jakości produktu oraz wymagają drogiego i energochłonnego sprzętu produkcyjnego, który nie jest w stanie zaspokoić obecnego zapotrzebowania klinicznego na EVs6.

Egzosomy naśladujące (EMs), syntetyczne substytuty natywnych EV, przyciągnęły dużą uwagę ze względu na ich bardzo podobną strukturę, funkcję i skalowalność w produkcji. Głównym źródłem EM jest bezpośrednia ekstruzja całych komórek rodzicielskich z ciągłym cięciem9,10, wykazując silne funkcje biologiczne jako natywne EVs11,12. Na przykład EM pochodzące z ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny (hUCMSC) wywierają podobne efekty gojenia się ran jak natywne EV i są bogatsze w skład białka13. Chociaż EMs pochodzące z całych komórek mają biologiczną złożoność EV, ich główną wadą jest niejednorodność produktów, ponieważ są one nieuchronnie zanieczyszczone przez różne organelle komórkowe i szczątki komórkowe. Analiza lokalizacji białek wykazała ponadto, że EM pochodzące z ekstruzji całych komórek zawierają wiele niespecyficznych dla EVs białek z mitochondriów i retikulum endoplazmatycznego13. Co więcej, większość metod produkcji EMs nadal wymaga ultrawirowania, co jest bardzo czasochłonnym i energochłonnym procesem14. Biorąc pod uwagę fakt, że egzosomy pochodzą wyłącznie z endosomów komórkowych, postawiliśmy hipotezę, że bioinżynieryjne nanopęcherzyki pochodzące z endosomów mogą lepiej podsumować biologiczną homologię między egzosomami a EM w porównaniu z dobrze znanymi EM pochodzącymi z błony komórkowej wytwarzanymi metodą ekstruzji całych komórek14. Niemniej jednak wytwarzanie nanopęcherzyków pochodzących z endosomów jest trudne ze względu na brak realnych podejść.

Badania kliniczne zostały przeprowadzone przy użyciu EVs jako substytutu terapii bezkomórkowej i nanoskalowego systemu dostarczania leków do leczenia różnych chorób. Na przykład EV pochodzące z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego były stosowane w leczeniu ciężkiego zapalenia płuc wywołanego przez COVID-19 i przyniosły obiecujące wyniki. Ostatnio genetycznie zmodyfikowane EV przenoszące białka CD24 wykazały również silne korzyści terapeutyczne w leczeniu pacjentów z COVID-1915,16. Jednak kliniczne wymagania terapii EV nadal nie mogą być spełnione tradycyjnymi metodami izolacji ze względu na niską wydajność i koszty. Badanie to donosi o produkcji na dużą skalę nanopęcherzyków pochodzących z endosomów za pomocą szybkiej homogenizacji wspomaganej separacją magnetyczną. Wykorzystuje szlak endocytozy MNP do izolowania endosomów obciążonych MNP poprzez separację magnetyczną, a następnie homogenizację z dużą prędkością w celu sformułowania endosomów w monodyspersyjne nanopęcherzyki. Ponieważ rodzaje endosomów zbieranych za pomocą tego protokołu są różnorodne, nadal potrzebne są dalsze dogłębne badania w celu ustalenia dobrych praktyk produkcyjnych (GMP) w branży. To nowatorskie podejście do przygotowania EM jest bardziej efektywne czasowo (5 minut szybkiej homogenizacji) w celu uzyskania nanopęcherzyków homologicznych do natywnych EV. Wytwarza wykładniczo więcej pęcherzyków z tej samej ilości komórek niż ultrawirowanie, które można ogólnie zastosować do różnych typów komórek.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Schemat metody jest pokazany w Rysunek 1.

1. Przygotowanie i izolacja EM

  1. Internalizacja komórkowa MNP
    1. Hodowla komórkowa
      1. Zawiesić 1 × 106 mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego szczura (BMSC), komórek 293T lub komórek nabłonka nabłonka jajnika myszy (ID8) w kompletnym pożywce DMEM z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 5% roztworem penicyliny-streptomycyny (P / S) w 2 ml na płytkę sześciodołkową (patrz Tabela materiałów).
      2. Hodować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
        UWAGA: Liczba komórek po przyleganiu wynosiła około 1 × 106.
    2. Endocytoza MNP
      1. Zmniejszyć objętość podłoża w każdej sześciodołkowej płytce do 1 ml. Współhodowlę komórek z nanocząstkami (IONP) tlenku żelaza modyfikowanymi polilizyną o długości 10 nm (zob. tabela materiałów) w stężeniu 100 μg/1 × 106 komórek i inkubacja w temperaturze 37 °C w atmosferze zawierającej 5% CO2 przez 12 godzin, aby umożliwić komórkom pełną endocytozę jonów IONP.
  2. Izolacja i homogenizacja endosomów
    1. Leczenie hipotoniczne komórek
      1. Trawić komórki, które mają w pełni zinternalizowane IONPs, za pomocą 0,5 ml / studzienkę trypsyny przez 3 minuty i zakończyć trawienie, dodając 1 ml / studzienkę kompletnej pożywki.
      2. Wirować przy 1000 x g przez 5 minut i odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić komórki w buforze fosforanowym soli fizjologicznej (PBS) i odwirować, kilkakrotnie dwukrotnie, aby wypłukać pozostałą pożywkę i niewchłonięte IONP.
      3. Na koniec zawiesić osad w 8 ml we wstępnie przygotowanym roztworze hipotonicznym (71,4 mM chlorku potasu, 1,3 mM cytrynianu sodu, pH 7,2-7,4) przez 15 minut (patrz Tabela Materiałów).
    2. Uwalnianie organelli przez homogenizację przy niskiej prędkości
      1. Przenieść zawiesinę komórkową w roztworze hipotonicznym do szklanej probówki i uwolnić organelle za pomocą szklanego homogenizatora (patrz tabela materiałów) przez 20 wstrząsów przy 1000 obr./min.
    3. Separacja magnetyczna w celu uzyskania endosomów
      1. Przenieś 1 ml homogenizowanego roztworu komórkowego do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieść w separatorze magnetycznym na 1 godzinę, aby całkowicie oddzielić endosomy obciążone IONP od innych organelli (takich jak jądro i mitochondria) oraz szczątków komórkowych.
      2. Zbierz brązowe granulki na powierzchni styku probówek do mikrowirówek obok ramy magnetycznej (patrz Tabela materiałów), tj. endosomy załadowane IONP. Wylej płyn do probówek do mikrowirówek i dodaj 3 ml PBS w celu ponownego zawieszenia endosomów.
  3. Homogenizacja z dużą prędkością
    1. Przenieść roztwór zawierający endosomy do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml o objętości cieczy między 3-10 ml.
    2. Wysunąć sondę 10 mm homogenizatora szybkoobrotowego (patrz Tabela materiałów) do dna probówki wirówki, nie dotykając dna. Dostosuj przycisk Prędkość pod ekranem, ustaw prędkość na 140 x g i wyreguluj przycisk Czas, aby ustawić czas 5 minut, a następnie naciśnij przycisk OK.
    3. Naciśnij przycisk Start, aby przeprowadzić homogenizację po umieszczeniu pojemnika na lód pod próbką.
  4. Sortowanie magnetyczne dla EM
    1. Roztwór zawierający nanopęcherzyki otrzymany w wyniku szybkiej homogenizacji przenieść do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i umieścić w separatorze magnetycznym na 1 godzinę.
    2. Zbierz płyn zawierający wymagane EM. Uważaj, aby nie dotknąć powierzchni rurek obok ramy magnetycznej, która adsorbowała wolne IONP i EMs obciążone IONP.

2. Charakterystyka EM (Rysunek 2 i Rysunek 3)

  1. Analiza dynamicznego rozpraszania światła (DLS)
    1. Wstrzyknąć 1 ml próbki EM (20 μg/ml) wzdłuż ścianki do kuwety i umieścić ją w gnieździe na próbkę instrumentu w instrumencie DLS (patrz Tabela materiałów).
    2. Otwórz oprogramowanie DLS, wybierz Test wielkości cząstek i rozpocznij testowanie.
    3. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA (patrz tabela materiałów).
  2. Analiza śledzenia nanocząstek (NTA)
    1. Rozcieńczyć EM PBS do roztworu o stężeniu 1 × 107-1 × 108 cząstek/ml i wstrzyknąć je do komory przyrządu NTA (patrz tabela materiałów) za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml przy natężeniu przepływu 500-1000 μl/min.
    2. Otwórz 488 kanałów laserowych i upewnij się, że liczba EMs w interfejsie oprogramowania mieści się w zakresie 100-300 i jest w ruchu Browna.
    3. Zgodnie z protokołem producenta wybierz odpowiedni SOP (EV-488), aby upewnić się, że czułość przyrządu jest odpowiednia do wykrywania EM.
  3. Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)
    1. Ustalić EM (1 mg/ml) o równej objętości 5% aldehydu glutarowego przez 30 minut i określić ilościowo stężenie EM jako 1 mg/ml za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA.
    2. Umieść 10 μl kropli EMs po stronie węglowej siatki miedzianej i po 10 minutach usuń nadmiar płynu z boku bibułą filtracyjną. Dodać 10 μl PBS i natychmiast osuszyć bibułą filtracyjną. Powtórz dwukrotnie, aby usunąć nadmiar aldehydu glutarowego.
    3. Wrzuć 5 μl środka kontrastowego z octanu uranylu i barwij ujemnie przez 1 minutę, a następnie usuń nadmiar środka kontrastowego. Umyj trzykrotnie wodą dejonizowaną i wysusz w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Rejestruj obraz za pomocą TEM przy napięciu przyspieszenia 100 kV.
  4. Western blotting (zachodnia plama)
    1. Do próbek dodać 100 μl buforu do lizy komórek i 5 μl koktajlu 50x inhibitorów proteazy (patrz tabela materiałów). Delikatnie wymieszaj pistoletem do pipet i umieść na lodzie na 30 minut.
    2. Odwirować roztwór o sile 1000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, określić ilościowo stężenie białka w supernatantze za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA i zebrać go.
    3. Wymieszać 100 μl supernatantu z 25 μl 5x buforu ładującego białko i podgrzewać w temperaturze 95 °C przez 10 min.
    4. Przygotuj żele zgodnie z instrukcją wstępnie uformowanych żeli. Załadować 15 μg białka do studzienki i przeprowadzić elektroforezę żelową pod napięciem 80 V. Poczekaj, aż próbka przepłynie do żelu rozdzielającego, zmień na 100 V, a następnie przenieś białko do membrany nitrocelulozowej przy napięciu 100 V, 60 minut w kąpieli lodowej.
    5. Wykryć markery niespecyficzne dla EV (Calnexin) i biomarkery EV (Aneksyna i CD63) za pomocą western blot (patrz Tabela materiałów).
      UWAGA: Przeciwciała rozcieńcza się zgodnie z zaleceniami producenta.

3. Wykrywanie funkcji EM in vitro

  1. Etykietowanie EM
    1. Zmieszać 1 μl PKH26 z 250 μl rozcieńczalnika C (1:250), aby uzyskać 2x roztwór barwiący (4 × 10-6 M) (patrz Tabela Materiałów).
    2. Wymieszaj 250 μl EMs (1 mg/mL) z 250 μL 2x roztworu barwiącego i szybko przedmuchaj za pomocą pistoletu do pipetowania.
    3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 2-5 minut, delikatnie odwracając probówkę wirówkową.
    4. Dodać równą objętość surowicy lub 1% białka surowicy bydlęcej i inkubować przez 1 minutę, aby zakończyć trawienie.
    5. Usunąć nadmiar PKH26 przez ultrafiltrację za pomocą 1000 KD rurek ultrafiltracyjnych o stężeniu 3000 x g przez 30 minut i powtórzyć trzykrotnie, dodając PBS. Zawiesić pozostałą ciecz do 500 μl za pomocą PBS i przefiltrować przez filtr 0,22 μm.
  2. Test wychwytu komórek
    1. Inokulacja komórek: Wysiew 1 × 106 komórek w 35-milimetrowych naczyniach konfokalnych z 1 ml DMEM zawierającego 10% FBS i 5% P/S i inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc.
    2. Przefiltruj EM za pomocą sterylnych filtrów strzykawkowych 0,22 μm, aby usunąć potencjalne zanieczyszczenia.
    3. Traktuj komórki EMs znakowanymi PKH26 (109 cząstek/ml) przez 8 godzin.
    4. Przemyć trzykrotnie PBS, dodać DAPI (10 ng/ml) i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    5. Pozyskać obrazy fluorescencyjne w konfokalnej skaningowej mikroskopii fluorescencyjnej z wykorzystaniem kanałów laserowych 405 nm i 561 nm (patrz tabela materiałów).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przebieg przygotowania EM za pomocą szybkiej homogenizacji wspomaganej separacją magnetyczną jest pokazany w Rysunek 1. Komórki internalizują IONP zmodyfikowane polilizyną 10 nm, które są specyficznie gromadzone w endosomy poprzez endocytozę (Figura 3A). Po potraktowaniu hipotonicznym buforem i homogenizacji, endosomy obciążone IONP są uwalniane z komórek, a następnie zbierane przez separację magnetyczną. Wyizolowane endosomy są dalej odtwarzane w monodyspersyjne nanopęcherzyki, znane również jako EM, przez homogenizację z dużą prędkością. Zbadaliśmy wiele kluczowych parametrów (np. szybkość i czas homogenizacji), aby zidentyfikować zoptymalizowane warunki przygotowania EM (Rysunek 2). Ostatecznie wybrano prędkość homogenizacji 140 x g przez 5 minut jako stan zoptymalizowany, biorąc pod uwagę wielkość cząstek i wydajność wytwarzanych EM. Wolne IONP i EM obciążone IONP są ostatecznie usuwane z roztworu produktu końcowego przez drugą rundę separacji magnetycznej w celu uzyskania EM-ów wolnych od IONP. Metoda ta pozwala na uzyskanie wysoce jednorodnych i monorozproszonych nanopęcherzyków z endosomów komórek rodzicielskich, mających to samo pochodzenie biologiczne co natywne EV.

Aby porównać EV uzyskane przez ultrawirowanie z EMs wygenerowanymi tą metodą, BMSC i 293T zostały przygotowane dla EV i EMs. Średnica i morfologia EMs zostały przeanalizowane za pomocą NTA i TEM. Morfologia BMSC-EM ma cechę typowej struktury pęcherzykowatej w kształcie misy i jest ograniczona dwuwarstwą lipidową (Ryc. 3A). Zgodnie z analizą NTA, zarówno BMSC-EM, jak i 293T-EM mają podobną średnicę hydrodynamiczną do natywnych pojazdów elektrycznych (BMSC-EV i 293T-EV) (Rysunek 3B). Wydajność BMSC-EM homogenizacji z dużą prędkością wynosiła 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 106komórek, a wydajność natywnych EV przygotowanych przez ultrawirowanie wynosiła tylko 7,2 × 107-1,12 × 108/1 × 106komórek. Podobnie, wydajność 293T-EM homogenizacji z dużą prędkością wynosiła 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 106komórek, co osiąga około 100-krotnie wyższą wydajność niż w przypadku natywnych 293T-EV przygotowanych konwencjonalną metodą ultrawirówki (≈5,5 × 106/1 × 106 6 komórek) (Rysunek 4A).

Ponadto, wyniki western blot wykazały, że BMSC-EM zawierają te same biomarkery białkowe co EV (CD63 i Aneksyna). Zarówno EM, jak i EV są ujemne dla ekspresji Calnexin, co sugeruje, że EMs wytworzone tą metodą prawie nie miały zanieczyszczenia błony plazmatycznej (Rysunek 3C). Nie ma znaczącej różnicy w stężeniu białka między EM i EV, BMSC-EM i BMSC-EV wykazywały podobne całkowite stężenia białka, 11,15 μg/1 × 109 cząstek i 14,71 μg/1 × 109 cząstki za pomocą zestawu do oznaczania białek BCA. Co więcej, 293T-EM i 293T-EV wykazywały całkowite stężenie białka wynoszące odpowiednio około 31,8 μg/1 × 109 cząstek i 9,95 μg/1 × 109 cząstek (Rysunek 4B). Wyniki te wskazują, że EMs mają podobny skład białkowy jak natywne EV. Aby wykryć, czy EM mogą być endocytozyzowane, EMs i EV znakowane PKH26 inkubowano jednocześnie z BMSC i ID8 w stężeniu 1 × 109 cząstek/ml przez 8 godzin, a komórki obserwowano pod konfokalną mikroskopią fluorescencyjną, aby potwierdzić, że EM mogą być łatwo wychwytywane przez komórki do działania, podobnie jak EV (Rysunek 5).

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ideowy metody szybkiej homogenizacji wspomaganej magnetycznie. Krok 1: Komórki internalizują IONP do endosomów poprzez endocytozę. Krok 2: Zbierz organelle, w tym endosomy obciążone IONP, po leczeniu hipotonicznym i homogenizacji. Krok 3: Oczyść endosomy obciążone IONP przez separację magnetyczną. Krok 4: Endosomy są homogenizowane i odtwarzane w monodyspersyjne nanopęcherzyki. Krok 5: Usuń wolne IONP i EM załadowane IONP przez separację magnetyczną, aby zebrać EMs wolne od IONP. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja warunków przygotowania EM. (A) Średnica i PDI BMSC-EM w odpowiedzi na zmiany prędkości homogenizacji, gdy czas jest ustawiony na 5 minut, zostały przeanalizowane przez DLS. (B) Średnica i PDI BMSC-EM w odpowiedzi na zmiany czasu homogenizacji, gdy prędkość homogenizacji jest ustawiona na 140 x g, analizowano za pomocą DLS. (C) Średnica i PDI BMSC-EM w różnych punktach przechowywania zostały przeanalizowane przez DLS. (D) Średnica i stężenie BMSC-EM w odpowiedzi na zmiany prędkości homogenizacji, gdy czas jest ustawiony na 5 minut, zostały przeanalizowane przez NTA. (E) Średnica i stężenie BMSC-EM w odpowiedzi na zmianę czasu homogenizacji, gdy prędkość homogenizacji jest ustawiona na 140 x g, zostały przeanalizowane przez NTA. (F) Średnica i wydajność BMSC-EM w odpowiedzi na współinkubację komórek BMSC z IONP o różnych stężeniach zostały przeanalizowane przez NTA. p < 0,0001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka EMs. (A) Charakterystyka TEM morfologii komórek rodzicielskich z endocytozowanymi JONPs, endosomami i EMs. Paski skali reprezentują 500 nm. (B) Średnice hydrodynamiczne BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM i 293T-EV są scharakteryzowane przez NTA. (C) Wyniki analizy Western blot lizatów komórkowych BMSC-EM, BMSC-EV i BMSC. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wydajność EMs jest wyższa niż EV. (A) Wydajność EMs i EV przygotowanych z BMSC i 293T została przeanalizowana przez NTA. (B) Wydajność białka EMs i EV przygotowanych z BMSC i 293T. **p < 0,01. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Reprezentatywne obrazy z mikroskopu fluorescencyjnego EV i EM oznaczone PKH26 zinternalizowane przez BMSC i ID8. Podziałka skali reprezentuje 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako substytut terapii bezkomórkowej i nanoskalowego systemu dostarczania leków, pojazdy elektryczne nie spełniły jeszcze oczekiwań klinicznych, a główną przeszkodą jest brak skalowalnych i powtarzalnych metod produkcji i oczyszczania6. W związku z tym opracowano różne typy EM, które są analogami EV o podobnej złożoności biologicznej14. Do tej pory najczęściej stosowanym przykładem EM są nanopęcherzyki pochodzące z błony komórkowej. Przygotowanie takich nanopęcherzyków jest stosunkowo łatwe i proste dzięki bezpośredniemu wytłaczaniu całych komórek rodzicielskich17. Jednak nanopęcherzyki pochodzące z błony komórkowej nie mogą podsumować natywnych EV ze względu na dwie wady: po pierwsze, biologiczne pochodzenie tych nanopęcherzyków pochodzi z błony komórkowej, która zawiera inny skład lipidów i białek w porównaniu z natywnymi EV; Po drugie, zanieczyszczenia, w tym białka, kwasy nukleinowe i lipidy z organelli innych niż EV i szczątki komórkowe, powodujące nieuniknioną niejednorodność EM. W tej metodzie inkubowaliśmy komórki z IONP i zbieraliśmy endosomy obciążone IONP poprzez separację magnetyczną, a następnie wygenerowaliśmy monodyspersyjne nanopęcherzyki poprzez szybką homogenizację, ostatecznie uzyskując EM-y wolne od IONP przez drugą rundę separacji magnetycznej. Ponadto zoptymalizowaliśmy warunki przygotowania EM, badając wpływ różnych parametrów, takich jak szybkość i czas homogenizacji, na wielkość EM i wydajność. Protokół ten wykorzystuje interesujące zjawisko biologiczne: MNP (np. IONPy 10 nm) mogą być skutecznie internalizowane przez prawie wszystkie komórki poprzez endocytozę i gromadzone wyłącznie w endosomach, a nie w innych organellach. Ten unikalny proces biologiczny umożliwił izolację endosomów obciążonych MNP bez zanieczyszczeń innych niż EV poprzez separację magnetyczną. W zamian za to nanopęcherzyki przygotowane przez te oczyszczone endosomy komórkowe mogą wierniej odtworzyć biologiczną złożoność natywnych EV.

Co więcej, złotym standardem metody izolacji EV jest ultrawirowanie, które kosztuje masywne podłoża do hodowli komórkowych i długi czas przetwarzania wynoszący ponad 5 godzin i wytwarza tylko 1 × 107-1 × 108 cząstek z 1 x 106 komórek6. Tradycyjne metody wytłaczania całych komórek rodzicielskich obejmują wiele etapów, w tym wytłaczanie membranowe pod ultrawysokim ciśnieniem i ultrawirowanie, które dają stosunkowo wyższą wydajność, ale wymagają drogiego sprzętu17. Jednak wydajność produkcji EM, wydajność, koszty i siła robocza ulegają znacznej poprawie dzięki zastosowaniu naszego protokołu. Homogenizator szybkoobrotowy jest powszechnym i tanim sprzętem zapewniającym krótki czas przetwarzania wynoszący 5 minut w tym protokole, a ta metoda może wyprodukować do 100 razy więcej EMs z 1 × 106 komórek w porównaniu z natywnymi EV. Jednak metoda ta ma pewne ograniczenia, takie jak utrata białek endosomalnych podczas szybkiej homogenizacji i wykazano, że MNP endocytozowane przez komórki mogą być przenoszone do lizosomów, co stanowiłoby potencjalne zanieczyszczenie18.

W perspektywie, EM mogą być zaprojektowane tak, aby odgrywały ważne funkcje biologiczne, tak jak ich rodzime odpowiedniki, co może służyć jako nowy i obiecujący rodzaj biologicznych środków terapeutycznych. Substancje bioaktywne (np. białka i kwasy nukleinowe) mogą być integrowane z EM poprzez selekcję określonych komórek rodzicielskich (np. komórek macierzystych19) lub modyfikację genetyczną (np. białka fuzyjne20). Na przykład nanopęcherzyki pochodzące z komórek poprzez wytłaczanie żywych embrionalnych komórek macierzystych mają pozytywny wpływ na proces regeneracji lub gojenia się ran19. Modyfikacja genetyczna jest alternatywnym podejściem do generowania EM o określonych funkcjach biologicznych. Na przykład, gdy komórki zostały transfekowane wektorami nanociał receptora anty-epidermalnego czynnika wzrostu (EGFR) połączonych z peptydami sygnałowymi kotwicy glikozylofosfatydyloinozytolu (GPI), nanociała EGFR można zakotwiczyć na powierzchni EV w celu celowania w komórki nowotworowe wykazujące ekspresję EGFR20. Systemy EM sprawdziły się dobrze jako substytut terapii bezkomórkowej i nanoskalowego systemu dostarczania leków w wielu badaniach przedklinicznych14, ale brakuje kompleksowego mechanistycznego zrozumienia EM lub terapii opartej na EV, co budzi obawy o heterogeniczność i odtwarzalność EV i EM w badaniach klinicznych. Podsumowując, biologiczne funkcje EM i ich implikacje kliniczne wymagają dalszych badań.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.W. i P.G. są współtwórcami wniosku patentowego złożonego przez Instytut Medycyny Podstawowej i Raka (IBMC) Chińskiej Akademii Nauk. Drugi autor deklaruje, że nie występuje konflikt interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy potwierdzają użycie instrumentów w Shared Instrumentation Core Facility w Instytucie Podstawowej Medycyny i Raka (IBMC), Chińskiej Akademii Nauk. Badanie to było wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC; 82172598), Fundację Nauk Przyrodniczych prowincji Zhejiang w Chinach (LZ22H310001), Projekt Szkolenia Talentów Zdrowotnych 551 Komisji Zdrowia Prowincji Zhejiang w Chinach, Projekt Badawczy Rozwoju Rolnictwa i Rozwoju Społecznego Miejskiego Biura Nauki i Technologii w Hangzhou (2022ZDSJ0474) oraz Interdyscyplinarny Grant Badawczy Qiantang.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Przeciwciało aneksynyABklonalneA11235BCA Western blotting
BeyotimeP0012Test stężenia białka
CalnexinGeneTexHL1598Western blotting
Przeciwciało CD63ABclonalA19023Western blotting
Bufor do lizy komórek dla Western i IPBeyotimeP0013Western Wirówka do blottingu
BeckmanAllegra X-30RWirówka komórkowa
Inkubator CO2Hodowla ThermoCell
Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna ze skaningiem laserowymNIKONA1 HD25Zdjęcie obrazu fluorescencji
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTHodowla komórkowa
Dynamiczne rozpraszanie światła (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600Analiza średnicy
Elektryczny homogenizator szkłaSCIENTZ (Ningbo, Chiny)DY89-IIHomogenizacja wolnoobrotowa
FBS zubożony w egzosomyBioscienceEXO-FBS-50A-1Hodowla komórkowa
Homogenizator szybkoobrotowySCIENTZ (Ningbo, Chiny)XHF-DYHomogenizacja o dużej prędkości
Ruszt magnetycznyTuohe Electromechanical Technology (Szanghaj, Chiny)NASeparacja magnetyczna
PKH26 Zestaw łączników komórek czerwonej fluorescencji do ogólnego etykietowania błon komórkowychSigma-AldrichPKH26GL-1KTZestaw zawiera łącznik komórek PKH26 w etanolu i rozcieńczalnik C
Nanocząstki tlenku żelaza modyfikowane polilizyną (JONP)Zhongke Leiming Technology (Pekin, Chiny)Mag1100-10Hodowla komórkowa
Potas chlorekAladyn7447-40-7Leczenie hipotoniczne komórek
Koktajl inhibitorów proteazyBeyotimeP1030Inhibitor proteinazy
Cytrynian soduAladdin7447-40-7Leczenie hipotoniczne komórek
Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM)JEOLJEM-2100plusObraz morfologii
UltrawirówkaBeckmanOptima XPN-100Wirówka egzosomowa
ZetaZobacz analizatory nanocząstek  śledzeniecząstek MetrixPMX120Analiza śledzenia nanocząstek
Zestaw do testowania System

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), eaau6977(2020).
  2. Hyenne, V., et al. RAL-1 controls multivesicular body biogenesis and exosome secretion. J Cell Biol. 211 (1), 27-37 (2015).
  3. Farooqi, A. A., et al. Exosome biogenesis, bioactivities and functions as new delivery systems of natural compounds. Biotechnol Adv. 36 (1), 328-334 (2018).
  4. Gatti, S., et al. Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury. Nephrol Dial Transplant. 26 (5), 1474-1483 (2011).
  5. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  6. Yang, D., et al. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
  7. Castilletti, C., et al. Coordinate induction of IFN-alpha and -gamma by SARS-CoV also in the absence of virus replication. Virology. 341 (1), 163-169 (2005).
  8. Guo, P., Huang, J., Moses, M. A. Cancer nanomedicines in an evolving oncology landscape. Trends Pharmacol Sci. 41 (10), 730-742 (2020).
  9. Jo, W., et al. Large-scale generation of cell-derived nanovesicles. Nanoscale. 6 (20), 12056-12064 (2014).
  10. Yoon, J., et al. Generation of nanovesicles with sliced cellular membrane fragments for exogenous material delivery. Biomaterials. 59, 12-20 (2015).
  11. Li, M., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells ablate neuroblastoma tumor in vitro and in vivo. Biomater Adv. 142, 213161(2022).
  12. Wang, J., et al. Exosome mimetics derived from bone marrow mesenchymal stem cells deliver doxorubicin to osteosarcoma in vitro and in vivo. Drug Deliv. 29 (1), 3291-3303 (2022).
  13. Zhang, Z., et al. Comprehensive proteomic analysis of exosome mimetic vesicles and exosomes derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 312(2022).
  14. Li, Y. J., et al. Artificial exosomes for translational nanomedicine. J Nanobiotechnology. 19 (1), 242(2021).
  15. Yang, W., et al. Clinical characteristics of 310 SARS-CoV-2 Omicron variant patients and comparison with Delta and Beta variant patients in China. Virol Sin. 37 (5), 12(2022).
  16. Shapira, S., et al. A novel platform for attenuating immune hyperactivity using EXO-CD24 in COVID-19 and beyond. EMBO Mol Med. 14 (9), 15997(2022).
  17. Jang, S. C., et al. Bioinspired exosome-mimetic nanovesicles for targeted delivery of chemotherapeutics to malignant tumors. ACS Nano. 7 (9), 7698-7710 (2013).
  18. Le, T. S., et al. Quick and mild isolation of intact lysosomes using magnetic-plasmonic hybrid nanoparticles. ACS Nano. 16 (1), 885-896 (2022).
  19. Jeong, D., et al. Nanovesicles engineered from ES cells for enhanced cell proliferation. Biomaterials. 35 (34), 9302-9310 (2014).
  20. Kooijmans, S. A., et al. Display of GPI-anchored anti-EGFR nanobodies on extracellular vesicles promotes tumour cell targeting. J Extracell Vesicles. 5, 31053(2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Magnetic SeparationHigh Speed HomogenizationEndosome Derived VesiclesExosome MimicsExtracellular VesiclesNanoparticle TrackingTransmission Electron MicroscopeWestern BlottingHypotonic TreatmentMagnetic Nanoparticles

Related Articles